Name: Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-03T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: Poznaj precyzyjną ablację laserową komórek nerkowych u larw Danio rerio do modelowania ostrego uszkodzenia nerek. Ta metoda umożliwia kontrolowane badanie mechanizmów regeneracji nefronów in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Dr. Iainowi Drummondowi i Dr. Vladimirowi Korzhowi za udostępnienie transgenicznych linii nerek GFP. Chcielibyśmy również podziękować NYITCOM za udostępnienie niezbędnych zasobów do przeprowadzenia tych prac. Badanie to było częściowo wspierane przez granty: K08DK082782, R03DK097443 (NIH) oraz HSCI Pilot Grant (AV).

To badanie zostało przeprowadzone zgodnie z zaleceniami zawartymi w Przewodniku dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych National Institutes of Health. Protokół został zatwierdzony przez NYIT College of Osteopathic Medicine Institutional Animal Care and Use Committee (NYITCOM IACUC). Wszystkie operacje i eksperymenty in vivo przeprowadzano w znieczuleniu tricaine i dołożono wszelkich starań, aby zminimalizować cierpienie.
1. Pozyskiwanie i utrzymywanie zarodków
<ol>
	<li>Uzyskuj zarodki przez skrzyżowanie nerek GFP fluorescencyjnego danio pręgowanego. 
	UWAGA: Przykłady znakowanych fluorescencyjnie linii transgenicznych danio pręgowanego wymieniono w Tabeli 1.</li>
	<li>Przechowywać zarodki w temperaturze 28,5 °C w roztworze E3 przez 24 godziny po zapłodnieniu.</li>
	<li>Po 24 godzinach zastąpić pożywkę roztworem E3 zawierającym 0,003% 1-fenylo-2-tiomocznika (PTU). 
	UWAGA: PTU jest stosowany, ponieważ blokuje zależne od tyrozynazy etapy melanogenezy, a tym samym zapobiega pigmentacji. W tym przypadku rozwiązanie to określa się mianem E3-PTU.</li>
	<li>Wyhodować zapłodnione zarodki w temperaturze 28,5 °C, aż osiągną >6 dpf, po czym nerki osiągną dojrzałość. 
	UWAGA: Najlepiej używać larw w oknie 7-9 dpf.</li>
	<li>Używając fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego przy 40-krotnym powiększeniu i zielonych filtrów emisyjnych fluorescencji, wybierz larwy z jasną fluorescencją GFP nerek.</li>
</ol>
2. Montaż danio pręgowanego do obrazowania na żywo
<ol>
	<li>W przypadku fotoablacji zarodków przed 3 dpf, usuń kosmówkę z każdego niewyklutego danio pręgowanego przed zamontowaniem danio pręgowanego do obrazowania.
	<ol>
		<li>Ręcznie dechorynować kleszczami (preferowane) lub zastosować obróbkę chemiczną mieszaniną proteaz. 
		UWAGA: Dechorynacja pozwala na uzyskanie najlepszych wyników obrazowania.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wypłucz resztki kosmówki na szalce Petriego za pomocą roztworu E3-PTU i ponownie napełnij naczynie E3-PTU.</li>
	<li>Przygotuj 1-2% agarozę o niskiej temperaturze topnienia (LMP) z 0,2 mg/ml roztworu tricainy, aby zamontować danio pręgowanego do fotoablacji nerek i obrazowania na żywo.
	<ol>
		<li>Jeśli agaroza LMP została już wcześniej przygotowana, podgrzej ją ponownie w kuchence mikrofalowej, aby się rozpuściła.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po przygotowaniu agarozy LMP umieść plastikową szalkę Petriego o średnicy 35 mm na mikroskopie preparacyjnym. Umieść w pobliżu wyciągniętą szklaną sondę, aby prawidłowo zorientować znieczulone larwy. 
	UWAGA: Ważne jest, aby wykonać ten krok w odpowiednim czasie i mieć wszystko na swoim miejscu, ponieważ zarodki muszą być zorientowane, zanim agaroza zestalą się w ciągu około 1-3 minut.</li>
	<li>Przed przeniesieniem zarodka do agarozy należy upewnić się, że agaroza jest chłodna (tj. ma temperaturę zbliżoną do temperatury ciała). Użyj plastikowej lub szklanej pipety transferowej, aby umieścić zarodek w schłodzonym, stopionym roztworze agarozy i trikainy. 
	UWAGA: Dzieje się tak, ponieważ agaroza, która jest zbyt gorąca, może być szkodliwa dla zarodka, prowadząc do zatrzymania akcji serca lub śmierci</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej ponownie narysuj zarodek w roztworze agarozy i umieść zarodek/larwę na środku szalki o średnicy 35 mm.</li>
	<li>Szybko rozprowadź agarozę zawierającą zarodek/larwę, aby równomiernie pokryć dno szalki o średnicy 35 mm; najlepsza objętość agarozy do użycia to ~1-1,1 ml.</li>
