Name: Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Poznaj analizę różnicowania neuronalnego komórek macierzystych myszy przy użyciu kwasu retinowego w ciałach embrionalnych. Ta metoda umożliwia śledzenie ekspresji genów i markerów białkowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

To badanie było wspierane przez grant NIH R01 HL119984 dla A.H.

1. Hodowla fibroblastów embrionalnych myszy (MEF)
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę MEF, zmodyfikowaną pożywkę Eagle's firmy Dulbecco (DMEM, o wysokiej zawartości glukozy), uzupełnioną 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS).</li>
	<li>Pokryj 100 mm szalki do hodowli komórkowych 0,5% roztworem żelatyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Policz MEF za pomocą cytometru. Usunąć roztwór żelatyny i natychmiast wlać pożywkę MEF podgrzaną do temperatury 37 °C. Szybko rozmrozić fiolki z MEF nasączone mitomycyną C w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez 2 minuty, a następnie wysiać 2,8 x 106 MEF na 100 mm naczynie pokryte żelatyną. Dostosuj odpowiednio numer komórki, jeśli używasz naczyń o innych rozmiarach. Inkubować MEF przez noc w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Zmień podłoże następnego dnia. Hodowla przez 2-3 dni, aż warstwa MEF się zlewa.</li>
</ol>
2. Kultura ESC myszy
<ol>
	<li>Przygotuj pożywkę ESC, zmodyfikowaną pożywkę Dulbecco firmy Iscove (IMDM) uzupełnioną 15% FBS i 103 U/ml czynnika hamującego białaczkę (LIF), 0,1 mM aminokwasów endogennych, 55 mM 2-merkaptoetanolu, penicyliny (100 U/ml), streptomycyny (100 μg/ml), gentamycyny (200 μg/ml) i 0,2% antybiotyku mykoplazmowego.</li>
	<li>Usunąć pożywkę MEF z naczynia przygotowanego w kroku 1 i zastąpić ją wstępnie podgrzanym podłożem ESC o temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Rozmrozić fiolkę z ESC i komórki nasienne na wierzchu warstwy MEF. Inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , aż ESC osiągną konfluencję.</li>
	<li>Przygotuj nowe naczynia do hodowli komórkowych zawierające zlewającą się monowarstwę MEF. Aby przejść przez ESC, przemyj raz PBS i odłącz 0,25% trypsyny/EDTA na 2-5 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 . Zatrzymaj trypsynizację, dodając świeży IMDM z 15% FBS do oddzielających się komórek, przenieś zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml i odwiruj przy 160 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić ESC świeżym IMDM i przejść jedną piątą komórek do każdej nowej płytki pokrytej MEF; inkubować, aż komórki osiągną konfluencję (zwykle 4-5 dni).</li>
</ol>
3. Wycofaj MEFy i ESC do hodowli na płytkach pokrytych żelatyną
<ol>
	<li>Gdy ECS osiągną konfluencję, odłącz je i MEF z 0,25% trypsyny/EDTA, jak w kroku 2.4, ponownie zawieś komórki w świeżym IMDM, przenieś na nieprzywierającą bakteriologiczną szalkę Petriego i inkubuj przez 40 minut w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
	<li>Ostrożnie przenieść ESC i pożywkę zawierającą MEF na nową płytkę pokrytą żelatyną za pomocą pipety o pojemności 5 ml, unikając wielokrotnego pipetowania. Komórki pozostające na szalkach Petriego to MEF, ponieważ ESC nie przylegają.</li>
	<li>Przechodź przez ESC co 3-4 dni. Rzadsze pasażowanie może zmniejszyć pluripotencję ESC. Nie przekraczaj 60% zbiegu, ponieważ może to sprzyjać różnicowaniu.</li>
	<li>Powtórz kroki 3.2-3.3 trzy lub więcej razy, w zależności od potrzeb, aż MEF-y nie będą już wykrywalne przez mikroskop hodowli komórkowych, przy użyciu obiektywu 20X, aby upewnić się, że MEF-y nie są obecne.</li>
	<li>Sprawdź pluripotencję ESC, sprawdzając hodowlę ESC, aby sprawdzić, czy komórki tworzą gęste kolonie o typowej morfologii wielokątnej ESC (Figura 1A). Przetestuj pnialność komórek za pomocą ilościowej reakcji łańcuchowej polimerazy z odwrotną transkryptazą (qRT-PCR)17, immunoblotting17, lub immunofluorescencji podstawowych czynników transkrypcyjnych pluripotencji17 (Rysunek 2).</li>
</ol>
4. Formacja EB
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy all-trans-RA o stężeniu 10 mM w DMSO i rozlać na 1,5 ml chronionych przed światłem probówek do mikrofugów. Roztwór jest stabilny w temperaturze -80 °C przez okres do dwóch tygodni. Chroń go przed światłem.</li>
	<li>Trypsynizować ESC jak w kroku 2.4; ponownie platerować w świeżym IMDM bez LIF, jako zawiesinę jednokomórkową.</li>
	<li>Policz komórki za pomocą hemocytometru i przygotuj zawiesinę 5 x 105 komórek/ml w IMDM z 0,5 μM RA.</li>
