Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Niniejszy protokół opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych (micro-TENNs), które są miniaturowymi konstrukcjami trójwymiarowymi składającymi się z długich, wyrównanych pęczków aksonalnych łączących rozproszone populacje neuronów wewnątrz światła hydrożelu rurkowego. Micro-TENNs odwzorowują ogólną anatomię konektomu mózgu na poziomie systemowym, a konkretnie funkcjonalnie podobne grupy neuronów połączone długimi pęczkami aksonalnymi. Ponieważ są one hodowane w celu naśladowania cytoarchitektury szlaków mózgowych, micro-TENNs mogą być stosowane do celowanej rekonstrukcji obwodów neuronalnych utraconych w wyniku urazów lub chorób neurodegeneracyjnych, a także jako biowierne modele w badaniach neurobiologicznych.

Jednym z najtrudniejszych aspektów tego protokołu jest praca z formą o rozmiarze mikronowym, co jest niezbędne, aby umożliwić minimalnie inwazyjne wprowadzenie do mózgu. Należy rozpocząć od ręcznego łamania szklanych rurek kapilarnych na fragmenty o długości od 2 do 2,5 cm, a następnie włożyć jedną igłę do akupunktury do każdego fragmentu. Przenieś 1 mL 3% agarozy w DPBS na powierzchnię pustej szalki Petriego.

Trzymając rurkę kapilarną w wprowadzonej igle, należy umieścić jeden koniec rurki w kontakcie z płynną agarozą, aby wypełniła się ona w wyniku działania kapilarnego. Gdy ciecz przestanie wznosić się w górę, należy wyjąć rurkę kapilarną z cieczy i położyć ją poziomo na powierzchni szalki Petriego. Następnie należy położyć kciuk i palec wskazujący po obu stronach rurki i mocno ją chwycić.

Drugą ręką szybko wyciągnij igłę, podczas gdy kciuk i palec wskazujący zapobiegają wysunięciu się samej mikrokolumny z probówki. Następnie wprowadź igłę o rozmiarze 30G do rurki kapilarnej, aby powoli wypchnąć mikrokolumnę do naczynia zawierającego DPBS. Ostrożnie przenieś jedną mikrokolumnę z DPBS do pustego naczynia za pomocą pęsety precyzyjnej.

Dodaj 10 µL DPBS na górę mikrokolumny za pomocą mikropipety, aby zapobiec wysychaniu. Pracując pod stereomikroskopem, utnij mikrokolumnę mikro skalpelem, aby skrócić ją do pożądanej długości. Następnie użyj precyzyjnej pęsety, aby przenieść przyciętą mikrokolumnę do innej szalki Petri zawierającej DPBS.

Sterylizować mikrokolumny w szalkach Petri zawierających DPBS pod światłem ultrafioletowym przez 30 minut. Za pomocą wiertła wykonać 16 otworów w pokrywce szalki Petri o średnicy 10 cm, tworząc macierz 4 na 4 o wymiarach 4 cm z odstępami 1 cm między otworami. Wewnątrz wyciągu chemicznego odważyć w dolnej części szalki Petri 27 g PDMS oraz 3 g utwardzacza.

Mieszać mikroszpatułką, aby równomiernie rozprowadzić utwardzacz. Następnie przykryć utwardzacz PDMS przebitą pokrywką. Jeden koniec węża podłączyć do portu próżniowego dygestorium, a drugi koniec włożyć do szyjki lejka o odpowiedniej wielkości.

Na końcówkę pipety 1-mililitrowej nałóż gruszkę 1-mililitrową, a następnie wprowadź ją do węża i pociągnij wąż do góry, aż gruszka uszczelni połączenie węża z szyjką lejka. Następnie umieść lejek na przebitej pokrywce szalki i zabezpiecz wąż za pomocą dostępnego stabilnego wspornika. Otwórz zawór próżniowy na pięć minut, aby odessać powietrze i wynieść pęcherzyki powietrza na powierzchnię.

Po pięciu minutach zamknąć zawór, wyjąć lejek i kilkakrotnie uderzyć płytką Petriego o powierzchnię dygestorium, aby rozbić pozostałe pęcherzyki powietrza. Umieścić wydrukowaną w 3D formę z piramidowymi wgłębnikami w każdym z dołków 12-dołkowej płytki hodowlanej, tak aby piramidy były skierowane w górę. Następnie wlać utwardzacz PDMS na wierzch form, aż każdy dołek płytki zostanie wypełniony.

Przenieś przykrytą płytkę do inkubatora na jedną godzinę w temperaturze 60 °C w celu wysuszenia. Po wysterylizowaniu macierzy PDMS w autoklawie i pracując w komorze z laminarnym przepływem powietrza, włóż jedną macierz mikrootworów do każdego dołka sterylnej płytki 12-dołkowej. Aby utworzyć agregaty neuronalne, użyj mikropipety, aby dodać 12 µL zawiesiny komórkowej do każdego mikrootworu macierzy PDMS.

Odwiruj płytkę z prędkością 200 ×g przez pięć minut, aby wymusić agregację komórek na dnie mikroprzestrzeni. Następnie ostrożnie dodaj około dwóch mililitrów pożywki hodowlanej na górną powierzchnię każdej matrycy PDMS, tak aby pokryć wszystkie wysiane mikroprzestrzenie. Inkubuj płytkę od 12 do 24 godzin w temperaturze 37 °C w 5% CO₂.

