Ocena pierwotnych efektów wybuchu in vitro
18 września 2017
Zrozumienie, w jaki sposób komórki są modulowane przez ekspozycję na fale uderzeniowe, może pomóc w zidentyfikowaniu mechanizmów stojących za urazami wywołanymi przez wybuch. Protokół ten wykorzystuje specjalnie skonstruowane rurki uderzeniowe do przykładania fal uderzeniowych o różnym ciśnieniu do monowarstw komórek i identyfikowania ich późniejszego wpływu na żywotność komórek.
Ogólnym celem tej metody jest wygenerowanie reprezentatywnych fal uderzeniowych, które mogą wystąpić podczas wybuchu, oraz ocena wpływu tego wstrząsu mechanicznego na żywotność komórek pierwotnych w hodowli. Metoda ta może pomóc nam odpowiedzieć na kluczowe pytania dotyczące reakcji poszczególnych typów komórek na zdarzenia o wysokiej energii, takie jak ekspozycja na falę uderzeniową. Główną zaletą tej metody jest to, że pozwala nam ocenić różne reakcje komórek na pojedynczą falę uderzeniową, w przeciwieństwie do odpowiedzi na poziomie tkanek lub narządów.
Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku identyfikacji mechanizmów komórkowych zmienionych w wyniku pierwotnych urazów wybuchowych, które są spowodowane ekspozycją na falę uderzeniową. Chociaż metoda ta jest demonstrowana z określonym typem komórek, dowolne komórki można hodować i umieszczać w konfiguracji testowej w celu oceny specyficznych dla komórek reakcji na falę uderzeniową. Na początek hoduj interesującą nas linię komórkową w standardowej hodowli, aż osiągną 80% konfluencji.
Następnie odessać pożywkę. Umyj komórki dwukrotnie PBS i dodaj dwa mililitry Trypsyny-EDTA. Inkubuj je w standardowych warunkach hodowli przez pięć minut.
Krótko sprawdzić, czy komórki pomyślnie oddzieliły się od kolby. A następnie dodaj cztery mililitry pożywki hodowlanej zawierającej FBS do kolby w celu zneutralizowania trypsyny i przeniesienia komórek do 15-mililitrowej stożkowej probówki. Odwirować komórki z prędkością 200 razy g przez cztery minuty, aby osadzać komórki.
Następnie powoli zasysać supernatant, uważając, aby nie usunąć osadu. I ponownie zawieś granulat w pięciu mililitrach podłoża. Umieść trzy oznaczone 35-mililitrowe naczynia w 90-mililitrowym naczyniu.
Następnie dodaj dwa mililitry pożywki do każdego naczynia i wysiewaj je z 70 tysiącami komórek. Inkubuj komórki przez noc, aby umożliwić odpowiednie przyłączenie komórek przed wystawieniem ich na działanie fali uderzeniowej. Przed przystąpieniem do montażu rurki amortyzującej należy założyć odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym buty robocze ze stalowymi noskami i fartuch laboratoryjny.
Zacznij od włożenia dwóch prętów wyrównujących przez otwory na znajdujące się w płaszczyźnie poziomej kołnierza wylotowego. Następnie umieść arkusz uszczelki z kauczuku nitrylowego na końcu prętów wyrównujących, tak aby znajdował się między kołnierzem wylotowym a zestawem do hodowli organów ex vivo. Przymocuj zestaw EVOC do kołnierza wylotowego rury amortyzującej, przesuwając uchwyt po prętach wyrównujących.
Upewnij się, że jest prawidłowo zorientowany, tak aby sekcja, w której znajduje się szalka Petriego, znajdowała się u jej podstawy. Następnie włóż cztery i podkładki M24 do pozostałych otworów i mocno dokręć nakrętki i kolejno w ukośnie symetryczny sposób, jednocześnie sprawdzając wzrokowo, czy zestaw EVOC i rura amortyzatora zostały pomyślnie wyrównane. Następnie podłącz przetwornik ciśnienia do statywu EVOC i podłącz go do źródła prądu za pomocą czujnika.
Dodatkowo użyj BNC, aby podłączyć źródło prądu do oscyloskopu. Upewnij się, że wszystkie zawory spustowe i regulatory przepływu na rurze amortyzatora są zamknięte. Następnie otwórz wbudowany zewnętrzny przewód sprężonego powietrza i ręcznie obróć regulator ciśnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby naładować elektrozawór do 2,5 bara.
Otwórz butlę ze sprężonym powietrzem, a następnie powoli przekręć regulator ciśnienia zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zwiększyć ciśnienie do około 15 barów. Następnie przygotuj membrany, tnąc arkusz tworzywa sztucznego o grubości 0,125 mililitra na kwadraty o wymiarach 10 centymetrów na 10 centymetrów. Utwórz uchwyty z taśmy i przymocuj je do górnej i dolnej części membrany.
