Name: Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-06T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 42 s
Description: Poznaj metodę kriowalenia tkanek mięśniowych poprzez bezpośrednie zanurzenie w ciekłym azocie, eliminującą artefakty zamarzania. Nowy kriowial z wieloma otworami zapobiega efektowi kołdry azotu, zapewniając doskonałą integralność próbek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt był wspierany przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (NSFC): 31301950 i 31671288.

Obecna metoda została opracowana i zatwierdzona do zbierania i przechowywania ponad 1000 próbek mięśni do barwienia histologicznego w naszym laboratorium. Wszystkie procedury związane z opieką nad zwierzętami i ich użytkowaniem były zgodne z wytycznymi ustanowionymi przez Ministerstwo Rolnictwa Chin.
1. Sprzęt do pobierania próbek
<ol>
	<li>Oznacz tożsamość próbki na każdej fiolce kriogenicznej. 
	Uwaga: Fiolka kriogeniczna jest specjalnie zaprojektowana do zamrażania świeżych próbek tkanek do procedury kriosekcji (ryc. 1A). Fiolki są wykonane z polipropylenu w fabryce form (rysunek 1C).</li>
	<li>Zaopatrz się w następujący sprzęt: ciekły azot w odpowiednim zbiorniku z ciekłym azotem, okulary ochronne lub przyłbicę, rękawice do zamrażania, kleszcze 10 cm, pęseta 25 cm, chłodziarka styropianowa (wymiary wewnętrzne: dł. 20 cm x szer. 12 cm x wys. 13,5 cm; wymiary zewnętrzne: dł. 24 cm x szer. 16 cm x wys.), folia z tworzywa sztucznego (dł. 2,5 cm x szer. 0,8 cm x grubość 0,1 mm), skalpel i okładki do oprawy A4 z PVC (21 cm x 29,5 cm) (Rysunek 1B).</li>
</ol>
2. Przygotowanie próbek mięśni
<ol>
	<li>Napełnij chłodnicę styropianu ciekłym azotem 5 minut przed pobraniem próbki. 
	UWAGA: Duża kolumna ciekłego azotu jest niezbędna, ponieważ część ciekłego azotu gotuje się i zamienia w gaz, gdy dotykają jej świeże próbki. Aby zmniejszyć częstotliwość przenoszenia ciekłego azotu w celu uzupełnienia ubytku, należy wcześniej nabyć chłodnicę styropianową o odpowiedniej wielkości, w zależności od liczby próbek.</li>
	<li>Po uzyskaniu próbki delikatnie umieść ją na kawałku osłony wiążącej z PVC A4 i obserwuj kierunek włókien mięśniowych. 
	UWAGA: Tutaj użyliśmy przekroju poprzecznego mięśnia najdłuższego grzbietu od pierwszego do ostatniego kręgu lędźwiowego u świń. Okazy mają około 12 cm długości, 8 cm szerokości i 5 cm wysokości.</li>
	<li>Za pomocą skalpela wykonaj dwa równoległe nacięcia przez próbkę w kierunku włókien mięśniowych, o długości około 3 cm i odległości 0,6 cm od siebie. Przytnij nacięty mięsień w prostokąt o szerokości około 0,6 cm x wysokości 0,6 cm x długości 1,5 cm. 