	<li>Umieść 100 kropli 20 μl na 100-milimetrową szalkę Petriego za pomocą 8-kanałowej pipety i końcówek o pojemności 200 μl, odwróć szalki i napełnij odwróconą pokrywkę PBS, aby zapobiec wysychaniu wiszących kropli. Chronić pożywki hodowlane zawierające RZS przed światłem.</li>
	<li>Kultura EB w wiszących kroplach w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez 4 dni.</li>
</ol>
5. Kultura EB 2D
<ol>
	<li>Okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 12 mm pokryć 30 μg/ml fibronektyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umieść każde szkiełko nakrywkowe w dołku na płytce 24-dołkowej i dodaj 1 ml IMDM na studzienkę.</li>
	<li>Zbierz 3 jednodniowe wiszące krople EB jeden po drugim za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl i wysiewaj je na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, po 20 EB na dołek, używając tych samych końcówek do pipet. 
	UWAGA: 3-dniowe EB są lepsze niż 4-dniowe EB, ponieważ lepiej przylegają do szkiełek nakrywkowych.</li>
	<li>Kontynuuj kulturę z IMDM-15% FBS bez LIF. Wymieniaj podłoże co 3-4 dni. W razie potrzeby zebrać zużyte podłoże do analizy wydzielania białka.</li>
</ol>
6. Wykrywanie wydzielanych białek
<ol>
	<li>Przenieść 500 μl pożywki EB do filtrów odśrodkowych o natężeniu 10 kDa, wirować z prędkością 20 000 x g przez 60 minut w temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Sprawdzaj pożywkę pozostałą wewnątrz filtrów odśrodkowych co 15-20 minut, aby zapobiec nadmiernemu wzbogaceniu. Przerwać wirowanie, gdy objętość pozostałej pożywki spadnie do 25 μl.</li>
	<li>Zebrać pozostałą stężoną pożywkę po odwróceniu filtra i wirowaniu w temperaturze 160 x g w temperaturze 4 °C, postępując zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Wykryj wydzielane białka poprzez immunoblotting z określonymi przeciwciałami17.</li>
</ol>
7. 3D Kultura EB
<ol>
	<li>Zbierz EB hodowane przez 4 dni w wiszących kroplach zgodnie z opisem w kroku 5.2 i umieść je w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml (30 EB na probówkę).</li>
	<li>Przygotuj roztwór żelu kolagenowego zgodnie z instrukcjami zestawu do hodowli kolagenu 3D (patrz Tabela materiałów/wyposażenia). Rozcieńczyć odpowiednie objętości roztworu kolagenu i 5x DMEM (składnik zestawu); Dodaj roztwór neutralizujący (składnik zestawu) i natychmiast dobrze wymieszaj, a następnie trzymaj go na lodzie.</li>
	<li>Odpipetować odpowiednią objętość schłodzonego roztworu kolagenu do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej EB i delikatnie przenieść do dołków 6-dołkowej płytki za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 ml. Unikaj robienia bąbelków.</li>
	<li>Natychmiast przenieść płytkę do temperatury 37 °C, 5% CO2 , na 60 minut, aby zainicjować polimeryzację kolagenu.</li>
	<li>Nałóż płytkę zawierającą EB za pomocą IMDM.</li>
	<li>Zmieniaj podłoże co 3-4 dni.</li>
</ol>
8. Dysocjacja EB
<ol>
	<li>Zebrać 4 EBs (z kroku 4) jeden po drugim, za pomocą końcówek do pipet o pojemności 200 μl i przenieść je na nieprzywierającą bakteriologiczną szalkę Petriego zawierającą IMDM z 15% FBS; hodowlę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 przez kolejne 4 dni. Sprawdzaj EB dwa razy dziennie, aby upewnić się, że nie przyczepiają się do spodu; delikatnie potrząśnij naczyniem, aby zapobiec przyczepianiu się EB do dna.</li>
	<li>Odwirować EB przy 185 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej, w wirówce stołowej.</li>
	<li>Usunąć supernatanty. Ilość granulatu w każdej probówce nie powinna przekraczać 100 μl.</li>
	<li>Dodać do granulowanych EBs 1 ml 0,25% kolagenazy typu I na probówkę, uzupełnioną 20% FBS w PBS.</li>
	<li>Mieszaninę kolagenazy EB inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C, 5% CO2 , delikatnie pipetując co 20 minut, używając końcówek do pipet o pojemności 1 ml.</li>
	<li>Delikatnie umyj komórki 3x za pomocą PBS. Jeśli obecne są agregaty komórkowe, użyj sitka do komórek z siatką 100 μm, aby je usunąć.</li>
	<li>Ponownie naniec komórki na pokrytych żelatyną szalkach o średnicy 60 mm w IMDM. Następnie inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2 .</li>
</ol>
9. Transfekcja zdysocjowanych EB
<ol>
	<li>W przypadku qRT-PCR i immunoblottingu pokryj 6-dołkową płytkę 0,5% żelatyną.</li>
	<li>W celu immunofluorescencji pokryj szkiełka nakrywkowe 30 μg/ml fibronektyny przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umieść każde szkiełko nakrywkowe w dołku na 24-dołkowej płytce. Dodaj IMDM.</li>
