Protokół śledzenia wideo w celu przesiewania środków chemicznych odstraszających pszczoły miodne

Ogólnym celem niniejszej procedury jest ocena chemicznych substancji odstraszających pszczoły miodne. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu entomologii, takie jak to, które związki chemiczne modyfikują zachowanie pszczół miodnych, oddalając je od źródła pożywienia. Główną zaletą tego protokołu jest zapewnienie prostego podejścia do przesiewowej oceny substancji odstraszających pszczoły miodne w sposób stosunkowo szybki i łatwy.

Aby przygotować kostkę z cukru i agarozy dla grupy kontrolnej, wlej lekko schłodzony roztwór cukru i agarozy do formy z łódki wagowej. W przypadku grupy z repelentem, dodaj pożądaną ilość związku do lekko schłodzonego roztworu agarozy. W niniejszej demonstracji zastosowano końcowe stężenie 1% DEET.

Zawirować kolbę, aby wymieszać związek, a następnie przelać roztwór do formy w postaci łódki wagowej. Po schłodzeniu kostek cukrowo-agarozowych wyjąć stwardniałe kostki z form i umieścić je w plastikowym pojemniku z nawilżonym ręcznikiem papierowym. Pojemniki należy umieścić w lodówce w celu przechowywania.

W oprogramowaniu do śledzenia przejdź do ustawień eksperymentu w pasku eksploratora eksperymentów, który znajduje się po lewej stronie ekranu. Upewnij się, że wybrano odpowiednią kamerę i że nagranie wideo jest wycentrowane na arenach w szalkach Petriego. Jeśli nagranie wideo wymaga wycentrowania, przejdź do ustawień kamery, w sekcji sterowania obszarem zainteresowania, i wybierz opcje Center X oraz Center Y.

W ustawieniach eksperymentu (experiment settings) zmień liczbę aren na 16. W sekcji śledzonych cech (tracked features) wybierz detekcję punktu centralnego (center point detection). Następnie wybierz ustawienia areny (arena settings), aby skonfigurować arenę wymaganą do przeprowadzenia analizy.

Umieść 16 szalek Petriego w układzie cztery na cztery na blacie lightboxa umieszczonego pod kamerą. W ustawieniach areny (arena settings) użyj przycisku przechwytywania tła (grab background), znajdującego się w panelu narzędzi po prawej stronie, aby zrobić zdjęcie 16 szalek Petriego. Obraz ten posłuży jako szablon do skonfigurowania areny.

Wybierz opcję tworzenia elipsy z paska narzędzi znajdującego się na górze ekranu ustawień areny i utwórz okrąg o średnicy odpowiadającej jednej z szalek Petriego na pobranym obrazie. Umieść marker areny jeden wewnątrz okręgu. Następnie wybierz grupę stref jeden, znajdującą się pod areną jeden w panelu narzędzi po prawej stronie.

Wybierz narzędzie tworzenia prostokąta z paska narzędzi u góry ekranu. Za pomocą tego narzędzia utwórz kwadrat o wymiarach 30 na 30 pikseli. Następnie umieść go w środku koła utworzonego w poprzednim kroku.

Wybierz opcję dodaj strefę z górnego paska narzędzi, a następnie kliknij w środku kwadratu. Przesuń strefę o jeden znacznik tak, aby znajdowała się w kwadracie. Następnie wybierz arenę jeden w panelu narzędzi po prawej stronie, a następnie kliknij duplikuj całą arenę.

Z menu rozwijanego wybierz wszystkie pozostałe areny, a następnie kliknij OK. Przesuń zduplikowane konfiguracje aren do pozostałych szalek Petriego na przechwyconym obrazie. Następnie wybierz arenę pierwszą i zaznacz kalibrację skali na górnym pasku narzędzi. Narysuj linię kalibracyjną w poprzek średnicy szalki Petriego areny pierwszej.

Zmień pomiar średnicy na 9 cm. Wybierz opcję walidacji ustawień areny w panelu narzędzi po prawej stronie. Następnie wybierz ustawienia detekcji na pasku sterowania po lewej stronie.

Wybierz ustawienia detekcji jeden, a następnie wybierz skalę szarości w menu rozwijanym znajdującym się w pasku narzędzi po prawej stronie. W sekcji detekcji ustaw zakres od 0 do 83. Kliknij prawym przyciskiem myszy ustawienia detekcji i utwórz nowe ustawienia o nazwie Ustawienia Detekcji Dwa.

Upewnij się, że skala szarości jest nadal zaznaczona, ale nie zmieniaj pozostałych parametrów. Wybierz listę prób w eksploratorze eksperymentów i kliknij „add variable” w górnym pasku narzędzi. Nazwij zdefiniowaną przez użytkownika zmienną jako Treatment.