Aby rozpocząć wytwarzanie rdzenia CEM, należy zmieszać kolagen typu 1, lamininę oraz pożywkę hodowlaną w probówce do mikrocentryfugi i dostosować pH do zakresu od 7,2 do 7,4. Następnie probówkę zawierającą CEM należy umieścić na lodzie. Za pomocą sterylnej pęsety należy przenieść mikrokolumny do pustychy szalek Petri o średnicy 35 lub 60 mm.

Następnie, pracując pod stereomikroskopem, należy użyć końcówki 10 µL dołączonej do końcówki 1000 µL, aby usunąć resztki DPBS oraz pęcherzyki powietrza z lumenu. Szybko należy pobrać mikropipetą od czterech do pięciu µL CEM, a następnie umieścić końcówkę mikropipety na jednym z końców mikrokolumny i podać odpowiednią ilość CEM, aby wypełnić lumen. Aby zapobiec odwodnieniu, należy dodać dwa µL CEM wokół każdej mikrokolumny.

Inkubować mikrokolumny CEM z hydrożelu w szalkach Petriego w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 15 minut. Przystąpić do wysiewania komórek niezwłocznie po inkubacji. Przenieść około 10 do 20 µL pożywki hodowlanej do dwóch wolnych obszarów w szalkach Petriego zawierających mikrokolumny.

Użyj mikropipety, aby pojedynczo zebrać agregaty neuronalne, a następnie przenieś je do szalki Petriego zawierającej konstrukty. Za pomocą pęsety przesuń agregaty do jednej z małych objętości pożywki hodowlanej, aby zachować żywotność komórek. Obserwując preparat pod stereomikroskopem, użyj pęsety, aby umieścić agregat na jednym końcu mikrokolumn w przypadku jednokierunkowych mikro-TENN lub na obu końcach w przypadku architektury dwukierunkowej.

Następnie przenieś zasiane mikrokolumny do drugiej małej puli pożywki hodowlanej, aby uniknąć odwodnienia i zachować żywotność agregatów. Po załadowaniu wszystkich mikrokolumn inkubuj je w temperaturze 37 °C w 5% CO2 przez 45 minut, aby umożliwić przyleganie agregatów do CEM. Po inkubacji sprawdź pod stereomikroskopem, czy agregaty nadal znajdują się na końcach mikrokolumn.

Na koniec, za pomocą pipety ostrożnie zalej szalki Petriego zawierające micro-TENN kulturą pożywką. Umieść szalki w inkubatorze w temperaturze 37°C w 5% CO2 w celu długoterminowej hodowli. Te obrazy w kontraście fazowym przedstawiają jednokierunkowe micro-TENN o długości 2 mm hodowane in vitro do ośmiu dni.

Na tych obrazach widoczne są agregaty neuronalne na końcach mikrokolumny, podczas gdy wyrównane pęczki aksonalne przebiegają przez jej światło. Jak tutaj widać, pęczki aksonalne rozciągają się na niemal całej długości mikrokolumny w piątym dniu in-vitro. W przypadku dwukierunkowych mikro-TENN o długości 5 mm, pęczki aksonalne wypełniają długość mikrokolumny w 5. dniu in-vitro, a architektura ta jest utrzymywana co najmniej do 10. dnia in-vitro.

Następujące dwa obrazy mogą pomóc w rozwiązywaniu problemów z procedurą. Ten obraz przedstawia całkowicie odwodnioną, wysuszoną mikrokolumnę hydrożelową w wyniku całkowitego usunięcia i/lub odparowania DPBS, CEM lub pożywki hodowlanej podczas procesu tworzenia. Ten obraz przedstawia mikrokolumnę, w której światło znajduje się przy ścianie zewnętrznej z powodu braku koncentrycznego wyrównania igły do akupunktury z rurką kapilarną.

Na koniec, ten obraz konfokalny przedstawia dwukierunkowy micro-TENN po 28 dniach in-vitro, w którym jądra komórkowe zostały zabarwione Hoechstem na niebiesko, aksony oznakowano tudge one na czerwono, a Boutony presynaptyczne synapsyną 1 na zielono. Widoczna jest migracja komórek z agregatów wzdłuż szlaków aksonalnych w obecności terminali presynaptycznych, zgodnie z założeniami. Micro-TENNs są samowystarczalnymi, inspirowanymi anatomicznie konstrukcjami, które emulują kluczowe aspekty cytoarchitektury konektomu; w związku z tym micro-TENNs mogą stanowić sposób na zastąpienie utraconych szlaków neuronalnych po implantacji do mózgu.

Kluczowe elementy tej metody obejmują schemat otaczania materiałem biomimetycznym w formie rurek, który umożliwia podłużny wzrost aksonów, oraz metodę agregacji, która zapewnia uzyskanie właściwej cytoarchitektury ciał komórkowych ograniczonych do końców traktów aksonalnych wzdłuż wnętrza. Po opanowaniu tych metod zasady tej techniki można zastosować do budowy mikro-TENN z innymi fenotypami komórek i komponentami biomateriałowymi, w zależności od konkretnego zastosowania.