Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego
May 31st, 2017
Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.
Protokół ten opisuje wytwarzanie sieci neuronowych inżynierii mikrotkankowej lub mikro-TENN, które są miniaturowymi trójwymiarowymi konstruktami składającymi się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych obejmujących dyskretne populacje neuronów w świetle hydrożelu rurkowego. Mikro-TENNY replikują ogólną anatomię konektomu mózgu na poziomie systemów, w szczególności funkcjonalnie podobne grupy neuronów połączone długimi drogami aksonalnymi. Ze względu na to, że są one wstępnie hodowane w celu naśladowania cytoarchitektury ścieżek mózgowych, mikro-TENN mogą być stosowane do celowanej rekonstrukcji obwodów nerwowych utraconych w wyniku urazu lub choroby neurodegeneracyjnej oraz jako modele biofideliczne do badań neurobiologicznych.
Jednym z najtrudniejszych aspektów tego protokołu jest praca z formatem w skali mikronowej, który jest ostatecznie niezbędny, aby umożliwić minimalnie inwazyjne dostarczanie do mózgu. Zacznij od ręcznego rozbicia szklanych kapilar na 2 do 2,5 centymetra i włóż jedną igłę do akupunktury w każdy fragment. Przenieś jeden mililitr trzyprocentowej agarozy w DPBS na powierzchnię pustej szalki Petriego.
Trzymając rurkę kapilarną we wprowadzonej igle, umieść jeden koniec rurki w kontakcie z płynną kałużą agarozy, aby napełnić ją przez działanie kapilarne. Gdy ciecz przestanie się unosić, wyjmij rurkę kapilarną z basenu i umieść ją poziomo na powierzchni szalki Petriego. Następnie umieść kciuk i palec wskazujący po obu stronach rurki i mocno chwyć.
Drugą ręką szybko wyciągnij igłę, podczas gdy kciuk i palec wskazujący zapobiegają wysunięciu się mikrokolumny z tubki. Następnie włóż igłę o rozmiarze 30 do rurki kapilarnej, aby powoli wypchnąć mikrokolumnę do naczynia zawierającego DPBS. Ostrożnie przenieś jedną mikrokolumnę z DPBS do pustego naczynia za pomocą drobnych kleszczyków.
Dodaj 10 mikrolitrów DPBS do górnej części mikrokolumny za pomocą mikropipetowania, aby zapobiec wysuszeniu. Podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym należy uruchomić mikrokolumnę mikroskalpelem, aby skrócić ją do pożądanej długości. Następnie za pomocą cienkich kleszczyków przenieś przyciętą mikrokolumnę na inną szalkę Petriego zawierającą DBPS.
Sterylizować mikrokolumny na szalkach Petriego zawierających DPBS w świetle ultrafioletowym przez 30 minut. Użyj wiertła, aby przebić 16 otworów jako 4-centymetrową matrycę 4 na 4 z 1-centymetrową separacją w pokrywie 10-centymetrowej szalki Petriego. Wewnątrz okapu wyciągowego użyj dolnej części szalki Petriego, aby zważyć 27 gramów PDMS i trzy gramy utwardzacza.
Wymieszaj mikroszpatułką, aby równomiernie rozprowadzić środek. Następnie przykryj utwardzacz PDMS przebitą pokrywką. Podłącz jeden koniec węża do króćca podciśnieniowego dygestoria, a drugi koniec włóż do trzpienia lejka o odpowiedniej wielkości.
Umieść 1-mililitrową gruszkę pipety na 1-mililitrowej końcówce w wężu i pociągnij wąż do góry, aż bańka uszczelni wąż w trzpieniu lejka. Następnie umieść lejek na przebitej pokrywie naczynia i zabezpiecz wąż dostępnym solidnym wspornikiem. Otwórz zawór podciśnieniowy na pięć minut, aby zassać i wyprowadzić pęcherzyki powietrza na powierzchnię.
Po pięciu minutach zamknij zawór, wyjmij lejek i kilkakrotnie uderz szalką Petriego o powierzchnię dygestoria, aby rozerwać pozostałe pęcherzyki powietrza. Umieść piramidalną studnię wydrukowaną w 3D w każdej ze studni w 12-dołkowej płytce hodowlanej z piramidami skierowanymi do góry. Następnie wlej utwardzacz PDMS na wierzch form, aż każda studzienka płytki zostanie wypełniona.
Przełóż przykrytą blachę do piekarnika na godzinę w temperaturze 60 stopni Celsjusza do wyschnięcia. Po wysterylizowaniu macierzy PDMS przez autoklawowanie i pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego, włóż jedną matrycę mikrodołków do każdej studzienki sterylnej 12-dołkowej płytki. Aby utworzyć agregaty neuronalne, użyj mikropipetowania, aby dodać 12 mikrolitrów zawiesiny komórkowej do każdej mikrostudzienki macierzy PDMS.
