Name: Technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-02T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 6 s
Description: Poznaj technikę laparoskopową do pobierania węzłów chłonnych krezkowych i wątroby u makaków. Ta metoda umożliwia wielokrotne pobieranie próbek przy minimalnym obciążeniu zwierząt, wspierając badania nad translokacją mikrobną i biologią HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant NIH numer P51OD010425.

Zwierzęta były trzymane i opiekowane w obiektach akredytowanych przez Association for the Assessment and Accreditation of Laboratory Animal Care international (AAALACi), a wszystkie procedury na zwierzętach były wykonywane zgodnie z protokołami zatwierdzonymi przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Uniwersytetu Waszyngtońskiego i Washington National Primate Research Center.
1. Przygotowanie chirurgiczne, znieczulenie i analgezja
<ol>
	<li>Sedacja i indukcja
	<ol>
		<li>Uspokoić makaka wstrzyknięciem domięśniowym 10 mg/kg ketaminy i 0,015 mg/kg deksmedetomidyny (łącznie w jednej strzykawce). Upewnij się, że nie ma odruchów wycofania przed wyjęciem z klatki.</li>
		<li>Zaintubuj zwierzę i utrzymuj je w znieczuleniu ogólnym za pomocą izofluranu (1,0 - 2,5%) i 100% tlenu. Więcej informacji na temat intubacji i znieczulenia ogólnego u makaków można znaleźć w odnośnikach17,18,19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wspomaganie i monitorowanie anestezjologii
	<ol>
		<li>Wprowadzić cewnik do żył obwodowych i podać dożylnie płyny izotoniczne (takie jak mleczanowy roztwór Ringera) w ilości 5 ml/kg/h przez cały czas znieczulenia i operacji. Zastosuj sterylny lubrykant do oczu, aby zapobiec wysuszeniu rogówki.</li>
		<li>Zapewnij środki przeciwbólowe, takie jak preparat buprenorfiny o przedłużonym uwalnianiu (0,2 mg/kg, podskórnie). 
		UWAGA: NLPZ (taki jak meloksykam lub ketoprofen) może być również podawany podczas rekonwalescencji anestezjologicznej, pod warunkiem, że protokół eksperymentalny zezwala na podawanie NLPZ i że zwierzę jest normotensyjne i dobrze nawodnione podczas znieczulenia.</li>
		<li>Monitoruj głębokość znieczulenia (np. ton szczęki), tętno, częstość oddechów, EKG, ciśnienie krwi, natlenienie tętna, końcowy oddechowy CO2 i temperaturę ciała podczas znieczulenia i operacji. 
		UWAGA: Gdy brzuch jest nadmuchiwany, zwierzę może hipowentylować. Zapewnić wentylację mechaniczną, jeśli częstość oddechów spada lub końcowy poziom CO2 w oddychaniu przekracza 45 mmHg.</li>
		<li>Po zabiegu chirurgicznym należy podać atipamezol (0,15 mg/kg mc., domięśniowo) w celu odwrócenia deksmedetomidyny.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie chirurgiczne
	<ol>
		<li>Wykonaj wiele lewatyw z ciepłą wodą, aby zmniejszyć objętość kału w okrężnicy, aby ułatwić wizualizację i manipulację jelitami podczas zabiegu20.</li>
		<li>Użyj maszynki do strzyżenia z ostrzem numer 40, aby usunąć włosy z pola operacyjnego. Gol się od grzbietu żebrowego do kości łonowej i od lewej do prawej flanki.</li>
		<li>Aseptycznie przygotować pole operacyjne za pomocą odpowiednich środków antyseptycznych, takich jak naprzemienne peelingi z alkoholem chlorheksydynowym lub powidonem i alkoholem jodowym.</li>
		<li>Ułóż zwierzę na stole operacyjnym na jego grzbiecie, pod kątem w połowie odległości między leżeniem grzbietowym a prawym bocznym. Zwiąż ręce i nogi liną w wyprostowanej pozycji. Zapewnij końcowe przygotowanie chlorheksydyny i alkoholu, gdy zwierzę przejdzie na salę operacyjną i zostanie ustawione do operacji.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Chirurgia
Uwaga: Aby uzyskać więcej informacji na temat laparoskopii u małych zwierząt, zobacz reference21.
<ol>
	<li>Przygotowanie instrumentu laparoskopowego
	<ol>
		<li>Ułóż zwierzę sterylną zasłoną z okienkami.</li>
		<li>Za pomocą niesterylnego asystenta owiń aparat cyfrowy sterylną zasłoną aparatu i przymocuj do wieży. Przymocuj sztywną lunetę do głowicy kamery.</li>
		<li>Podłącz sterylny świetlny do sztywnego lunety i podłącz do źródła światła. Balans bieli aparatu zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
		<li>Podłącz sterylną rurkę insuflatora do insuflatora.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wejście laparoskopowe
	<ol>
		<li>Za pomocą skalpela #15 wykonaj ~ 5 mm nacięcie kłute przez skórę na głębokość mięśni brzucha, około 1 - 2 cm na lewo od pępka.</li>
		<li>Używając ręki niedominującej, unieś ścianę brzucha czaszki do miejsca nacięcia kłutego. Ręką dominującą umieść końcówkę igły Veress w nacięciu i ustaw końcówkę pod kątem czaszkowym. 
		UWAGA: Kąt penetracji igły Veress będzie się różnić w zależności od stanu ciała zwierzęcia. Na przykład u grubego zwierzęcia igła Veressa będzie musiała zostać wprowadzona prawie prostopadle do ściany brzucha. U szczupłego zwierzęcia igła Veressa powinna być ustawiona pod kątem czaszki, aby zmniejszyć ryzyko kontaktu z wnętrznościami.
		<ol>
			<li>Trzymając trzon (nie piastę) igły Veress, mocno wciśnij igłę, aby wniknęła w ścianę brzucha do jamy brzusznej. Wyraźne "kliknięcie" i spadek oporu będą odczuwalne, gdy ostra końcówka wnika w otrzewną, a końcówka igły Veress wyskakuje do przodu do jamy brzusznej. 
			UWAGA: Jeśli igła prawidłowo wejdzie do jamy brzusznej, opór będzie niewielki, gdy zostanie wysunięta i wycofana o 1 - 2 cm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Podłączyć rurkę wdmuchiwacza CO2 do igły i otworzyć zawór odcinający. Zwiększ ciśnienie w jamie brzusznej nie więcej niż 10-12 mmHg, aby wytworzyć odmę otrzewnową. 
		UWAGA: Brzuch osiągnął idealną insuflację, gdy rozszerzył się symetrycznie i nastąpiła utrata normalnego ostrego konturu brzegów żebrowych. Ciśnienie powinno zapewniać odpowiednią przestrzeń do wprowadzenia kaniuli/trokaru bez ryzyka kontaktu z wnętrznościami.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieszczenie kaniuli
	<ol>
		<li>Gdy brzuch jest całkowicie nadmuchiwany, wykonaj nacięcie ~ 5 - 7 mm ostrzem skalpela #15 przez skórę lewej części brzucha czaszki do mięśni brzucha ~ 2 - 4 cm ogonowo do ostatniego żebra.</li>
		<li>Umieść zespół trokar-kaniula 5 mm przez nacięcie skóry i ustaw go pod kątem ~ 45 - 60 stopni ogoniasto-przyśrodkowo. Wniknąć do jamy brzusznej na głębokość 1-2 cm. Wkręć gwintowaną kaniulę w brzuch, obracając kaniulę (~ 0,5 - 1 cm dalej) na głębokość 1,5 - 3 cm i wyjmij trokar.</li>
		<li>Wyjmij rurkę insuplatora z igły Veress, zakręć kran i wyjmij igłę. Podłącz rurkę insuflatora do kaniuli i otwórz kurek, aby utrzymać odmę otrzewnową na poziomie nie większym niż 10 - 12 mmHg.</li>
		<li>Przełóż sztywną lunetę przez kaniulę do jamy brzusznej.</li>
		<li>Pod wizualizacją kamery kontynuuj wykonywanie małego nacięcia ostrzem skalpela #15 przez mięśnie brzucha i otrzewną w poprzednim nacięciu skóry używanym do wprowadzenia igły Veress. Kamera służy do wizualizacji brzusznej strony nacięcia, aby uniknąć naczyń krwionośnych i zminimalizować krwawienie. 
		UWAGA: Upewnij się, że nacięcie przez mięsień i otrzewną jest wystarczająco duże, aby ułatwić wejście sondy i zewnętrzizowanie krezki (~ 0,5 cm). Większe nacięcie może być wymagane w celu uzewnętrznienia krezki u zwierząt z nadmierną ilością tłuszczu krezkowego.</li>
		<li>Umieść zwierzę w pozycji Trendelenburga21 ze stopami uniesionymi pod kątem około 15 - 30 stopni nad głową. Jest to opcjonalne, ale może umożliwić łatwiejszy dostęp do krezkowych węzłów chłonnych jelita grubego, ponieważ przewód cienki przesunie się do pozycji bardziej czaszkowej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Biopsja węzła chłonnego krezkowego
	<ol>
		<li>Pod wizualizacją kamery wprowadź solidną sondę przez nacięcie brzucha wykonane w kroku 2.3.5.</li>
		<li>Umieść sondę między siecią a jelitem i użyj zamaszystego ruchu, aby delikatnie zmieść sieć z jelita, aby umożliwić wizualizację leżącej pod spodem krezki. Kontynuując ruch zamiatający od ogona do czaszki. Sieć może być umieszczona w prawej części czaszki, tak aby znajdowała się poza polem operacyjnym</li>.
		<li>Użyj sondy, aby przesunąć okrężnicę zstępującą w kierunku lewej lub prawej ściany brzucha. Umożliwi to lepszą wizualizację krezki, aby pomóc w poszukiwaniu węzłów chłonnych krezkowych.</li>
		<li>Użyj sondy, aby przeczesać krezkę, aby zlokalizować krezkowe węzły chłonne wzdłuż okrężnicy i naczyń krezkowych. 