	UWAGA: Wiarygodność pomiaru pola przekroju poprzecznego włókien mięśniowych zależy głównie od orientacji włókien naciętego mięśnia.</li>
	<li>Za pomocą kleszczyków o długości 10 cm delikatnie umieść próbkę na kawałku folii z tworzywa sztucznego, tak aby oś podłużna naciętego mięśnia była równoległa do dłuższej krawędzi folii (rysunek 2A). 
	UWAGA: Folia z tworzywa sztucznego ma dwie funkcje: funkcję przytrzymywania, która pomaga w ustaleniu orientacji włókien mięśniowych oraz funkcję adhezji, która zapobiega pęknięciom próbki w wyniku szybkiego zamarzania.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy umieść tkankę mięśniową w dolnej środkowej części oznakowanej fiolki kriogenicznej, tuż między otworami wlotowymi, a następnie szczelnie zakręć fiolkę (ryc. 2B).</li>
</ol>
3. Zamrażanie i przechowywanie próbek mięśni
<ol>
	<li>Za pomocą pęsety o długości 25 cm szybko zanurz całą fiolkę kriogeniczną w ciekłym azocie we wstępnie schłodzonej chłodnicy styropianowej, czekając, aż ciekły azot przestanie się gotować (około 10-20 s). 
	UWAGA: Kriowial będzie unosił się na wodzie, gdy ciekły azot się zagotuje, więc ostrożnie zanurz fiolkę we wrzącym ciekłym azocie na 10-20 s.</li>
	<li>Przenieść próbki mięśni do zbiornika do przechowywania ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania.</li>
</ol>
4. Przygotowanie slajdów
<ol>
	<li>Schłodzić kriostat do temperatury od -20 °C do -22 °C.</li>
	<li>Wyjmij i wyrzuć stare ostrze mikrotomu, wytrzyj uchwyt noża i płytkę zabezpieczającą przed przewróceniem się w kriostacie, zainstaluj nowe ostrze mikrotomu w kriostacie i ustaw grubość cięcia na 8 μm.</li>
	<li>Przenieść próbkę mięśni w fiolce kriogenicznej ze zbiornika do przechowywania ciekłego azotu lub zamrażarki o temperaturze -80 °C do kriostatu, transportując ją w ciekłym azocie lub na suchym lodzie.</li>
	<li>Odczekać 30 minut, aż próbka zrównoważy się z temperaturą kriostatu. 
	UWAGA: Wszelkie urządzenia, które mogą dotknąć próbki, muszą być wstępnie schłodzone, ponieważ wysoka temperatura może spowodować tworzenie się kryształków lodu w próbce.</li>
	<li>Zamontować próbkę w uchwycie próbki w optymalnym roztworze glikoli i żywic rozpuszczalnych w wodzie (OCT) o optymalnej temperaturze skrawania. Cięcie odcinków 8 μm. 
	UWAGA: Dostosuj kąt cięcia prostopadle do orientacji włókien mięśniowych, ponieważ CSAF to pole przekroju poprzecznego włókien mięśniowych.</li>
	<li>Zamontuj sekcje w kierunku środka mikroszkiełka o temperaturze pokojowej. Natychmiast umieść szkiełko w pojemniku na szkiełka w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Nie pozwól, aby szkiełko wyschło w temperaturze pokojowej.</li>
</ol>