	<li>Zasiewaj 4,75 x 105 lub 1 x 105 zdysocjowanych komórek EB (kroki 8,4-8,7) na dołek odpowiednio na płytkach 6- lub 24-dołkowych.</li>
	<li>Wyhoduj komórki do 70% konfluencji przed transfekcją.</li>
	<li>Transfekcję komórek za pomocą nieliposomalnego odczynnika optymalnego dla lipidowych komórek macierzystych17 (patrz Tabela Materiałów/Sprzętu), postępując zgodnie z instrukcjami producenta. 
	UWAGA: Używany przez nas odczynnik zazwyczaj osiągał skuteczność transfekcji na poziomie 50% (patrz Reprezentatywne wyniki).</li>
	<li>Próbki należy przeanalizować metodą qRT-PCR lub metodą immunoblottingu17 odpowiednio 2 lub 3 dni po transfekcji.</li>
</ol>
10. Analiza różnicowania EB przez immunofluorescencję
<ol>
	<li>Przemyj 2D EB lub zdysocjowane 3D EB za pomocą PBS i utrwal 4% paraformaldehydem w PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj stałe komórki 3 razy PBS, aby usunąć pływające resztki komórek. 
	UWAGA: Paraformaldehyd działa drażniąco na skórę i oczy; Zachowaj ostrożność podczas obchodzenia się z nim.</li>
	<li>Dodaj 1% triton X-100 w PBS, aby przepuszczalność komórek przez 20 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć 3x PBS.</li>
	<li>Usuń PBS i zablokuj za pomocą 5% BSA w PBS na 30 minut.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędowe rozcieńczenie przeciwciał w 1% BSA/PBS uzupełnione 0,03% trytonem X-100. Zastąp roztwór blokujący pierwszorzędowym roztworem przeciwciała. Inkubować przez 3 godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C, a następnie przemyć komórki 3x PBS.</li>
	<li>Zastosuj przeciwciało drugorzędowe w PBS zgodnie z instrukcjami producenta. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej, a następnie przemyć komórki 3x PBS.</li>
	<li>Zamontuj szkiełka nakrywkowe na szkiełkach podstawowych za pomocą podłoża zapobiegającego blaknięciu do mikroskopii optycznej.</li>
</ol>

<ol><li>Hopfl, G., Gassmann, M., Desbaillets, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiating+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiating embryonic stem cells into embryoid bodies.</a> Methods Mol Biol. 254, 79-98 (2004).</li>
<li>Itskovitz-Eldor, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+embryoid+bodies+compromising+the+three+embryonic+germ+layers%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Differentiation of human embryonic stem cells into embryoid bodies compromising the three embryonic germ layers.</a> Mol Med. 6 (2), 88-95 (2000).</li>
<li>Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficiency+of+embryoid+body+formation+and+hematopoietic+development+from+embryonic+stem+cells+in+different+culture+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems.</a> Biotechnol Bioeng. 78 (4), 442-453 (2002).</li>
<li>Johansson, S., Svineng, G., Wennerberg, K., Armulik, A., Lohikangas, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-integrin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Biosci%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-integrin interactions.</a> Front Biosci. 2, d126-d146 (1997).</li>
<li>Blumberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+role+for+retinoid+signaling+in+anteroposterior+neural+specification+and+neuronal+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">An essential role for retinoid signaling in anteroposterior neural specification and neuronal differentiation.</a> Semin Cell Dev Biol. 8 (4), 417-428 (1997).</li>
<li>Ross, S. A., McCaffery, P. J., Drager, U. C., De Luca, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+in+embryonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Retinoids in embryonal development.</a> Physiol Rev. 80 (3), 1021-1054 (2000).</li>
<li>Bain, G., Ray, W. J., Yao, M., Gottlieb, D. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+promotes+neural+and+represses+mesodermal+gene+expression+in+mouse+embryonic+stem+cells+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid promotes neural and represses mesodermal gene expression in mouse embryonic stem cells in culture.</a> Biochem Biophys Res Commun. 223 (3), 691-694 (1996).</li>
<li>Okada, Y., Shimazaki, T., Sobue, G., Okano, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic-acid-concentration-dependent+acquisition+of+neural+cell+identity+during+in+vitro+differentiation+of+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic-acid-concentration-dependent acquisition of neural cell identity during in vitro differentiation of mouse embryonic stem cells.</a> Dev Biol. 275 (1), 124-142 (2004).</li>