Odwirować płytkę z prędkością 200 razy g przez pięć minut, aby wymusić agregację komórek na dnie mikrostudzienek. Następnie ostrożnie dodaj około dwóch mililitrów pożywki hodowlanej na wierzch każdej tablicy PDMS, aby pokryć wszystkie zasiane mikrodołki. Inkubuj płytkę przez 12 do 24 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla.
Aby rozpocząć wytwarzanie rdzenia CEM, wymieszaj kolagen typu 1, lamininę i pożywkę hodowlaną w probówce z mikrowirówką i dostosuj pH do 7,2 do 7,4. Następnie umieścić probówkę zawierającą CEM na lodzie. Użyj sterylnych kleszczy, aby przenieść mikrokolumny do opróżnienia 35 lub 60-milimetrowych szalek Petriego.
Następnie, podczas pracy pod mikroskopem stereoskopowym, użyj 10-mikrolitrowej końcówki przymocowanej do końcówki o pojemności 1000 mikrolitrów, aby wydobyć resztki DPBS i pęcherzyki powietrza ze światła. Szybko pobrać od czterech do pięciu mikrolitrów CEM do mikropipetowania, a następnie umieścić końcówkę mikropipetowanego na jednym końcu mikrokolumny i rozładować tyle CEM, aby wypełnić światło. Aby zapobiec odwodnieniu, dodaj dwa mikrolitry CEM wokół każdej mikrokolumny.
Mikrokolumny hydrożelu CEM inkubować na szalkach Petriego w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 15 minut. Przystąp do wysiewu komórek natychmiast po inkubacji. Przenieść około 10 do 20 mikrolitrów pożywki hodowlanej do dwóch wolnych obszarów na szalkach Petriego zawierających mikrokolumny.
Użyj mikropipetowania, aby zebrać agregaty neuronalne pojedynczo i przenieść je na szalkę Petriego zawierającą konstrukty. Przenieś agregaty za pomocą kleszczy do jednej z małych pul pożywki hodowlanej, aby zachować zdrowie komórek. Podczas obserwacji pod mikroskopem stereoskopowym użyj kleszczyków, aby wprowadzić agregat na jednym końcu mikrokolumn w przypadku jednokierunkowych mikro-TENN lub na każdym końcu w przypadku architektury dwukierunkowej.
Następnie przenieś wysianą mikrokolumnę do drugiej małej puli pożywki hodowlanej, aby uniknąć odwodnienia i zachować zagregowane zdrowie. Po załadowaniu wszystkich mikrokolumn inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla przez 45 minut, aby agregaty mogły przylegać do CEM. Po inkubacji sprawdzić, czy agregaty pozostały na końcach mikrokolumn za pomocą stereomikroskopu.
Na koniec ostrożnie zalać szalki Petriego zawierające mikro-TENN pożywką hodowlaną za pomocą pipety. Umieść naczynia w inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 5% dwutlenku węgla w celu długotrwałej hodowli. Te obrazy z kontrastem fazowym pokazują jednokierunkowe mikro-TENN o długości 2 mililitrów do ośmiu dni in vitro.
Na tych obrazach zwróć uwagę na agregaty neuronalne na krańcach mikrokolumny, podczas gdy wyrównane drogi aksonalne wystają w poprzek światła. Jak widać tutaj, drogi aksonalne rozciągają się prawie na całej długości mikrokolumny przez pięć dni in vitro. W przypadku 5-milimetrowych dwukierunkowych mikro-TENN, drogi aksonalne wypełniają długość mikrokolumny po 5 dniach in-vitro, a architektura ta jest utrzymywana co najmniej do 10 dni in vitro.
Poniższe dwa obrazy mogą pomóc w rozwiązywaniu problemów z procedurą. Ten obraz przedstawia całkowicie odwodnioną, wysuszoną mikrokolumnę hydrożelową w wyniku całkowitego usunięcia i/lub odparowania DPBS, CEM lub pożywki hodowlanej podczas wytwarzania. Ten obraz przedstawia mikrokolumnę ze światłem wyściełającym zewnętrzną ścianę z powodu braku koncentrycznego wyrównania igły do akupunktury z rurką kapilarną.
Wreszcie, ten konfokalny obraz pokazuje dwukierunkowy mikro-TENN po 28 dniach in vitro, barwiony dla jąder komórkowych za pomocą Hoechst na niebiesko i z aksonami oznaczonymi tudge one na czerwono i presynaptycznymi butonami znakowanymi synapsyną 1 na zielono. Migrację komórek z agregatów wzdłuż dróg aksonalnych obserwuje się w obecności zakończeń presynaptycznych, jak sugerowano. Micro-TENN to samodzielne, inspirowane anatomią konstrukty, które naśladują kluczowe aspekty cytoarchitektury konektomu; w związku z tym mikro-TENy mogą stanowić środek do zastąpienia utraconych ścieżek nerwowych po implantacji do mózgu.
Istotnymi elementami tej metody są schemat obudowy biomateriału rurkowego, który pozwala na podłużny wzrost aksonów, oraz metoda agregowana, która zapewnia uzyskanie prawidłowej cytoarchitektury ciał komórkowych ograniczonych do końców dróg aksonalnych wzdłuż wnętrza. Po opanowaniu tych metod, zasady tej techniki mogą być stosowane do budowy mikro-TENN z innymi fenotypami komórek i składnikami biomateriału, w zależności od konkretnego zastosowania.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Niniejszy manuskrypt opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci nerwowych (mikro-TENN), które są trójwymiarowymi konstrukcjami z wyrównanymi sznurami aksonowymi i skupieniami neuronów w żelu. Te żywe szkielety mogą rekonstruować lub modyfikować obwody nerwowe i służyć jako modele do badań neurobiologicznych.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Inżynieria tkankowa
- Neurobiologia
Tło
- Mikro-TENN replikują anatomię łączności mózgu.
- Składają się z długich sznurów aksonowych łączących populacje neuronów.
- Konstrukty te są zaprojektowane dla minimalnie inwazyjnego wprowadzania do mózgu.
- Mogą pomóc w rekonstrukcji obwodów nerwowych utraconych z powodu urazów lub chorób.
Cel badania
- Wytworzenie mikro-TENN do rekonstrukcji obwodów nerwowych.
- Stworzenie biofidelnych modeli do badań neurobiologicznych.
- Naśladowanie cytoarchitektury szlaków mózgowych.
Stosowane metody
- Ręczne łamanie szklanych kapilar na fragmenty.
- Wprowadzanie igieł akupunkturowych do fragmentów.
- Przygotowanie roztworu agarozy dla konstrukcji.
- Wykorzystanie rurkowego żelu dla agregacji neuronów.
Główne wyniki
- Udana produkcja mikro-TENN, które naśladują struktury mózgu.
- Zdemonstrowana potencjalność rekonstrukcji szlaków nerwowych.
- Ustanowienie metody tworzenia żywych szkieletów dla badań.
- Zarysowanie wyzwań związanych z pracą na skalę mikronometrową.
Konkluzje
- Mikro-TENN są obiecującymi narzędziami dla badań neuronaukowych.
- Mogą ułatwić badania obwodów nerwowych i funkcji mózgu.
- Dalszy rozwój może zwiększyć ich zastosowanie w medycynie regeneracyjnej.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
Micro-tissue engineered neural networks (micro-TENNs) offer a reproducible platform for reconstructing lost neural pathways and modeling brain connectome architecture in vitro. This technology addresses a critical gap in CNS repair and provides a scalable system for studying neurobiological mechanisms relevant to neurodegeneration and trauma. The approach enables predictive confidence in translational research and supports risk-adjusted portfolio decisions in neurotherapeutic development.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of neuronal connectivity and pathway-specific mechanisms in a controlled 3D environment.
- Supports biological de-risking by recapitulating brain cytoarchitecture for functional target validation.
- Facilitates predictive confidence in selecting disease-relevant neural circuits for intervention.
Screening & Assay Development
- Provides standardized, reproducible constructs for quantitative assessment of neuronal and axonal responses.
- Enables assay development with aligned axonal tracts and defined neuronal populations for compound evaluation.
- Supports scalability and platform reuse for high-content screening of neuroactive agents.
Translational & Preclinical Research
- Offers biofidelic models for studying synaptic integration, network modulation, and regenerative processes.
- Aligns with translational biomarker strategies by enabling in vitro modeling of CNS circuitry and repair.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation of neuroregenerative interventions.
Pipeline & Workflow Integration
Micro-TENNs integrate into the discovery-to-preclinical continuum by providing a modular system for hypothesis testing, mechanistic de-risking, and quantitative analytics in neural tissue engineering.
- Discovery Biology: Facilitates hypothesis-driven studies of neuronal aggregation, axonal growth, and synaptic formation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for comparing neuroactive conditions and interventions.
- Analytics: Enables measurement of axonal extension, synaptic distribution, and intrinsic electrical activity.
- Translational Research: Bridges in vitro modeling with preclinical strategies for CNS reconstruction and modulation.
- Enterprise Reuse: Provides a flexible platform adaptable to various cell types and biomaterials for diverse R&D needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in CNS pathway studies.
- Operational Value: Standardizes fabrication and culture of neural constructs for reproducible results.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation in neuroregenerative portfolios.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS repair and modeling programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in neural tissue engineering and microscale fabrication techniques.
- Demands access to stereomicroscopy, cell culture, and imaging infrastructure.
- Necessitates cross-team standardization for construct preparation and analysis.
- Adaptable to different neuronal phenotypes and biomaterial compositions as supported by application needs.
- Practical limitations include handling at micron scale and maintaining construct hydration and alignment.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
9:51
Conclusion
8:14
Results: Observation of Axonal Growth in Micro-TENNs by Phase-contrast Imaging and Cytoarchitecture by Confocal Microscopy
0:58
Micro-column Fabrication Using Capillary Tubes
2:04
Micro-column Trimming and Sterilization
2:48
Preparation of the Pyramidal Micro-well Array
4:46
Formation of Neuronal Aggretates
5:27
ECM Core Fabrication
6:42
Neuronal Aggregate Seeding of Micro-columns
