Technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków

Ogólnym celem tej małoinwazyjnej procedury laparoskopowej jest poprawa oceny skutków translokacji drobnoustrojów z przewodu pokarmowego poprzez pobieranie biopsji węzłów chłonnych krezki i wątroby w wielu punktach czasowych przy jednoczesnej poprawie dobrostanu zwierząt. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii HIV dotyczące immunologicznych konsekwencji infekcji i translokacji drobnoustrojów na węzły chłonne krezkowe i wątrobę oraz patologii tych tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na pobieranie próbek w wielu punktach czasowych badania przy minimalnym wpływie na zwierzę lub na oceniane parametry.

Metoda ta może dostarczyć próbek o kluczowym znaczeniu dla pogłębienia naszej wiedzy na temat wirusa HIV. Może być również stosowany do innych modeli, w których ważne jest zapalenie przewodu pokarmowego i translokacja drobnoustrojów. Zabieg przeprowadzą dr Jeremy Smedley i dr Cassie Moats, lekarze weterynarii z Washington National Primate Research Center.

Po przygotowaniu makaka do zabiegu, jak wskazano w protokole tekstowym, przykryj go sterylną zasłoną z okienkiem. Następnie, używając sterylnej zasłony na aparat, szczelnie przykryj aparat cyfrowy i podłącz go do wieży. Połącz sztywną lunetę z głowicą kamery.

Następnie podłącz sterylny świetlny do sztywnej lunety i podłącz go do źródła światła. Na koniec zamontuj sterylną rurkę do insuflacji na insulatatorze. Aby rozpocząć laparoskopię, umieść 15 ostrzy skalpela około jednego do dwóch centymetrów na lewo od pępka i wykonaj około 5-milimetrowe nacięcie w skórze, które dociera do mięśni brzucha.

Ręką niedominującą podnieś ścianę brzucha po stronie czaszki cięcia. Następnie drugą ręką wprowadź przez nacięcie końcówkę igły szpotawości skierowaną pod kątem w kierunku głowy zwierzęcia. Chwyć igłę szpotawości za trzon i mocno ją popchnij, aż przebije się przez ścianę jamy brzusznej, a opór wobec igły zmniejszy się w jamie brzusznej.

Następnie przymocuj rurkę insuflatora CO2 do igły i otwórz kurek, aby uwolnić gaz do jamy brzusznej. Stwórz odmę otrzewnową, osiągając ciśnienie do 10 do 12 milimetrów słupa rtęci. Teraz, gdy brzuch jest całkowicie nadmuchiwany, umieść 15 ostrzy skalpela nad lewym brzuchem czaszki, około dwóch do czterech centymetrów ogonowych do ostatniego żebra i wykonaj około pięciu do siedmiu milimetrowych nacięć skóry.

Następnie przełóż przez nacięcie pięciomilimetrowy zespół kaniuli trokarowej. Wprowadzić zespół na głębokość od jednego do dwóch centymetrów, kierując go pod kątem około 45 do 60 stopni kaudośrodkowo. Następnie ruchem obrotowym przesuń kaniulę do przodu, osiągając głębokość od 1,5 do trzech centymetrów, aby wkręcić kaniulę w brzuch.

Następnie wyjmij trokar. Odłączyć rurkę insuflatora od igły szpotawości, a następnie zakręcić kurek. Podłącz rurkę do kaniuli i otwórz kurek, aby utrzymać odmę otrzewnową.

Po sprawdzeniu, czy ciśnienie jest skutecznie utrzymywane, usuń igłę szpotawości. Następnie przez kaniulę włóż sztywną lunetę do jamy brzusznej. Pod kontrolą kamery pogłębić nacięcie skóry pozostałe po usunięciu igły szpotawości, przecinając mięśnie brzucha i otrzewną.

Na koniec ustaw zwierzę ze stopami uniesionymi pod kątem około 15 do 30 stopni nad głową. Aby pobrać biopsję z węzła chłonnego krezkowego, należy wprowadzić solidną sondę do jamy brzusznej przez przygotowane nacięcie. Umieść sondę między siecią a jelitem i delikatnym ruchem przypominającym zamaszyste ruchy odsłonij jelito od sieci aby uwidocznić krezkę, która jest ukryta poniżej.

Kontynuuj przesuwanie sondy z kierunku ogonowego do czaszkowego, aby odepchnąć sieć od pola operacyjnego. Następnie za pomocą sondy przesuń okrężnicę zstępującą w kierunku ściany brzucha. Zbadaj krezkę za pomocą sondy, aby zlokalizować krezkowe węzły chłonne znajdujące się wzdłuż okrężnicy i naczyń krezkowych.

Po zidentyfikowaniu węzła chłonnego zastąp sondę w jamie brzusznej kleszczami zapadkowymi Maryland i chwyć krezkę przylegającą do węzła. Pociągnij krezkę w kierunku nacięcia i wyjmij lunetę z kaniuli. Następnie wyłącz insulatator i pozostaw otwarty kran kaniuli, aby uwolnić gaz z jamy brzusznej, co ułatwi eksterioryzację krezki.