		UWAGA: Węzły okrężnicy biegną wzdłuż krezkowej granicy jelita grubego, lewe węzły kolkowe można znaleźć w pobliżu punktów rozgałęzień naczyń, a węzły krezkowe dolne można znaleźć wzdłuż dolnych naczyń krezkowych. Węzły chłonne krezkowe są łatwo widoczne u szczupłych zwierząt. Po zakopaniu w tłuszczu krezkowym często nadają lekko podniesiony, lśniący wygląd leżącej nad nim krezce i mogą mieć bardziej szarawy brązowy kolor niż otaczający tłuszcz krezkowy. Dodatkowo węzły chłonne krezkowe mają tendencję do leżenia wzdłuż układu limfatycznego i naczyniowego krezki.</li>
		<li>Po zidentyfikowaniu węzła chłonnego wyjmij sondę i włóż kleszcze zapadkowe Maryland do jamy brzusznej. Użyj kleszczy, aby chwycić krezkę przylegającą do węzła docelowego. Pociągnij krezkę w kierunku nacięcia i wyjmij lunetę z kaniuli.</li>
		<li>Wyłącz insulatator i pozostaw otwarty kran kaniuli, aby rozhermetyzować jamę brzuszną, aby ułatwić eksterioryzację krezki. Wyciągnij krezkę na zewnątrz ciała przez nacięcie. Po uzewnętrznieniu chwyć krezkę zakrzywionymi hemostatami komarów lub kleszczami kciuka, aby zapewnić dostęp przez nacięcie.</li>
		<li>Zidentyfikuj węzeł (węzły) chłonny w obrębie zewnętrznej krezki, badając palpacyjnie w celu uzyskania mocniejszego węzła chłonnego i/lub bezpośrednią wizualizację bardziej szarego koloru lub guzkowatego wyglądu węzła chłonnego.
		<ol>
			<li>Po zidentyfikowaniu wykonaj mały otwór (~ 3 - 5 mm) w krezce w pobliżu węzła za pomocą zakrzywionych hemostatów. Swobodne przyczepy do krezki za pomocą sekcji z zakrzywionymi hemostatami. W razie potrzeby podwiązać naczynia krwionośne niewchłanialnym szwem monofilamentowym 4-0. Użyj ostrego rozbioru skalpelem, aby usunąć węzeł chłonny. Umieść węzły w podłożu Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 na lodzie.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbadaj zewnętrzną krezkę pod kątem krwawienia. W przypadku stwierdzenia krwawienia należy zapewnić odpowiednią hemostazę, zamykając naczynia hemostatami lub ligaturami (niewchłanialny szew monofilamentowy 4-0) lub stosując kauteryzację. Zwolnij krezkę i wdmuchnij brzuch z powrotem do 10 - 12 mmHg, aby umożliwić krezka powrót do jamy brzusznej.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.4.1 do 2.4.8, aby uzyskać dodatkowe biopsje węzłów chłonnych.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Biopsja wątroby
	<ol>
		<li>Przywróć tabelę do pozycji poziomej.</li>
		<li>Umieść gwintowaną kaniulę w jamie brzusznej przez nacięcie używane wcześniej do pobrania biopsji węzłów chłonnych (nacięcie wykonane w kroku 2.3.5). Upewnij się, że nacięcie jest wystarczająco duże (~ 5 - 7 mm), aby umożliwić umieszczenie kaniuli bez wprowadzania trokaru. Przełóż sztywną lunetę przez tę kaniulę w kierunku czaszkowej jamy brzusznej i uwidocznij czaszkę, brzuch i wątrobę.</li>
		<li>Pod wizualizacją kamery wprowadzić kleszczyki biopsyjne przez kaniulę umieszczoną wcześniej w lewej części czaszki (nacięcie wykonane w kroku 2.3.1).</li>
		<li>Aby uzyskać biopsję wątroby, umieść kleszcze do biopsji pod wybranym brzegiem płata wątroby tak, aby ruchoma część szczęki była skierowana w stronę wątroby, otwórz kleszcze i pozwól, aby margines wpadł do otwartych szczęk. Upewnij się, że między wątrobą a kleszczami do biopsji nie ma sieci komórkowej. Dostosuj położenie kleszczyków i zamknij instrument nad żądanym obszarem próbki.
		<ol>
			<li>Utrzymuj ciśnienie przez około 20 - 30 s, aby zapewnić hemostazę. Przy zamkniętych kleszczach wyjmij próbkę, delikatnie przeciągając kleszcze przez kaniulę. Spowoduje to delikatne oderwanie biopsji od wątroby. Umieścić biopsje wątroby w pożywce RPMI 1640 na lodzie. 
			UWAGA: Rozmiar biopsji wątroby wynosi około 5 mm x 2 mm x 2 mm przy użyciu kleszczy do biopsji 5 mm.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbadaj miejsce biopsji pod kątem krwotoku za pomocą wizualizacji kamery. W przypadku zaobserwowania krwotoku należy przepuścić przez kaniulę sterylny wacik zwilżony solą fizjologiczną i przyłożyć ucisk do miejsca biopsji. Alternatywnie, wypełnij miejsca biopsji sterylną pianką żelową, aby wspomóc hemostazę.</li>
		<li>Powtórz kroki od 2.5.3 do 2.5.5, aby uzyskać dodatkowe biopsje wątroby. 
		UWAGA: W tym przypadku pobrano 3 biopsje na zwierzę podczas każdej procedury, co jest wystarczające do wszystkich dalszych analiz.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zamknięcie chirurgiczne
	<ol>
		<li>Zbadaj jamę brzuszną pod kątem krwawienia. 
		UWAGA: Do tej pory nie miało to miejsca. Jeśli jednak zauważy się nadmierne krwawienie, należy określić miejsce krwotoku i zapewnić odpowiednią hemostazę poprzez ucisk sterylnymi wacikami lub użycie pianki żelowej.</li>
		<li>Wyłączyć insulatator i otworzyć kurki kaniuli. Zastosuj delikatny ręczny nacisk na brzuch, aby całkowicie rozhermetyzować jamę otrzewnej. Wyjmij kaniule.</li>
		<li>Zamknij każde z nacięć ściany brzucha za pomocą 1 do 2 prostych szwów przerywanych na miejsce. Zalecany jest szew wchłanialny 4-0.</li>
		<li>Wykonaj blok rozbryzgowy, umieszczając 0,1-0,3 ml bupiwakainy w każdym nacięciu w celu znieczulenia miejscowego przed zamknięciem skóry.</li>
		<li>Zamknij skórę za pomocą 1-2 zakopanych szwów przerywanych (zalecany jest szew wchłanialny 4-0) na miejsce. Można zastosować klej tkankowy.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przetwarzanie biopsji wątroby i analiza limfocytów
<ol>
	<li>Przechowuj kilka kawałków tkanki wątroby (o wymiarach około 0,5 mm x 0,5 mm x 0,5 mm) w probówkach do krioprezerwacji, w preferowanym roztworze do przechowywania RNA i 10% formalinie do przyszłych analiz molekularnych i histologicznych.
	<ol>
		<li>Pozostałe biopsje wątroby umieścić w 50 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 1x penicyliną/streptomycyną, 40 μg/ml dostępnego w handlu roztworu kolagenazy i 4 μg/ml DNAzy w sterylnym plastikowym kubku o pojemności 250 ml z pokrywką. Mieszać energicznie za pomocą mieszadła magnetycznego i płytki mieszającej przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Równomiernie rozprowadzić, wlewając strawioną tkankę. Rozdrobnić strawioną tkankę (z kroku 3.1.1) na dwóch filtrach 70 μm, umieścić w dwóch stożkowych probówkach o pojemności 50 ml w zawiesinę jednokomórkową za pomocą końcówki sterylnej strzykawki o pojemności 5 ml. Doprowadzić objętość obu probówek do 50 ml w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej 10% płodową surowicą bydlęcą i 1x penicyliną/streptomycyną (R10).</li>
	<li>Odwirować komórki przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant. Skoncentrować komórki w jednej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, zawieszając komórki z obu probówek w 5 ml R10 i łącząc w jedną stożkową probówkę o pojemności 50 ml. Doprowadzić objętość do 50 ml za pomocą R10. Policz komórki za pomocą hemocytometru, aby określić wydajność komórkową.
	<ol>
		<li>Odwirować komórki przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml R10, równomiernie rozprowadzić w dwóch okrągłodennych probówkach z polistyrenu o pojemności 5 ml i zwiększyć objętość każdej probówki do 4 ml za pomocą R10, dążąc do > 500 000 komórek w każdej probówce.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 4 ml roztworu soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Wirować przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 100 μl PBS, delikatnie wirując. Dodać 1,5 μl możliwej do utrwalenia barwie z martwych komórek. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 5 minut.</li>
	<li>Dodać następujące nierozcieńczone przeciwciała do barwienia powierzchni w mianach zalecanych przez producenta: CD45-PerCP (klon D058-1283), CD3-PE-CF594 (klon SP34-2), CD20-PE-Cyanin5 (klon 2H7), CD4-BV605 (klon OKT4), CD8-BV570 (klon RPA-T8) i CD14-BV785 (klon M5E2). Inkubować w temperaturze 4 °C przez 20 minut.</li>
	<li>Dodać 4 ml PBS i odwirować przy 840 x g przez 6 minut w temperaturze 4 °C. Zdekantować supernatant i ponownie zawiesić komórki w 250 μl 1% paraformaldehydu w PBS. 
	Uwaga: Paraformaldehyd jest toksyczny. Nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Przeanalizuj populacje komórek za pomocą cytometru przepływowego, zgodnie z opisem w reference22.</li>
</ol>