Użyj ich, aby ostrożnie ustawić membranę obok przedniego małego kołnierza przy komorze zamka. Upewnij się, że membrana jest prosta i prawidłowo ustawiona przed zamknięciem zamka. A następnie zabezpiecz go na miejscu za pomocą czterech i nakrętek M24.
Wewnątrz sterylnego kaptura przygotuj samoprzylepne membrany przepuszczające gazy, tak aby każda z nich była wystarczająco duża, aby pokryć górną część jednej 35-mililitrowej szalki Petriego. Następnie przenieś 90-mililitrową szalkę Petriego zawierającą trzy próbki eksperymentalne do okapu. Odessać pożywkę z jednej z naczyń i przykryć ją dwoma sekcjami membrany, upewniając się, że między membraną a krawędzią naczynia jest szczelne uszczelnienie.
Przenieś próbkę do wiertnicy EVOC i przymocuj ją do podstawy oprawy tak, aby górna część naczynia była wyrównana z wewnętrzną podstawą rurki uderzeniowej. W tym momencie załóż ochronniki słuchu, okulary ochronne, obuwie ochronne i fartuch laboratoryjny. Zwiększ ciśnienie w systemie rurki uderzeniowej, obracając pokrętło regulacji przepływu na regulatorze zgodnie z ruchem wskazówek zegara.
U dołu panelu sterowania wybierz podwójny wlot zamka dla krótkotrwałej fali uderzeniowej lub wlot rury sterującej, aby wydłużyć czas trwania fali. Następnie włącz źródło zasilania prądem stałym i oscyloskop, aby wymagać danych o kształcie fali. Następnie włącz światła bezpieczeństwa za pomocą przełącznika na ścianie naprzeciwko panelu sterowania, aby powiadomić innych badaczy, aby nie wchodzili do pomieszczenia podczas ładowania rurki wstrząsowej.
Na elektromagnetycznej skrzynce sterowniczej naciśnij przełącznik, aby zamknąć elektrozawór. Następnie na panelu sterowania powoli otwórz regulator przepływu, obracając pokrętło w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara, aby stopniowo zwiększać ciśnienie w komorze sprężania. Gdy ciśnienie rozrywające membranę zostanie osiągnięte, membrana pęknie i będzie słychać huk.
Gdy usłyszysz ten dźwięk, szybko zamknij pokrętło regulacji przepływu. Następnie otwórz elektrozawór, wyłączając przełącznik na elektroskrzynce sterowniczej i wyłącz lampkę bezpieczeństwa. Przenieś próbkę komórek do sterylnego kaptura.
Tam usuń samoprzylepną membranę przepuszczającą gaz i napełnij naczynie dwoma mililitrami świeżego podłoża wzrostowego. Dodaj 200 mikrolitrów odczynnika wskaźnika redoks do każdej płytki eksperymentalnej bezpośrednio po ponownym napełnieniu ich dwoma mililitrami świeżej pożywki wzrostowej. Następnie przenieś naczynie do standardowego inkubatora na cztery godziny.
Po inkubacji przenieść dwie porcje o pojemności 100 mikrolitrów z każdej płytki na odpowiednią płytkę 96-dołkową. Odczytaj tabliczkę na czytniku płytek fluorescencyjnych, a następnie wyeksportuj i zapisz dane. W przypadku obrazowania fluorescencyjnego żywych i martwych komórek, komórki należy wstępnie posiać na szklanym szkiełku przykrywkowym wewnątrz 35-mililitrowych płytek hodowlanych.
Po leczeniu falą uderzeniową odessać pożywkę i dwukrotnie umyć komórki w jednym mililitrze PBS. Następnie przenieś 100 mikrolitrów żywego martwego odczynnika z zestawu do obrazowania do każdej próbki. I inkubować komórki i odczynnik w temperaturze pokojowej, chronić przed światłem przez 15 minut.
Po inkubacji usuń odczynnik i umyj komórki raz za pomocą jednego mililitra PBS. Za pomocą cienkich kleszczyków punktowych ostrożnie wyjmij szkiełko nakrywkowe z 35-mililitrowego naczynia i umieść je ekranem do dołu na szklanym szkiełku mikroskopowym. Uzyskaj obrazy dla każdej próbki za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w soczewkę obiektywową 5X o aperturze numerycznej 0,25.
Następnie użyj oprogramowania do analizy obrazu, aby ręcznie lub automatycznie policzyć liczbę żywych zielonych komórek i czerwonych martwych komórek z każdego obrazu. Korzystając z opisanej tutaj metody, komórki hodowane w monowarstwie poddano działaniu fal uderzeniowych generowanych za pomocą rurki uderzeniowej. Czujniki w rurze uderzeniowej wyświetlają profile ciśnienia obserwowane w różnych miejscach wzdłuż rury.