<ol><li>Joo, S. T., Kim, G. D., Hwang, Y. H., Ryu, Y. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+fresh+meat+quality+through+manipulation+of+muscle+fiber+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">Control of fresh meat quality through manipulation of muscle fiber characteristics.</a> Meat Sci. 95 (4), 828-836 (2013).</li>
<li>Lefaucheur, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+second+look+into+fibre+typing--relation+to+meat+quality%5BTitle%5D)+AND+%22Meat+Sci%22%5BJournal%5D)">A second look into fibre typing--relation to meat quality.</a> Meat Sci. 84 (2), 257-270 (2010).</li>
<li>Fiems, L. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double+Muscling+in+Cattle%3A+Genes%2C+Husbandry%2C+Carcasses+and+Meat%5BTitle%5D)+AND+%22Animals+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Double Muscling in Cattle: Genes, Husbandry, Carcasses and Meat.</a> Animals (Basel). 2 (3), 472-506 (2012).</li>
<li>Cockett, N. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+callipyge+mutation+and+other+genes+that+affect+muscle+hypertrophy+in+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Genet+Sel+Evol%22%5BJournal%5D)">The callipyge mutation and other genes that affect muscle hypertrophy in sheep.</a> Genet Sel Evol. 37, Suppl 1 65-81 (2005).</li>
<li>Stinckens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+RYR1+g.1843C%3ET+mutation+is+associated+with+the+effect+of+the+IGF2+intron3-g.3072G%3EA+mutation+on+muscle+hypertrophy%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">The RYR1 g.1843C>T mutation is associated with the effect of the IGF2 intron3-g.3072G>A mutation on muscle hypertrophy.</a> Anim Genet. 38 (1), 67-71 (2007).</li>
<li>Brameld, J. M., Buttery, P. J., Dawson, J. M., Harper, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nutritional+and+hormonal+control+of+skeletal-muscle+cell+growth+and+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nutr+Soc%22%5BJournal%5D)">Nutritional and hormonal control of skeletal-muscle cell growth and differentiation.</a> Proc Nutr Soc. 57 (2), 207-217 (1998).</li>
<li>Reinoso, R. F., Telfer, B. A., Rowland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+water+content+in+rats+measured+by+desiccation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Tissue water content in rats measured by desiccation.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 38 (2), 87-92 (1997).</li>
<li>Meng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+triage+and+freezing+for+models+of+skeletal+muscle+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Tissue triage and freezing for models of skeletal muscle disease.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Kumar, A., Accorsi, A., Rhee, Y., Girgenrath, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Do%27s+and+don%27ts+in+the+preparation+of+muscle+cryosections+for+histological+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Do's and don'ts in the preparation of muscle cryosections for histological analysis.</a> J Vis Exp. (99), e52793(2015).</li>
<li>Meijer, A. E., Vloedman, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+histochemical+characterization+of+the+coupling+state+of+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Histochemistry%22%5BJournal%5D)">The histochemical characterization of the coupling state of skeletal muscle mitochondria.</a> Histochemistry. 69 (3), 217-232 (1980).</li>
<li>Harnkarnsujarit, N., Kawai, K., Suzuki, T. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500156343">Effects of Freezing Temperature and Water Activity on Microstructure, Color, and Protein Conformation of Freeze-Dried Bluefin Tuna (Thunnus orientalis).</a> Food Bioprocess Technol. 8 (4), 916-925 (2015).</li>
<li>Dubowitz, V., Sewry, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDubowitz%2C+V+%22Muscle+Biopsy%3A+A+Practical+Approach%22">Muscle Biopsy: A Practical Approach</a>. , Elsevier. Ch. 15 407-422 (2007).</li>
<li>Suvarna, S. K., Layton, C., Bancroft, J. D. <a target="_blank" href="http://www.elsevier.ca/ISBN/9780702042263/Bancrofts-Theory-and-Practice-of-Histological-Techniques">Bancroft's Theory and Practice of Histological Techniques: Expert Consult: Online and Print, 7e</a>. , Elsevier. (2008).</li>
<li>Sulaiman, S. A., Kamarudin, N. A. Z. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/222964817_Bubble_Size_in_Coalescence_Dominant_Regime_of_Turbulent_Air-Water_Flow_Through_Horizontal_Pipes">Bubbles Size Estimation in Liquid Flow Through a Vertical Pipe.</a> J Appl Sci. 12 (23), 2464-2468 (2012).</li>
<li>Fukutomi, K., et al. <a target="_blank" href="https://www.jstage.jst.go.jp/article/kikaib1979/53/496/53_496_3516/_article">A Study of A Flow through Small Apertures : 2nd Report, Experiments on The Velocity Field.</a> Nihon Kikai Gakkai Ronbunshu B Hen/transactions of the Japan Society of Mechanical Engineers Part B. 53 (496), 3516-3521 (1987).</li>
<li>Shah, M. S., Joshi, J. B., Kalsi, A. S., Prasad, C. S. R., Shukla, D. S. <a target="_blank" href="http://agris.fao.org/agris-search/search.do?recordID=US201500029141">Analysis of flow through an orifice meter: CFD simulation.</a> Chem Eng Sci. 71 (9), 300-309 (2012).</li>
</ol>

