Ocena pierwotnych efektów wybuchu in vitro
September 18th, 2017
Zrozumienie, w jaki sposób komórki są modulowane przez ekspozycję na fale uderzeniowe, może pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów stojących za urazami wywołanymi przez wybuch. Protokół ten wykorzystuje specjalnie skonstruowane rurki uderzeniowe do przykładania fal uderzeniowych o różnym ciśnieniu do monowarstw komórek i identyfikowania ich późniejszego wpływu na żywotność komórek.
Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie reprezentatywnych fal uderzeniowych, które mogą wystąpić podczas wybuchu, oraz ocena wpływu tego wstrząsu mechanicznego na żywotność komórek pierwotnych w hodowli. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące reakcji poszczególnych typów komórek na zdarzenia o wysokiej energii, takie jak ekspozycja na falę uderzeniową. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala nam ocenić różne reakcje komórek na pojedynczą falę uderzeniową, w przeciwieństwie do odpowiedzi na poziomie tkanek lub narządów.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku identyfikacji mechanizmów komórkowych zmienionych w wyniku pierwotnych urazów wybuchowych, które są spowodowane ekspozycją na falę uderzeniową. Chociaż metoda ta jest demonstrowana z określonym typem komórek, dowolne komórki można hodować i umieszczać w konfiguracji testowej w celu oceny specyficznych dla komórek reakcji na falę uderzeniową. Na początek hoduj interesującą nas linię komórkową w standardowej hodowli, aż osiągną 80% konfluencji.
Następnie odessać pożywkę. Umyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj dwa mililitry Trypsyny-EDTA. Inkubuj je w standardowych warunkach hodowli przez pięć minut.
Krótko sprawdzić, czy komórki pomyślnie oddzieliły się od kolby. A następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej zawierającej FBS do kolby w celu zneutralizowania trypsyny i przeniesienia komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować komórki z prędkością 200 razy g przez cztery minuty, aby osadzać komórki.
Następnie powoli zasysać supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu. I ponownie zawieś granulat w pięciu mililitrach podłoża. Umieść trzy oznaczone 35-mililitrowe naczynia w 90-mililitrowym naczyniu.
Następnie dodaj dwa mililitry pożywki do każdego naczynia i wysiewaj je z 70 tysiącami komórek. Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić odpowiednie przyłączenie komórek przed wystawieniem ich na działanie fali uderzeniowej. Przed przystąpieniem do montażu rurki amortyzującej należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym buty robocze ze stalowymi noskami i fartuch laboratoryjny.
Zacznij od włożenia dwóch prętów wyrównujących przez otwory na znajdujące się w płaszczyźnie poziomej kołnierza wylotowego. Następnie umieść arkusz uszczelki z kauczuku nitrylowego na końcu prętów wyrównujących, tak aby znajdował się między kołnierzem wylotowym a zestawem do hodowli organów ex vivo. Przymocuj zestaw EVOC do kołnierza wylotowego rury amortyzującej, przesuwając uchwyt po prętach wyrównujących.
Upewnij się, że jest prawidłowo zorientowany, tak aby sekcja, w której znajduje się szalka Petriego, znajdowała się u jej podstawy. Następnie włóż cztery i podkładki M24 do pozostałych otworów i mocno dokręć nakrętki i kolejno w ukośnie symetryczny sposób, jednocześnie sprawdzając wzrokowo, czy zestaw EVOC i rura amortyzatora zostały pomyślnie wyrównane. Następnie podłącz przetwornik ciśnienia do statywu EVOC i podłącz go do źródła prądu za pomocą czujnika.
Dodatkowo użyj BNC, aby podłączyć źródło prądu do oscyloskopu. Upewnij się, że wszystkie zawory spustowe i regulatory przepływu na rurze amortyzatora są zamknięte. Następnie otwórz wbudowany zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i ręcznie obróć regulator ciśnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby naładować elektrozawór do 2,5 bara.
Otwórz butlę ze sprężonym powietrzem, a następnie powoli przekręć regulator ciśnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zwiększyć ciśnienie do około 15 barów. Następnie przygotuj membrany, tnąc arkusz tworzywa sztucznego o grubości 0,125 mililitra na kwadraty o wymiarach 10 centymetrów na 10 centymetrów. Utwórz uchwyty z taśmy i przymocuj je do górnej i dolnej części membrany.
Użyj ich, aby ostrożnie ustawić membranę obok przedniego małego kołnierza przy komorze zamka. Upewnij się, że membrana jest prosta i prawidłowo ustawiona przed zamknięciem zamka. A następnie zabezpiecz go na miejscu za pomocą czterech i nakrętek M24.
Wewnątrz sterylnego kaptura przygotuj samoprzylepne membrany przepuszczające gazy, tak aby każda z nich była wystarczająco duża, aby pokryć górną część jednej 35-mililitrowej szalki Petriego. Następnie przenieś 90-mililitrową szalkę Petriego zawierającą trzy próbki eksperymentalne do okapu. Odessać pożywkę z jednej z naczyń i przykryć ją dwoma sekcjami membrany, upewniając się, że między membraną a krawędzią naczynia jest szczelne uszczelnienie.