<li>Duester, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+synthesis+and+signaling+during+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid synthesis and signaling during early organogenesis.</a> Cell. 134 (6), 921-931 (2008).</li>
<li>Niederreither, K., Dolle, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+in+development%3A+towards+an+integrated+view%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid in development: towards an integrated view.</a> Nat Rev Genet. 9 (7), 541-553 (2008).</li>
<li>Maden, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+in+the+development%2C+regeneration+and+maintenance+of+the+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid in the development, regeneration and maintenance of the nervous system.</a> Nat Rev Neurosci. 8 (10), 755-765 (2007).</li>
<li>Sheng, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+regulates+bone+morphogenic+protein+signal+duration+by+promoting+the+degradation+of+phosphorylated+Smad1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid regulates bone morphogenic protein signal duration by promoting the degradation of phosphorylated Smad1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (44), 18886-18891 (2010).</li>
<li>Gajovic, S., St-Onge, L., Yokota, Y., Gruss, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+mediates+Pax6+expression+during+in+vitro+differentiation+of+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid mediates Pax6 expression during in vitro differentiation of embryonic stem cells.</a> Differentiation. 62 (4), 187-192 (1997).</li>
<li>Dong, D., Ruuska, S. E., Levinthal, D. J., Noy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+roles+for+cellular+retinoic+acid-binding+proteins+I+and+II+in+regulating+signaling+by+retinoic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Distinct roles for cellular retinoic acid-binding proteins I and II in regulating signaling by retinoic acid.</a> J Biol Chem. 274 (34), 23695-23698 (1999).</li>
<li>Sessler, R. J., Noy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+ligand-activated+nuclear+localization+signal+in+cellular+retinoic+acid+binding+protein-II%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A ligand-activated nuclear localization signal in cellular retinoic acid binding protein-II.</a> Mol Cell. 18 (3), 343-353 (2005).</li>
<li>Tang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SIRT1-Mediated+Deacetylation+of+CRABPII+Regulates+Cellular+Retinoic+Acid+Signaling+and+Modulates+Embryonic+Stem+Cell+Differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">SIRT1-Mediated Deacetylation of CRABPII Regulates Cellular Retinoic Acid Signaling and Modulates Embryonic Stem Cell Differentiation.</a> Mol Cell. 55 (6), 843-855 (2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RhoA+inhibits+neural+differentiation+in+murine+stem+cells+through+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Signal%22%5BJournal%5D)">RhoA inhibits neural differentiation in murine stem cells through multiple mechanisms.</a> Sci Signal. 9 (438), ra76(2016).</li>
<li>Garnaas, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Syx%2C+a+RhoA+guanine+exchange+factor%2C+is+essential+for+angiogenesis+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Syx, a RhoA guanine exchange factor, is essential for angiogenesis in Vivo.</a> Circ Res. 103 (7), 710-716 (2008).</li>
<li>Chou, Y. H., Khuon, S., Herrmann, H., Goldman, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nestin+promotes+the+phosphorylation-dependent+disassembly+of+vimentin+intermediate+filaments+during+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Nestin promotes the phosphorylation-dependent disassembly of vimentin intermediate filaments during mitosis.</a> Mol Biol Cell. 14 (4), 1468-1478 (2003).</li>
<li>Arai, T., Matsumoto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcellular+localization+of+functionally+differentiated+microtubules+in+squid+neurons%3A+regional+distribution+of+microtubule-associated+proteins+and+beta-tubulin+isotypes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Subcellular localization of functionally differentiated microtubules in squid neurons: regional distribution of microtubule-associated proteins and beta-tubulin isotypes.</a> J Neurochem. 51 (6), 1825-1838 (1988).</li>