<ol><li>Peterson, L. W., Artis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intestinal+epithelial+cells%3A+regulators+of+barrier+function+and+immune+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Intestinal epithelial cells: regulators of barrier function and immune homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (3), 141-153 (2014).</li>
<li>Jacobs, J. P., Braun, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+and+genetic+gardening+of+the+intestinal+microbiome%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Immune and genetic gardening of the intestinal microbiome.</a> FEBS Lett. 588 (22), 4102-4111 (2014).</li>
<li>Macpherson, A. J., Smith, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mesenteric+lymph+nodes+at+the+center+of+immune+anatomy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Mesenteric lymph nodes at the center of immune anatomy.</a> J Exp Med. 203 (3), 497-500 (2006).</li>
<li>Vaikunthanathan, T., Safinia, N., Lombardi, G., Lechler, R. I. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/26835593">Microbiota, immunity and the liver.</a> Immunol Lett. 171, 36-49 (2016).</li>
<li>Macpherson, A. J., Heikenwalder, M., Ganal-Vonarburg, S. C. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/cell-host-microbe/abstract/S1931-3128(16)30442-5">The Liver at the Nexus of Host-Microbial Interactions.</a> Cell Host Microbe. 20 (5), 561-571 (2016).</li>
<li>Shuai, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptive+immunity+in+the+liver%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adaptive immunity in the liver.</a> Cell Mol Immunol. 13 (3), 354-368 (2016).</li>
<li>Chun, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistence+of+HIV+in+gut-associated+lymphoid+tissue+despite+long-term+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Persistence of HIV in gut-associated lymphoid tissue despite long-term antiretroviral therapy.</a> J Infect Dis. 197 (5), 714-720 (2008).</li>
<li>Horiike, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymph+nodes+harbor+viral+reservoirs+that+cause+rebound+of+plasma+viremia+in+SIV-infected+macaques+upon+cessation+of+combined+antiretroviral+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Virology%22%5BJournal%5D)">Lymph nodes harbor viral reservoirs that cause rebound of plasma viremia in SIV-infected macaques upon cessation of combined antiretroviral therapy.</a> Virology. 423 (2), 107-118 (2012).</li>
<li>North, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Viral+sanctuaries+during+highly+active+antiretroviral+therapy+in+a+nonhuman+primate+model+for+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Viral sanctuaries during highly active antiretroviral therapy in a nonhuman primate model for AIDS.</a> J Virol. 84 (6), 2913-2922 (2010).</li>
<li>Xu, H., Wang, X., Lackner, A. A., Veazey, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD8+down-regulation+and+functional+impairment+of+SIV-specific+cytotoxic+T+lymphocytes+in+lymphoid+and+mucosal+tissues+during+SIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Leukoc+Biol%22%5BJournal%5D)">CD8 down-regulation and functional impairment of SIV-specific cytotoxic T lymphocytes in lymphoid and mucosal tissues during SIV infection.</a> J Leukoc Biol. 93 (6), 943-950 (2013).</li>
<li>Zhang, L., Dailey, P. J., Gettie, A., Blanchard, J., Ho, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Liver+Is+a+Major+Organ+for+Clearing+Simian+Immunodeficiency+Virus+in+Rhesus+Monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Virology%22%5BJournal%5D)">The Liver Is a Major Organ for Clearing Simian Immunodeficiency Virus in Rhesus Monkeys.</a> Journal of Virology. 76 (10), 5271-5273 (2002).</li>
<li>Dillon, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+altered+intestinal+mucosal+microbiome+in+HIV-1+infection+is+associated+with+mucosal+and+systemic+immune+activation+and+endotoxemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">An altered intestinal mucosal microbiome in HIV-1 infection is associated with mucosal and systemic immune activation and endotoxemia.</a> Mucosal Immunol. 7 (4), 983-994 (2014).</li>
<li>Jiang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+bacterial+DNA+correlate+with+immune+activation+and+the+magnitude+of+immune+restoration+in+persons+with+antiretroviral-treated+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of bacterial DNA correlate with immune activation and the magnitude of immune restoration in persons with antiretroviral-treated HIV infection.</a> J Infect Dis. 199 (8), 1177-1185 (2009).</li>
<li>Sandler, N. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+levels+of+soluble+CD14+independently+predict+mortality+in+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Plasma levels of soluble CD14 independently predict mortality in HIV infection.</a> J Infect Dis. 203 (6), 780-790 (2011).</li>
<li>Klase, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysbiotic+bacteria+translocate+in+progressive+SIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Dysbiotic bacteria translocate in progressive SIV infection.</a> Mucosal Immunol. 8 (5), 1009-1020 (2015).</li>
<li>Evans, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIV-induced+Translocation+of+Bacterial+Products+in+the+Liver+Mobilizes+Myeloid+Dendritic+and+Natural+Killer+Cells+Associated+With+Liver+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">SIV-induced Translocation of Bacterial Products in the Liver Mobilizes Myeloid Dendritic and Natural Killer Cells Associated With Liver Damage.</a> J Infect Dis. 213 (3), 361-369 (2016).</li>
<li>Fish, R., Danneman, P. J., Brown, M., Karas, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFish%2C+R+%22Anesthesia+and+Analgesia+in+Laboratory+Animals.+2+edn%22">Anesthesia and Analgesia in Laboratory Animals. 2 edn</a>. , Elsevier. (2011).</li>
<li>Flecknell, P. A. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/book/9780123693761">Laboratory Animal Anaesthesia. 3 edn</a>. , Academic Press. (2009).</li>
<li>Tranquilli, W. J., Thurnom, J. C., Grimm, K. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTranquilli%2C+WJ+%22Lumb+and+Jones%27+Veterinary+Anesthesia+and+Analgesia%22">Lumb and Jones' Veterinary Anesthesia and Analgesia</a>. , Blackwell Publishing. (2007).</li>
<li>Ford, R. B., Mazzaferro, E. M. <a target="_blank" href="https://elsevier.ca/product.jsp?isbn=9781437707984">Kirk and Bistner's Handbook of Veterinary Procedures and Emergency Treatment. 9 edn</a>. , Elsevier. (2012).</li>
<li>Fransson, B. A., Mayhew, P. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFransson%2C+BA+%22Small+Animal+Laparoscopy+and+Thoracoscopy%22">Small Animal Laparoscopy and Thoracoscopy</a>. , Wiley Blackwell. (2015).</li>
<li>Hensley-McBain, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+Fecal+Microbial+Transplantation+on+Microbiome+and+Immunity+in+Simian+Immunodeficiency+Virus-Infected+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of Fecal Microbial Transplantation on Microbiome and Immunity in Simian Immunodeficiency Virus-Infected Macaques.</a> J Virol. 90 (10), 4981-4989 (2016).</li>
<li>Smedley, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laparoscopic+Technique+for+Serial+Collection+of+Para-Colonic%2C+Left+Colic%2C+and+Inferior+Mesenteric+Lymph+Nodes+in+Macaques%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Laparoscopic Technique for Serial Collection of Para-Colonic, Left Colic, and Inferior Mesenteric Lymph Nodes in Macaques.</a> PLoS One. 11 (6), 0157535(2016).</li>
<li>Park, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short-chain+fatty+acids+induce+both+effector+and+regulatory+T+cells+by+suppression+of+histone+deacetylases+and+regulation+of+the+mTOR-S6K+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Mucosal+Immunol%22%5BJournal%5D)">Short-chain fatty acids induce both effector and regulatory T cells by suppression of histone deacetylases and regulation of the mTOR-S6K pathway.</a> Mucosal Immunol. 8 (1), 80-93 (2015).</li>
<li>Ziegler-Heitbrock, H. W., Ulevitch, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD14%3A+cell+surface+receptor+and+differentiation+marker%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Today%22%5BJournal%5D)">CD14: cell surface receptor and differentiation marker.</a> Immunol Today. 14 (3), 121-125 (1993).</li>
<li>Brenchley, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microbial+translocation+is+a+cause+of+systemic+immune+activation+in+chronic+HIV+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microbial translocation is a cause of systemic immune activation in chronic HIV infection.</a> Nat Med. 12 (12), 1365-1371 (2006).</li>
</ol>