Przenieś próbkę do wiertnicy EVOC i przymocuj ją do podstawy oprawy tak, aby górna część naczynia była wyrównana z wewnętrzną podstawą rurki uderzeniowej. W tym momencie załóż ochronniki słuchu, okulary ochronne, obuwie ochronne i fartuch laboratoryjny. Zwiększ ciśnienie w systemie rurki uderzeniowej, obracając pokrętło regulacji przepływu na regulatorze zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
U dołu panelu sterowania wybierz podwójny wlot zamka dla krótkotrwałej fali uderzeniowej lub wlot rury sterującej, aby wydłużyć czas trwania fali. Następnie włącz źródło zasilania prądem stałym i oscyloskop, aby wymagać danych o kształcie fali. Następnie włącz światła bezpieczeństwa za pomocą przełącznika na ścianie naprzeciwko panelu sterowania, aby powiadomić innych badaczy, aby nie wchodzili do pomieszczenia podczas ładowania rurki wstrząsowej.
Na elektromagnetycznej skrzynce sterowniczej naciśnij przełącznik, aby zamknąć elektrozawór. Następnie na panelu sterowania powoli otwórz regulator przepływu, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby stopniowo zwiększać ciśnienie w komorze sprężania. Gdy ciśnienie rozrywające membranę zostanie osiągnięte, membrana pęknie i będzie słychać huk.
Gdy usłyszysz ten dźwięk, szybko zamknij pokrętło regulacji przepływu. Następnie otwórz elektrozawór, wyłączając przełącznik na elektroskrzynce sterowniczej i wyłącz lampkę bezpieczeństwa. Przenieś próbkę komórek do sterylnego kaptura.
Tam usuń samoprzylepną membranę przepuszczającą gaz i napełnij naczynie dwoma mililitrami świeżego podłoża wzrostowego. Dodaj 200 mikrolitrów odczynnika wskaźnika redoks do każdej płytki eksperymentalnej bezpośrednio po ponownym napełnieniu ich dwoma mililitrami świeżej pożywki wzrostowej. Następnie przenieś naczynie do standardowego inkubatora na cztery godziny.
Po inkubacji przenieść dwie porcje o pojemności 100 mikrolitrów z każdej płytki na odpowiednią płytkę 96-dołkową. Odczytaj tabliczkę na czytniku płytek fluorescencyjnych, a następnie wyeksportuj i zapisz dane. W przypadku obrazowania fluorescencyjnego żywych i martwych komórek, komórki należy wstępnie posiać na szklanym szkiełku przykrywkowym wewnątrz 35-mililitrowych płytek hodowlanych.
Po leczeniu falą uderzeniową odessać pożywkę i dwukrotnie umyć komórki w jednym mililitrze PBS. Następnie przenieś 100 mikrolitrów żywego martwego odczynnika z zestawu do obrazowania do każdej próbki. I inkubować komórki i odczynnik w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem przez 15 minut.
Po inkubacji usuń odczynnik i umyj komórki raz za pomocą jednego mililitra PBS. Za pomocą cienkich kleszczyków punktowych ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z 35-mililitrowego naczynia i umieść je ekranem do dołu na szklanym szkiełku mikroskopowym. Uzyskaj obrazy dla każdej próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę obiektywową 5X o aperturze numerycznej 0,25.
Następnie użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby ręcznie lub automatycznie policzyć liczbę żywych zielonych komórek i czerwonych martwych komórek z każdego obrazu. Korzystając z opisanej tutaj metody, komórki hodowane w monowarstwie poddano działaniu fal uderzeniowych generowanych za pomocą rurki uderzeniowej. Czujniki w rurze uderzeniowej wyświetlają profile ciśnienia obserwowane w różnych miejscach wzdłuż rury.
Korzystając z testu wskazania redoks, stwierdzono, że zastosowanie fali uderzeniowej o stężeniu 127 kilopaskali było w stanie znacznie zmniejszyć żywotność komórek brodawek skórnych w porównaniu z grupą kontrolną po 24 godzinach w hodowli. Zastosowanie fali uderzeniowej o mocy 72 kilopaskali lub mniejszej nie zmniejszyło żywotności. Aby potwierdzić te obserwacje, test żywych trupów wykazał również zmniejszenie żywotności komórek u osób narażonych na 127-kilopaskalową falę uderzeniową w porównaniu z grupą kontrolną.
Po opanowaniu technika ta może być wykonywana zmiennie szybko z szybkością 60 próbek na godzinę. Rura uderzeniowa może być używana do generowania fal uderzeniowych w celu zbadania szeregu pierwotnych obrażeń spowodowanych wybuchem. Mogą one wahać się od blastu płuc do kostnienia heterotopowego, które jest nieprawidłowym tworzeniem się kości w tkankach miękkich ciała.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ryzyku związanym z pracą ze sprężonymi gazami i falami uderzeniowymi o wysokiej energii oraz zawsze przestrzegać odpowiednich wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Drobne modyfikacje w rurze uderzeniowej mogą umożliwić nam zmianę fali uderzeniowej. Następnie możemy ocenić odpowiedź komórkową na różne profile ciśnienia i intensywności, które reprezentują różne scenariusze wybuchu.
Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania badawcze, takie jak: W jaki sposób ekspozycja na falę uderzeniową zmienia naszą naturalną inskrypcję w komórkach?
Przegląd
Ten protokół bada wpływ fal uderzeniowych na żywotność komórek, mając na celu zrozumienie reakcji komórkowych na uderzenie mechaniczne. Korzystając z niestandardowego sprzętu do badania fal uderzeniowych, badanie ocenia, jak różne ciśnienia wpływają na komórkowe warstwy jednowarstwowe.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauki
- Biologia komórki
- Uraz mechaniczny
Tło
- Fale uderzeniowe mogą powodować pierwotne obrażenia wybuchowe w komórkach.
- Zrozumienie reakcji komórkowych na fale uderzeniowe jest kluczowe dla mechanizmów obrażeń.
- Ta metoda pozwala na badanie poszczególnych typów komórek, a nie reakcji tkankowych.
- Do generowania kontrolowanych fal uderzeniowych wykorzystywany jest niestandardowy sprzęt do badania fal uderzeniowych.
Cel badania
- Ocenić wpływ uderzenia mechanicznego na komórki pierwotne w kulturze.
- Zidentyfikować mechanizmy komórkowe zmienione przez ekspozycję na fale uderzeniowe.
- Ocenić reakcje komórek na fale uderzeniowe.
Zastosowane metody
- Hodowla komórek do 80% stężenia i przygotowanie do ekspozycji na fale uderzeniowe.
- Montaż sprzętu do badania fal uderzeniowych i zapewnienie właściwych środków bezpieczeństwa.
- Generowanie fal uderzeniowych przy różnych ciśnieniach i ekspozycja próbek komórek.
- Analiza żywotności komórek za pomocą czytnika płytek fluorescencyjnych po inkubacji.
Główne wyniki
- Zaobserwowano odrębne reakcje różnych typów komórek na fale uderzeniowe.
- Żywotność komórek została oceniona po ekspozycji, aby określić skutki.
- Dane wskazują na specyficzne mechanizmy komórkowe, na które wpływają uderzenia.
Wnioski
- Ta metoda dostarcza informacji na temat reakcji komórkowych na uderzenie mechaniczne.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu strategii łagodzenia obrażeń wybuchowych.
- Dalsze badania mogą obejmować różne typy komórek i parametry uderzeń.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This method enables biopharma R&D to model primary blast-induced cellular injury in a controlled in vitro system, supporting mechanistic de-risking of mechanosensitive pathways. By quantifying viability thresholds at defined overpressures, it provides predictive confidence for target validation in trauma and neuroinflammatory indications. The scalable shock wave platform facilitates early discovery screening of compounds that mitigate mechanical stress responses.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Interrogates therapeutic hypotheses by linking defined mechanical stress inputs to viability outputs in primary cells.
- Operational Value: Enables functional target validation through dose-response assessment of shock wave effects on cell survival.
- Predictive Value: Supports portfolio triage by establishing damage thresholds that inform go/no-go decisions for mechanoprotective candidates.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Prepares validated monolayer systems for reproducible compound testing under controlled mechanical injury conditions.
- Operational Value: Delivers quantitative redox and live/dead readouts that enable assay standardization and Z'-factor assessment.
- Scalability: Supports medium-throughput workflows at 60 samples per hour, enabling platform reuse across multiple cell types and pressure profiles.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery findings to preclinical models by defining cellular responses that mirror primary blast injury mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Identifies pressure-sensitive pathways that can be targeted to reduce late-stage failure in trauma-related indications.
- Biomarker Alignment: Enables transcriptional and epigenetic profiling post-shock to support translational biomarker discovery.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing mechanobiological readouts that inform early compound evaluation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing by isolating mechanical shock as an independent variable to clarify stress-response pathways.
- Screening: Delivers assay-ready, standardized monolayers with quantitative viability outputs for reliable compound screening.
- Analytics: Generates fluorescence-based viability measurements and imaging data that enable condition comparison and EC50 estimation.
- Translational Research: Connects to preclinical work by defining cellular damage thresholds relevant to blast lung, brain injury, and heterotopic ossification models.
- Enterprise Reuse: Establishes a modular shock wave capability applicable across dermal, neural, and pulmonary cell systems for cross-program mechanobiology studies.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing ambiguity in mechanotransduction mechanism assignment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized shock wave generation and sealed sample presentation.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of mechanoprotective targets before costly in vivo studies.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted advancement decisions by providing quantitative thresholds for blast-induced cellular dysfunction.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cell culture, shock wave physics, and fluorescence-based viability assays.
- Needs shock tube instrumentation, pressure transducers, oscilloscopes, and sterile workflow infrastructure.
- Demands cross-team standardization between cell biology and biophysics groups for consistent pressure calibration.
- Involves adaptation considerations for suspension vs. adherent cells and tissue explants via rig modifications.
- Limited by the challenge of perfectly replicating in vivo blast dynamics, though useful for defining comparative thresholds and mechanism screening.