	<li>Użyj szklanej sondy, aby ustawić zarodek w najlepszej możliwej pozycji do fotoablacji i obrazowania. 
	UWAGA: Film 1 pokazuje najlepszą orientację zarodka/larwy do jednostronnej fotoablacji. Ten krok jest najbardziej wrażliwy na czas i powinien być wykonany szybko, zanim agaroza zacznie żelować, ponieważ każda próba zmiany orientacji ryby po rozpoczęciu żelowania jest szkodliwa.
	<ol>
		<li>Ustaw larwę tak, aby interesujący ją segment nerki był prostopadły do toru wiązki, podczas gdy segment przeciwległy był z dala od wiązki laserowej (patrz film 1). 
		UWAGA: Można to osiągnąć, obracając larwę, jak pokazano na filmie 1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odczekaj około 15 minut, aż agaroza stężeje. Przykryj szalkę Petriego, aby zminimalizować parowanie. Gdy agaroza zastygnie, zarodek lub larwa jest gotowa do fotoablacji.</li>
</ol>
3. Ablacja laserowa
<ol>
	<li>Obsługa systemu obrazowania konfokalnego. 
	UWAGA: W przypadku korzystania z referencyjnej platformy obrazowania (patrz tabela materiałów), zalecane ustawienia obejmują 40-krotne powiększenie, soczewkę zanurzającą w wodzie 0,8 NA oraz pierwszy zestaw zwierciadła dichroicznego umożliwiający oświetlenie próbki zarówno 488, jak i 405 nm. Detekcja powinna być wykonana na kanale zielonym.</li>
	<li>Umieść naczynie zawierające unieruchomionego danio pręgowanego na stoliku konfokalnym. 
	UWAGA: Ta procedura jest zoptymalizowana pod kątem konfiguracji pionowej przy użyciu soczewki do zanurzania w wodzie 40-60X. Powinna jednak istnieć możliwość modyfikacji procedury dla mikroskopu odwróconego.</li>
	<li>W konfiguracji pionowej umieść szalkę Petriego zawierającą zarodek na szkiełku mikroskopowym i utrzymuj ją na miejscu za pomocą plasteliny (np. plasteliny). Umieść szkiełko podstawowe z szalką Petriego na stoliku mikroskopu konfokalnego.</li>
	<li>Dodać 3 ml roztworu do obrazowania E3-PTU (patrz krok 1.3) z 0,2 mg/ml trikainy. 
	UWAGA: Roztwór do obrazowania można również dodać bezpośrednio przed umieszczeniem szkiełka na stoliku. Dodawanie roztworu do obrazowania powinno odbywać się bardzo ostrożnie, aby agaroza nie unosiła się z dna naczynia.</li>
	<li>Przełącz na soczewkę do zanurzania w wodzie (40 lub 60X). Powoli podnieś stolik, upewniając się, że obiektyw jest lekko pochylony, aby zapobiec uwięzieniu powietrza na ścieżce wiązki. Gdy soczewka dotknie roztworu pod kątem, wyśrodkuj ją tak, aby znalazła się w polu widzenia zarodków.</li>
	<li>Znajdź interesujący Cię segment za pomocą fluorescencyjnego źródła światła. Umieść gałąź docelową w uszkodzeniu, aby zminimalizować rozpraszanie światła (patrz Film 1). 
	UWAGA: W kolejnych krokach wykorzystywane jest oprogramowanie referencyjne (patrz tabela materiałów), ale procedurę można łatwo dostosować do innych platform.</li>
	<li>Otwórz oprogramowanie. Przejdź do "Widok"| "Kontrola przejęcia"| "C2plus Compact GUI" i ustaw "czas zatrzymania piksela" na "1,9 μs", "rozmiar ramki" na "512 x 512 pikseli" i "rozmiar otworka" na "90 μm". Ustaw "Intensywność lasera 405 nm (lub 408 nm w niektórych systemach)" na zero, a "Intensywność lasera 488" na "niską" (najlepiej <1%). Dostosuj "wzmocnienie", aby uzyskać dobry zakres dynamiki, ale nie nasycić sygnału. 
	UWAGA: Te wartości nie są krytyczne i są używane w celu zapewnienia spójności. Użycie lasera o długości fali 405 nm spowoduje wzrost fluorescencji GFP. Aby uniknąć nasycenia sygnału podczas fotowybielania (krok 3.11), wartość wzmocnienia sygnału powinna być przeskalowana w dół na kanale zielonym. Wzmocnienie kanału niebieskiego można pozostawić na poziomie zerowym, ponieważ nie jest ono używane do próbkowania.</li>
	<li>Kliknij "Skanuj" w interfejsie oprogramowania, aby zeskanować nerkę za pomocą lasera 488 nm. Znajdź interesujący nas segment, który jest prostopadły do ścieżki wiązki i który jest dobrze zobrazowany, z dobrą fluorescencją GFP. Po zidentyfikowaniu tego regionu narysuj obszar zainteresowania za pomocą eliptycznego regionu zainteresowania (ROI).
	<ol>
		<li>Przejdź do "ROI" | "Narysuj eliptyczny ROI." 
