Wielokrotne pomiary aktywności mięśni oddechowych i wentylacji w mysich modelach choroby nerwowo-mięśniowej

Ogólnym celem tej procedury jest wielokrotny pomiar aktywności mięśni oddechowych oraz wentylacji w trakcie postępu choroby. Pomiar ten następuje po chirurgicznej implantacji urządzenia telemetrycznego z elektrodami do elektromiografii wprowadzonymi do wybranych mięśni. Metoda ta może być wykorzystana do udzielenia odpowiedzi na kluczowe pytania dotyczące tego, w jaki sposób dodatkowe mięśnie oddechowe kompensują upośledzoną funkcję przepony w wyniku choroby lub urazu.

Główną zaletą tej techniki jest możliwość pomiaru wentylacji i aktywności mięśni oddechowych u tej samej myszy o swobodnym zachowaniu w trakcie postępu choroby. Metoda ta może dostarczyć cennych informacji dotyczących diagnozy i leczenia ALS, ale może być również zastosowana w innych modelach chorób nerwowo-mięśniowych lub urazów rdzenia kręgowego. Rozpocznij od przygotowania elektrod EMG.

Użyj nożyczek przeznaczonych do pracy z przewodami, aby przyciąć dystalne końcówki elektrod, tak aby pozostało około trzech centymetrów przewodu niezbędnego do dotarcia do docelowego mięśnia. Następnie za pomocą skalpela usuń 0,5 centymetra plastikowej osłonki, uważając, aby nie przeciąć samego przewodu. W dalszej kolejności użyj narzędzi do obróbki przewodów, aby rozciągnąć końce elektrod do czterech lub pięciu razy ich pierwotnej długości.

Przytnij odsłonięte druty przewodów tak, aby miały długość 0.5 cm. Następnie przygotuj kapturki na przewody, aby zakryć końce drutów, odcinając odcinki rurek o długości 0.25 cm z wcześniej usuniętej plastikowej obudowy. Po znieczuleniu myszy wykonaj ucisk palca u nogi oraz ucisk ogona, aby upewnić się, że mysz jest w pełni znieczulona, co potwierdzi brak reakcji.

Następnie przenieś mysz do zestawu chirurgicznego i załóż stożek nosowy, aby utrzymać znieczulenie podczas operacji. Nałóż okulistyczną maść nawilżającą, aby zapobiec wysychaniu oczu w trakcie zabiegu. Przytnij pazury u palców stopy po stronie ipsilateralnej względem miejsca operacji, aby zmniejszyć ryzyko wyciągnięcia przez mysz elektrod lub powstania ran w wyniku drapania podczas procesu gojenia.

Wygoli mysz, aby odsłonić miejsce operacyjne między uchem a barkiem. Następnie przecieraj naprzemiennie pole operacyjne, najpierw środkiem dezynfekującym, a następnie izopropanolem. Aby rozpocząć implantację, odciągnij przednią kończynę w stronę przeciwległej stopy, aby przesunąć łopatkę w kierunku ogonowym, co zapewni dostęp chirurgiczny do mięśni skalenowych i mięśnia czworobocznego.

Używając tępych pęset zakrzywionych, odsunąć przednią łapę po stronie ipsilateralnej względem miejsca operacji i przymocować ją taśmą. Po założeniu nowej pary rękawiczek chirurgicznych, za pomocą skalpela wykonać dwucentymetrowe cięcie skośne między barkiem a uchem. Następnie, trzymając w każdej ręce pęsety do laminektomii, odsunąć poduszkę tłuszczową i rozsunąć mięsień czworoboczny oraz mięsień szeroki szyi, aby odsłonić powięź pokrywającą mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy oraz mięśnie scalenus.

Wykorzystaj bladą mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy oraz nerw przeponowy jako punkty orientacyjne w celu zidentyfikowania mięśni żebrowych. Należy zauważyć, że nerw przeponowy biegnie równolegle do mięśni żebrowych, natomiast mięsień mostkowo-obojczykowo-sutkowy znajduje się poniżej. Mięśnie żebrowe biegną ukośnie od kręgów szyjnych do żeber, pod mięśniem czworobocznym.

Przewody potencjału biologicznego zostaną wprowadzone do mięśnia scalenus anterior, który można zidentyfikować jako mięsień biegnący w sąsiedztwie nerwu przeponowego. Następnie należy utworzyć kieszonkę na nadajnik, wprowadzając końcówki nożyc rozdzielających tkanki pod skórę myszy i rozwierając je do momentu powstania kieszonki nieco większej niż szerokość nadajnika. Kieszonkę należy przepłukać ciepłą sterylną solą fizjologiczną.

Następnie wprowadź nadajnik płaską stroną w stronę mięśnia. Ustaw nadajnik tak, aby przylegał płasko, a przewody wychodziły z kieszonki równolegle do siebie, nie będąc skręconymi. Poprowadź elektrody z nadajnika do mięśni skalenus i czworobocznego w taki sposób, aby dwa zestawy elektrod biopotencjałowych przylegały płasko i równolegle do siebie.

