Name: Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Poznaj metodę obrazowania dynamiki mikrotubul astralnych w żywych komórkach drożdży pączkujących przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ta technika umożliwia badanie wpływu mutacji na dynamikę mikrotubul in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Stevenowi Markusowi (Colorado State University) i Elmarowi Schiebelowi (Universität Heidelberg) za udostępnienie różnych plazmidów FP-TUB1. Jesteśmy wdzięczni Melissie Gardner (University of Minnesota) za przeszkolenie nas w zakresie metody przygotowania komory szkiełkowej. Praca ta była wspierana przez grant National Institutes of Health (NIH) R01GM112893-01A1 (dla J.K.M.) i T32GM008730 (dla CE).

<ol><li>Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synergy+between+XMAP215+and+EB1+increases+microtubule+growth+rates+to+physiological+levels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels.</a> Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).</li>
<li>Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dynamic+behavior+of+the+APC-binding+protein+EB1+on+the+distal+ends+of+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules.</a> Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).</li>
<li>Byers, B., Goetsch, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Behavior+of+spindles+and+spindle+plaques+in+the+cell+cycle+and+conjugation+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae.</a> J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).</li>
<li>Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+Tub4p%2C+a+yeast+gamma-tubulin-like+protein%3A+implications+for+microtubule-organizing+center+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function.</a> J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).</li>
<li>Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((gamma-Tubulin-like+Tub4p+of+Saccharomyces+cerevisiae+is+associated+with+the+spindle+pole+body+substructures+that+organize+microtubules+and+is+required+for+mitotic+spindle+formation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation.</a> J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).</li>
<li>Winey, M., Bloom, K. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22491889">Mitotic spindle form and function.</a> Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).</li>
<li>Gupta, M. L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((beta-Tubulin+C354+mutations+that+severely+decrease+microtubule+dynamics+do+not+prevent+nuclear+migration+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast.</a> Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).</li>
<li>Moore, J. K., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordinating+mitosis+with+cell+polarity%3A+Molecular+motors+at+the+cell+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex.</a> Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).</li>
<li>Gartz Hanson, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+alpha-tubulin+mutation+disrupts+neural+development+and+tubulin+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis.</a> Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).</li>
<li>Fees, C. P., Aiken, J., O'Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+negatively+charged+carboxy-terminal+tail+of+beta-tubulin+promotes+proper+chromosome+segregation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation.</a> Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).</li>
<li>Song, S., Lee, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+function+of+Saccharomyces+cerevisiae+CDC5+in+cytokinesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis.</a> J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).</li>
<li>Knop, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epitope+tagging+of+yeast+genes+using+a+PCR-based+strategy%3A+more+tags+and+improved+practical+routines%5BTitle%5D)+AND+%22Yeast%22%5BJournal%5D)">Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines.</a> Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).</li>
<li>Kosco, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+microtubule+dynamics+by+Stu2p+is+essential+for+spindle+orientation+and+metaphase+chromosome+alignment+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast.</a> Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).</li>
<li>Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+stabilization+of+microtubule+dynamic+instability+in+vitro+by+vinblastine%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine.</a> Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).</li>
<li>Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+reveals+novel+and+discrete+functions+for+tubulin+carboxy-terminal+tails%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails.</a> Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).</li>
<li>Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitosis+in+living+budding+yeast%3A+anaphase+A+but+no+metaphase+plate%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate.</a> Science. 277 (5325), 574-578 (1997).</li>
<li>Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cdc14-regulated+midzone+assembly+controls+anaphase+B%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B.</a> J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).</li>
<li>Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+Plasmids+for+Fluorescent+Protein+Tagging+of+Microtubules+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae.</a> Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Model pączkujących drożdży oferuje znaczne korzyści w zakresie gromadzenia pomiarów dynamiki mikrotubul w wysokiej rozdzielczości w warunkach in vivo , w tym możliwość obrazowania pojedynczych mikrotubul w czasie oraz możliwość manipulowania tubulinami i regulatorami mikrotubul przy użyciu narzędzi genetyki drożdży.
Komory z powłoką Concanavalin A zapewniają szereg zalet w porównaniu z poprzednio opisanymi aparatami, w tym stopionymi podkładkami agarowymi. Szkiełka z komorami mogą być...