		UWAGA: Będzie to wykorzystywane do ciągłego pomiaru średniej intensywności GFP podczas fotowybielania, co pozwoli na podanie precyzyjnej dawki leczenia laserowego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przejdź do "Widok" | "Kontrola pozyskiwania"| "Obszar skanowania C2plus" i wybierz "Obszar skanowania pasmowego". Prostokątna maska pojawi się w tym interfejsie. Ręcznie zdefiniuj prostokątne okno skanowania za pomocą kursora (tj. przeciągnij, zmień rozmiar i obróć maskę), aby pokryć segment przeznaczony do ablacji laserowej. Kliknij prawym przyciskiem myszy w obszarze maski, aby zaakceptować wybór. 
	UWAGA: Skanowany będzie tylko wybrany region.</li>
	<li>Rozpocznij pomiar czasu, monitorując kanał zielony, używając tylko lasera 488 nm do aktywacji GFP. Upewnij się, że intensywność lasera 488 jest stosunkowo niska (~1%). Zmierz średnią intensywność zwykłej praktyki rolniczej w regionie zainteresowania, wybierając opcję "Zmierz" | "Pomiar czasu". Użyj zakładek "Wykres" lub "Dane", aby monitorować średnie wartości intensywności w ROI. 
	UWAGA: Szybkość akwizycji jest definiowana przez czas przebywania pikseli i rozmiar prostokątnego okna ustawiony w kroku 3.9, ale ogólnie pozwala na szybkie monitorowanie sygnału (~2-10 klatek/s).</li>
	<li>Wywołaj uszkodzenie komórek nerkowych za pomocą fioletowego lasera (405 nm), zwiększając intensywność do 100%, przesuwając regulator "mocy lasera" maksymalnie w prawo. Laser o długości fali 488 nm może pozostać aktywny, jeśli jego intensywność jest niska.
	<ol>
		<li>Obserwuj wykres liniowy za pomocą zakładki "Wykres" lub wartości liczbowe intensywności GFP za pomocą zakładki "Dane" i poczekaj, aż spadnie do pożądanego poziomu, na przykład 50% linii bazowej (jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1). 
		UWAGA: Laser o mocy 20 mW został użyty jako część referencyjnego zespołu laserowego (patrz Tabela materiałów); Maksymalna intensywność może się różnić w zależności od systemu. Niższą intensywność można skompensować dłuższą ekspozycją (tj. przy użyciu procentowego wybielania GFP jako miary całkowitego narażenia).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Gdy intensywność GFP w eliptycznym ROI (krok 3.8) spadnie do pożądanego poziomu, natychmiast zmniejsz intensywność fioletowego (405 nm) lasera do "0", przesuwając suwak "moc lasera" maksymalnie w lewo w panelu sterowania oprogramowania.
	<ol>
		<li>Uzyskać nową linię bazową fluorescencji GFP. Potwierdź ablację, uzyskując stosunek X/Y. 
		UWAGA: Zobacz Rysunek 1B; Y = średnia intensywność przed ablacją i X = średnia intensywność po ablacji, przy użyciu średnio 4 kolejnych próbek w ramach ROI. Dokładny docelowy stosunek (50%, 60% itd.) zależy od wielkości obrażeń, które są pożądane w danym eksperymencie.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Mikroskopia poklatkowa z barwieniem jodkiem propidyny
<ol>
	<li>Zastosuj ogólne rozważania dotyczące upływu czasu (opisane w poprzednim badaniu15), aby zobrazować barwienie jodkiem propidyny jako korelat uszkodzenia komórek nerkowych po fotoablacji.</li>
	<li>Wstępnie inkubować larwy w 30 μM roztworze jodku propydu (1% DMSO w E3-PTU) przez 3 godziny przed zatopieniem i fotoablacją, jak opisano odpowiednio w krokach 2 i 3.7. 
	UWAGA: W agarozie ani roztworze do obrazowania nie jest wymagany dodatkowy jodek propidyny.</li>
	<li>Wywołać segmentowe uszkodzenie nerek, jak opisano w krokach 3.1-3.12.</li>
	<li>Uzyskaj stosy obrazów poklatkowych, jak opisano w poprzednim badaniu14, używając lasera 488 nm (GFP) i lasera 461 nm (jodek propidy, PI). 
	UWAGA: Te dwa kolory są nakładane na stosy konfokalne w celu skorelowania zaniku GFP i pojawienia się barwienia jodkiem propidyny.</li>
	<li>Ustaw parametry uzyskiwania stosów obrazów poklatkowych w następujący sposób: grubość wirtualnego wycinka = 4 μm, interwał stosu z = 2 μm, czas przebywania pikseli = 1,9 μs, wymiary obrazu = 512 x 512 i uśrednianie = 2, 
	UWAGA: Parametry te pozwalają na ciągłą, trwającą od 10 do 15 minut rejestrację do 4 larw i zapewniają minimalne fotowybielanie próbki.</li>
	<li>Użyj oprogramowania do obrazowania zgodnego z formatem pliku nagrania, aby wizualizować i analizować dane.</li>
</ol>

