Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

Ogólnym celem tej procedury jest zamrożenie tkanek mięśniowych poprzez bezpośrednie zanurzenie ich w ciekłym azocie, przy jednoczesnym wyeliminowaniu artefaktów mrożenia. Maozhang He, student z mojego laboratorium, zaprezentuje tę procedurę wraz z Yizhong Huang. Na początek należy opisać tożsamość próbki na każdej probówce kriogenicznej.

Następnie przygotuj następujący sprzęt: zbiornik z ciekłym azotem, okulary ochronne lub przyłbicę, rękawice do zamrażarek, kleszczyki 10 cm oraz pęsetę 25 cm. Przygotuj również styropianową lodówkę, folię plastikową, skalpel oraz okładki do bindowania z PVC w formacie A4. Aby przygotować próbki mięśni, zacznij od napełnienia lodówki ciekłym azotem.

W ciągu pięciu minut od pobrania preparatu delikatnie umieść próbkę na kawałku okładki do opraw PVC w formacie A4 i określ kierunek włókien mięśniowych. Następnie za pomocą skalpela wykonaj dwa równoległe nacięcia w preparacie wzdłuż włókien mięśniowych, o długości około 3 centymetrów i odstępie 0,6 centymetra. Przytnij nacięty mięsień do kształtu prostokąta o wymiarach około 0,6 centymetra szerokości, 0,6 centymetra wysokości i 1,5 centymetra długości.

Następnie, używając pincety dziesięciocentymetrowej, delikatnie przenieś próbkę na kawałek folii plastikowej w taki sposób, aby oś podłużna naciętego mięśnia była równoległa do długiej krawędzi folii. Umieść tkankę mięśniową w dolnej środkowej części opisanej probówki kriogenicznej, dokładnie pomiędzy otworami wlotowymi, a następnie szczelnie zamknij probówkę. Aby zamrozić próbkę tkanki, użyj pęsety dwudziestopięciocentymetrowej, by szybko zanurzyć całą probówkę kriogeniczną w ciekłym azocie, znajdującym się w schłodzonym pojemniku styropianowym, i poczekaj, aż ciekły azot przestanie wrzeć.

Ilość ciekłego azotu powinna być wystarczająca do całkowitego zanurzenia krioszczelnej probówki, a probówka ta powinna znajdować się w całości poniżej poziomu cieczy. Przenieś próbki mięśni do zbiornika z ciekłym azotem lub do zamrażarki w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Należy unikać przypadkowego kontaktu zamrożonych mięśni z naczyniami lub narzędziami w temperaturze pokojowej.

Aby przygotować preparaty, należy schłodzić kriostat do temperatury od 20 °C do 22 °C. Należy wyjąć i wyrzucić zużytą ostrze mikrotomu, a następnie przetrzeć uchwyt noża oraz płytkę antyrolującą w kriostacie. Następnie w kriostacie należy zamontować nowe ostrze mikrotomu i ustawić grubość cięcia na 8 µm.

Wyjmij probówkę kriogeniczną z próbką mięśnia z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie lub z zamrażarki o temperaturze -80°C i umieść ją w ciekłym azocie lub na suchym lodzie. Następnie przenieś próbkę do kriostatu i odczekaj 30 minut, aż preparat wyrówna temperaturę z temperaturą kriostatu. Po zatopieniu próbki w medium OCT, zamocuj ją w uchwycie do preparatów.

Następnie należy wykonać przekroje o grubości ośmiu mikrometrów. Przekroje należy nanieść na środek szkiełka przedmiotowego w temperaturze pokojowej. Następnie niezwłocznie umieścić szkiełko w kasecie na preparaty.

Następnie umieścić kasetkę z szkiełkami w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek w temperaturze pokojowej. Jak widać tutaj, kryształy lodu, które utworzyły się po umieszczeniu próbki mięśnia najdłuższego grzbietowego świń bezpośrednio w zamrażarce o temperaturze -80 °C, spowodowały znany jako efekt sera szwajcarskiego w krioprzekroju mięśnia.

Kryształy lodu tworzyły się również wtedy, gdy tkanka mięśniowa była zanurzana bezpośrednio w ciekłym azocie. Stosując inną metodę, w przedziale cytoplazmatycznym włókien mięśniowych powstało wiele igłowatych kryształów lodu, gdy tkankę zanurzono w medium montażowym OCT w odpowiedniej orientacji, a następnie szybko zamrożono w zawiesinie izopentanu. Zamrażanie tkanki w wielo otworskowej probówce kriogenicznej zapewnia doskonałą integralność preparatu, z wyraźnie widocznym przedziałem cytoplazmatycznym i ścisłym przyleganiem włókien mięśniowych do otaczającej tkanki.

Przy użyciu tej metody przeanalizowano aktywność ATPase w szybko kurczliwych i wolno kurczliwych włóknach mięśniowych. Przy zastosowaniu równych czasów reakcji włókna szybko kurczliwe wykazują barwienie jasne, z dwoma stopniami natężenia, natomiast włókna wolno kurczliwe barwią się na czarno. W standardowej metodzie mrożenia przedstawionej w materiale tkanka mięśniowa została zanurzona w zawiesinie izopentanu bez bezpośredniego kontaktu z medium montażowym OCT; jednakże stan stało-ciekłej zawiesiny izopentanu jest trudny do utrzymania przez więcej niż jedną godzinę, a izopentan nie zawsze jest dostępny.