Mikrotubule są polimerami cytoszkieletu zbudowanymi z podjednostek białka αβ-tubuliny i są używane w wielu różnych kontekstach komórkowych, w tym w transporcie wewnątrzkomórkowym, podziale komórek, morfogenezie i ruchliwości. Aby zbudować sieci mikrotubul dla tych różnorodnych ról, komórki muszą dokładnie regulować, gdzie i kiedy tworzą się mikrotubule. Regulacja ta odbywa się poprzez kontrolowanie reakcji, które albo składają podjednostki αβ-tubuliny w polimery mikrotubul, albo rozkładają mikrotubule na wolne podjednostki; Jest to znane jako dynamika mikrotubul.
Głównym celem pola mikrotubul jest wyjaśnienie mechanizmów molekularnych regulujących dynamikę mikrotubul, w tym badania podjednostek αβ-tubuliny i zewnętrznych regulatorów, które wiążą się z tubuliną i/lub mikrotubulami. Ugruntowanym podejściem eksperymentalnym jest odtworzenie tego układu in vitro przy użyciu oczyszczonego białka αβ-tubuliny, często w połączeniu z oczyszczonymi regulatorami zewnętrznymi. Chociaż jest to użyteczne podejście, jasne jest, że dynamika mikrotubul w odtworzonych układach znacznie różni się od tej obserwowanej w żywych komórkach. Na przykład mikrotubule rosną szybciej i kurczą się wolniej in vivo niż in vitro. Różnice te można przypisać dostępności znanych regulatorów zewnętrznych1, a także jeszcze niezdefiniowanym czynnikom w komórkach. Dlatego tak ważne jest określenie aktywności regulatorów mikrotubul i mutantów, które zakłócają dynamikę w natywnym kontekście komórkowym.
Chociaż modele metazoan okazały się dominującymi systemami do badania funkcji mikrotubul i organizacji wyższego rzędu, kilka praktycznych problemów poważnie ogranicza użyteczność tych modeli do precyzyjnego pomiaru dynamiki mikrotubul. Po pierwsze, duża liczba mikrotubul, wahająca się od kilkudziesięciu do tysięcy na komórkę, utrudnia pewne śledzenie pojedynczych mikrotubul w czasie. Wiele badań zajmuje się tym wyzwaniem, obrazując białka, które selektywnie lokalizują się na końcach mikrotubul, takie jak białka z rodziny wiążących końcówki (EB). Wiadomo jednak, że białka te lokalizują się tylko na końcach rosnących mikrotubul w metazoans2. W związku z tym użyteczność tych białek ogranicza się do bezpośredniego pomiaru tempa wzrostu, podczas gdy tylko pośrednio mierzy inne aspekty dynamiki, takie jak częstotliwość katastrof. Po drugie, pomimo postępów w technologii edycji genomu, tworzenie komórek, które stabilnie wyrażają tubulinę znakowaną fluorescencyjnie lub wprowadzanie mutacji w celu selektywnego manipulowania tubuliną lub regulatorami mikrotubul, pozostaje poważnym wyzwaniem. Co więcej, obecność wielu izotypów tubuliny w metazoanach utrudnia badanie, w jaki sposób mutacje wpływają na poszczególne geny tubuliny.
System pączkujących drożdży zapewnia kilka ważnych zalet do pomiaru dynamiki mikrotubul in vivo. Drożdże mają uproszczoną sieć mikrotubul, która umożliwia wizualizację pojedynczych mikrotubul. W drożdżach mikrotubule emanują z centrów organizacyjnych znanych jako ciała wrzecionowate (SPB), które są osadzone w otoczce jądrowej3. SPB służą jako rusztowania dla małych kompleksów γ-tubuliny, które nukleują mikrotubule4,5. SPB nukleizują dwie klasy mikrotubul, mikrotubule wrzecionowe i mikrotubule astralne. Mikrotubule wrzeciona rzutują do nukleoplazmy i są ważne dla przyłączania się do chromosomów za pomocą mikrotubul kinetochorowych oraz dla stabilizacji wrzeciona za pomocą nakładających się mikrotubul międzybiegunowych6. W przeciwieństwie do tego, mikrotubule astralne wystają na zewnątrz do cytozolu i są stosunkowo rzadkie w porównaniu z gęstą siecią mikrotubul wrzecionowych. Podczas mitozy komórki przed anafazą mają tylko 1-2 mikrotubule astralne emanujące z dowolnego SPB; Istnieją one jako pojedyncze mikrotubule, a nie jako wiązki<klasa SUP="xref">7. Rolą mikrotubul astralnych podczas mitozy jest przemieszczanie jądra i wrzeciona do połączenia między przedziałami matki i pąka, znanego jako szyjka pąka. Ruch ten obejmuje dobrze zdefiniowane ścieżki, które generują siłę na mikrotubule astralne, ciągnąc jądro i wrzeciono w kierunku i ostatecznie do szyjki pąka8.
Kolejną zaletą systemu drożdżowego jest użyteczność jego genetyki, która może być wykorzystana do badania regulatorów mikrotubul i podjednostek tubuliny z niezrównaną precyzją. Drożdże posiadają również uproszczony repertuar izotypów tubuliny: pojedynczy gen β-tubuliny (TUB2) i dwa geny α-tubuliny (TUB1 i TUB3). Mutacje mogą być łatwo wprowadzane do tych genów i w ten sposób badane w jednorodnej populacji tubuliny9,10. Istnieje wiele powszechnie dostępnych konstruktów do znakowania mikrotubul, które mogą być przeznaczone do integracji w loci chromosomów w celu stabilnej ekspresji (patrz Dyskusja).
Ogólnym celem tej metody jest obrazowanie pojedynczych mikrotubul w żywych komórkach drożdży w czterech wymiarach (X, Y, Z i T) w celu uzyskania wysokiej rozdzielczości pomiarów dynamiki mikrotubul. Opisano metody całkowania konstruktów dla konstytutywnej, niskopoziomowej ekspresji tubuliny znakowanej fluorescencyjnie w komórkach drożdży. Przed obrazowaniem żywe komórki są umieszczane w komorach szkiełkowych pokrytych lektyną Concanavalin A w celu ustabilizowania komórek do długotrwałego obrazowania. Opisano również optymalne parametry akwizycji obrazu, a także przepływ pracy do analizy danych.

