Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie ukierunkowanej ablacji komórek nabłonka nerek Danio przebrzmiałego w celu modelowania uszkodzenia i naprawy nefronów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji organów, a w szczególności nerek, takie jak: jakie są główne procesy komórkowe zaangażowane w regenerację, jaki jest zakres plastyczności przetrwałych tkanek i wiele innych.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na precyzyjną czasowo-przestrzenną kontrolę urazu, a także na możliwość dostosowania stopnia uszkodzenia. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę ostrego uszkodzenia nerek, ponieważ umożliwia ona precyzyjną przestrzenną i czasową ocenę procesów komórkowych i molekularnych biorących udział w uszkodzeniu i regeneracji komórek nerek. Aby rozpocząć, należy uzyskać zarodki poprzez skrzyżowanie fluorescencyjnych Zebrafish z GFP w nerkach.

Przez 24 godziny po zapłodnieniu należy przechowywać embriony w roztworze E3 w temperaturze 28.5 degree celsius. Następnie należy zastąpić medium E3 roztworem E3 zawierającym 0.003% PTU. Embriony należy zwrócić do inkubatora na sześć lub więcej dni, po których nerki powinny osiągnąć dojrzałość.

Aby unieruchomić danio przeżebrowanego do obrazowania na żywo, należy przygotować 1% do 2% agarozę niskotopliwą z roztworem trigainy o stężeniu 0,2 mg/ml. Przed użyciem plastikowej lub szklanej pipety do przeniesienia zarodka do roztworu należy upewnić się, że roztwór agarozy z trigainą jest wystudzony. Następnie, za pomocą pipety transferowej, należy pobrać larwę wraz z agarozą i umieścić ją na środku szalki o średnicy 35 mm.

Szybko rozprowadź agarozę zawierającą Zebrafish, aby równomiernie pokryć dno naczynia. Następnie za pomocą szklanej sondy ustaw larwę do fotoablacji i obrazowania w taki sposób, aby interesujący segment nerki był prostopadły do drogi wiązki, podczas gdy segment przeciwległy znajdzie się poza zasięgiem wiązki lasera. Prawidłowe ustawienie Zebrafish jest kluczowe dla kolejnych etapów obejmujących ablację laserową.

Zaleca się zastosowanie odpowiedniej techniki, aby upewnić się, że larwy pozostają w pozycji prostopadłej w agarozie. Przykryj szalkę Petriego, aby zminimalizować parowanie, i pozostaw agarozę do zastygnięcia na około 15 minut. Po skonfigurowaniu mikroskopu konfokalnego w orientacji pionowej, zgodnie z protokołem tekstowym, umieść szalkę Petriego z larwą na szkiełku przedmiotowym i użyj plasteliny, aby ją ustabilizować.

Następnie umieść przesuwną szalkę Petriego na stole mikroskopu. Po tym dodaj 3 mL roztworu obrazującego. Używając obiektywu imersyjnego, powoli podnoś stół, upewniając się, że obiektyw jest lekko nachylony, aby zapobiec uwięzieniu pęcherzyków powietrza w drodze wiązki.

Gdy soczewka dotknie roztworu pod kątem, wycentruj ją tak, aby znajdowała się w polu widzenia w obszarze zarodka. Następnie, korzystając z fluorescencyjnego źródła światła, zlokalizuj interesujący segment, a następnie ustaw ostrość na gałązkę powierzchowną, aby przygotować ją do uszkodzenia. Gałązki powierzchowne wybrano w celu zminimalizowania rozpraszania światła.

W oprogramowaniu mikroskopu przejdź do widoku, sterowania akwizycją (acquisition control), C2plus compact GUI. Ustaw czas przebywania piksela (pixel dwell time) na 1,9 microseconds, rozmiar klatki na 512 by 512 pixels, a wielkość otworu pinhole na 90 microns. Ustaw intensywność lasera 405 nanometer na zero, a intensywność lasera 488 na niską wartość.

Podczas korzystania z lasera o długości fali 488 nanometrów, kliknij opcję scan w interfejsie oprogramowania. Znajdź segment zainteresowania, który jest prostopadły do drogi wiązki i który jest dobrze zwizualizowany dzięki silnej fluorescencji GFP. Po zidentyfikowaniu tego obszaru przejdź do ROI, wybierz draw elliptic ROI i wyznacz obszar zainteresowania.