Autorzy deklarują brak sprzecznych interesów finansowych.

Tutaj demonstrujemy minimalnie inwazyjną technikę seryjnego pobierania biopsji MLN i wątroby, która miała 100% wskaźnik sukcesu u tych i innych zwierząt nieopisanych w tym badaniu. Co więcej, stosowanie tej techniki na tych samych zwierzętach na przestrzeni czasu nie wiązało się z żadnymi zdarzeniami niepożądanymi. Rzeczywiście, nie było żadnych powikłań wynikających z zastosowania tej techniki w innych kohortach zwierząt, które były zakażone SIV, simian/ludzkim wirusem niedoboru odporności (SHIV) lub wirusem Zika (dane niepublikowane). Podobnie, operacja ta okazała się skuteczna nawet u zwierząt, które wcześniej przeszły poważną operację jamy brzusznej, oraz u zwierząt z małopłytkowością (dane niepublikowane). Wykazaliśmy, że próbki te można pobrać przez te same dwa porty, odwracając położenie kamery podczas przełączania z MLN na wątrobę, unikając konieczności wykonywania dodatkowych nacięć. Czynniki wpływające na pobór MLN zostały wcześniej zgłoszone13.
Na przestrzeni czasu przeprowadzono do czterech kolekcji po 3 mln biopsji wątroby i 3 biopsje wątroby każda, bez powikłań, zmian we wskaźnikach powodzenia lub zmian w zebranych danych. Ponadto ta laparoskopowa technika pobierania MLN/wątroby została z powodzeniem połączona z innymi procedurami, takimi jak pobieranie obwodowych LN, endoskopowe biopsje górnego i dolnego odcinka przewodu pokarmowego, aspiracja szpiku kostnego, pobieranie płynu mózgowo-rdzeniowego i nakłucie żyły w tym samym znieczuleniu, co pozwala na obszerną ocenę odpowiedzi wirusologicznych i immunologicznych w sposób seryjny (dane niepublikowane).
Cała procedura trwa zazwyczaj 30 - 45 minut i odbywa się poprzez dwa nacięcia ~ 0,5 cm. U zwierząt otyłych może być konieczne wykonanie większego nacięcia (~1 - 1,5 cm) w celu pobrania MLN i może wymagać dodatkowego czasu na wykonanie. Zwierzęta z rozległym tłuszczem krezkowym często wymagają znacznego doświadczenia, aby odróżnić MLN od otaczającego tłuszczu. MLN są często znajdowane wzdłuż naczyń krezkowych i wydają się być bardziej rozpowszechnione w pobliżu punktów rozgałęzień w naczyniach. Krytycznym aspektem tej techniki jest to, że wymaga ona, aby wybrany MLN miał wystarczającą ruchomość w krezce, aby mógł zostać wyeksterioryzowany przez nacięcie brzucha. W rezultacie technika ta nie może być stosowana do zbierania MLN w pobliżu nasady krezki. Ze względu na powiększenie, czasami łatwiej jest zidentyfikować MLN za pomocą kamery, a uchwycenie w bliskiej odległości od MLN może pomóc w zlokalizowaniu i zidentyfikowaniu węzła po jego uzewnętrznieniu.
Użycie pozycji Trendelenburga nie zawsze jest wymagane do pobrania MLN, a jeśli MLN można łatwo pobrać bez użycia pozycji Trendelenburga, może to ułatwić biopsję wątroby, ponieważ zapobiegnie przesuwaniu się narządów w czaszce. Czasami, po umieszczeniu w pozycji Trendelenburga, wątroba jest przesuwana w górę w stosunku do przepony i musi być delikatnie manipulowana z powrotem na miejsce przed pobraniem biopsji. Ponieważ port do pobrania MLN znajduje się po lewej stronie, biopsje wątroby są zwykle pobierane z lewego bocznego i lewego przyśrodkowego płata wątroby, ponieważ znajdują się one bliżej kaniuli.
Pobrane biopsje MLN i wątroby zapewniły wystarczającą wydajność komórek do różnych dalszych analiz i wykazały wysoką żywotność pobranych komórek. W tym przypadku komórki wybarwiono do analizy cytometrycznej przepływowej populacji leukocytów i limfocytów i wyjaśniono kluczowe różnice między tymi dwoma ważnymi narządami odpornościowymi. Na przykład MLN były znacznie wzbogacone o limfocyty T CD4 + w porównaniu z wątrobą, ze względu na znaczenie MLN jako centralnych punktów gromadzenia i rozpowszechniania adaptacyjnych odpowiedzi immunologicznych, a także znaczenie T CD4 + w zarządzaniu odpowiedziami zapalnymi i tolerogennymi na antygeny środowiska pochodzące z diety i mikroorganizmów rezydujących w GI24. Jednak wątroba została znacznie wzbogacona o leukocyty CD14+ w porównaniu z MLN. CD14 ulega ekspresji głównie na monocytach i makrofagach i jest kluczowym składnikiem kompleksu receptorowego dla bakteryjnego lipopolisacharydu (LPS)25. Rzeczywiście, zwiększone stężenia rozpuszczalnego CD14 w osoczu są związane z translokacją drobnoustrojów i aktywacją immunologiczną w HIV i patogennych zakażeniach SIV26. Zatem wyższe częstości występowania leukocytów CD14+ w wątrobie prawdopodobnie wynikają z większego obciążenia bakteryjnego tego narządu w porównaniu z MLN. 
Tutaj demonstrujemy szybką i minimalnie inwazyjną technikę chirurgiczną do seryjnego pobierania biopsji MLN i wątroby przy użyciu tylko dwóch małych nacięć do laparoskopowego wprowadzenia, które nie doprowadziło do żadnych niepożądanych wyników. Próbki te stanowią użyteczną drogę do oceny kluczowych procesów immunologicznych, wirusologicznych i mikrobiologicznych zachodzących w MLN i wątrobie, które są odrębne i unikalne od odporności ogólnoustrojowej. Podobnie, biopsje wątroby mają kluczowe znaczenie dla długoterminowej oceny skutków HIV/SIV, terapii lekowych i translokowanych drobnoustrojów, które często łączą się, aby wywołać znaczne uszkodzenie wątroby16. Ponadto, ponieważ MLN i wątroba są narządami odpornościowymi narażonymi na mikrobiotę przewodu pokarmowego, możliwość oceny odporności tych narządów w czasie stanowi doskonałą platformę do zrozumienia roli, jaką mikrobiom odgrywa w utrzymaniu homeostazy immunologicznej gospodarza. Podsumowując, ocena wątroby i MLN ma ogromne znaczenie w kontekście skuteczności szczepionki i terapii, klirensu rezerwuaru wirusa SIV i ogólnej odporności błony śluzowej. Możliwość pobrania tych próbek za pomocą minimalnie inwazyjnego podejścia oznacza, że ryzyko wystąpienia stanu zapalnego związanego z zabiegiem jest mniejsze niż w przypadku obecnie opublikowanych technik i mniejszy wpływ na fizjologię zwierząt. W przyszłości ocenimy potencjał połączenia pobierania MLN i wątroby z pobieraniem śledziony przez te same dwie lokalizacje portów, aby umożliwić pobranie próbek innej ważnej i odrębnej części układu odpornościowego, która, jak wykazano, odgrywa znaczącą rolę w wielu modelach choroby.