Autorzy nie deklarują żadnych konfliktów interesów, finansowych lub innych.

W tym miejscu opisujemy nowy, wielootworowy kriowial do zamrażania i przechowywania tkanek mięśniowych w celu przeprowadzenia histologicznej oceny funkcji mięśni. Krytycznym zmodyfikowanym krokiem w tym protokole jest to, że próbka w wielootworowym kriowiale jest bezpośrednio zanurzona w ciekłym azocie. Według naszej wiedzy jest to najprostszy i najszybszy sposób uzyskania doskonałych zamrożonych próbek do kriosekcji mięśniowej spośród istniejących metod zamrażania (patrz reprezentatywne wyniki).
<p class="jove_conte...

Mięśnie szkieletowe są najcenniejszym składnikiem zwierzęcia produkującego mięso z punktu widzenia żywienia i przetwarzania. W przemyśle mięsnym istnieją dwa szczególnie krytyczne aspekty: efektywność wzrostu mięśni i jakość uzyskanego mięsa. Jako główny składnik mięśni, włókna mięśniowe są bezpośrednio związane z wydajnością wzrostu i jakością świeżego mięsa u zwierząt1. Na przykład całkowita liczba włókien (TNF) i pole przekroju poprzecznego włókien (CSAF) w większości determinują masę mięśniową i jakość mięsa; również skład rodzaju błonnika (FTC) silnie wpływa na jakość świeżego mięsa2. Dlatego manipulacja cechami włókien mięśniowych u zwierząt jest wysoce skuteczną metodą zwiększania podstawowej rentowności i konkurencyjności gospodarstw1.
Do tej pory zidentyfikowano kilka wewnętrznych i zewnętrznych czynników manipulujących charakterystyką włókien mięśniowych1. Manipulację tą można osiągnąć poprzez ukierunkowaną selekcję zwierząt z określonymi genami, takimi jak gen miostatyny u bydła3, gen Callipyge u owcy4 oraz geny RYR1 i IGF2 u świń5. Również kontrola diety i leczenie określonymi hormonami odgrywają ważną rolę w charakterystyce włókien mięśniowych6. W ten sposób podejście, które łączy czynniki genetyczne i żywieniowe, może być w stanie poprawić zawartość chudego mięsa i jego jakość. Jednak badania nad włóknami mięśniowymi są ograniczone w przemyśle mięsnym, ponieważ wyjaśnienie budowy włókien mięśniowych nadal stanowi wyzwanie.
Właściwości włókien mięśniowych są identyfikowane za pomocą metod histochemicznych, takich jak test miozyny adenozynotrifosfatazy (ATPazy). Metoda ta opiera się na fakcie, że enzymy znajdujące się w cienkich (6-8 μm) zamrożonych odcinkach włókien mięśniowych mogą ulegać reakcji chemicznej z niektórymi produktami. Jednak zawartość wody w mięśniach jest większa niż 75% u świń, królików, myszy i ludzi, niezależnie od pozycji (tj. grzbiet, brzuch lub kończyna tylna)7. Tak wysoka zawartość wilgoci w mięśniach powoduje często spotykany problem – zamarzanie artefaktów – podczas przygotowywania kriosekcji, jak opisano wcześniej8,9. Z naszego doświadczenia wynika, że w większości przypadków odpowiednie zamrożenie tkanek mięśniowych na linii produkcyjnej w rzeźni jest prawie niemożliwe.
Przedstawiony tutaj protokół opisuje prostą i efektywną metodę stosowaną w naszym laboratorium do zamrażania tkanek mięśniowych do kriosekcji w sposób wysokoprzepustowy. Główną atrakcją tej metody jest nowy kriowial, który jest przeznaczony do błyskawicznego zamrażania tkanek mięśniowych w ciekłym azocie. Obecny przebieg pracy może jednocześnie ułatwić zamrażanie i przetwarzanie tkanek w celu uzyskania doskonałej kriosekcji mięśni, z wyraźnie widocznym przedziałem cytoplazmatycznym i ścisłym przyleganiem włókien mięśniowych do otaczającej tkanki. Ponadto protokół ten może być stosowany do szerokiej gamy opcji analizy tkanek, ponieważ ciekły azot nie miesza się z tkankami.

<table><tbody><tr><td>Mikrotom kriostatu</td><td>&nbsp; Mikroskop</td> cyfrowy <td>Leica Leica CM1950</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nikon</td><td>Nikon DS-U3</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp; Fiolka kriogeniczna&nbsp; &nbsp; Folia z tworzywa sztucznego</td><td>Zaprojektowany przez nas</td>Ciekły azot Skalpel używany powszechnie Kleszcze używane powszechnie 10 cm Pęseta 25 cm używane powszechnie Szkło bezpieczne używane komunalnie Rękawice do zamrażania <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>Powszechnie używane</td></tr></tbody></table>

kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

A Multi-hole Cryovial Eliminates Freezing Artifacts when Muscle Tissues are Directly Immersed in Liquid Nitrogen