<table><tbody><tr><td>Data urodzenia (bazy dropoutów)</td><td>Nauka o wschodzie słońca&nbsp;</td><td>1650</td><td></td></tr><tr><td>CSM-Leu</td><td>Wschód słońca nauka&nbsp;</td><td>1005</td><td></td></tr><tr><td>Agar</td><td>Ameresco</td><td>N833</td><td></td></tr><tr><td>100 mm płytki polistyrenowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>ssDNA (Samon Sperm)&nbsp; w sterylnym DiH2O</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>&nbsp; Ponowne zawieszenie D7656</td><td>w stężeniu 10 mg/ml w DiH2O. Przechowuj podwielokrotności na poziomie -20 &ordm; C</td></tr><tr><td>Syntetyczne kompletne media&nbsp;</td><td>Nauka o wschodzie słońca&nbsp;</td><td>1459-100</td><td></td></tr><tr><td>Concanavalin A</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>L7647</td><td>zawiesić w stężeniu 2 mg/ml w DiH2O. Przechowuj podwielokrotności na poziomie -20 &ordm; C</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-1</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-B</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>film parafinowy</td></tr><tr><td>VALAP (równe części wazeliny, lanoliny i parafiny)</td><td></td><td></td> <td>topią się w temperaturze 75 &ordm; C przed użyciem</td></tr><tr><td>kleszczy&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-106</td><td></td></tr><tr><td>Glikol poyetylenowy (PEG) 3350</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td>202444</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>mikroskop</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ti E odwrócony mikroskop Perfect Focus</td><td>Instrumenty Nikon MEA53100</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw 1,45 NA 100X CFI Plan Apo</td><td>Nikon Instruments</td><td>MRD01905</td><td></td></tr><tr><td>Piezoelektryczny przedwzmacniacz elektryczny&nbsp;</td><td>Physik Instrumente</td><td>P-736</td><td></td></tr><tr><td>Skaner wirujących dysków</td><td>Yokogawa</td><td>CSU10</td><td></td></tr><tr><td>Moduł sumatora laserowego</td><td>Agilent Technologies</td><td>MCL400B</td><td></td></tr><tr><td>Kamera EMCCD</td><td>Andor Technology</td><td>iXon Ultra 897&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</strong</td><td>>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NIS Oprogramowanie</td><td>Nikon Instruments</td><td>MQS31100</td><td></td></tr><tr><td>Microsoft Excel oprogramowanie</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie MATLAB</td><td>MathWorks, Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ImageJ64</td><td>NIH</td><td></td><td>Rasband, WS, ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016.</td></tr><tr><td>Wtyczka Bio-Formats Importer</td><td>Open Microscopy Environment</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Plasmids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pUC19-LEU2::GFP-TUB1</td><td></td><td>pSK1050</td><td>odniesienie: Song, S. i Lee, K. S. Nowa funkcja Saccharomyces cerevisiae CDC5 w cytokinezie. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001)</td></tr></tbody></table>

obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

High-resolution Imaging and Analysis of Individual Astral Microtubule Dynamics in Budding Yeast

Dynamiczne mikrotubule są podstawą wielu procesów komórkowych, a dokładne pomiary dynamiki mikrotubul mogą dostarczyć wglądu w to, jak komórki regulują te procesy i jak mutacje genetyczne wpływają na regulację. Kwantyfikacja dynamiki mikrotubul w modelach metazoanów wiąże się z szeregiem powiązanych wyzwań, w tym z dużą gęstością mikrotubul i ograniczeniami w manipulacjach genetycznych. W przeciwieństwie do tego, model drożdży pączkujących oferuje zalety, które przezwyciężają te wyzwania. Protokół ten opisuje metodę pomiaru dynamiki pojedynczych mikrotubul w żywych komórkach drożdży. Komórki wykazujące ekspresję fluorescencyjnie znakowanej tubuliny są przyklejane do zmontowanych komór szkiełkowych, co pozwala na stabilną akwizycję obrazu poklatkowego. Dostępny jest również szczegółowy przewodnik dotyczący szybkiej, czterowymiarowej akwizycji obrazu, a także protokół ilościowego określania właściwości dynamicznych mikrotubul w konfokalnych stosach obrazów. Ta metoda, w połączeniu z konwencjonalną genetyką drożdży, zapewnia podejście, które jest wyjątkowo odpowiednie do ilościowej oceny wpływu regulatorów mikrotubul lub mutacji, które zmieniają aktywność podjednostek tubuliny.

Pomiar dynamiki mikrotubul w żywych komórkach drożdży stanowi skuteczne narzędzie do oceny, w jaki sposób mutacje w genach kodujących regulatory mikrotubul lub podjednostki tubuliny wpływają na szybkość polimeryzacji i depolimeryzacji, a także na częstotliwość przejść między tymi stanami. Rycina 1 przedstawia serię czasową dynamiki mikrotubul astralnych w komórce typu dzikiego oraz w komórce mutanta z mutacją w β-tubulinie (tub2-430Δ). Mikrotubule zostały znakowa...

Drożdże pączkujące są korzystnym modelem do badania dynamiki mikrotubul in vivo ze względu na ich potężną genetykę i prostotę cytoszkieletu mikrotubul. Poniższy protokół opisuje, w jaki sposób przekształcać i hodować komórki drożdży, uzyskiwać obrazy mikroskopii konfokalnej i ilościowo analizować dynamikę mikrotubul w żywych komórkach drożdży.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Dynamic microtubules are fundamental to many cellular processes, and accurate measurements of microtubule dynamics can provide insight into how cells ...