Następnie należy użyć kleszczyków do laminektomii, aby oddzielić mięsień pochyły przedni od otaczających go mięśni. Następnie należy wprowadzić igłę 25G przez mięsień pochyły prostopadle do włókien mięśniowych. Do czubka igły należy wsunąć jedną elektrodę, a następnie wyciągnąć igłę z mięśnia, pozostawiając elektrodę wewnątrz mięśnia do poziomu izolacji przewodu.

Zapisz, które kolorowe elektrody zostały wprowadzone do których mięśni. Nanieś kroplę kleju cyjanoakrylowego na igłę o rozmiarze 21G, aby ułatwić aplikację kleju na elektrody. Następnie nanieś klej na odsłonięty koniec przewodu, blisko mięśnia, w którym znajduje się elektroda.

Szybko nasuń nasadkę elektrody na przewód w taki sposób, aby między nasadką a mięśniem nie pozostał odsłonięty fragment przewodu. Odetnij nadmiar przewodu za nasadką i nanieś kroplę kleju cyjanoakrylowego na koniec nasadki i przewodu. Odczekaj do polimeryzacji kleju przed zwolnieniem ucisku.

Następnie w ten sam sposób wprowadź elektrodę o przeciwnej polaryzacji równolegle do pierwszej w ten sam mięsień. Elektroda ta powinna znajdować się w odległości od jednego do dwóch milimetrów od pierwszej elektrody. Powtórz procedurę, aby wprowadzić elektrody do mięśnia czworobocznego, znajdującego się bezpośrednio przed mięśniem skalenowym, jak pokazano tutaj.

Następnie sprawdź, czy przewody są stabilnie zamocowane i czy pozostawiono w nich wystarczający luz, aby zwierzę mogło wykonywać ruchy ciała bez naciągania przewodów. Następnie delikatnie usuń taśmę mocującą przednią kończynę. Odsuń poduszkę tłuszczową z powrotem nad mięsień i użyj jej do przykrycia wprowadzonych przewodów.

Następnie delikatnie przybliż płaty skóry, tak aby linie nacięcia pokrywały się. Ściśnij fragmenty płatów skóry za pomocą pęsety zakrzywionej i nałóż cienką linię kleju cyjanoakrylowego wzdłuż tego miejsca. Wstrzyknij 0,1 milliliters karprofenu podskórnie, aby złagodzić ból pooperacyjny, gdy zwierzę wciąż znajduje się pod wpływem znieczulenia.

Wyjmij zwierzę z stożka nosowego i umieść je w czystej klatce w wstępnie ogrzanym inkubatorze, aż zwierzę się obudzi i zacznie dobrowolnie poruszać się po klatce. Umieść mysz w komorze do pletyzmografii na co najmniej jedną godzinę, aby mogła się zaaklimatyzować przed rejestracją EMG i pletyzmografii. Przed rozpoczęciem rejestracji, lecz po kalibracji, włącz nadajnik, przykładając silny magnes w odległości do jednej cali od zaimplantowanego zwierzęcia.

Czerwona lampka na przednim panelu odbiornika wskazuje, kiedy nadajnik jest włączony. Rozpocznij akwizycję, korzystając z menu rozwijanego o nazwie Acquisition i wybierając opcję Start Acquisition. Chociaż czas trwania nagrania może różnić się w zależności od eksperymentu, typowe nagranie pletyzmograficzne i EMG trwa od jednej do trzech godzin.

Po zakończeniu akwizycji wyłączyć nadajnik za pomocą magnesu i umieścić zwierzę z powrotem w klatce domowej. Poniżej przedstawiono zapisy WBP i EMG mięśni skalenów oraz mięśnia czworobocznego u myszy SOD-1(G93A) w fazie presymptomatycznej w 98. dniu po urodzeniu. Do analizy wykorzystuje się okresy, w których zwierzę znajduje się w spoczynku.

Czerwona ramka przedstawia zapisy EMG w spoczynku bez występowania serii wyładowań EMG, co jest charakterystyczne dla myszy presymptomatycznej. Zapisy poza czerwoną ramką wykazują duże i nieregularne piki w zapisach pletyzmografii, aktywności mięśniowej oraz zapisach EMG, co jest typowe podczas poruszania się zwierzęcia. Obraz przedstawia zapisy WBP oraz EMG mięśnia czworobocznego u symptomatycznej myszy SOD-1(G93A) w 126. dniu po urodzeniu, w momencie wystąpienia serii wyładowań EMG podczas spoczynku myszy.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura może zająć 35 minut. Po zastosowaniu tej metody zwierzęta z implantami mogą zostać wykorzystane do oceny skuteczności farmaceutyków zwiększających aktywność dodatkowych mięśni oddechowych w modelach chorób lub urazów.