<ol><li>Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Kidney+Injury%2C+Mortality%2C+Length+of+Stay%2C+And+Costs+In+Hospitalized+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Acute Kidney Injury, Mortality, Length of Stay, And Costs In Hospitalized Patients.</a> J Am Soc Nephrol. 16 (11), 3365-3370 (2005).</li>
<li>Yasuda, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incidence+And+Clinical+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury+Requiring+Renal+Replacement+Therapy+In+Japan%5BTitle%5D)+AND+%22Ther+Apher+Dial%22%5BJournal%5D)">Incidence And Clinical Outcomes of Acute Kidney Injury Requiring Renal Replacement Therapy In Japan.</a> Ther Apher Dial. 14 (6), 541-546 (2010).</li>
<li>Waikar, S. S., Liu, K. D., Chertow, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis%2C+Epidemiology+And+Outcomes+of+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Diagnosis, Epidemiology And Outcomes of Acute Kidney Injury.</a> Clin J Am Soc Nephrol. 3 (3), 844-861 (2008).</li>
<li>Lameire, N., Van Biesen, W., Vanholder, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19041789">Acute Kidney Injury.</a> The Lancet. 372 (9653), 1863-1865 (2008).</li>
<li>Esson, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diagnosis+And+Treatment+of+Acute+Tubular+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Intern+Med%22%5BJournal%5D)">Diagnosis And Treatment of Acute Tubular Necrosis.</a> Ann Intern Med. 137 (9), 744(2002).</li>
<li>Vaidya, V. S., Ferguson, M. A., Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC2742480/">Biomarkers of Acute Kidney Injury.</a> Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 48 (1), 463-493 (2008).</li>
<li>Hentschel, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acute+Renal+Failure+In+Zebrafish%3A+A+Novel+System+To+Study+A+Complex+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Renal+Physiol%22%5BJournal%5D)">Acute Renal Failure In Zebrafish: A Novel System To Study A Complex Disease.</a> Am J Physiol Renal Physiol. 288 (5), F923-F929 (2005).</li>
<li>Cianciolo Cosentino, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intravenous+Microinjections+of+Zebrafish+Larvae+To+Study+Acute+Kidney+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intravenous Microinjections of Zebrafish Larvae To Study Acute Kidney Injury.</a> J Vis Exp. (42), (2010).</li>
<li>Johnson, C. S., Holzemer, N. F., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+Ablation+of+The+Zebrafish+Pronephros+To+Study+Renal+Epithelial+Regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Laser Ablation of The Zebrafish Pronephros To Study Renal Epithelial Regeneration.</a> J Vis Exp. (54), (2011).</li>
<li>Drummond, I. A., Davidson, A. J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/21111220">Zebrafish Kidney Development.</a> Methods Cell Biol. , 233-260 (2010).</li>
<li>Toback, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regeneration+After+Acute+Tubular+Necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Kidney+Int%22%5BJournal%5D)">Regeneration After Acute Tubular Necrosis.</a> Kidney Int. 41 (1), 226-246 (1992).</li>
<li>Witzgall, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localization+of+Proliferating+Cell+Nuclear+Antigen%2C+Vimentin%2C+C-Fos%2C+And+Clusterin+In+The+Postischemic+Kidney.+Evidence+For+A+Heterogenous+Genetic+Response+Among+Nephron+Segments%2C+And+A+Large+Pool+of+Mitotically+Active+And+Dedifferentiated+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Localization of Proliferating Cell Nuclear Antigen, Vimentin, C-Fos, And Clusterin In The Postischemic Kidney. Evidence For A Heterogenous Genetic Response Among Nephron Segments, And A Large Pool of Mitotically Active And Dedifferentiated Cells.</a> J Clin Invest. 93 (5), 2175-2188 (1994).</li>
<li>Bonventre, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dedifferentiation+And+Proliferation+of+Surviving+Epithelial+Cells+In+Acute+Renal+Failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Soc+Nephrol%22%5BJournal%5D)">Dedifferentiation And Proliferation of Surviving Epithelial Cells In Acute Renal Failure.</a> J Am Soc Nephrol. 14 (90001), (2003).</li>
<li>Palmyre, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collective+Epithelial+Migration+Drives+Kidney+Repair+After+Acute+Injury%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Collective Epithelial Migration Drives Kidney Repair After Acute Injury.</a> PLoS ONE. 9 (7), e101304(2014).</li>
<li>Vasilyev, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Live+Imaging+Kidney+Development+In+Zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Live Imaging Kidney Development In Zebrafish.</a> Methods Mol Biol. , 55-70 (2012).</li>
<li>Korzh, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+Compound+Transgenic+Zebrafish+In+Development%3A+A+Tale+of+Green+Fluorescent+Protein+And+Killerred+%5BTitle%5D)+AND+%22Zebrafish%22%5BJournal%5D)">Visualizing Compound Transgenic Zebrafish In Development: A Tale of Green Fluorescent Protein And Killerred .</a> Zebrafish. 8 (1), 23-29 (2011).</li>
<li>Bollig, F., Mehringer, R., Perner, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+and+comparative+expression+analysis+of+a+second+wt1+gene+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Identification and comparative expression analysis of a second wt1 gene in zebrafish.</a> Dev Dyn. 235 (2), 554-561 (2006).</li>
<li>Liu, Y., Pathak, N., Kramer-Zucker, A., Drummond, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+controls+the+differentiation+of+transporting+epithelia+and+multiciliated+cells+in+the+zebrafish+pronephros%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Notch signaling controls the differentiation of transporting epithelia and multiciliated cells in the zebrafish pronephros.</a> Development. 134 (6), 1111-1122 (2007).</li>
<li>Diep, C. Q., Ma, D., Deo, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470 (7332), 95-100 (2011).</li>
<li>Zhou, W., Boucher, R. C., Bollig, F., Englert, C., Hildebrandt, F. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20810610">Characterization of mesonephric development and regeneration using transgenic zebra fish.</a> Am J Physiol. 299 (5), F1040-F1047 (2010).</li>
<li>Fisher, S., Grice, E. A., Vinton, R. M., Bessling, S. L., McCallion, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conservation+of+RET+regulatory+function+from+human+to+zebrafish+without+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Conservation of RET regulatory function from human to zebrafish without sequence similarity.</a> Science. 312 (5771), 276-279 (2006).</li>
<li>Seiler, C., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transgenic+labeling+of+the+zebrafish+pronephric+duct+and+tubules+using+a+promoter+from+the+enpep+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expr+Patterns%22%5BJournal%5D)">Transgenic labeling of the zebrafish pronephric duct and tubules using a promoter from the enpep gene.</a> Gene Expr Patterns. 11 (0), 118-121 (2011).</li>
<li>Lin, H. F., Traver, D., Zhu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+thrombocyte+development+in+CD41-GFP+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Analysis of thrombocyte development in CD41-GFP transgenic zebrafish.</a> Blood. 106 (12), 3803-3810 (2005).</li>
<li>Choo, B. G., Kondrichin, I., Parinov, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+transgenic+Enhancer+TRAP+line+database+%28ZETRAP%29%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Zebrafish transgenic Enhancer TRAP line database (ZETRAP).</a> BMC Dev Biol. 6 (1), 5(2006).</li>
<li>Parinov, S., Kondrichin, I., Korzh, V., Emelyanov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2+transposon-mediated+enhancer+trap+to+identify+developmentally+regulated+zebrafish+genes+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Tol2 transposon-mediated enhancer trap to identify developmentally regulated zebrafish genes in vivo.</a> Dev Dyn. 231 (2), 449-459 (2004).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Należy zauważyć, że całkowita moc lasera różni się w zależności od systemu. Jednak zastosowanie procentowego fotowybielania GFP pozwala na odczyt całkowitej energii dostarczonej do fluorescencyjnej nerki, niezależnie od zmian mocy lasera i skompensowanej długością ekspozycji. Należy jednak pamiętać, że reakcja różnych tkanek na tę metodę fotoablacji jest różna. Nawet w okresie dojrzewania nerek znacznie trudniej jest uzyskać 50% zmniejszenie fluorescencji GFP u młodszych zarodków niż u dojrzałych larw. Te różnice w reakc...