Ogólnym celem tej procedury jest pomiar dynamiki mikrotubul w komórkach drożdży. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad mikrotubulami, takie jak wpływ mutacji w tubulinach i regulatorach mikrotubul na dynamikę mikrotubul w żywej komórce. Główną zaletą tej techniki jest stabilizacja żywych komórek drożdży w obrazie.Zamiast tego stosuje się wysoką rozdzielczość czasową przez dziesięć minut lub niską rozdzielczość czasową przez kilka godzin. Procedurę zaprezentują Colby Fees oraz Cassi Estrem, dwaj doktoranci z mojego laboratorium. Komórki drożdży wykorzystane w tym doświadczeniu zostały zmodyfikowane tak, aby konstytutywnie ekspresować tubulinę znakowaną GFP.Zaszczep około 1 µL komórek drożdży z pojedynczej kolonii z płytki do 3 mL syntetycznego medium kompletnego. Pozostaw komórki do wzrostu przez noc w temperaturze 30 °C przy wytrząsaniu z prędkością 250 RPM. Następnego dnia rozcieńcz nasyconą kulturę w medium do wartości OD600 poniżej 0,1.Przenieś rozcieńczoną kulturę do inkubatora z wytrząsarką w temperaturze 30 °C na trzy do czterech godzin lub do momentu, aż wartość OD600 wyniesie od 0,4 do 0,8. Rozpocznij przygotowanie szkiełek do komór przepływowych, wycinając z folii parafinowej fragment o szerokości czterech cali i długości siedmiu cali. Połóż standardowe szkiełko przedmiotowe wzdłuż szerokości folii parafinowej wynoszącej cztery cale i owiń folię wokół szkiełka trzy do czterech razy, tak aby szkiełko było pokryte warstwą folii o grubości od trzech do czterech warstw.Dociśnij warstwy do siebie, aby zapewnić szczelne połączenie, unikając jednak zbyt mocnego nacisku, który mógłby spowodować zmarszczenie folii. Używając czystego ostrza nożyka do pudełek oraz drugiego szkiełka w celu uzyskania prostej krawędzi cięcia, wytnij folię parafinową wzdłuż zewnętrznych krawędzi szkiełka. Oderwij nadmiar folii z szkiełka roboczego i wyrzuć go.Używając drugiego szkiełka jako prowadnicy, przetnij ułożone warstwy folii wzdłuż dłuższej osi szkiełka na około 10 pasków o szerokości od dwóch do czterech milimetrów każdy. Następnie, prostopadle do poprzednich cięć, przetnij ułożone warstwy folii parafinowej wzdłuż krótszej osi szkiełka, aby utworzyć paski o szerokości od dwóch do czterech milimetrów, długości od 23 do 24 milimetrów i grubości od trzech do czterech warstw. Użyj żyletki pod kątem 45 stopni, aby oddzielić przecięte paski folii.Następnie za pomocą pęsety równomiernie rozmieść wycięte paski na czystym szkiełku przedmiotowym, aby utworzyć żądaną liczbę komór. W tym przykładzie do utworzenia trzech komór zostaną użyte cztery paski folii. Połóż pojedyncze szkiełko nakrywkę na paskach folii i ustaw ją w odpowiedniej pozycji za pomocą pęsety.Umieść przygotowany preparat szkiełkiem podstawowym do góry na płycie grzejnej ustawionej na około 95 °C i podgrzewaj go przez około trzy minuty, aż paski filmu staną się półprzezroczyste. Uszczelnij szkiełko podstawowe i nakrywkowe, używając pęsety do delikatnego dociśnięcia obszarów nakrywki