Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Ogólnym celem tej procedury jest analiza ekspresji i produkcji genów i markerów białkowych, odpowiednio, różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu mechanizmu odpowiedzialnego za hamowanie różnicowania neuronów przez surowy wiek DPA i prowadzić do lepszych protokołów różnicowania komórek macierzystych w neurony do celów terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że ułatwia śledzenie procesu różnicowania neuronów na poziomie emeryny i białka, w tym za pomocą mikroskopii optycznej.

Procedurę zademonstruje dr Junning Yang, pracownik naukowy w moim laboratorium. Rozpocznij tworzenie ciała zarodka od pobrania embrionalnych komórek macierzystych z 0,25% trypsyną-EDTA przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla. Dodaj świeże zmodyfikowane podłoże Dulbecco firmy Iscove lub IMDM z 15% FBS do oddzielających komórek i przenieś zawiesinę komórkową do 15-mililitrowej probówki.

Wirować przy 160 x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę pięć x 10 do piątej na mililitr w IMDM z 0,5 mikromolowym kwasem retinowym. Następnie użyj ośmiokanałowej pipety i końcówek o pojemności 200 mikrolitrów, aby nanieść krople o pojemności 120 mikrolitrów na 100-milimetrową szalkę Petriego.

Odwróć naczynie i napełnij odwróconą pokrywkę PBS, aby zapobiec wysychaniu wiszących kropli. Hodowla w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, przez trzy do czterech dni. Użyj końcówek pipet o pojemności 200 mikrolitrów, aby zebrać wiszące ciała zarodków hodowane przez trzy dni.

Dotknąć ciała zarodka końcówką pipety i przenieść je na szkiełko nakrywkowe pokryte włóknem nektynowym na płytce 24-dołkowej. Zmieniaj podłoże na kulturach co dwa do trzech dni. Zmieniając pożywkę, w razie potrzeby należy zebrać zużyte podłoże do analizy wydzielania białka.

Aby wykryć wydzielane białka w pożywce, przenieś 500 mikrolitrów pożywki z ciałem embrionów do 10-kilodaltonowych filtrów odśrodkowych i wiruj z prędkością 20 000 x G w czterech stopniach Celsjusza. Sprawdzaj pożywkę pozostałą wewnątrz filtrów odśrodkowych co 15 do 20 minut, aby zapobiec nadmiernemu wzbogaceniu. Przerwij wirowanie, gdy objętość pozostałej pożywki spadnie do 25 mikrolitrów.

Odwróć filtr i wiruj w temperaturze 160 x G w czterech stopniach Celsjusza, a następnie zbierz pozostałą stężoną pożywkę, postępując zgodnie z instrukcjami producenta. Aby uzyskać kulturę 3D, zbierz ciała zarodków hodowane przez cztery dni jako wiszące krople za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 mikrolitrów, tak jak poprzednio. Przenieś 30 ciał zarodkowych do 1,5-mililitrowej probówki wirówkowej, a następnie przygotuj roztwór żelu kolagenowego, rozcieńczając odpowiednie objętości roztworu kolagenu i 5X DMEM, dodając roztwór neutralizacyjny i natychmiast dobrze mieszając.

Umieść żel kolagenowy na lodzie. Następnie należy odpipetować odpowiednią objętość schłodzonego roztworu kolagenu do probówki zawierającej ciała zarodków, a następnie delikatnie odpipetować zawiesinę ciała zarodka do dołków sześciodołkowej płytki bez tworzenia pęcherzyków. Natychmiast przenieś płytkę do 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, na 60 minut, aby zainicjować polimeryzację kolagenu.

Po upływie 60 minut nałożyć na płytkę zawierającą ciała zarodkowe IMDM. W celu dysocjacji ciała zarodka ponownie zbierz czterodniowe wiszące ciała embrionów za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 mikrolitrów. Tym razem przenieś je na nieprzywierającą bakteriologiczną szalkę Petriego zawierającą IMDM z 15% FBS i hodowlę w temperaturze 37 stopni Celsjusza, 5% dwutlenku węgla, przez kolejne cztery dni.

Sprawdzaj ciała zarodków dwa razy dziennie, aby upewnić się, że nie przyczepiają się do dna. Delikatnie potrząśnij naczyniem, aby zapobiec przyczepieniu się ciała zarodka. Po czterech dniach przenieść ciała zarodków do probówki wirówkowej i wirować w temperaturze 185 x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.

Po odwirowaniu usunąć supernatant. Objętość palety nie powinna przekraczać 100 mikrolitrów. Następnie odpipetować jeden mililitr 0,25% kolagenazy typu I, uzupełnionej 20% FBS w PBS do probówki z ciałami embrionalnymi.

Inkubuj mieszaninę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Delikatnie pipetować zawiesinę za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety co 20 minut. Po inkubacji delikatnie umyj komórki trzykrotnie PBS.

Jeśli obecne są agregaty komórkowe, użyj sitka do komórek z siatką o wielkości 100 mikronów, aby je usunąć. Umieść komórki na pokrytych żelatyną szkiełkach nakrywkowych w IMDM, a następnie inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Umyj 2D lub zdysocjowane ciała zarodkowe 3D PBS.

Następnie utrwalaj za pomocą czteroprocentowego paraformaldehydu i PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym umyciu stałych komórek PBS w celu usunięcia pływających resztek komórek, dodaj 1% tryton X-100 do PBS, aby przepuszczalność komórek przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po umyciu jak poprzednio, usuń ostatnie pranie i zablokuj 5% BSA w PBS na 30 minut.

Pod koniec inkubacji przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w 1% BSA w PBS uzupełnionym 0,03% trytonem X-100. Po upływie 30 minut zastąpić roztwór blokujący roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez trzy godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Po umyciu nanieść przeciwciało drugorzędowe w PBS i inkubować przez godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych z podłożem zapobiegającym blaknięciu do mikroskopii optycznej. Obraz ten pokazuje wyłanianie się kiełków z ciała embrionalnego wygenerowanego z ESC, dodatniego dla dwóch kopii genu Syx, który koduje czynnik wymiany guaniny, który aktywuje GTPazę RhoA.

Zdjęcie zostało wykonane po sześciu dniach w kulturze 3D. To zarodkowe ciało utworzone z ESC Syx KnockOut wykazuje zwiększone kiełkowanie po tym samym czasie w hodowli. W tym przypadku obrazy fazowe 2D krawędzi ciała zarodka pokazują, że komórki rozszerzały się szybciej z Syx KnockOuts niż z Syx typu dzikiego.

Te obrazy immunofluorescencyjne ilustrują, że marker różnicowania neuronalnego, Nestin, pokazany na czerwono, był bardziej obfity w komórkach rozwijających się z sześciodniowych ciał zarodkowych 2D6 KnockOut niż z ich odpowiedników typu dzikiego Syx. W tym przypadku obrazy immunofluorescencyjne pokazują, że markery różnicowania neuronalnego Nestin i beta III Tubulin były bardziej obfite w komórkach zdysocjowanych z 13-dniowych ciał zarodkowych 3D6 KnockOut niż z ich odpowiedników typu dzikiego Syx. Jest to procedura czasochłonna ze względu na czas trwania wzrostu i różnicowania się ciała zarodka.

Nie tylko wymaga to co najmniej ośmiu dni, ale w niektórych przypadkach stosujemy różnicowanie do 24 dni. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o ograniczeniu żywotności średnicy ciała zarodka, aby zapewnić podobne tempo różnicowania wzdłuż ciał zarodka.