<li>Arnhold, S., Klein, H., Semkova, I., Addicks, K., Schraermeyer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurally+selected+embryonic+stem+cells+induce+tumor+formation+after+long-term+survival+following+engraftment+into+the+subretinal+space%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Neurally selected embryonic stem cells induce tumor formation after long-term survival following engraftment into the subretinal space.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 45 (12), 4251-4255 (2004).</li>
<li>Liu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid+receptor+beta+mediates+the+growth-inhibitory+effect+of+retinoic+acid+by+promoting+apoptosis+in+human+breast+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid receptor beta mediates the growth-inhibitory effect of retinoic acid by promoting apoptosis in human breast cancer cells.</a> Mol Cell Biol. 16 (3), 1138-1149 (1996).</li>
<li>Altucci, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoic+acid-induced+apoptosis+in+leukemia+cells+is+mediated+by+paracrine+action+of+tumor-selective+death+ligand+TRAIL%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Retinoic acid-induced apoptosis in leukemia cells is mediated by paracrine action of tumor-selective death ligand TRAIL.</a> Nat Med. 7 (6), 680-686 (2001).</li>
<li>Pettersson, F., Dalgleish, A. G., Bissonnette, R. P., Colston, K. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retinoids+cause+apoptosis+in+pancreatic+cancer+cells+via+activation+of+RAR-gamma+and+altered+expression+of+Bcl-2%2FBax%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Retinoids cause apoptosis in pancreatic cancer cells via activation of RAR-gamma and altered expression of Bcl-2/Bax.</a> Br J Cancer. 87 (5), 555-561 (2002).</li>
<li>Kothapalli, C. R., Kamm, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+matrix+microenvironment+for+targeted+differentiation+of+embryonic+stem+cells+into+neural+and+glial+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">3D matrix microenvironment for targeted differentiation of embryonic stem cells into neural and glial lineages.</a> Biomaterials. 34 (25), 5995-6007 (2013).</li>
<li>Cai, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BMP+and+TGF-beta+pathway+mediators+are+critical+upstream+regulators+of+Wnt+signaling+during+midbrain+dopamine+differentiation+in+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">BMP and TGF-beta pathway mediators are critical upstream regulators of Wnt signaling during midbrain dopamine differentiation in human pluripotent stem cells.</a> Dev Biol. 376 (1), 62-73 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów ani interesów finansowych

W niniejszym protokole przedstawiamy stosunkowo prostą i przystępną metodę badania różnicowania neuronalnego mysich ESC. W poprzednich protokołach RZS dodawano do pożywki odpowiednio w 2 lub 4 dniu wiszącej kropliEB 8 lub przez kulturę zawiesinową7 lub bezpośrednio po agregacji wiszącej kropli EB21. W opracowanym przez nas protokole RA został dodany wcześniej. Pomimo wcześniejszego wprowadzenia RZS do EB utworzonych przez hodowlę zawiesiny, protokół ...

ESC pochodzą z wewnętrznej masy komórkowej blastocysty. Komórki te są pluripotencjalne, tzn. mają zdolność różnicowania się w dowolny typ komórek organizmu, z którego pochodzą. Różnicowanie ESC in vitro cieszy się dużym zainteresowaniem jako eksperymentalny system do badania ścieżek i mechanizmów rozwojowych. Oferuje potężny i elastyczny system modelowy do testowania nowych podejść terapeutycznych do korekcji dysfunkcji komórek i tkanek. EB podsumowują wiele aspektów różnicowania komórek podczas wczesnej embriogenezy. W szczególności EB mogą być stosowane, gdy letalność zarodka utrudnia określenie komórkowej podstawy wad embrionalnych1,2. EB mogą być formowane zarówno przez technikę wiszącej kropli, jak i płynnej zawiesiny3. Zaletą tych pierwszych jest możliwość generowania EB o stałej wielkości i gęstości, co ułatwia odtwarzalność eksperymentalną.
Interakcja z białkami adhezyjnymi macierzy zewnątrzkomórkowej (ECM) może wpływać na ruchliwość i przeżywalność przylegających komórek. W systemie hodowli 2D fibronektyna jest często stosowana w celu zwiększenia adhezji komórek do podłoża. Fibronektyna jest podstawowym składnikiem blaszki rozpoznawanym przez 10 typów heterodimerów integryny powierzchniowej komórki4.