Badania nad fizjologią mięśni szkieletowych stoją przed technicznym wyzwaniem odpowiedniego przetwarzania próbek w celu uzyskania sekcji z wyraźnie widocznymi przedziałami cytoplazmatycznymi. Kolejną przeszkodą jest ścisłe przyleganie włókien mięśniowych do otaczających tkanek. Ponieważ proces utrwalania tkanek i osadzania parafiny prowadzi do kurczenia się włókien mięśniowych, zamrażanie jest optymalnym sposobem utwardzania tkanki mięśniowej do cięcia. Jednak często spotykany problem, jakim jest tworzenie się kryształków lodu, występuje podczas przygotowywania zamrożonych skrawków ze względu na wysoką zawartość wody w mięśniach. Przedstawiony tutaj protokół jako pierwszy opisuje prostą i skuteczną metodę prawidłowego zamrażania tkanek mięśniowych poprzez zanurzenie ich w ciekłym azocie. Problem z użyciem samego ciekłego azotu polega na tym, że powoduje on powstawanie bariery gazowej azotu obok tkanki, która działa jak izolator i hamuje chłodzenie tkanek. Aby uniknąć efektu "koca parowego", zaprojektowano nowy kriowial, który zwiększa prędkość przepływu cieczy po powierzchni tkanki. Osiągnięto to poprzez wybicie łącznie 14 otworów wlotowych w ściance fiolki. Zgodnie z dynamiką pęcherzyków, większe natężenie przepływu cieczy skutkuje mniejszymi pęcherzykami i mniejszymi szansami na utworzenie bariery gazowej. Kiedy ciekły azot wpływa do kriowialu przez otwory wlotowe, prędkość przepływu wokół tkanki jest wystarczająco duża, aby wyeliminować barierę gazową. W porównaniu z metodą zamrażania tkanek mięśniowych przy użyciu wstępnie schłodzonego izopentanu, protokół ten jest prostszy i bardziej wydajny i może być stosowany do zamrażania mięśni w sposób przepustowy. Ponadto metoda ta jest optymalna dla instytucji, które nie mają dostępu do izopentanu, który jest skrajnie łatwopalny w temperaturze pokojowej.

Ilustracja krio probówki oraz powszechnie stosowany sprzęt laboratoryjny do mrożenia mięśni podczas przygotowania skrawków mrożonych przedstawiono na Rysunku 1. Krio probówki są wykonane z polipropylenu w formie wtryskowej. Każda probówka posiada łącznie 14 otworów wlotowych: jeden znajduje się w zakrętce, inny na dnie, a pozostałe 12 tworzy cztery równoległe linie, z których każda składa się z czterech otworów ustawionych pod kątem 90° względem siebie. Otwory wlotowe te ...

Ten protokół opisuje procedurę zamrażania tkanek mięśniowych poprzez zanurzanie ich bezpośrednio w ciekłym azocie. Protokół ten podkreśla również nowy kriowial, który może uniknąć "ogólnego efektu" gazowego azotu, gdy ciekły azot styka się z powierzchnią tkanki próbki.

Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

Studies on skeletal muscle physiology face the technical challenge of appropriately processing the specimens to obtain sections with clearly visible ...

