Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

Ogólnym celem tej procedury jest zamrożenie tkanek mięśniowych poprzez zanurzenie ich bezpośrednio w ciekłym azocie przy jednoczesnym wyeliminowaniu artefaktów zamrażania. Maozhang He, student z mojego laboratorium, zademonstruje tę procedurę z Yizhong Huangiem. Na początek oznacz tożsamość próbki na każdej fiolce kriogenicznej.

Następnie zorganizuj następujący sprzęt: zbiornik z ciekłym azotem, okulary ochronne lub osłonę twarzy, rękawice do zamrażania, 10-centymetrowe kleszcze i 25-centymetrową pęsetę. Zorganizuj również styropianową chłodziarkę, folię z tworzywa sztucznego, skalpel i osłony do bindowania A4 PCV. Aby przygotować próbki mięśni, zacznij od napełnienia chłodnicy ciekłym azotem.

W ciągu pięciu minut od pobrania próbki delikatnie umieść próbkę na kawałku osłony wiążącej A4 PVC i obserwuj kierunek włókien mięśniowych. Następnie za pomocą skalpela wykonaj dwa równoległe nacięcia przez próbkę w kierunku włókien mięśniowych, o długości około 3 centymetrów i odległości 0,6 centymetra od siebie. Przytnij nacięty mięsień w prostokąt o szerokości około 0,6 centymetra, wysokości 0,6 centymetra i długości 1,5 centymetra.

Następnie za pomocą dziesięciocentymetrowych kleszczy delikatnie umieść próbkę na kawałku folii z tworzywa sztucznego tak, aby oś podłużna naciętego mięśnia była równoległa do dłuższej krawędzi folii. Umieść tkankę mięśniową w dolnej środkowej części oznakowanej fiolki kriogenicznej, tuż między otworami wlotowymi i szczelnie zakręć fiolkę. Aby zamrozić próbkę tkanki, użyj 25-centymetrowej pęsety, aby szybko zanurzyć całą fiolkę kriogeniczną w ciekłym azocie, we wstępnie schłodzonej styropianowej chłodnicy, czekając, aż ciekły azot przestanie wrzeć.

Ciekły azot powinien być wystarczający do zanurzenia całego kriowiala, a fiolka kriogeniczna powinna znajdować się całkowicie poniżej poziomu cieczy. Przenieś próbki mięśni do zbiornika do przechowywania ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza w celu długotrwałego przechowywania. Ważne jest, aby unikać przypadkowego kontaktu zamrożonych mięśni z pojemnikami lub narzędziami o temperaturze pokojowej.

Aby przygotować szkiełka, należy wstępnie schłodzić kriostat do temperatury od 20 stopni Celsjusza do 22 stopni Celsjusza. Wyjmij i wyrzuć stare ostrze mikrotonowe i wytrzyj uchwyt noża oraz płytkę zapobiegającą przetaczaniu się w kriostacie. Następnie zainstaluj nowe ostrze mikrotonowe w kriostacie i ustaw grubość cięcia na osiem mikrometrów.

Wyjmij fiolkę kriogeniczną z próbką mięśni ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze 80 stopni Celsjusza i umieść ją w ciekłym azocie lub na suchym lodzie. Następnie przenieś próbkę do kriostatu i odczekaj 30 minut, aż próbka zrównoważy się z temperaturą kriostatu. Po użyciu OCT do osadzenia próbki, zamontuj próbkę w uchwycie na próbkę.

Następnie wytnij osiem odcinków mikrometrycznych. Zamontuj sekcje w kierunku środka mikroprowadnicy o temperaturze pokojowej. Natychmiast umieść szkiełko w pudełku na slajdy.

Następnie umieść pudełko ze szkiełkami w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza. Nie pozwól, aby szkiełko wyschło w temperaturze pokojowej. Jak widać tutaj, kryształki lodu powstały, gdy próbka mięśnia najdłuższego grzbietu świni została umieszczona bezpośrednio w zamrażarce o temperaturze 80 stopni Celsjusza i spowodowała dobrze znany efekt sera szwajcarskiego na kriosekcji mięśni.

Kryształki lodu powstawały również, gdy tkanka mięśniowa była zanurzona bezpośrednio w ciekłym azocie. Stosując inną metodę, wiele przypominających igły kryształków lodu utworzyło się w cytoplazmatycznym przedziale włókien mięśniowych, gdy tkanka została zanurzona w podłożu montażowym OCT we właściwej orientacji, a następnie szybko zamrożona w zawiesinie izopentanu. Zamrożenie tkanki w wielootworowym kriowiale pozwala osiągnąć doskonałą integralność próbki, z wyraźnie widocznym przedziałem cytoplazmatycznym i ścisłym przyleganiem włókien mięśniowych do otaczającej tkanki.

Za pomocą tej metody analizowano aktywność ATPazy we włóknach mięśniowych szybko kurczących się i wolno kurczących się. Po podaniu równoważnych czasów włókna szybko kurczące się wydają się lekkie, o dwóch stopniach, a włókna wolno kurczące się wydają się czarne. W przedstawionej tutaj standardowej metodzie zamrażania, tkanka mięśniowa została zanurzona w zawiesinie izopentanu bez bezpośredniego kontaktu z medium montażowym OCT, jednak stan stałej cieczy zawiesiny izopentanu jest trudny do utrzymania przez ponad godzinę, a izopentan nie zawsze jest dostępny.