Korzystając z testu wskazania redoks, stwierdzono, że zastosowanie fali uderzeniowej o stężeniu 127 kilopaskali było w stanie znacznie zmniejszyć żywotność komórek brodawek skórnych w porównaniu z grupą kontrolną po 24 godzinach w hodowli. Zastosowanie fali uderzeniowej o mocy 72 kilopaskali lub mniejszej nie zmniejszyło żywotności. Aby potwierdzić te obserwacje, test żywych trupów wykazał również zmniejszenie żywotności komórek u osób narażonych na 127-kilopaskalową falę uderzeniową w porównaniu z grupą kontrolną.
Po opanowaniu technika ta może być wykonywana zmiennie szybko z szybkością 60 próbek na godzinę. Rura uderzeniowa może być używana do generowania fal uderzeniowych w celu zbadania szeregu pierwotnych obrażeń spowodowanych wybuchem. Mogą one wahać się od blastu płuc do kostnienia heterotopowego, które jest nieprawidłowym tworzeniem się kości w tkankach miękkich ciała.
Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać o ryzyku związanym z pracą ze sprężonymi gazami i falami uderzeniowymi o wysokiej energii oraz zawsze przestrzegać odpowiednich wytycznych dotyczących bezpieczeństwa. Drobne modyfikacje w rurze uderzeniowej mogą umożliwić nam zmianę fali uderzeniowej. Następnie możemy ocenić odpowiedź komórkową na różne profile ciśnienia i intensywności, które reprezentują różne scenariusze wybuchu.
Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić sekwencjonowanie nowej generacji, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania badawcze, takie jak: W jaki sposób ekspozycja na falę uderzeniową zmienia naszą naturalną inskrypcję w komórkach?
Przegląd
Niniejszy protokół bada wpływ fal uderzeniowych na żywotność komórek, mając na celu zrozumienie odpowiedzi komórkowych na wstrząs mechaniczny. Wykorzystując specjalnie skonstruowaną aparaturę z rurą uderzeniową, badanie ocenia, w jaki sposób różne ciśnienia wpływają na monowarstwy komórek.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia komórki
- Uraz mechaniczny
Wstęp
- Fale uderzeniowe mogą powodować pierwotne obrażenia blastowe w komórkach.
- Zrozumienie odpowiedzi komórkowych na fale uderzeniowe jest kluczowe dla wyjaśnienia mechanizmów powstawania obrażeń.
- Metoda ta umożliwia badanie poszczególnych typów komórek, a nie odpowiedzi całych tkanek.
- Do generowania kontrolowanych fal uderzeniowych wykorzystywana jest specjalistyczna aparatura w postaci rury uderzeniowej.
Cel badania
- Ocena wpływu wstrząsu mechanicznego na pierwotne komórki w hodowli.
- Identyfikacja mechanizmów komórkowych zmienionych przez ekspozycję na fale uderzeniowe.
- Ocena specyficznych dla danych komórek odpowiedzi na fale uderzeniowe.
Zastosowane metody
- Hodować komórki do osiągnięcia 80% konfluencji i przygotować je do ekspozycji na fale uderzeniowe.
- Zmontować urządzenie z rurą uderzeniową i zapewnić odpowiednie środki bezpieczeństwa.
- Generować fale uderzeniowe o różnych ciśnieniach i poddać im próbki komórek.
- Przeanalizować żywotność komórek przy użyciu fluorescencyjnego czytnika płytek po inkubacji.
Główne wyniki
- Zaobserwowano odmienne reakcje poszczególnych typów komórek na fale uderzeniowe.
- W celu określenia skutków ekspozycji oceniono żywotność komórek po wystawieniu na działanie fal.
- Dane wskazały na specyficzne mechanizmy komórkowe, na które wpłynęła ekspozycja na fale uderzeniowe.
Wnioski
- Metoda ta pozwala na uzyskanie wiedzy na temat reakcji komórkowych na wstrząs mechaniczny.
- Wyniki mogą pomóc w opracowaniu strategii ograniczania obrażeń powybuchowych.
- Dalsze badania mogą objąć różne typy komórek oraz parametry wstrząsu.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Niniejsza metoda umożliwia działom badawczo-rozwojowym biofarmacji modelowanie pierwotnych uszkodzeń komórkowych wywołanych falą uderzeniową w kontrolowanym systemie in vitro, co wspiera mechanistyczne ograniczanie ryzyka w badaniach nad szlakami mechanosensytywnymi. Dzięki ilościowemu określeniu progów żywotności przy zdefiniowanych nadciśnieniach, metoda ta zapewnia pewność prognostyczną w walidacji celów terapeutycznych w przypadku urazów oraz wskazań neurozapalnych. Skalowalna platforma fal uderzeniowych ułatwia wczesne przesiewowe odkrywanie związków łagodzących odpowiedzi na stres mechaniczny.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Weryfikuje hipotezy terapeutyczne poprzez powiązanie określonych bodźców w postaci stresu mechanicznego z przeżywalnością pierwotnych komórek.