Ostre uszkodzenie nerek (AKI)1,2, które również może być określane jako ostra niewydolność nerek, jest szeroko definiowane jako nagłe upośledzenie funkcji nerek3. Chociaż poziom zrozumienia tego schorzenia znacznie się poprawił na przestrzeni lat, wskaźniki zachorowalności i śmiertelności pozostały wysokie1,2. Obecne leczenie tego schorzenia jest w większości pomocne, ponieważ wyniki wielu badań klinicznych nad terapią lekową były negatywne4,5. Wyjątkowość nerki polega na tym, że mają zdolność do samonaprawy. Dlatego terapia wspomagająca po wczesnym rozpoznaniu AKI jest najlepszym sposobem na ograniczenie zachorowalności6. Jednak trudno jest wcześnie wykryć AKI, a śmiertelność wynosi oszałamiające 50-80% u osób wymagających dializy5. Biorąc pod uwagę zdolność nerek do samonaprawy i brak opcji leczenia tego schorzenia, ważne jest opracowanie metod usprawniających ten proces regeneracji nefronów.
Do badań AKI użyto wielu różnych modeli, które obejmują różne czynniki urazów i modele zwierzęce. Jeśli chodzi o czynniki powodujące uszkodzenie nerek, antybiotyk aminoglikozydowy gentamycyna został użyty jako środek nefrotoksyczny, który prowadzi do AKI7,8. Jednak kilka grup odkryło, że leczenie gentamycyną jest śmiertelne dla zarodka danio pręgowanego9. Powoduje uszkodzenie kanalików, które jest zbyt poważne, aby można było odzyskać zarodek, co utrudnia badanie regeneracji bez pewnego rodzaju interwencji. Modele ssaków, takie jak mysz i szczur, są również uważane za cenne, ale napotykają wiele ograniczeń podczas badania AKI. Być może główną wadą modeli gryzoni jest trudność w wizualizacji nerki gryzonia, a tym samym określeniu precyzyjnych procesów czasoprzestrzennych prowadzących do śmierci i naprawy nabłonka.
Johnson et al. zgłosiły technikę opartą na ablacji laserowej w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek u embrionalnych i larwalnych danio pręgowanego9. Użyli pulsacyjnej ablacji laserowej w celu uszkodzenia nerki po wstrzyknięciu domięśniowym koniugatów dekstranu. Fluorescencja z koniugatów dekstranu pozwala na wizualizację uszkodzeń i regeneracji w nabłonku kanalików9. Model ten pokonuje dwa ograniczenia wymienione powyżej, ale nie pozwala na stopniowanie poziomów uszkodzeń i jest trudny do przeprowadzenia na dużych, arbitralnych grupach komórek.
Opisany tutaj nowy model AKI oparty na ablacji laserowej rozwiązuje wszystkie powyższe ograniczenia. Nerka pronefryczna u larw danio pręgowanego jest dojrzałym, funkcjonującym narządem, który zawiera segmenty podobne do nefronu ssaków, w tym kłębuszek nerkowy, kanaliki proksymalne i dystalne oraz przewód zbiorczy10. Larwy danio pręgowanego są również optycznie przezroczyste, co umożliwia obserwację nerki za pomocą technik fluorescencyjnych. Tak więc danio pręgowany jest cennym modelem AKI in vivo, a larwalna nerka pronefryczna (5-12 dni po zapłodnieniu (dpf)) może być wykorzystana do badania procesów komórkowych i molekularnych związanych z uszkodzeniem i naprawą nerek.
Ten artykuł przedstawia metodę, dzięki której specyficzne segmenty nefronu wyrażające zielone białko fluorescencyjne (GFP) mogą być fotoablalowane za pomocą niskoenergetycznego (w porównaniu do systemu laserowego) fioletowego światła laserowego (405 nm). Fluorescencja GFP pozwala na celowanie w grupę komórek, dzięki czemu zachodzące zmiany są widoczne poprzez obserwację fotowybielania GFP. Ponadto GFP (poprzez pochłanianie światła fioletowego) służy jako pochłaniacz energii w celu nasilenia uszkodzenia w komórkach nerkowych wykazujących ekspresję GFP. Mikroskopia poklatkowa może być następnie wykorzystana do zbadania procesu naprawy. Badania wykazały, że proliferacja komórek, migracja komórek i metaplazja komórek11,12,13 to potencjalne procesy, które mogą odgrywać ważną rolę w naprawie nerek. Jednak względne znaczenie tych procesów i szczegóły ich wzajemnych oddziaływań były trudne do odkrycia ze względu na ograniczenia istniejących modeli AKI. Korzystając z tego nowatorskiego podejścia, udało się wykazać, że migracja komórek odgrywa kluczową rolę w naprawie nerek po ostrym urazie14.