Ogólnym celem tej procedury jest zamrożenie tkanek mięśniowych poprzez bezpośrednie zanurzenie ich w ciekłym azocie, przy jednoczesnym wyeliminowaniu artefaktów mrożenia. Maozhang He, student z mojego laboratorium, zaprezentuje tę procedurę wraz z Yizhong Huang. Na początek należy opisać tożsamość próbki na każdej probówce kriogenicznej.Następnie przygotuj następujący sprzęt: zbiornik z ciekłym azotem, okulary ochronne lub przyłbicę, rękawice do zamrażarek, kleszczyki 10 cm oraz pęsetę 25 cm. Przygotuj również styropianową lodówkę, folię plastikową, skalpel oraz okładki do bindowania z PVC w formacie A4. Aby przygotować próbki mięśni, zacznij od napełnienia lodówki ciekłym azotem.W ciągu pięciu minut od pobrania preparatu delikatnie umieść próbkę na kawałku okładki do opraw PVC w formacie A4 i określ kierunek włókien mięśniowych. Następnie za pomocą skalpela wykonaj dwa równoległe nacięcia w preparacie wzdłuż włókien mięśniowych, o długości około 3 centymetrów i odstępie 0,6 centymetra. Przytnij nacięty mięsień do kształtu prostokąta o wymiarach około 0,6 centymetra szerokości, 0,6 centymetra wysokości i 1,5 centymetra długości.Następnie, używając pincety dziesięciocentymetrowej, delikatnie przenieś próbkę na kawałek folii plastikowej w taki sposób, aby oś podłużna naciętego mięśnia była równoległa do długiej krawędzi folii. Umieść tkankę mięśniową w dolnej środkowej części opisanej probówki kriogenicznej, dokładnie pomiędzy otworami wlotowymi, a następnie szczelnie zamknij probówkę. Aby zamrozić próbkę tkanki, użyj pęsety dwudziestopięciocentymetrowej, by szybko zanurzyć całą probówkę kriogeniczną w ciekłym azocie, znajdującym się w schłodzonym pojemniku styropianowym, i poczekaj, aż ciekły azot przestanie wrzeć.Ilość ciekłego azotu powinna być wystarczająca do całkowitego zanurzenia krioszczelnej probówki, a probówka ta powinna znajdować się w całości poniżej poziomu cieczy. Przenieś próbki mięśni do zbiornika z ciekłym azotem lub do zamrażarki w temperaturze -80 °C w celu długotrwałego przechowywania. Należy unikać przypadkowego kontaktu zamrożonych mięśni z naczyniami lub narzędziami w temperaturze pokojowej.Aby przygotować preparaty, należy schłodzić kriostat do temperatury od 20 °C do 22 °C. Należy wyjąć i wyrzucić zużytą ostrze mikrotomu, a następnie przetrzeć uchwyt noża oraz płytkę antyrolującą w kriostacie. Następnie w kriostacie należy zamontować nowe ostrze mikrotomu i ustawić grubość cięcia na 8 µm.Wyjmij probówkę kriogeniczną z próbką mięśnia z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie lub z zamrażarki o temperaturze -80°C i umieść ją w ciekłym azocie lub na suchym lodzie. Następnie przenieś próbkę do kriostatu i odczekaj 30 minut, aż preparat wyrówna temperaturę z temperaturą kriostatu. Po zatopieniu próbki w medium OCT, zamocuj ją w uchwycie do preparatów.Następnie należy wykonać przekroje o grubości ośmiu mikrometrów. Przekroje należy nanieść na środek szkiełka przedmiotowego w temperaturze pokojowej. Następnie niezwłocznie umieścić szkiełko w kasecie na preparaty.Następnie umieścić kasetkę z szkiełkami w zamrażarce o temperaturze -80 °C. Nie dopuścić do wyschnięcia szkiełek w temperaturze pokojowej. Jak widać tutaj, kryształy lodu, które utworzyły się po umieszczeniu próbki mięśnia najdłuższego grzbietowego świń bezpośrednio w zamrażarce o temperaturze -80 °C, spowodowały znany jako efekt sera szwajcarskiego w krioprzekroju mięśnia.Kryształy lodu tworzyły się również wtedy, gdy tkanka mięśniowa była zanurzana bezpośrednio w ciekłym azocie. Stosując inną metodę, w przedziale cytoplazmatycznym włókien mięśniowych powstało wiele igłowatych kryształów lodu, gdy tkankę zanurzono w medium montażowym OCT w odpowiedniej orientacji, a następnie szybko zamrożono w zawiesinie izopentanu. Zamrażanie tkanki w wielo otworskowej probówce kriogenicznej zapewnia doskonałą integralność preparatu, z wyraźnie widocznym przedziałem cytoplazmatycznym i ścisłym przyleganiem włókien mięśniowych do otaczającej tkanki.Przy użyciu tej metody przeanalizowano aktywność ATPase w szybko kurczliwych i wolno kurczliwych włóknach mięśniowych. Przy zastosowaniu równych czasów reakcji włókna szybko kurczliwe wykazują barwienie jasne, z dwoma stopniami natężenia, natomiast włókna wolno kurczliwe barwią się na czarno. W standardowej metodzie mrożenia przedstawionej w materiale tkanka mięśniowa została zanurzona w zawiesinie izopentanu bez bezpośredniego kontaktu z medium montażowym OCT; jednakże stan stało-ciekłej zawiesiny izopentanu jest trudny do utrzymania przez więcej niż jedną godzinę, a izopentan nie zawsze jest dostępny.

a-multi-hole-cryovial-eliminates-freezing-artifacts-when-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

W tym filmie demonstrujemy ultraszybką metodę kriowitryfikacji do konserwacji próbek biologicznych. Metoda polega na zastosowaniu kombinacji krioprotektantów w celu ochrony tkanki biologicznej przed uszkodzeniem przez zamarzanie poprzez zapobieganie tworzeniu się wewnątrzkomórkowych kryształków lodu.

Kriokonserwacja oparta na witryfikacji: ultraszybka technika chłodzenia służąca do przechowywania próbek biologicznych w bardzo niskich temperaturach w celu długotrwałego przechowywania

Ten film opisuje procedurę szybkiego zamrażania tkanki mięśniowej i uzyskiwania jej cienkich odcinków. Technika ta może pomóc w badaniu kacheksji związanej z rakiem w mysich modelach raka jelita grubego.

Błyskawiczne zamrażanie tkanki mięśniowej do cięcia: protokół uzyskiwania ultracienkich skrawków szybko zamrożonej mysiej tkanki mięśniowej

Analiza tkanek mięśni szkieletowych w celu określenia właściwości strukturalnych, funkcjonalnych i biochemicznych jest znacznie ułatwiona dzięki odpowiedniemu przygotowaniu.  Protokół ten opisuje odpowiednie metody przygotowania tkanki mięśni szkieletowych do szerokiego zakresu badań fenotypowania.

Klasyfikacja i zamrażanie tkanek w modelach chorób mięśni szkieletowych

Uzyskanie wysokiej jakości obrazów z transmisyjnej mikroskopii elektronowej jest wyzwaniem, szczególnie w przypadku komórek roślinnych, które mają obfite duże wakuole wypełnione wodą i napowietrzone przestrzenie. Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zastępowanie przez zamrażanie znacznie skracają czas przygotowania próbek roślinnych do TEM, jednocześnie wytwarzając próbki o doskonałej konserwacji ultrastrukturalnej.

Tandemowe zamrażanie wysokociśnieniowe i szybkie zamrażanie podstawiania tkanek roślinnych do transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Tutaj demonstrujemy najbardziej efektywne metody zamrażania, osadzania, kriosekcji i barwienia biopsji mięśni, aby uniknąć artefaktów zamrażania.

Co robić, a czego nie robić w przygotowaniu kriosekcji mięśni do analizy histologicznej

Ten manuskrypt opisuje łatwą w użyciu i tanią metodę kriofiksacji do wizualizacji komórek zawiesinowych za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej.

Zamrażanie wgłębne: narzędzie do badań ultrastrukturalnych i immunolokalizacyjnych komórek zawiesinowych w transmisyjnej mikroskopii elektronowej

Kolejne kriosekcje są zbierane, aby umożliwić zastosowania histologiczne i wzbogacenie RNA do pomiarów ekspresji genów przy użyciu sąsiednich regionów z pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy. Wysokiej jakości RNA uzyskuje się z 20 - 30 mg zbiorczych kriosekcji, a pomiary są bezpośrednio porównywane między aplikacjami.

Kriosekcja sąsiadujących ze sobą obszarów pojedynczego mięśnia szkieletowego myszy w celu ekspresji genów i analiz histologicznych

Prezentowany tutaj jest protokół kriogenicznego transferu zamrożonych próbek do sondy dynamicznego rezonansu magnetycznego (NMR) dynamicznej polaryzacji jądrowej (DNP) z magicznym kątem wirowania (MAS). Protokół zawiera wskazówki dotyczące przechowywania wirnika przed eksperymentem oraz wskazówki dotyczące pomiarów żywotności przed i po eksperymencie.

Ładowanie próbki kriogenicznej do wirującego spektrometru magnetycznego rezonansu jądrowego pod magicznym kątem, który zachowuje żywotność komórek

Ten manuskrypt przedstawia metodę ręcznego zamrażania próbek biologicznych do kriogenicznej mikroskopii elektronowej z pojedynczymi cząstkami.

Ręczne zamrażanie próbek biologicznych metodą blot and plunge do kriogenicznej mikroskopii elektronowej pojedynczych cząstek

Protokół ten opisuje nowatorski trójwymiarowy (3-D) model hodowli wykorzystujący hydrożel hialuronowy połączony z tyraminą do enkapsulacji i hodowli pęcherzyków preantralnych z jajnika myszy. Szczegółowo opisujemy również dwa podejścia do kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych przez witryfikację.

Zastosowanie nowego hydrożelu hialuronowego do trójwymiarowej hodowli pęcherzyków jajnikowych i metodologii kriokonserwacji pęcherzyków jajnikowych myszy

Poznaj metodę kriowalenia tkanek mięśniowych poprzez bezpośrednie zanurzenie w ciekłym azocie, eliminującą artefakty zamarzania. Nowy kriowial z wieloma otworami zapobiega efektowi kołdry azotu, zapewniając doskonałą integralność próbek.

Kriowialny z wieloma otworami eliminuje artefakty zamarzania, gdy tkanki mięśniowe są bezpośrednio zanurzone w ciekłym azocie

Przeglądaj więcej filmów