Przewód pokarmowy (GI) jest największą powierzchnią błony śluzowej ciała i jest narażony na niezliczone antygeny pochodzące z żywności, patogenów i endosymbiotycznych społeczności bakteryjnych, powszechnie określanych jako mikrobiom1,2. Krezkowe węzły chłonne (MLN) wyściełają przewód pokarmowy i są głównym miejscem funkcji immunologicznej promującej odpowiedzi zapalne lub tolerogenne na te różne antygeny. Fizyczna organizacja MLN tworzy podzielony na przedziały system, który może reagować na antygeny lokalnie bez wywoływania odpowiedzi ogólnoustrojowych3. Podobnie, krew z przewodu pokarmowego spływa do wątroby przez żyłę wrotną przed powrotem do krążenia, a zatem jest narażona na działanie drobnoustrojów i produktów mikrobiologicznych, które przemieściły się z przewodu pokarmowego do blaszki właściwej i dostały się do krwiobiegu4. Wątroba funkcjonuje również jako wtórny narząd limfatyczny i ma dużą liczbę komórek odpornościowych, w tym wyspecjalizowane makrofagi, do usuwania translokowanych drobnoustrojów5,6. Tak więc MLN i wątroba są głównymi narządami odpornościowymi narażonymi na bakterie komensalne i chorobotwórcze z przewodu pokarmowego, a także środowisko antygenów z innych źródeł, co czyni je wyjątkowymi i ważnymi z perspektywy immunologicznej.
MLN są krytycznymi miejscami do oceny wirusologicznych i immunologicznych skutków zakażenia ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV) lub patogennym wirusem niedoboru odporności (SIV) i prawdopodobnie są zaangażowane we wczesne rozprzestrzenianie się SIV po prowokacji doodbytniczej. Wiadomo, że tkanka limfatyczna związana z jelitami jest głównym miejscem trwałej replikacji wirusa HIV, pomimo skutecznej kontroli wiremii za pomocą nowoczesnych terapii przeciwretrowirusowych (ART)7. W modelach infekcji SIV wykazano, że MLN są ważnymi rezerwuarami utajonego wirusa i mogą być głównym rezerwuarem8,9. Wątroba jest również ważna w zakażeniu lentiwirusowym, o czym świadczy akumulacja limfocytów T CD8 + specyficznych dla SIV w wątrobach makaków podczas ostrego zakażenia SIV10. Co więcej, jest to główny organ odpowiedzialny za usuwanie wirusa z krążenia11.
Zakażenie HIV i SIV wiąże się ze zmienioną mikrobiotą przewodu pokarmowego, zaburzoną integralnością nabłonka przewodu pokarmowego oraz zwiększoną translokacją drobnoustrojów i produktów mikrobiologicznych z jelita grubego na obrzeża i krążenie12,13. Procesy te są związane z miejscową i ogólnoustrojową aktywacją immunologiczną oraz zwiększoną zachorowalnością i śmiertelnością u osób zakażonych wirusem HIV14. W zakażeniu SIV translokowane bakterie zaobserwowano w klasie MLN<sup="xref">15, podczas gdy akumulacja produktów mikrobiologicznych w wątrobie powoduje stan zapalny i uszkodzenie narządu16. Tak więc, w kontekście zakażeń HIV i SIV, MLN i wątroba mogą być bardzo pouczające dla zrozumienia procesów zapalnych napędzanych przez bakterie rezydujące w przewodzie pokarmowym.
Tutaj prezentujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania próbek MLN i wątroby u naczelnych (NHP). Wykazaliśmy skuteczne działanie tej techniki na dwóch zdrowych samicach makaków rezusów (RM), pobierając próbki od każdego zwierzęcia dwa razy, z 160-dniowym odstępem między każdą operacją. Następnie wykorzystujemy te próbki do oceny i porównania kluczowych populacji leukocytów i limfocytów w każdym narządzie za pomocą cytometrii przepływowej i wykazujemy wysoce spójne dane między tymi dwoma punktami czasowymi.

<table><tbody><tr><td>Sztuczne łzy Lubrykant Maść okulistyczna</td><td>Patterson Veterinary</td><td>97-890-8152</td><td></td></tr><tr><td>Priority Care Chlorheksydyna 2% Scrub</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-842-6153</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol Vedco, Izopropyl 70%</td> <td>Patterson Veterinary</td><td>07-869-6434</td><td></td></tr><tr><td>Vedco Vetadine Scrub</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-869-6772</td><td></td></tr><tr><td>Hospira Mleczana Ringer's 250 mL</td><td>Patterson Veterinary</td><td>07-800-9325</td><td></td></tr><tr><td>Serweta chirurgiczna do laparotomii u młodzieży</td><td>Medline</td><td>DYNJP3004</td><td></td></tr><tr><td>Access 40 L Insufflator</td><td>Dyonics</td><td>7205832</td><td></td></tr><tr><td>300XL Xenon Light Source</td><td>Dyonics</td><td>7206084</td><td></td></tr><tr><td>460P 3 &ndash; Kamera cyfrowa CCD z głowicą</td><td>Dyonics</td><td>72200086</td><td></td></tr><tr><td>uniwersalna zasłona do kamery, 7" x 96"</td><td>Usługi wsparcia endoskopowego</td><td>ESS-6920</td><td></td></tr><tr>Uniwersalny światłowód, <td>usługi wsparcia endoskopowego</td><td>7,5 stopy</td><td>USA. OU225</td><td></td></tr><tr>Usługi <td>wsparcia endoskopii</td><td>rurki insuskopatora</td><td>TM-102</td><td></td></tr><tr><td>Uniwersalny sztywny zakres, 2,7 mm x 187,5 mm,</td><td>usługi wsparcia endoskopowego</td> 0 stopni <td>B30-0007-00</td><td></td></tr><tr><td>Osłona egzaminacyjna i ochronna do lunety 2,7 mm x 187,5 mm z jednym stałym kranem</td><td>Usługi wsparcia endoskopii</td><td>B10-0025-00</td><td></td></tr><tr><td>Sztywny zakres, 5 mm x 300 mm</td><td>Usługi</td> <td>wsparcia endoskopowegoB30-0071-00</td><td></td></tr><tr><td>Igła Veress, 2 mm x 80 mm&nbsp;</td><td>Usługi wsparcia endoskopowego</td><td>8302.08</td><td></td></tr><tr><td>Solidna sonda z oznaczeniami, 5 mm x 320 mm</td><td>Usługi wsparcia endoskopowego</td><td>8383.661</td><td></td></tr><tr><td>Maryland Kleszcze chwytające i preparujące z rękojeścią zapadkową o podwójnym działaniu, 3,5 mm x 240 mm&nbsp; &nbsp;</td><td>Usługi wsparcia endoskopowego</td><td>8390.2054</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze do biopsji, 3,5 mm x 310 mm</td><td>R. Wolf</td><td>8391.4063</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula z gwintem z tworzywa sztucznego z portem insuskopijnym, 3,5 mm x 60 mm</td><td>Usługi wsparcia endoskopowego</td><td>8903.072</td><td></td></tr><tr><td>Kaniula z gwintem z tworzywa sztucznego z portem insuskopijnym, 5,5 mm x 60 mm</td><td>Usługi wsparcia endoskopii</td><td>8919.333</td><td></td></tr><tr><td>Endoskopia trokarowa z końcówką</td><td> Usługi wsparcia</td><td>8903.101</td><td></td></tr><tr>Usługi <td>wsparcia endoskopii</td><td>trokarowej z końcówką piramidalną</td><td>8903.121</td><td></td></tr><tr><td>CO2</td><td>Airgas</td><td>CD USPE</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH30027FS</td><td>z roztworem stabilizującym L-glutaminę</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7021</td><td></td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TM Research Grade</td><td>Sigma Aldrich</td><td>5401119001</td><td>Komercyjnie dostępny roztwór kolegialny</td></tr><tr><td>Dnaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5025</td><td></td></tr><tr><td>70 &micro; m sitka do komórek</td><td>Morganville Scientific</td><td>CSS0200</td><td></td></tr><tr><td>5 ml strzykawka</td><td>BD</td><td>309646</td><td></td></tr><tr><td>50 ml stożkowe probówki wirówkowe</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>339652</td><td></td></tr><tr><td>Surowica bydlęca</td> płodu <td>Fisher Scientific</td><td>SH3007003</td><td></td></tr><tr><td>5 ml probówki polistyrenowe z okrągłym dnem</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-959A</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3025601</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Aqua Fixable Zestaw do barwienia martwych komórek</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>L34957</td><td>Aminowe barwienie martwych komórek</td></tr><tr><td>CD45-PerCP (klon D058-1283)</td><td>BD Biosciences</td><td>558411</td><td></td></tr><tr><td>PE-CF594 Mysz anty-Hu CD3 (klon SP34-2)</td><td>BD Biosciences</td><td>562406</td><td></td></tr><tr><td>BV605 Mysz Anti-Hu CD4 (klon OKT4)</td><td>Biolegend</td><td>317438</td><td></td></tr><tr><td>APC-H7 Mysz anty-Hu CD8 (klon SK1)</td> <td>BD Biosciences</td><td>560179</td><td></td></tr><tr><td>PE-Cy5 Mysz Anti-Hu CD20 (klon 2H7)</td> <td>BD Biosciences</td><td>555624</td><td></td></tr><tr><td>BV786 Mysz Anti-Hu CD14 (klon M5E2)</td> <td>BD Biosciences</td><td>563698</td><td></td></tr><tr><td>16% PARAFORMALDEHYD AQ SOLUTN</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-980-487</td><td></td></tr><tr><td>Cytometr przepływowy LSR II</td><td>BD</td><td>NA</td><td></td></tr></tbody></table>

technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków

Laparoscopic Technique for Serial Collection of Liver and Mesenteric Lymph Nodes in Macaques

Węzły chłonne krezkowe (MLN) i wątroba są narażone na działanie mikrobów i produktów mikrobiologicznych z przewodu pokarmowego (GI), co czyni je immunologicznie unikalnymi. Przewód pokarmowy i związany z nim MLN są miejscami wczesnej replikacji wirusa w zakażeniu ludzkim wirusem niedoboru odporności (HIV), a MLN są prawdopodobnie ważnymi miejscami rezerwuarowymi, które zawierają utajone zakażone komórki nawet po długotrwałej terapii antyretrowirusowej (ART). Wykazano, że wątroba odgrywa znaczącą rolę w odpowiedziach immunologicznych na lentiwirusy i wydaje się, że odgrywa znaczącą rolę w usuwaniu wirusa z krążenia. Modele naczelnych innych niż ludzie (NHP) dla HIV i zespołu nabytego niedoboru odporności (AIDS) ściśle naśladują te aspekty zakażenia wirusem HIV, a seryjne pobieranie próbek podłużnych z pierwotnych miejsc replikacji wirusa i związanych z nimi odpowiedzi immunologicznych w tym modelu pomoże wyjaśnić krytyczne zdarzenia w zakażeniu, patogenezę i wpływ różnych strategii interwencyjnych na te zdarzenia. Obecnie opublikowane techniki pobierania próbek wątroby i MLN obejmują poważną operację i/lub sekcję zwłok, co ogranicza możliwość badania tych ważnych miejsc w sposób seryjny u tego samego zwierzęcia. Wcześniej opisaliśmy laparoskopową technikę pobierania MLN. W tym miejscu opisujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania podłużnych próbek wątroby i MLN przez te same dwie lokalizacje portów, które są wymagane do pobrania MLN. Zastosowanie tych samych dwóch portów minimalizuje wpływ na zwierzęta, ponieważ nie są wymagane żadne dodatkowe nacięcia. Technika ta może być stosowana ze zwiększoną częstotliwością pobierania próbek w porównaniu z poważnymi operacjami jamy brzusznej i zmniejsza ryzyko powikłań chirurgicznych oraz związanych z nimi miejscowych i ogólnoustrojowych reakcji zapalnych, które mogą komplikować interpretację wyników. Procedura ta może potencjalnie ułatwić badania z wykorzystaniem modeli NHP przy jednoczesnej poprawie dobrostanu zwierząt.

Szczegółowe metody przetwarzania węzłów chłonnych krezkowych (MLN) pobranych laparoskopowo, a także uzyskane ilości komórek oraz częstotliwość występowania leukocytów w tych organach zostały opisane we wcześniejszych publikacjach13. Rysunek 1 przedstawia dane dotyczące liczby uzyskanych komórek oraz ich żywotności w porównaniu biopsji MLN i wątroby pobranych w dwóch odstępach czasowych co 160 dni od dwóch zdrowych samic makaków rezus (RM) z zastosowaniem tej techniki laparoskopowej. Stwierdzono, że liczba komórek uzyskanych z MLN była istotnie wyższa niż z wątroby (P = 0.0021), przy średniej odpowiednio 33.5 x 106 oraz 6.74 x 106 uzyskanych komórek. Barwienie martwych komórek i analiza metodą cytometrii przepływowej wykazały, że &gt;90% komórek wyizolowanych z obu organów było żywotnych.
Wykorzystując cytometrię przepływową, oceniliśmy i porównaliśmy liczebność leukocytów oraz limfocytów w MLN i wątrobie. Reprezentatywny schemat bramkowania dla wątroby przedstawiono na Rysunku 2, gdzie najpierw wyznaczono bramkę dla pojedynczych komórek w celu wykluczenia agregatów, następnie wybrano tylko komórki żywe, potem komórki CD45+, a na koniec komórki CD3+. Z populacji CD3+ oceniliśmy liczebność limfocytów T CD4+ i CD8+, natomiast z populacji CD3- oceniliśmy liczebność komórek CD14+ i CD20+. Reprezentatywne wykresy cytometrii przepływowej pokazujące populacje CD45+ i CD3+ z MLN i wątroby obu zwierząt w dniu 0 i dniu 160 przedstawiono na Rysunku 3, natomiast Rysunek 4 przedstawia liczebność leukocytów i limfocytów dla dwóch pobrań u obu zwierząt. W MLN stwierdzono istotnie wyższą liczebność komórek CD45+ niż w wątrobie (średnio odpowiednio 76,9% i 7,66% komórek żywych, P= 0,0002). Oczekiwane było, że MLN wykaże istotnie wyższe proporcje limfocytów T CD3+ (P &lt; 0,0001) oraz limfocytów T CD4+ (P = 0,0004). Odwrotnie, wątroba była istotnie wzbogacona w leukocyty CD14+ w porównaniu z MLN (P = 0,0036). W MLN odnotowano wyższą średnią liczbę limfocytów T CD8+ , jednak nie było to istotne statystycznie. Co zaskakujące, u obu zwierząt oba organy wykazały podobną liczebność limfocytów B CD20+. Uzyskana liczba komórek oraz liczebność różnych podgrup leukocytów i limfocytów z MLN w niniejszym badaniu potwierdziły wcześniej raportowane wartości23.
<img alt="Wykresy słupkowe wydajności i żywotności komórek dla MLN i wątroby, wykazujące istotną różnicę (P=0.0021)." src="/files/ftp_upload/55617/55617fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 1"> 
Rysunek 1. Całkowita wydajność komórkowa (góra) i żywotność komórek (dół) z seryjnie pobranych biopsji MLN i wątroby. W MLN odnotowano istotnie wyższą wydajność komórek niż w wątrobie. Jednak oba typy próbek dostarczyły wystarczającej liczby komórek do dalszych analiz. Żywotność komórek, zmierzona metodą cytometrii przepływowej przy użyciu stałego barwnika aminowego do martwych komórek, wykazała, że oba typy próbek zazwyczaj zapewniały żywotność komórek &gt; 90% po dysocjacji tkanek. Słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe między próbkami. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Schemat cytometrii przepływowej; analiza bramkowania komórek dla markerów CD: CD45, CD3, CD4, CD8, CD14, CD20." src="/files/ftp_upload/55617/55617fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rycina 2. Reprezentatywna strategia bramkowania w cytometrii przepływowej. W pierwszej kolejności wykluczono aglomeraty komórek, a następnie wyselekcjonowano wyłącznie komórki żywe po barwieniu aminowym barwnikiem do martwych komórek typu fixable. Następnie wyselekcjonowano leukocyty CD45+, a w kolejnym kroku limfocyty T CD3+. Z populacji CD3+ przeanalizowano limfocyty T CD4+ i CD8+. Z populacji CD3- przeanalizowano komórki CD14+ i CD20+. Tę samą strategię bramkowania zastosowano również dla MLN. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykresy kropkowe z cytometrii przepływowej przedstawiające FSC-H w stosunku do ekspresji CD45/CD3 dla komórek MLN i wątroby, dzień 0/160." src="/files/ftp_upload/55617/55617fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Wykresy z cytometrii przepływowej z MLN i wątroby dwóch zwierząt w badaniu podłużnym. Próbki z MLN i wątroby pobrano w odstępie 160 dni dla obu zwierząt. (A). Komórki CD45+ w MLN (leukocyty); (B) komórki CD45+ w wątrobie (leukocyty); (C) komórki MLN+ CD3+ (limfocyty T); (D) komórki CD3+ w wątrobie (limfocyty T). U obu zwierząt w MLN zaobserwowano wyższe proporcje komórek CD45+ i CD3+ w porównaniu z wątrobą. W czasie częstotliwość występowania tych populacji była podobna u obu zwierząt. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wyniki cytometrii przepływowej; częstość występowania komórek CD45+ w MLN w porównaniu z wątrobą; zaznaczono istotne wartości P." src="/files/ftp_upload/55617/55617fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Częstość występowania komórek CD45+ (po lewej) oraz różnych subpopulacji leukocytów i limfocytów (po prawej) w 23 indywidualnych próbkach. W MLN odnotowano istotnie wyższą częstość występowania komórek CD45+, CD3+ i CD4+, podczas gdy w wątrobie stwierdzono istotnie wyższą częstość leukocytów CD14+, co wykazuje unikalne funkcje każdego z organów. Słupki błędu reprezentują odchylenie standardowe między próbkami. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55617/55617fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>