Następnie przeciągnij krezkę przez nacięcie. Chwyć zewnętrzną krezkę kleszczami, aby zapewnić dostęp przez nacięcie. Dotykaj lub obserwuj krezkę, aby zidentyfikować węzeł chłonny, który powinien wyglądać jako twardszy guzek lub bardziej szary obszar.

Następnie, używając zakrzywionych hemostatów, wykonaj od trzech do pięciu milimetrowych otworów w krezce przylegającej do węzła i tępo wypreparuj wszelkie przyczepy do tkanki. W razie potrzeby podwiązać naczynia krwionośne niewchłanialnym szwem monofilamentowym 4-0 i za pomocą skalpela wyciąć węzeł chłonny. Następnie umieścić biopsję w pożywce RPMI 1640 na lodzie.

Na koniec należy uwolnić krezkę i ponownie wdmuchnąć brzuch, aby umożliwić cofnięcie tkanki do jamy brzusznej. Przywróć tabelę do pozycji poziomej. Aby pobrać biopsję wątroby, wprowadź gwintowaną kaniulę do jamy brzusznej przez nacięcie używane do pobierania węzłów chłonnych.

Następnie za pomocą kaniuli wsuń sztywny zakres skierowany w stronę czaszkowej jamy brzusznej, aby uwidocznić wątrobę. Pod kontrolą kamery wprowadzić kleszcze biopsyjne przez kaniulę używaną wcześniej do wdmuchiwania jamy brzusznej. Umieść kleszcze poniżej wyznaczonego brzegu płata wątroby, tak aby ich szczęki były skierowane w stronę tkanki, i otwórz kleszcze, pozwalając, aby margines wpadł do szczęk.

Po wyregulowaniu ich położenia zamknij kleszcze i utrzymuj nacisk przez około 20 do 30 sekund. Następnie usuń próbkę, delikatnie przeciągając kleszcze przez kaniulę. Umieścić biopsję w pożywce RPMI na lodzie.

Na koniec upewnij się, że w miejscu biopsji nie obserwuje się krwotoku i zamknij nacięcia. Przedstawiono tutaj wydajność komórkową uzyskaną z biopsji węzłów chłonnych krezkowych i wątroby pobranych od dwóch zdrowych samic w dwóch różnych punktach czasowych. Zgodnie z oczekiwaniami, biopsje węzłów chłonnych dały znacznie większą liczbę izolowanych komórek w porównaniu z biopsjami wątroby.

Niezależnie od tkanki źródłowej, ponad 85% wyizolowanych komórek było zdolnych do życia. Następnie wyizolowane próbki komórek analizowano pod kątem populacji limfocytów CD45+leukocytów i CD45+CD3+limfocytów. Węzły chłonne krezkowe miały większą częstość występowania leukocytów CD45 + i limfocytów CD3 + w porównaniu z komórkami pochodzącymi z wątroby.

Szczegółowa charakterystyka izolowanych populacji wykazała, że krezkowe węzły chłonne zawierały istotnie wyższy odsetek limfocytów T CD3+ i limfocytów T CD4+, a także zwiększoną liczbę limfocytów T CD8+. I odwrotnie, wątroba była znacznie wzbogacona w leukocyty CD14+. Oba narządy wykazywały podobną obfitość komórek CD20+B.

Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu 30 do 40 minut. Zwierzęta są zazwyczaj odzyskiwane po znieczuleniu, aktywne i jedzące w ciągu kilku godzin, a nacięcia są tak małe, że mogą być trudne do zobaczenia po stronie klatki. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby utrzymać zwierzęta w stanie fizycznym, który ułatwi osiągnięcie sukcesu.

Znaczna ilość tłuszczu krezkowego może być trudną przeszkodą, ponieważ zasłania węzły i zwiększa smażalność i krwawienie. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak flebotomia, biopsja obwodowych węzłów chłonnych, endoskopia górnego i dolnego odcinka przewodu pokarmowego oraz biopsja odbytnicy w celu oceny ogólnoustrojowej i śluzówkowej odpowiedzi immunologicznej, stanu drobnoustrojów i barier nabłonkowych, a także wiremii. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z naszego laboratorium do badania populacji drobnoustrojów w stanach zapalnych podłużnie w tkankach makaków, które wcześniej były dostępne tylko w procesie sekcji

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię HIV, ponieważ translokacja drobnoustrojów jest główną przyczyną stanu zapalnego, który napędza patogenezę HIV. Ocena tego w sposób seryjny może dostarczyć potencjalnych celów i pozwolić na ocenę interwencji terapeutycznych. Nie zapominaj, że praca z makakami zarażonymi wirusem może być niezwykle niebezpieczna.

Powinny być dostępne środki ostrożności, takie jak odpowiednie szkolenie w zakresie zagrożeń biologicznych, w tym herpeswirusa 1 makakrysyny, odpowiednie środki ochrony osobistej, zestawy do gryzienia i drapania oraz odpowiednia obserwacja medyczna.