<table><tbody><tr><td>Szalki Petriego, 35 x 10 mm</td><td>Genesee Scientific</td><td>32-103</td><td>Proceduralne użycie: Krok 2.4, 2.7</td></tr><tr><td>Szalki Petriego, 100 x 15 mm</td><td>Midwest Scientific</td><td>910</td><td>Zastosowanie proceduralne: Krok 1</td></tr><tr><td>Kleszcze dechorynacyjne - Mikroskopia elektronowa Sciences Pęseta Dumont 5 Dumostar</td><td>Fischer Scientific</td><td>50-241-57</td><td>Proceduralne zastosowanie: Krok 2.1.1</td></tr><tr><td>Plastikowa kula do pipet transferowych</td><td> Scientific</td><td>135030</td><td>Zastosowanie proceduralne: Krok 2.5, 3.6</td></tr><tr><td>Tricaine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5040-25G</td><td>Użycie proceduralne: Krok 2.3, 3.4</td></tr><tr><td>Agaroza</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP165-25</td><td>Zastosowanie proceduralne: Krok 2.3</td></tr><tr><td>Ciągnięta szklana sonda (wytwarzana ręcznie ze szklanych rurek kapilarnych)</td> <td>Fischer Scientific</td><td>21-1640-2C</td><td>Zastosowanie proceduralne: Krok 2.4</td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy</td><td>Nikon</td><td>SMZ1270</td><td>Procedura użycia: Krok 1.5</td></tr><tr><td>SOLA Light Engine</td><td>Lumencor</td><td>SOLA SM-5-LCR-SB</td><td>Zastosowanie proceduralne: Krok 1.5</td></tr><tr><td>System mikroskopu konfokalnego Eclipse C2 Plus</td><td>Procedura Nikon</td><td></td><td>Zastosowanie: Krok 3</td></tr><tr><td>Rozwiązanie</td><td></td><td></td> <td>1x E3Receptura używana do generowania: 5 mM NaCl, 0,17 mM KCl, 0,33 mM CaCl2 , 0,33 mM MgSO4 Użycie kroku proceduralnego: 1.2, 1.3, 2.2, 2.3</td></tr><tr><td>PTU</td><td>Sigma</td><td>P7629-10G</td><td>Krok proceduralny Zastosowanie: 1.3, 2.2, 3.4, 4.2</td></tr><tr><td>Oprogramowanie NIS</td><td>Elements Nikon</td><td>C2 +</td> <td>Procedura użycia: Krok 3</td></tr><tr><td>Jednostka laserowa</td><td>Agilent</td><td>MLC 400</td><td>Krok proceduralny 3.11</td></tr><tr><td>Propidium Jodek (PI)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>P4170-100MG</td><td>Krok proceduralny Zastosowanie: 4.2</td></tr></tbody></table>

precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Precise Cellular Ablation Approach for Modeling Acute Kidney Injury in Developing Zebrafish

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) jest powszechnym schorzeniem o wysokiej śmiertelności. Dzięki zdolnościom naprawczym nerek możliwe jest przywrócenie prawidłowej funkcji nerek po leczeniu wspomagającym. Jednak lepsze zrozumienie, w jaki sposób śmierć i naprawa komórek nefronów zachodzi na poziomie komórkowym, jest konieczne, aby zminimalizować śmierć komórki i usprawnić proces regeneracji. Przednercze danio pręgowanego jest dobrym systemem modelowym do osiągnięcia tego celu, ponieważ zawiera segmenty anatomiczne, które są podobne do nefronu ssaków. Wcześniej najczęstszym modelem stosowanym do badania uszkodzenia nerek u ryb był farmakologiczny model gentamycyny. Model ten nie pozwala jednak na precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę urazu, a co za tym idzie, trudno jest badać procesy komórkowe i molekularne zaangażowane w naprawę nerek. Aby przezwyciężyć to ograniczenie, w niniejszej pracy przedstawiono metodę, za pomocą której, w przeciwieństwie do podejścia gentamycyny, specyficzny segment nefronu wykazujący ekspresję białka zielonego fuorescencyny (GFP) może być fotoablowany za pomocą fioletowego światła laserowego (405 nm). Ten nowatorski model AKI zapewnia wiele korzyści, których brakuje innym metodom uszkodzenia nabłonka. Jego główne zalety to możliwość "wybrania" poziomu urazu i precyzyjna kontrola czasoprzestrzenna w solidnym modelu zwierzęcym in vivo. Ta nowa metoda może znacznie przyczynić się do pogłębienia wiedzy na temat uszkodzeń nerek i mechanizmów naprawczych.

Należy pamiętać, że protokół ten został z sukcesem zastosowany w kilku transgenicznych liniach nerek GFP, w tym ET(krt8:EGFP)sqet11-9, ET(krt8:EGFP)sqet33-d10 oraz Tg(atp1a1a.4:GFP). Przedstawione tutaj przykładowe wyniki uzyskano przy użyciu linii ET(krt8:EGFP)sqet11-9.
Rysunek 1 przedstawia przykładowy protokół fotoablacji. Średnia intensywność GFP jest monitorowana w obszarze zainteresowania (<st...

Ta praca przedstawia nowy model in vivo segmentowego uszkodzenia nerek przy użyciu transgenicznego danio pręgowanego GFP. Model pozwala na indukcję celowanej ablacji komórek nabłonka nerek w celu ukazania komórkowych mechanizmów uszkodzenia i naprawy nefronów.

Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Acute Kidney Injury (AKI) is a common medical condition with a high mortality rate. With the repair abilities of the kidney, it is possible to restore ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wywołanie ukierunkowanej ablacji komórek nabłonka nerek Danio przebrzmiałego w celu modelowania uszkodzenia i naprawy nefronów. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji organów, a w szczególności nerek, takie jak: jakie są główne procesy komórkowe zaangażowane w regenerację, jaki jest zakres plastyczności przetrwałych tkanek i wiele innych.Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na precyzyjną czasowo-przestrzenną kontrolę urazu, a także na możliwość dostosowania stopnia uszkodzenia. Zastosowania tej techniki rozciągają się na terapię lub diagnostykę ostrego uszkodzenia nerek, ponieważ umożliwia ona precyzyjną przestrzenną i czasową ocenę procesów komórkowych i molekularnych biorących udział w uszkodzeniu i regeneracji komórek nerek. Aby rozpocząć, należy uzyskać zarodki poprzez skrzyżowanie fluorescencyjnych Zebrafish z GFP w nerkach.Przez 24 godziny po zapłodnieniu należy przechowywać embriony w roztworze E3 w temperaturze 28.5 degree celsius. Następnie należy zastąpić medium E3 roztworem E3 zawierającym 0.003% PTU. Embriony należy zwrócić do inkubatora na sześć lub więcej dni, po k

precise-cellular-ablation-approach-for-modeling-acute-kidney-injury

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisujemy technikę mikroiniekcji aminoglikozydu, gentamyciny, do larw zebrafish w 2. dniu po zapłodnieniu (dpf) w celu wywołania ostrego uszkodzenia nerek (AKI). Opisujemy również metodę immunohistochemii całego preparatu, zatapiania w plastiku i sekcjonowania larw zebrafish w celu wizualizacji uszkodzeń wywołanych przez AKI.