Tutaj opisujemy minimalnie inwazyjną technikę laparoskopową do seryjnego pobierania próbek wątroby i krezkowych węzłów chłonnych (MLN) u makaków, która pozwala na zwiększenie częstotliwości pobierania próbek i zmniejsza ryzyko powikłań chirurgicznych w porównaniu do wykonywania laparotomii.

Technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków

The mesenteric lymph nodes (MLN) and the liver are exposed to microbes and microbial products from the gastrointestinal (GI) tract, making them ...

Ogólnym celem tej małoinwazyjnej procedury laparoskopowej jest usprawnienie oceny skutków translokacji drobnoustrojów z przewodu pokarmowego poprzez pobieranie węzłów chłonnych krezkowych oraz biopsji wątroby w wielu punktach czasowych, przy jednoczesnej poprawie dobrostanu zwierząt. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii HIV dotyczące immunologicznych następstw infekcji i translokacji drobnoustrojów w obrębie węzłów chłonnych krezkowych i wątroby, a także patologii tych tkanek. Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona pobieranie próbek w wielu punktach czasowych w ramach jednego badania przy minimalnym wpływie na zwierzę lub na oceniane parametry.Metoda ta pozwala na pozyskanie próbek kluczowych dla pogłębienia naszej wiedzy na temat HIV. Można ją również zastosować w innych modelach, w których istotne są stan zapalny przewodu pokarmowego oraz translokacja mikrobiologiczna. Procedury przeprowadzą dr Jeremy Smedley oraz dr Cassie Moats, lekarze weterynarii w Washington National Primate Research Center.Po przygotowaniu makaka do operacji zgodnie z opisem w protokole tekstowym, przykryj go jałowym obłożeniem z otworem. Następnie, używając jałowego pokrowca na kamerę, szczelnie osłoń aparat cyfrowy i podłącz go do wieży. Połącz sztywny endoskop z głowicą kamery.Następnie przymocuj sterylny światłowód do sztywnego endoskopu i podłącz go do źródła światła. Na koniec zamontuj sterylną rurkę do insufflacji w insufflatorze. Aby rozpocząć laparoskopię, ustaw ostrze skalpela 15 około jednego do dwóch centymetrów na lewo od pępka i wykonaj w skórze nacinanie punktowe o długości około 5 mm, sięgające mięśni brzucha.Niedominującą ręką unieś ścianę brzucha po stronie kranialnej od nacięcia. Następnie drugą ręką wprowadź przez nacięcie końcówkę igły varus, skierowaną kątem w stronę głowy zwierzęcia. Trzymając igłę varus za trzpień, dociśnij ją zdecydowanie, aż kliknie przy przebijaniu ściany brzucha, a opór stawiany igle w jamie brzusznej zmaleje.Następnie podłącz wężyk insufflatora CO2 do igły i otwórz kranik, aby wprowadzić gaz do jamy brzusznej. Utwórz pneumoperitoneum, osiągając ciśnienie od 10 do 12 mmHg. Po pełnym rozdmuchaniu jamy brzusznej, umieść ostrze skalpela nr 15 nad lewą górną częścią brzucha, około dwóch do czterech centymetrów za ostatnim żebrem, i wykonaj nacięcie skóry o długości około pięciu do siedmiu milimetrów.Następnie przez nacięcie wprowadź zestaw kaniuli trokarowej o średnicy 5 mm. Wprowadź zestaw na głębokość od 1 do 2 cm, kierując go pod kątem około 45 do 60 stopni w kierunku kaudomedialnym. Następnie ruchem obrotowym przesuń kaniulę do przodu, osiągając głębokość od 1,5 do 3 cm, aby wkręcić kaniulę do jamy brzusznej.Następnie usuń trokar. Odłącz rurkę insuflatora od igły varus, a następnie zamknij kurek. Podłącz rurkę do kaniuli i otwórz kurek, aby utrzymać pneumoperitoneum.Po upewnieniu się, że ciśnienie jest utrzymywane prawidłowo, należy usunąć igłę warus. Następnie, przez kaniulę, należy wprowadzić sztywny endoskop do jamy brzusznej. Pod kontrolą kamery należy pogłębić nacięcie skóry pozostałe po usunięciu igły warus, przecinając mięśnie brzucha i otrzewną.Na koniec ustaw zwierzę tak, aby stopy były uniesioneApproximately 15 do 30 stopni powyżej poziomu głowy. Aby pobrać biopsję z węzła chłonnego krezkowego, wprowadź sztywną sondę do jamy brzusznej przez przygotowane nacięcie. Umieść sondę pomiędzy siecią a jelitami i delikatnym ruchem zamiatającym odsłoń jelita od sieci, aby uwidocznić znajdującą się pod nimi krezkę.Kontynuuj przesuwanie sondy w kierunku od ogonowym do czaszkowym, aby odsunąć sieciówkę od pola operacyjnego. Następnie, używając sondy, przesuń zstępujące jelito grube w stronę ściany brzusznej. Przebadaj sondą krezkę, aby zlokalizować węzły chłonne krezki położone wzdłuż jelita grubego i naczyń krezkowych.Po zidentyfikowaniu węzła chłonnego, zastąp sondę w jamie brzusznej ząbkowaną kleszczykami Maryland i chwyć krezkę sąsiadującą z węzłem. Pociągnij krezkę w stronę nacięcia i wyjmij endoskop z kaniuli. Następnie wyłącz insufflator i pozostaw otwarty kurek kaniuli, aby wypuścić gaz z brzucha, co ułatwi eksterioryzację krezki.Następnie wyciągnij krezkę przez nacięcie. Chwyć wyciągniętą krezkę pęsetą, aby zapewnić dostęp przez nacięcie. Palpuj lub obserwuj krezkę, aby zidentyfikować węzeł chłonny, który powinien być widoczny jako twardszy guzek lub obszar o bardziej szarym zabarwieniu.Następnie, używając zakrzywionych kleszczyków hemostatycznych, wykonaj otwór o wielkości od trzech do pięciu milimetrów w krezce w sąsiedztwie węzła i przeprowadź rozczep preparatu z przylegających tkanek. W razie potrzeby podwiąż naczynia krwionośne za pomocą niewchłanialnej nici monofilamentowej 4-0 i za pomocą skalpela wypreparuj węzeł chłonny. Następnie umieść biopsjat w pożywce RPMI 1640 w lodzie.Na koniec zwolnij krezkę i ponownie wykonaj insufflację jamy brzusznej, aby umożliwić cofnięcie tkanki do jamy brzusznej. Przywróć stół do pozycji poziomej. W celu pobrania biopsji wątroby wprowadź kaniulę z gwintem do jamy brzusznej przez nacięcie wykorzystane do pobrania węzłów chłonnych.Następnie za pomocą kaniuli wprowadź sztywny endoskop, kierując go w stronę głowowej części jamy brzusznej, aby uwidocznić wątrobę. Pod kontrolą kamery wprowadź kleszczyki biopsyjne przez kaniulę używaną wcześniej do insuflacji jamy brzusznej. Ustaw kleszczyki poniżej wyznaczonego brzegu płata wątroby tak, aby ich ramiona były skierowane w stronę tkanki, a następnie otwórz kleszczyki, pozwalając brzegu tkanki wpaść między ramiona.Po skorygowaniu ich położenia, zamknij pęsetę i utrzymuj nacisk przez około 20 do 30 sekund. Następnie wyjmij próbkę, ostrożnie wyciągając pęsetę przez kaniulę. Umieść biopsjat w pożywce RPMI na lodzie.Na koniec upewnij się, że w miejscu biopsji nie występuje krwotok, a następnie zamknij nacięcia. Przedstawiono tutaj wydajność komórkową uzyskaną z biopsji węzłów chłonnych krezkowych i wątroby pobranych od dwóch zdrowych samic makaków w dwóch różnych punktach czasowych. Zgodnie z oczekiwaniami, biopsje węzłów chłonnych dostarczyły znacznie większej liczby wyizolowanych komórek w porównaniu z biopsjami wątroby.Niezależnie od tkanek źródłowych, ponad 85% wyizolowanych komórek było żywotnych. Następnie próbki wyizolowanych komórek poddano analizie w celu określenia populacji leukocytów CD45+ oraz limfocytów CD45+CD3+. W węzłach chłonnych krezkowych odnotowano wyższą częstość występowania leukocytów CD45+ i limfocytów CD3+ w porównaniu z komórkami pochodzącymi z wątroby.Szczegółowa charakterystyka wyizolowanych populacji wykazała, że węzły chłonne krezkowe zawierały znacznie wyższe proporcje limfocytów T CD3+ i limfocytów T CD4+, a także zwiększoną liczbę limfocytów T CD8+. Z kolei w wątrobie odnotowano istotnie wyższe wzbogacenie w leukocyty CD14+. W obu organach stwierdzono podobną liczebność limfocytów B CD20+.Po opanowaniu techniki, procedura ta może być wykonana w czasie od 30 do 40 minut. Zwierzęta zazwyczaj budzą się z narkozy, odzyskują aktywność i zaczynają jeść w ciągu kilku godzin, a nacięcia są na tyle małe, że mogą być trudne do zauważenia podczas przeglądu w klatce. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest utrzymanie zwierząt w kondycji fizycznej, która ułatwi osiągnięcie sukcesu.Znaczna ilość tłuszczu krezkowego może stanowić istotną przeszkodę, ponieważ przesłania węzły chłonne oraz zwiększa podatność tkanek na uszkodzenia i ryzyko krwawienia. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak flebotomia, biopsja obwodowych węzłów chłonnych, endoskopia górnego i dolnego odcinka przewodu pokarmowego oraz biopsja odbytnicy, w celu oceny systemowych i śluzówkowych odpowiedzi immunologicznych, stanu mikrobów i barier nabłonkowych, a także miana wirusów. Po opracowaniu ta technika utorowała drogą badaczom w naszym laboratorium do podłużnego badania populacji drobnoustrojów w stanach zapalnych w tkankach makaków, które wcześniej były dostępne wyłącznie podczas sekcji zwłok.Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię HIV, ponieważ translokacja mikrobiologiczna jest główną przyczyną stanu zapalnego napędzającego patogenezę HIV. Ocena tego procesu w sposób seryjny może dostarczyć potencjalnych celów i umożliwić ewaluację interwencji terapeutycznych. Należy pamiętać, że praca z makakami zainfekowanymi jakimkolwiek wirusem może być niezwykle niebezpieczna.Należy zapewnić odpowiednie środki ostrożności, takie jak właściwe przeszkolenie w zakresie zagrożeń biologicznych, w tym w odniesieniu do herpesvirus 1 makaków, stosowanie odpowiednich środków ochrony indywidualnej, dostęp do zestawów pierwszej pomocy po ugryzieniach i zadrapaniach oraz zapewnienie właściwej opieki medycznej po ekspozycji.