RA to mały lipofilowy metabolit witaminy A, który indukuje różnicowanie neuronalne5,6. Wysokie stężenia RZS sprzyjają neuronalnej ekspresji genów i hamują ekspresję genów mezodermalnych podczas tworzenia EB7,8. RZS jest wytwarzany przez utlenianie witaminy A do retinaldehydu przez dehydrogenazę alkoholu lub retinolu, a następnie utlenianie retinaldehydu do produktu końcowego przez dehydrogenazę retinaldehydu9. Różnicowanie neuronalne wymaga transportu RZS z cytoplazmy do jądra przez komórkowe białko wiążące RZS 2 (CRABP2). W jądrze RZS wiąże się z pokrewnym kompleksem receptorowym składającym się z heterodimeru RAR-RXR klasy 10. Powoduje to rekrutację koaktywatorów transkrypcji i inicjację transkrypcji9,11. Ponadto RA sprzyja degradacji fosforylowanego (aktywnego) SMAD1, antagonizując w ten sposób sygnalizację BMP i SMAD12. Oprócz tych działań, RA zwiększa ekspresję Pax6, czynnika transkrypcyjnego, który obsługuje różnicowanie neuronalne13. Sygnalizacja RA jest modulowana przez sirtuinę-1 (Sirt1), enzym zależny od jądrowego dinukleotydu nikotynamidoadeninowego (NAD+), który deacetyluje CRABP2, zakłócając jego translokację do jądra, a tym samym wiązanie RA z heterodimerem RAR-RXR14,15,16.
Naszym celem w projektowaniu opisanego tutaj protokołu EB leczonego RZS jest optymalizacja różnicowania neuronalnego, aby ułatwić analizę in vitro szlaków sygnałowych, które regulują różnicowanie ESC w neuronalne komórki prekursorowe. Jedną z zalet tego protokołu jest ułatwienie analizy funkcji komórek za pomocą immunofluorescencji. 3D EB nie są dobrze penetrowane przez przeciwciała i są trudne do zobrazowania. Dysocjacja EB na monowarstwę 2D w określonych punktach czasowych podczas różnicowania neuronalnego ułatwia znakowanie immunologiczne i obrazowanie komórek za pomocą mikroskopii konfokalnej.

<table><tbody><tr><td>Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEFs</td><td>EMD Millipore</td><td>PMEF-CF</td><td>ESC warstwa zasilająca</td></tr><tr><td>ESC</td><td>EMD Millipore</td><td>CMTI-2</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (60 mm)</td><td>Eppendorf</td><td>30701119</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych (100 mm)</td><td>Falcon</td><td>353003</td><td>Szalka Petriego do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>(100 mm)</td><td>Corning</td><td>351029</td><td>Wiszące krople</td></tr><tr><td>Płytka 24-dołkowa</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662160</td><td>2D EBs</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka</td><td>Eppendorf</td><td>30720113</td><td>Transfection</td></tr><tr><td>Dark 1,5 ml Probówka wirówkowa</td><td>Celltreat Scientific Products</td><td>229437</td><td>RA</td></tr><tr><td>Szkło nakrywkowe mikroskopu</td><td>Fisherbrand</td><td>12-545-80</td><td>Okrągły, średnica 12 mm</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe Superfrost-plus</td><td>Fisherbrand</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw do hodowli kolagenu 3D</td><td>EMD Millipore</td><td>ECM675</td><td>Kultura 3D</td></tr><tr><td>Odczynnik do transfekcji Effectene</td><td>Qiagen</td><td>301427</td><td>Transfekcja komórek macierzystych</td></tr><tr><td>Microcon&nbsp; Filtry odśrodkowe (10 kDa)</td><td>EMD Milipory</td><td>MRCPRT010</td><td>Stężenie białka</td></tr><tr><td>Nazwa&nbsp; </td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Odczynniki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Lonza</td><td>12-709F</td><td>Posiewy MEFs</td></tr><tr><td>IMDM</td><td>Gibco</td><td>12440-046</td><td>Posiewy ESC</td></tr><tr><td>Surowica bydlęca płodu (FBS)</td><td>EMD Millipore</td><td>ES-009-B</td><td>Hodowla ESC</td></tr><tr><td>Żelatyna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G2625</td><td>Powłoka do naczyń</td></tr><tr><td>LIF</td><td>R& D Systems</td><td>8878-LF-025</td><td>Aby utrzymać pluripotencję ESC</td></tr><tr><td>MEM Roztwory aminokwasów endogennych</td><td>Gibco</td><td>11140050</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu</td><td>Gibco</td><td>21985023</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Penicylina-Streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>Gentamycyna</td><td>Gibco</td><td>15750060</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>MycoZap Plus-PR</td><td>Lonza</td><td>VZA-2022</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>0,25% Trypsyna-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-072</td><td>Hodowla komórkowa</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Kwas all-trans-retinowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R2625-50MG</td><td>Indukcja różnicowania neuronalnego</td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-50G</td><td>Blokowanie i rozcieńczanie przeciwciał&nbsp;</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8787-100ML</td><td>Przepuszczalność błony komórkowej</td></tr><tr><td>Sitko komórkowe</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Prolong Gold odczynnik zapobiegający blaknięciu z DAPI</td><td>Life Tech.