Następnie przejdź do widoku (view), kontroli akwizycji (acquisition controls), obszaru skanowania C2plus (C2plus scan area) i wybierz obszar skanowania pasma (band scan area); w tym interfejsie pojawi się prostokątna maska. Za pomocą kursora ręcznie zdefiniuj prostokątny obszar skanowania tak, aby obejmował segment przeznaczony do ablacji laserowej. Kliknij prawym przyciskiem myszy w obszarze maski, aby zatwierdzić wybór.

Używając wyłącznie lasera 488 nm do aktywacji GFP, rozpocznij pomiar czasu podczas monitorowania kanału zielonego. Upewnij się, że intensywność lasera 488 nm jest stosunkowo niska. Zmierz średnią intensywność GFP w obszarze zainteresowania, wybierając opcję pomiaru czasu (measure, time measurement).

Użyj karty wykresu lub danych, aby monitorować średnie poziomy intensywności w obrębie ROI. Wykorzystując laser fioletowy, wywołaj uszkodzenie komórek nerek, zwiększając intensywność do 100% poprzez przesunięcie suwaka sterowania mocą lasera maksymalnie w prawo. W karcie wykresu obserwuj wykres liniowy lub przejdź do karty danych, aby śledzić wartości liczbowe intensywności GFP, i czekaj, aż spadną one do pożądanego poziomu.

Na przykład 50% wartości bazowej. Gdy intensywność GFP w obrębie eliptycznego ROI spadnie do pożądanego poziomu, natychmiast zmniejsz intensywność fioletowego lasera do zera w panelu sterowania oprogramowania, przesuwając suwak mocy lasera całkowicie w lewo. Na koniec wyznacz nową wartość bazową fluorescencji GFP.

Jak pokazano na tej rycinie, po naświetleniu laserem o długości fali 405 nanometrów fluorescencja GFP nadal znika sukcesywnie w poszczególnych komórkach. W 220 minucie cały segment poddany ablacji traci 100% pozytywności na GFP. Wynika to z śmierci komórkowej, a nie z obniżenia ekspresji GFP, co potwierdza pojawienie się czerwonych fluorescencyjnych jąder pozytywnych pod kątem jodku propidyny w komórkach tracących pozytywność na GFP.

Obrazy te demonstrują, że poprzez zmianę początkowej ekspozycji możliwe jest precyzyjne dostosowanie stopnia uszkodzenia oraz odpowiedzi uszkodzonego nabłonka. Przy początkowym fotowybielaniu GFP na poziomie 10% do 20% praktycznie nie obserwuje się zmniejszenia pozytywności GFP pięć godzin po uszkodzeniu. Fotowybielanie na poziomie 50% i 60% prowadzi do całkowitego zaniku GFP po pięciu godzinach, natomiast wybielanie na poziomie 30% i 40% daje wyniki pośrednie, przy czym szacunkowa śmiertelność na poziomie 50% jest obserwowana przy fotowybielaniu wynoszącym około 35%.

Potwierdza to barwienie jodkiem propidynyum, gdzie fotowybielanie na poziomie 20% skutkuje niemal całkowitym brakiem barwienia jodkiem propidynyum w 100 minucie po ablacji. Natomiast fotowybielanie na poziomie 50% prowadzi do utrzymującego się pozytywnego barwienia jodkiem propidynyum w ablacyjnym nabłonku po 60 minutach. Z kolei fotowybielanie na poziomie 30% i 40% prowadzi do pośredniego stopnia wbudowania jodku propidynyum.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedura zajmuje 30 minut. Należy pamiętać, że praca z laserami i odczynnikami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak unikanie patrzenia w wiązkę lasera oraz stosowanie rękawiczek podczas pracy z chemikaliami. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak mikroskopia time-lapse, barwienie immunofluorescencyjne i inne, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania mające na celu analizę uszkodzenia i naprawy nerek na poziomie komórkowym i molekularnym.

Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom w dziedzinie regeneracji nerek. Celem jest zbadanie roli zbiorowej migracji komórek i naprawy nerek po urazie u rybek Danio pręgowany. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze rozumieć, jak wykorzystać mikroskopię konfokalną do wywołania urazu w konkretnych segmentach nerek u transgenicznych larw i embrionów Zebrafish GPF.