znajdujących się bezpośrednio nad paskami filmu parafinowego. Za pomocą pęsety zdejmij preparat z płyty grzejnej i odstaw go do ostygnięcia nakrywką do góry.W miarę stygnięcia preparasu, błona powróci do białej, nieprzezroczystej barwy. Aby rozpocząć tę procedurę, rozmrozić w temperaturze pokojowej zamrożoną alikwotę 200 µL Concanavalin A. Do każdej komory przygotowanego preparasu dodać około 100 µL rozmrożonej Concanavalin A, pipetując roztwór przez jeden z otwartych końców.Następnie zawiesić preparat, stroną z szkiełkiem nakrywką do dołu, pomiędzy dwoma statywami do probówek do wirówki na pięć minut, aby umożliwić przyleganie Konkanawaliny A do szkiełka nakrywki. Przenieść preparat z powrotem do pozycji ze szkiełkiem nakrywką do góry i usunąć Konkanawalinę A, przemywając komorę syntetyczną pożywką kompletną. Przepłukać komorę objętością pożywki równą dwukrotności objętości komory, używając rogu ręcznika papierowego do odsysania płynu z jednego końca komory, jednoczesnie pipetując świeży płyn do drugiego końca komory.Załaduj komórki, przepływając dwukrotność objętości komory zawiesiny komórek, stosując metodę przepływu kierowanego. Pozostaw preparat w pozycji zwisającej, z szkiełkiem nakrywką skierowanym w dół, na 10 minut, aby umożliwić adhezję komórek do szkiełka nakrywki. Wypłucz nieprzylegające komórki, przepływając przez komorę czterokrotność jej objętości syntetycznej pożywki kompletnej.Każdy koniec komory należy ostrożnie osuszyć czystym rogiem ręcznika papierowego, doprowadzając menisk do krawędzi szkiełka zakryjącego. Każdy koniec komory należy uszczelnić ciepłym uszczelniaczem. Akwizycję obrazów zostanie przeprowadzona przy użyciu mikroskopu odwróconego wyposażonego w obiektyw 1.45 NA 100X CFI Plan Apo, stół piezoelektryczny, konfokalną jednostkę skanującą z dyskiem wirującym, laser do oświetlania oraz kamerę EMCCD.Podczas akwizycji obrazów należy utrzymywać temperaturę stolika w temperaturze pokojowej. Ustawić ostrość komórek i przeszukać preparat w poszukiwaniu skupisk komórek, aby upewnić się, że w polu akwizycji znajduje się co najmniej pięć do sześciu komórek zgrupowanych w tej samej płaszczyźnie ogniskowania. Zaprogramować wielowymiarową akwizycję w celu zebrania wielu serii z (zSeries) w czasie.Skoryguj parametry w aktywnych ustawieniach akwizycji w następujący sposób: całkowita głębokość Z wynosząca 6 µm, aby objąć całą komórkę drożdży, rozmiar kroku Z wynoszący 300 nm w celu maksymalizacji zbierania światła bez nadmiarowego próbkowania, całkowity czas trwania 10 min, odstępy czasowe wynoszące 4 s pomiędzy seriami Z (zSeries) oraz czas ekspozycji 90 ms dla każdej płaszczyzny Z. Rozpocznij akwizycję, klikając Run, i pozwól jej trwać przez pełne 10 min. Dane są zapisywane jako seria obrazów; przykładowy wynik obrazowania time-lapse przedstawiono tutaj.Rozpocznij analizę obrazu, otwierając program ImageJ i przeciągając pozyskany stos obrazów bezpośrednio na panel sterowania. Import Bio-Formats rozpocznie się automatycznie. Wybierz „Okay”, aby załadować stos obrazów jako hyperstack.Używając funkcji ZProject, sprowadź każdą serię z (zSeries) do dwuwymiarowej projekcji maksymalnej intensywności. Zastosuj filtr medianowy do stosu obrazów w celu redukcji szumu typu speckle, wybierając menu proces (process), podmenu filtr (filter), a następnie funkcję median. W polu promienia wpisz 2.0 pixels i kliknij OK. Zidentyfikuj komórki przed-NFA w polu widzenia.Charakteryzują się one średniej wielkości pączkami oraz krótkim wrzecionem mitotycznym o długości około 1 do 1,5 µm. Zaczynając od pierwszego punktu czasowego serii obrazów, należy użyć narzędzia linii segmentowanej, aby narysować linię wzdłuż pojedynczej mikrotubuli astralnej, od miejsca jej połączenia z intensywniej znakowanymi mikrotubulami wrzeciona aż do końca plusowego, znajdującego się w cytoplazmie. Kliknij dwukrotnie koniec mikrotubuli, aby zakończyć rysowanie linii segmentowanej.Zapisz pomiar w tabeli wyników, korzystając z funkcji pomiaru poprzez naciśnięcie przycisku M na klawiaturze. Po dokonaniu pomiarów dla wszystkich punktów czasowych skopiuj dane z tabeli wyników, wklej je do arkusza kalkulacyjnego i wybierz opcję „Zapisz jako”, aby wybrać dane. Ta grafika przedstawia szereg czasowy dynamiki mikrotubul astralnych w komórce typu dzikiego oraz w szczepie mutantowym, u którego wcześniej wykazano większą stabilność mikrotubul.Mikrotubule zostały znakowane GFP-tagowaną alfa-tubuliną w celu wizualizacji ich długości. Czerwone strzałki wyznaczają całkowitą długość mikrotubuli astralnej, a groty strzałek wskazują końce plus. Długości mikrotubul mierzono w każdym punkcie czasowym przez osiem minut, a skompilowane dane przedstawiono na wykresach przebiegu w czasie.Zielone punkty oznaczają polimeryzację, a różowe punkty oznaczają depolimeryzację. Zdarzenia katastrofy są wskazane grotami strzałek. Wykresy te pokazują, że mikrotubula u mutanta jest dłuższa i wykazuje mniej katastrof niż mikrotubula typu dzikiego.Dodatkowo, szybkości polimeryzacji i depolimeryzacji wyznaczone z nachyleń krzywych wzrostu i spadku długości mikrotubul są w mutancie mniejsze w porównaniu z typem dzikim. Pomiary dynamiki mikrotubul ujawniają również, że mikrotubula w komórce mutanta wykazuje zmniejszoną dynamiczność w porównaniu z typem dzikim. Po opanowaniu techniki, przygotowanie preparatu, ładowanie komórek i akwizycja obrazów mogą zostać wykonane w ciągu 30 minut, co oznacza, że w ciągu jednego dnia można obrazować wiele różnych próbek.Komory na szkiełkach mogą zostać przygotowane i przechowywane z wyprzedzeniem, przed dodaniem konkanawaliny A. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat stabilizacji komórek drożdży w prostych komorach na szkiełkach, obrazowania w czterech wymiarach oraz pomiaru dynamiki mikrotubul w żywych komórkach. Poza mikrotubulami, procedurę tę można zmodyfikować w celu pomiaru dynamiki innych białek znakowanych fluorescencyjnie w żywych komórkach drożdży w skalach czasowych od sekund do godzin.