</td><td>P36931</td><td>Odczynnik montażowy</td></tr><tr><td>16% paraformaldehydu&nbsp;</td><td>Mikroskopia elektronowa Nauki</td><td>15710</td><td>Utrwalanie komórek</td></tr><tr><td>Fibronektyna</td><td>R& D Systems</td><td>1030-FN</td><td>Powłoka do naczyń</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010049</td><td></td></tr><tr><td>Kolagenaza typ I</td><td>Worthington Biochem. Corp</td><td>LS004196</td><td>EB dysocjacja</td></tr><tr><td><silny>Nazwa&nbsp; </td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała pierwotne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin (Rat-401)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-33677</td><td>Wykrywanie różnicowania neuronalnego</td></tr><tr><td>Oct4</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-5279</td><td>Wykrywanie różnicowanie neuronalne</td></tr><tr><td>Nanog</td><td>Bethyl Laboratories</td><td>A300-398A</td><td>Wykrywanie różnicowania neuronalnego</td></tr><tr><td>Sygnalizacja komórkowa</td><td>Sox2</td><td>3579</td><td>Wykrywanie różnicowania neuronalnego</td></tr><tr><td>Tubulina b3 (AA10)</td><td>Santa Cruz Biotech</td><td>sc-80016</td><td>Wykrywanie różnicowania neuronalnego</td></tr><tr><td>Nazwa&nbsp; </td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciała wtórne</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Donkey anti-Mouse-Alexa555</td><td>Life Tech.</td><td>A31570</td><td>Immunofluorescencyjny</td></tr><tr><td>osioł anty-mysz-Alexa488&nbsp;</td><td>Technologia życiowa.</td><td>A21202</td><td>Immunofluorescencja</td></tr><tr><td><silna>Nazwa&nbsp; </td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Instrumenty</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop szerokokątny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td>Obrazowanie hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny</td><td>Nikon</td><td>C2</td><td>Obrazowanie immunofluorescencyjne</td></tr></tbody></table>

analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mysie embrionalne komórki macierzyste (ESC) wyizolowane z wewnętrznej masy blastocysty (zazwyczaj w dniu E3.5), mogą być używane jako system modelowy in vitro do badania wczesnego rozwoju embrionalnego. W przypadku braku czynnika hamującego białaczkę (LIF) EKM domyślnie różnicują się w neuronalne komórki prekursorowe. Można je zgromadzić w trójwymiarowym (3D) sferycznym skupisku zwanym ciałem embrionalnym (EB) ze względu na jego podobieństwo do zarodka we wczesnym stadium. EB mogą być wysiewane na szkiełkach nakrywkowych pokrytych fibronektyną, gdzie rozszerzają się poprzez wzrost dwuwymiarowych (2D) przedłużeń lub wszczepiane w matryce kolagenowe 3D, gdzie kontynuują wzrost jako sferoidy i różnicują się w trzy listki zarodkowe: endodermalne, mezodermalne i ektodermalne. Kultura kolagenu 3D naśladuje środowisko in vivo bardziej niż EB 2D. Hodowla 2D EB ułatwia analizę za pomocą immunofluorescencji i immunoblottingu w celu śledzenia różnicowania. Opracowaliśmy dwuetapowy protokół różnicowania neuronalnego. W pierwszym etapie EB są generowane techniką wiszącej kropli i jednocześnie są indukowane do różnicowania przez ekspozycję na kwas retinowy (RZS). W drugim kroku różnicowanie neuronalne przebiega w formacie 2D lub 3D przy braku RA.

Oct4, Nanog i SOX2 to kluczowe czynniki transkrypcyjne, które zapewniają zdolność ESC do samoodnowy i pluripotencję. Zastosowaliśmy powyższy protokół, aby porównać różnicowanie neuronalne ESC pochodzących od myszy typu dzikiego oraz od szczepu myszy modyfikowanych genetycznie, w którym zdezaktywowano Syx – gen kodujący Syx, specyficzny czynnik wymiany dla RhoA. Wcześniej wskazaliśmy na udział Syx w angiogenezie18. Zauważyliśmy różnice w zachowaniu ciał emb...