Wybierz pasek rozwijanej listy wartości predefined values w kolumnie user defined treatment i dodaj control oraz treatment jako wartości predefiniowane. Kliknij przycisk add trials znajdujący się na górnym pasku narzędzi i dodaj dwie próby. Następnie dla każdej areny wybierz, czy jest to arena kontrolna (control arena), czy arena badawcza (treatment arena).

Następnie w panelu eksploratora eksperymentów wybierz profil danych. W kolumnie po lewej stronie wybierz czynnik „treatment”, znajdujący się pod nagłówkiem zdefiniowanych przez użytkownika zmiennych niezależnych. Spowoduje to dodanie pola filtra do obszaru z schematem blokowym.

Wybierz C w oknie wyskakującym, a następnie umieść nowo utworzony filtr pomiędzy polem startowym a polem wyniku. Strzałki schematu blokowego powinny dostosować się tak, aby wskazywały od pola startowego do filtra, a następnie do pola wyniku. Powtórz ten krok, jednak tym razem wybierz T jako filtr, a następnie wybierz wynik w sekcji elementów wspólnych.

Przenieś nowo utworzone bloki do obszaru schematu blokowego i połącz je strzałkami, a następnie zapisz plik. Uruchom program śledzenia wizualnego i otwórz zapisany plik eksperymentalny utworzony dla tego testu. Wybierz drugi zestaw ustawień detekcji.

Następnie umieść kontrolne kostki z agarozy z cukrem w centrach ośmiu z 16 płytek Petriego. Powtórz tę procedurę z kostkami z agarozy z cukrem i związkiem w pozostałych ośmiu płytkach. Za pomocą pęsety wyjmij jedną pszczołę miodną z plastikowego pudełka i umieść ją w jednej z kontrolnych płytek Petriego.

Powtórz ten krok dla pozostałych 15 szalek Petriego. Umieść wszystkie szalki na podświetlanym blacie. Oświetl blat od dołu za pomocą matrycy diod LED ustawionych na widmo czerwone i ustaw je tak, aby obszary detekcji areny pasowały do areny w każdej z szalek Petriego.

Otocz cały pojemnik oraz kamerę czarną plastikową folią, aby wyeliminować światło zewnętrzne i zmniejszyć liczbę cieni wewnątrz aren. Po ustawieniu szalek Petri upewnij się, że wybrane są ustawienia detekcji nr 1. Na tym etapie oprogramowanie do śledzenia wizualnego powinno wykrywać wyłącznie pszczoły miodne znajdujące się w arenach w szalkach Petri.

Następnie wybierz opcję akwizycji z eksploratora eksperymentów. Naciśnij zielony przycisk start trial w oknie wyskakującym sterowania akwizycją po prawej stronie, aby rozpocząć rejestrację. Przeprowadź analizę przez 10 minut, a następnie kliknij czerwony przycisk stop trial w oknie sterowania akwizycją, aby zatrzymać rejestrację.

Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki wpływu DEET na zachowanie żerowania poszczególnych pszczół miodnych. Osobniki eksponowane na kostki kontrolne spędziły w strefie żerowania średnio 343 sekundy, w porównaniu do 16 sekund w przypadku osobników eksponowanych na kostki z DEET. Tutaj zaprezentowano reprezentatywne wyniki wpływu dwóch różnych związków na zachowanie żerowania poszczególnych pszczół miodnych.

Osobniki narażone na związek niedziałaący odstraszająco spędziły w strefie żerowania średnio 282 sekundy, w porównaniu do grupy kontrolnej, która spędziła tam około 352 sekundy. Narażenie na związek o działaniu odstraszającym skutkuje tym, że osobniki spędzają w strefie żerowania znacznie mniej czasu, około 23 sekundy, w porównaniu do grupy kontrolnej, która spędziła w tej strefie średnio 493 sekundy.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura ta może zająć 20 minut. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest, aby przygotować wszystko z wyprzedzeniem i poddać pszczoły miodne głodzeniu przez odpowiedni czas. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak określić wpływ związku wprowadzonego do źródła pokarmu na poszczególne pszczoły miodne przy użyciu oprogramowania do śledzenia wideo.

Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy w polu bliskim i w terenie, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące wpływu związku na poziomie kolonii. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu entomologii do eksploracji nowych substancji chemicznych i ich wpływu na zachowania żywieniowe pszczół miodnych. Należy pamiętać, że praca ze związkami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak stosowanie środków ochrony indywidualnej.