- Wartość operacyjna: Umożliwia funkcjonalną walidację celu poprzez ocenę zależności dawka-odpowiedź efektów fal uderzeniowych na przeżycie komórek.
- Wartość prognostyczna: Wspiera selekcję projektów w portfelu poprzez ustalenie progów uszkodzeń, które stanowią podstawę do decyzji o kontynuowaniu lub przerwaniu prac nad kandydatem na lek mechanoprotekcyjny.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na przygotowanie zwalidowanych systemów monowarstw do powtarzalnego testowania związków w kontrolowanych warunkach uszkodzenia mechanicznego.
- Wartość operacyjna: Dostarcza ilościowe odczyty redoks oraz żywotności (live/dead), co umożliwia standaryzację testu i ocenę czynnika Z'.
- Skalowalność: Obsługuje przepływy pracy o średniej przepustowości na poziomie 60 próbek na godzinę, umożliwiając ponowne wykorzystanie platformy dla wielu typów komórek i profili ciśnienia.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Ciągłość translacyjna: Łączy wyniki badań podstawowych z modelami przedklinicznymi poprzez definiowanie odpowiedzi komórkowych odzwierciedlających mechanizmy pierwotnego urazu spowodowanego falą uderzeniową.
- Minimalizacja ryzyka mechanistycznego: Identyfikuje wrażliwe na ciśnienie szlaki sygnałowe, które mogą stać się celem terapeutycznym w celu zmniejszenia ryzyka niepowodzeń na późnych etapach badań w wskazaniach związanych z urazami.
- Korelacja biomarkerów: Umożliwia profilowanie transkrypcyjne i epigenetyczne po wstrząsie w celu wsparcia odkrywania translacyjnych biomarkerów.
Integracja potoków i przepływów pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków – od testowania hipotez dotyczących celu molekularnego po identyfikację związków wiodących – zapewniając mechanobiologiczne odczyty, które wspomagają wczesną ocenę związków.
- Biologia odkrywcza: Wspiera weryfikację hipotez poprzez izolację wstrząsu mechanicznego jako zmiennej niezależnej w celu wyjaśnienia szlaków odpowiedzi na stres.
- Przesiewy: Dostarcza zestandaryzowane monowarstwy gotowe do analizy, z ilościowymi wynikami żywotności, co pozwala na wiarygodne przesiewy związków.
- Analityka: Generuje pomiary żywotności oparte na fluorescencji oraz dane obrazowe, które umożliwiają porównanie warunków i szacowanie EC50.
- Badania translacyjne: Wiąże się z pracami przedklinicznymi poprzez definiowanie progów uszkodzeń komórkowych istotnych dla modeli urazów płuc po wybuchu, urazów mózgu oraz kostnienia heterotopijnego.
- Wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy modułową możliwość generowania fal uderzeniowych, możliwą do zastosowania w systemach komórek skóry, neuronów i płuc w ramach międzyprogramowych badań z zakresu mechanobiologii.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celów poprzez zmniejszenie niejednoznaczności w przypisywaniu mechanizmów mechanotransdukcji.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzowanemu generowaniu fal uderzeniowych i szczelnemu prezentowaniu próbek.
- Wartość strategiczna: Poprawia efektywność kapitałową poprzez umożliwienie wczesnego ograniczania ryzyka w odniesieniu do celów mechanoprotekcyjnych przed kosztownymi badaniami in vivo.
- Wpływ na portfolio: Wspiera decyzje o rozwoju skorygowane o ryzyko, dostarczając ilościowych progów dla dysfunkcji komórkowych wywołanych blastem.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna z zakresu hodowli komórkowych, fizyki fal uderzeniowych oraz fluorescencyjnych testów żywotności.
- Niezbędna jest aparatura do rur uderzeniowych, przetworniki ciśnienia, oscyloskopy oraz infrastruktura sterylnego przepływu pracy.
- Wymagana jest standaryzacja między zespołami biologii komórki i biofizyki w celu zapewnienia spójnej kalibracji ciśnienia.
- Wymaga rozważenia modyfikacji aparatury w celu adaptacji do komórek w zawiesinie i przylegających oraz eksplantów tkankowych.
- Ograniczeniem jest trudność w idealnym odwzorowaniu dynamiki blastu in vivo, choć metoda ta jest przydatna do określania progów porównawczych i przesiewowej analizy mechanizmów.