high-resolution-imaging-analysis-individual-astral-microtubule

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Delecja genów oraz nadekspresja białek to powszechnie stosowane metody badania funkcji białek. W niniejszym artykule opisujemy protokół analizy rozwoju fenotypu w zależności od stężenia białka na poziomie populacyjnym i pojedynczych komórek u Saccharomyces cerevisiae.

Analiza rozwoju fenotypu morfologicznego w funkcji stężenia białka u drożdży pączkujących

Zapewniamy powtarzalną podstawową metodę długoterminowej mikroskopii cyklu życia płciowego drożdży rozszczepialnych. Z niewielkimi korektami, przedstawiony protokół pozwala na skupienie badań na różnych etapach procesu rozrodczego.

Mikroskopia płciowego cyklu życiowego drożdży rozszczepialnych

Drożdże rozszczepienia, Schizosaccharomyces pombe, to doskonały system modelowy do badania cytokinezy, ostatniego etapu podziału komórki. Tutaj opisujemy podejście mikroskopowe do analizy różnych zdarzeń cytokinetycznych w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych.

Analiza czasoprzestrzenna zdarzeń cytokinetycznych w drożdżach rozszczepialnych

Ten protokół opisuje analizę fluorescencyjnie znakowanych przedziałów wewnątrzkomórkowych w pączkujących drożdżach za pomocą wielokolorowej mikroskopii konfokalnej 4D (time-lapse 3D). Parametry obrazowania dobierane są tak, aby wychwycić odpowiednie sygnały przy jednoczesnym ograniczeniu fotouszkodzeń. Niestandardowe wtyczki ImageJ umożliwiają śledzenie oznaczonych struktur i analizę ilościową.

Mikroskopia 4D drożdży

Tutaj prezentujemy obrazowanie żywych komórek, które jest nietoksyczną metodą mikroskopii, która pozwala badaczom badać zachowanie białek i dynamikę jądrową w żywych komórkach drożdży rozszczepialnych podczas mitozy i mejozy.

Badanie dynamiki jądrowej drożdży rozszczepienia mitotycznego i mejotycznego za pomocą fluorescencyjnej mikroskopii żywych komórek

Tutaj prezentujemy solidną i szczegółową metodę analizy dynamiki mikrotubul w komórkach zsynchronizowanych w prometafazie przy użyciu mikroskopii konfokalnej z żywym krążkiem komórkowym i przetwarzania obrazów opartego na MATLAB.

Pomiar dynamiki mikrotubul za pomocą mikroskopii wirujących dysków w monopolarnych wrzecionach mitotycznych

Prezentowany tutaj jest protokół do obrazowania żywych komórek w nienaruszonej tkance w superrozdzielczości. Ustandaryzowaliśmy warunki obrazowania bardzo wrażliwej populacji dorosłych komórek macierzystych w ich natywnym środowisku tkankowym. Technika ta polega na zrównoważeniu rozdzielczości czasowej i przestrzennej, aby umożliwić bezpośrednią obserwację zjawisk biologicznych w żywej tkance.

Obrazowanie żywych komórek w superrozdzielczości struktur subkomórkowych

Tutaj przedstawiono test rekonstytucji in vitro oparty na mikroskopii TIRF, który jednocześnie określa ilościowo i porównuje dynamikę dwóch populacji mikrotubul. Opisano metodę jednoczesnego przeglądania zbiorowej aktywności wielu białek związanych z mikrotubulami na usieciowanych wiązkach mikrotubul i pojedynczych mikrotubulach.

Jednoczesna wizualizacja dynamiki mikrotubul usieciowanych i pojedynczych in vitro za pomocą mikroskopii TIRF

Drożdże rozszczepienia są tutaj używane jako heterologiczne gospodarze do ekspresji bakteryjnych białek cytoszkieletu, takich jak FtsZ i MreB, jako translacyjnych białek fuzyjnych z GFP, aby uwidocznić ich polimeryzację. Również związki, które wpływają na polimeryzację, są identyfikowane przez obrazowanie za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego.

Drożdże rozszczepieniowe jako platforma do badań przesiewowych leków przeciwbakteryjnych ukierunkowanych na białka cytoszkieletu bakteryjnego

Protokół ten opisuje dwie metody zatrzymania cyklu komórkowego drożdży oraz opcjonalnego uwalniania oraz rozwija zastosowanie mikroskopii fluorescencyjnej do badania procesów zależnych od cyklu komórkowego u S. cerevisiae.

Manipulacja i analiza procesów zależnych od cyklu komórkowego u drożdży pączkujących

Poznaj metodę obrazowania dynamiki mikrotubul astralnych w żywych komórkach drożdży pączkujących przy użyciu mikroskopii konfokalnej. Ta technika umożliwia badanie wpływu mutacji na dynamikę mikrotubul in vivo.

Obrazowanie i analiza w wysokiej rozdzielczości dynamiki poszczególnych mikrotubul astralnych u pączkujących drożdży

Przeglądaj więcej filmów