Dożylne mikroiniekcje u larw rybiek zebra w celu badania ostrego uszkodzenia nerek

Transplantacja komórek jest kluczową techniką w badaniu regeneracji tkanek oraz w opracowywaniu terapii chorób opartych na komórkach. Przedstawiamy tutaj technikę mikrochirurgiczną, która umożliwia transplantację genetycznie znakowanych komórek bezpośrednio do nerki dorosłych ryb zebrafish.

Transplantacja komórek bezpośrednio do nerki dorosłych danio-ostroskrzelnych

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) u ludzi jest częstym problemem klinicznym spowodowanym uszkodzeniem komórek nabłonkowych tworzących nefrony nerkowe, a AKI wiąże się z wysoką śmiertelnością na poziomie 50-70%1. Po zniszczeniu komórek nabłonkowych nefrony mają ograniczoną zdolność do regeneracji, choć mechanizmy i ograniczenia sterujące tym zjawiskiem pozostają słabo poznane. W niniejszym artykule wideo opisujemy naszą technikę celowanej ablacji laserowej komórek nefronu nerki w nerce zarodka ryby...

Ablacja laserowa pronefry ryby danio w celu badania regeneracji nabłonka nerkowego

Dorosła nerka danio pręgowanego jest doskonałym systemem do regeneracji nerek i badań nad chorobami.  Istotnym aspektem takich badań jest ocena struktury i funkcji nefronu. Protokół ten opisuje kilka metodologii, które można zastosować do oceny składu kanalików nefronowych i oceny wchłaniania zwrotnego przez nerki.

Analiza składu i funkcji nefronów w nerce dorosłego danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy wiarygodną metodę badania regeneracji nerek u dorosłych poprzez wywoływanie ostrego uszkodzenia nerek przez wstrzyknięcie gentamycyny. Pokazujemy, że uraz jest zależny od dawki gentamycyny i temperatury otoczenia, stosując hybrydyzację in situ do znakowania lhx1a+, tworząc nowe nefrony.

Regeneracja nerek u dorosłego danio pręgowanego przez uraz wywołany gentamycyną

Ten artykuł opisuje metodę mechanicznego uszkodzenia naczynia krwionośnego u zarodków danio pręgowanego. Ten model urazów stanowi platformę do badania hemostazy, stanów zapalnych związanych z urazami i gojenia się ran w organizmie idealnie nadającym się do mikroskopii w czasie rzeczywistym.

Mechaniczne uszkodzenie naczynia w zarodkach danio pręgowanego

Opisana tutaj metoda pozwala na analizę poklatkową rozwoju narządów w zarodkach danio pręgowanego za pomocą fluorescencyjnego mikroskopu preparacyjnego, zdolnego do wykonywania sekcji optycznych i prostych strategii dostosowania w celu skorygowania dryfu ogniskowego i płaskiego.

Analiza rozwoju nerek danio pręgowanego z obrazowaniem poklatkowym przy użyciu mikroskopu preparacyjnego wyposażonego w sekcję optyczną

Uszkodzenia nerek spowodowane nefrotoksynami, które obejmują różne leki, od antybiotyków po chemioterapeutyki, mogą powodować złożone zaburzenia, których patogeneza pozostaje nie do końca poznana. Protokół ten pokazuje, w jaki sposób danio pręgowany może być wykorzystany do modelowania chorób tych stanów, co można zastosować do identyfikacji środków renoprotekcyjnych.

Mikroiniekcja nefrotoksyny u danio pręgowanego w celu modelowania ostrego uszkodzenia nerek

Ten protokół opisuje procedury wywoływania ostrego uszkodzenia nerek (AKI) u dorosłych ryb pręgowanych przy użyciu cisplatyny jako środka nefrotoksycznego. Szczegółowo opisaliśmy etapy oceny odtwarzalności techniki oraz dwie techniki analizy stanu zapalnego i śmierci komórek w tkance nerkowej, odpowiednio cytometrię przepływową i TUNEL.

Model ostrego uszkodzenia nerek wywołanego cisplatyną u dorosłych danio pręgowanego

Aby pomóc ocenić mechanizmy molekularne leżące u podstaw regeneracji wątroby u danio pręgowanego za pomocą dróg żółciowych, stworzyliśmy model uszkodzenia wątroby, w którym hepatocyty wykazujące ekspresję nitroreduktazy są genetycznie ablowane po leczeniu metronidazolem.  W tym protokole opisujemy, jak umiejętnie manipulować, monitorować i analizować ablację hepatocytów i regenerację wątroby napędzaną przez żółć.

Ablacja specyficzna dla hepatocytów u danio pręgowanego w celu zbadania regeneracji wątroby napędzanej przez drogi żółciowe

Poznaj precyzyjną ablację laserową komórek nerkowych u larw Danio rerio do modelowania ostrego uszkodzenia nerek. Ta metoda umożliwia kontrolowane badanie mechanizmów regeneracji nefronów in vivo.

Precyzyjne podejście do ablacji komórkowej do modelowania ostrego uszkodzenia nerek u rozwijającego się danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów