Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar dynamiki mikrotubul w komórkach drożdży. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mikrotubul, takie jak to, w jaki sposób mutacje w kanalikach i regulatory mikrotubul regulują dynamikę mikrotubul w żywej komórce. Główną zaletą tej techniki jest to, że żywe komórki drożdży są stabilizowane w obrazie.

Raczej wysoka rozdzielczość czasowa przez dziesięć minut lub niska rozdzielczość czasowa przez kilka godzin. Procedurę zademonstrują Colby Fees i Cassi Estrem, dwoje doktorantów z mojego laboratorium. Komórki drożdży użyte w tym eksperymencie zostały skonstruowane tak, aby konstytutywnie wyrażać tubulinę znakowaną GFP.

Zaszczepić około jednego mikrolitra komórek drożdży z pojedynczej kolonii na płytce w trzech mililitrach syntetycznej kompletnej pożywki. Pozwól komórkom rosnąć przez noc w temperaturze 30 stopni Celsjusza, potrząsając przy 250 obr./min. Następnego dnia rozcieńczyć nasyconą kulturę do OD600 poniżej 0,1 w pożywce.

Umieść rozcieńczoną kulturę z powrotem w wytrząsarce o temperaturze 30 stopni Celsjusza na trzy do czterech godzin lub do momentu, gdy OD600 znajdzie się między 0,4 a 0,8. Przygotowanie szkiełek z komorą przepływową należy rozpocząć od pocięcia arkusza folii parafinowej na kawałek o szerokości czterech cali i długości siedmiu cali. Umieść standardowe szkiełko mikroskopowe wzdłuż na szerokości czterech cali folii parafinowej i owiń folię wokół szkiełka trzy do czterech razy, tak aby szkiełko było pokryte folią o grubości trzech do czterech warstw.

Dociśnij warstwy do siebie, aby zapewnić rozsądne uszczelnienie, ale unikaj zbyt mocnego naciskania lub powodowania marszczenia folii. Używając czystej maszynki do golenia do cięcia pudełek i innego suwaka, aby zapewnić prostą krawędź do cięcia, przeciąć folię parafinową wzdłuż zewnętrznych krawędzi szkiełka. Oderwij nadmiar folii od szkiełka roboczego i wyrzuć.

Używając drugiego szkiełka jako prostej krawędzi, pokrój ułożone warstwy folii wzdłuż długiej osi szkiełka na około 10 pasków, każdy o szerokości od dwóch do czterech milimetrów. Następnie wytnij ułożone warstwy folii parafinowej prostopadle do poprzednich nacięć wzdłuż krótkiej osi szkiełka, aby utworzyć paski o szerokości od dwóch do czterech milimetrów, długości od 23 do 24 milimetrów i grubości od trzech do czterech warstw. Użyj brzytwy pod kątem 45 stopni, aby oderwać przycięte paski folii.

Następnie za pomocą kleszczyków równomiernie rozprowadź wycięte paski na czystym szkiełku mikroskopowym, aby uzyskać pożądaną liczbę komór. W tym przykładzie cztery paski folii zostaną użyte do stworzenia trzech komór. Umieść pojedyncze szkiełko nakrywkowe na paskach folii i przesuń je na miejsce za pomocą kleszczyków.

Umieść przygotowane szkiełko nakrywkowe do góry na płycie grzejnej ustawionej na około 95 stopni Celsjusza i podgrzewaj szkiełko przez około trzy minuty, aż paski folii staną się przezroczyste. Uszczelnij szkiełko podstawowe i szkiełko nakrywkowe za pomocą pęsety, aby delikatnie docisnąć obszary szkiełka nakrywkowego, które znajdują się bezpośrednio nad paskami folii parafinowej. Użyj kleszczyków, aby zdjąć szkiełko z płyty grzejnej i odłóż je na bok do ostygnięcia stroną z szkiełka nakrywkowego skierowaną do góry.

Gdy szkiełko ostygnie, folia powróci do białego, nieprzezroczystego zabarwienia. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić zamrożoną 200 mikrolitrową porcję konkanawaliny A w temperaturze pokojowej. Dodać około 100 mikrolitrów rozmrożonej konkanawaliny A do każdej komory przygotowanego szkiełka, pipetując do jednego z otwartych końców.

Następnie zawieś szkiełko nakrywkowe w dół między dwoma stojakami na probówki do mikrofuge na pięć minut, aby Concanavalin A przylgnął do szkiełka nakrywkowego. Ustawić szkiełko w pozycji wysuwanej pokrywy i wyjąć Concanavalin A, myjąc komorę syntetycznym kompletnym medium. Przepuścić przez komorę dwukrotność objętości medium w komorze, używając rogu ręcznika papierowego do wyciągnięcia płynu z jednego końca komory, jednocześnie pipetując świeży płyn do drugiego końca komory.

Załaduj ogniwa, przepływając dwukrotność objętości komory zawiesiny ogniwa przy użyciu metody przepływu skierowanego. Zawieś szkiełko nakrywkowe w dół na 10 minut, aby komórki przylegały do szkiełka nakrywkowego. Wypłucz wszelkie nieprzylegające komórki, przepuszczając przez czterokrotność objętości komory syntetycznego kompletnego podłoża.

Ostrożnie osusz każdy koniec komory czystym rogiem ręcznika papierowego, zbliżając menisk do krawędzi szkiełka nakrywkowego. Uszczelnij każdy koniec komory ciepłym szczeliwem. Akwizycja obrazu zostanie wykonana za pomocą mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 1,45 NA 100X CFI Plan Apo, stolik piezoelektryczny, konfokalny skaner z wirującym dyskiem, laser oświetleniowy i kamerę EMCCD.

Podczas akwizycji obrazu utrzymuj temperaturę stolika na poziomie pokojowym. Ustaw ostrość komórek i przeszukaj slajd w poszukiwaniu komórek zgrupowanych razem, aby upewnić się, że pole akwizycji ma co najmniej pięć do sześciu komórek zgrupowanych razem na tej samej płaszczyźnie ogniskowej. Zaprogramuj wielowymiarową akwizycję, aby zbierać wiele zSeries w czasie.

Dostosuj ustawienia w ustawieniach aktywnej akwizycji do następujących: Całkowita głębokość Z wynosząca sześć mikrometrów, aby objąć całą komórkę drożdży, rozmiar kroku Z 300 nanometrów, aby zmaksymalizować zbieranie światła bez nadmiernego próbkowania, całkowity czas trwania 10 minut, odstępy czasu między seriami z wynoszące cztery sekundy oraz czas ekspozycji 90 milisekund dla każdej płaszczyzny Z. Rozpocznij pobieranie, klikając przycisk Uruchom i pozwól mu działać przez pełne 10 minut. Dane są zapisywane jako seria obrazów, a przykładowy wynik obrazowania poklatkowego jest pokazany tutaj.

Rozpocznij analizę obrazu, otwierając ImageJ i przeciągając pobrany stos obrazów bezpośrednio na panel sterowania. Zaimportowane formaty biograficzne zostaną uruchomione automatycznie. Wybierz w porządku", aby załadować stos obrazów jako hiperstos.

Korzystając z funkcji ZProject, zwiń każdą zSeries do maksymalnej intensywności rzutowania dwuwymiarowego. Zastosuj średni filtr do stosu obrazów, aby zredukować szum plamkowania, wybierając menu procesu, podmenu filtru i funkcję mediany. Wprowadź 2,0 pikseli w polu promienia i kliknij w porządku"Zidentyfikuj komórki pre-NFA w polu.

Charakteryzują się one średniej wielkości pąkami i krótkim wrzecionem mitotycznym o długości około jednego do jednego punktu, pięciu mikrometrów. Zaczynając od pierwszego punktu czasowego serii obrazów, użyj narzędzia linii segmentowej, aby narysować linię wzdłuż pojedynczej mikrotubuli astralnej od znajdującej się na styku mikrotubuli astralnej i intensywniej znakowanych mikrotubul wrzeciona, do końca plus, który znajduje się w cytoplazmie. Kliknij dwukrotnie na końcu mikrotubuli, aby zakończyć linię segmentową.

Zapisz pomiar w tabeli wyników za pomocą funkcji pomiaru, naciskając przycisk M na klawiaturze. Po wykonaniu pomiarów dla wszystkich punktów czasowych skopiuj dane z tabeli wyników, wklej je do arkusza kalkulacyjnego i wybierz Zapisz jako", aby wybrać dane. Ta grafika przedstawia szereg czasowy dynamiki mikrotubul astralnych w komórce typu dzikiego oraz zmutowany szczep, który wcześniej okazał się mieć bardziej stabilne mikrotubule.

Mikrotubule są oznaczone jako tubulina alfa oznaczona GFP, aby uwidocznić długość mikrotubul. Czerwone strzałki wyznaczają całkowitą długość mikrotubuli astralnej, a groty strzałek oznaczają koniec plusa. Długości mikrotubul mierzono w każdym punkcie czasowym przez osiem minut, a te skompilowane długości są przedstawiane na wykresach życia.

Zielone punkty oznaczają polimeryzację, a różowe punkty oznaczają depolimeryzację. Zdarzenia katastroficzne są oznaczone grotami strzałek. Wykresy te pokazują, że mikrotubula w mutancie jest dłuższa i wykazuje mniej katastrof niż mikrotubula typu dzikiego.

Ponadto szybkość polimeryzacji i depolimeryzacji określona na podstawie nachyleń wstępujących i opadających długości mikrotubul jest zmniejszona w mutancie w porównaniu z typem dzikim. Pomiary dynamiki mikrotubul ujawniają również, że mikrotubula w zmutowanej komórce ma zmniejszoną dynamikę w porównaniu z typem dzikim. Po opanowaniu preparatu, ładowanie komórek i akwizycja obrazu mogą być wykonane w ciągu 30 minut, co oznacza, że w ciągu jednego dnia można zobrazować wiele różnych próbek.

Komory szkiełkowe mogą być wykonane i przechowywane z wyprzedzeniem przed dodaniem Concanavalin A. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak stabilizować komórki drożdży w prostych komorach szkiełkowych, obrazować w czterech wymiarach i mierzyć dynamikę mikrotubul w żywych komórkach. Oprócz mikrotubul, procedura ta może być modyfikowana w celu pomiaru dynamiki innych znakowanych fluorescencyjnie białek w żywych komórkach drożdży w skalach czasowych od sekund do godzin.