laparoscopic-technique-for-serial-collection-liver-mesenteric-lymph

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Aby śledzić przebieg odpowiedzi immunologicznej w czasie u tej samej myszy, węzły chłonne można usuwać sekwencyjnie drogą chirurgiczną. W niniejszym materiale opisujemy sposób wykonania tej techniki.

Chirurgiczne usuwanie powierzchownych węzłów chłonnych u myszy

Ten film demonstruje procedurę chirurgicznej izolacji węzła chłonnego drenującego pachwinę na modelu mysim. Nacięcie okolicy brzusznej zapewnia dostęp do pachwinowego węzła chłonnego, który jest pobierany chirurgicznie. Pobrany półprzezroczysty pachwinowy węzeł chłonny można wykorzystać do badań immunologicznych.

Pobieranie węzła chłonnego drenującego pachwiny z modelu mysiego

Ten film demonstruje technikę kanniulacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów. Metoda ta umożliwia bezpośredni dostęp do całej objętości składników obecnych w płynie limfatycznym.

Kaniulacja krezki limfatycznej w modelu szczura w celu pobrania płynu limfatycznego

Tutaj opisujemy technikę kannuacji krezkowego przewodu chłonnego u szczurów, która umożliwia ilościowe określenie transportu lipidów i leków przez układ limfatyczny po porodzie jelitowym. Technika ta może być dostosowana do oceny stężenia limfy krezkowej i/lub transportu płynu, komórek odpornościowych, peptydów, białek i cząsteczek lipofilowych.

Model szczura kaniulowanego kaniulowanego w krezkowym przewodzie chłonnym: zastosowanie do oceny transportu leków limfatycznych w jelitach

Przedstawiamy zabieg chirurgiczny polegający na cewnikowaniu jelitowego pnia limfatycznego u nowonarodzonych świń w celu pobrania dużych ilości składników metabolizmu lipidów z odprowadzającej limfy.

Długotrwałe cewnikowanie pnia limfatycznego jelit i pobieranie limfy u nowonarodzonych świń

Margining-hepatic leukocyty wykazują unikalne cechy i odrębne funkcje immunologiczne w porównaniu z innymi populacjami leukocytów. Tutaj opisujemy metodę selektywnego pobierania tej specyficznej populacji komórek wątroby poprzez wymuszoną perfuzję wątroby szczurów lub myszy. Leukocyty wątroby z marginesem wydają się mieć kluczowe znaczenie w określaniu podatności na choroby wątrobowe i przerzuty.

Selektywne pobieranie leukocytów wątrobowych z marginesami

Obecny protokół opisuje szczegółowy protokół chirurgiczny izolowania przepływającej limfy jelitowej w odpowiedzi na infuzje składników odżywczych dodwunastnicy u myszy. Pozwala to na fizjologiczne określenie całkowitego wchłaniania lipidów w jelitach oraz syntezy i wydzielania chylomikronu w odpowiedzi na różne eksperymentalne składniki odżywcze.

Izolacja przepływającej limfy krezkowej u myszy w celu ilościowego określenia in vivo kinetyki wchłaniania lipidów w diecie i wydzielania chylomikronu

Wykorzystanie rekonstrukcji 3D i wirtualnych symulacji w planowaniu przedoperacyjnym resekcji wątroby stanowi znaczący postęp w chirurgii onkologicznej. Opracowana przez nasz zespół technika 3D-LAST (trójwymiarowe podejście lokalizacyjne z jedwabną nicią) umożliwia bezpieczne, skuteczne i precyzyjne usuwanie guza z praktyczną nawigacją śródoperacyjną, obiecując szerokie zastosowanie w medycynie.

Trójwymiarowe podejście lokalizacyjne z laparoskopową segmentektomią pod kontrolą nici jedwabnej w przypadku guza wątroby

Protokół ten opisuje procedurę przeżycia dla bezpiecznej i dobrze tolerowanej mysiej krezki limfadenektomii na każdym z czterech stacji wzdłuż łańcucha węzłów chłonnych krezki. Procedura ta jest adaptowalna, aby umożliwić selektywne zakłócenie komunikacji limfatycznej z dalszym jelitem grubym, bliższym i/lub jelitem cienkim.

Mysia krezkowa limfadenektomia w celu selektywnego zakłócenia komunikacji limfatycznej z jelitem specyficznym dla regionu

Ten protokół eksperymentalny opisuje model szczura z kanalikiem limfatycznym wątroby, który umożliwia bezpośrednią i ilościową ocenę limfatycznego i naczyniowego drenażu wątroby. Model pozwala na jednoczesne pobieranie limfy wątrobowej i krwi ogólnoustrojowej w celu zbadania transportu, metabolizmu i sygnalizacji odpornościowej wątroby, wspierając badania farmakokinetyki leków i biologii specyficznej dla wątroby.

Kompleksowy model szczura do oceny dróg transportu wątrobowego poprzez jednoczesne pobieranie próbek limfatycznych i krwionośnych

Poznaj technikę laparoskopową do pobierania węzłów chłonnych krezkowych i wątroby u makaków. Ta metoda umożliwia wielokrotne pobieranie próbek przy minimalnym obciążeniu zwierząt, wspierając badania nad translokacją mikrobną i biologią HIV.

Technika laparoskopowa do seryjnego pobierania węzłów chłonnych wątroby i krezki u makaków

Przeglądaj więcej filmów