Opisujemy technikę wykorzystania mysich embrionalnych komórek macierzystych do generowania dwu- lub trójwymiarowych ciał embrionalnych. Następnie wyjaśniamy, jak indukować różnicowanie neuronalne komórek ciała zarodka za pomocą kwasu retinowego i jak analizować ich stan różnicowania za pomocą immunofluorescencji markerów komórek progenitorowych i immunoblottingu.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest analiza ekspresji genów oraz produkcji markerów białkowych różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy. Metoda ta może pomóc w określeniu mechanizmu odpowiedzialnego za hamowanie różnicowania neuronalnego przez surowe DPA oraz przyczynić się do opracowania lepszych protokołów różnicowania komórek macierzystych w neurony do celów terapeutycznych. Główną zaletą tej techniki jest ułatwienie monitorowania procesu różnicowania neuronalnego na poziomie mRNA i białek, w tym z wykorzystaniem mikroskopii optycznej.Procedurę zaprezentuje dr Junning Yang, adiunkt w moim laboratorium. Proces tworzenia ciał embrionoidalnych należy rozpocząć od zbioru embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu 0,25% Trypsyny-EDTA przez dwie do pięciu minut w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. Do odrywających się komórek należy dodać świeżą modyfikowaną pożywkę Dulbecco Iscove'a (IMDM) z 15% FBS, a następnie przenieść zawiesinę komórkową do probówki o pojemności 15 ml.Wirować przy 160 ×g przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie policzyć komórki za pomocą hemocytometru i przygotować zawiesinę o stężeniu 5 × 10⁵ komórek na ml w medium IMDM z dodatkiem 0,5 µM kwasu retinowego. Następnie, używając pipety ośmiokanałowej i końcówek 200 µL, nanieść krople o objętości 120 µL na szalkę Petriego o średnicy 100 mm.Odwróć szalkę i wypełnij odwróconą pokrywkę PBS, aby zapobiec wysychaniu kropli zwisających. Inkubuj w temperaturze 37 °C, przy 5% CO2, przez trzy do czterech dni. Użyj końcówek do pipety o objętości 200 µL, aby zebrać ciała embrionalne z kropli zwisających, które rosły przez trzy dni.Dotknąć ciała embrionoidalnego końcówką pipety i przenieść je na szkiełko podstawowe pokryte fibronektyną w płytce 24-dołkowej. Wymieniać pożywkę w kulturach co dwa do trzech dni. Podczas wymiany pożywki zbierać zużytą pożywkę do analizy sekrecji białek, zgodnie z potrzebami.Aby wykryć białka wydzielane do pożywki, przenieś 500 µL pożywki z ciałek embrionalnych do wirówek z filtrami o progu odcięcia 10 kDa i wiruj przy 20 000 ×g w temperaturze 4 °C. Kontroluj objętość pożywki pozostałej w filtrach co 15–20 minut, aby zapobiec nadmiernemu zagęszczeniu. Przerwij wirowanie, gdy objętość pozostałej pożywki spadnie do 25 µL.Odwróć filtr i wiruj przy 160 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza, a następnie zbierz pozostałą skoncentrowaną pożywkę zgodnie z instrukcjami producenta. W przypadku hodowli 3D, zbierz ciała embrionalne hodowane przez cztery dni metodą wiszących kropli, używając końcówek do pipety o pojemności 200 µl, jak poprzednio. Przenieś 30 ciał embrionalnych do probówki do wirowania o pojemności 1,5 ml, a następnie przygotuj roztwór żelu kolagenowego, rozcieńczając odpowiednie objętości roztworu kolagenu i 5X DMEM, dodając roztwór neutralizujący i natychmiast dobrze mieszając.Umieścić żel kolagenowy na lodzie. Następnie pipetować odpowiednią objętość schłodzonego roztworu kolagenu do probówki zawierającej ciała embrionalne, a następnie delikatnie przenieść zawiesinę ciał embrionalnych do dołków płytki sześciodołkowej, unikając tworzenia pęcherzyków powietrza. Natychmiast przenieść płytkę do inkubatora w temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 60 minut, aby zainicjować polimeryzację kolagenu.Po 60 minutach płytkę zawierającą ciała embroidalne przykryć medium IMDM. W celu dysocjacji ciał embroidalnych ponownie zebrać ciała embroidalne po czterodniowej metodzie wiszącej kropli za pomocą końcówek do pipety o pojemności 200 µL. Tym razem przenieść je do nieprzywierającej bakteriologicznej szalki Petriego zawierającej medium IMDM z 15% FBS i inkubować w temperaturze 37 °C, w atmosferze 5% CO2, przez kolejne cztery dni.Kontroluj ciała embrionalne dwa razy dziennie, aby upewnić się, że nie przywierają one do dna. Delikatnie potrząśnij naczyniem, aby zapobiec przywieraniu ciał embrionalnych. Po czterech dniach przenieś ciała embrionalne do probówki do wirowania i wiruj przy 185 x G przez pięć minut w temperaturze pokojowej.Po wirowaniu usunąć nadsącz. Objętość osadu nie powinna przekraczać 100 µl. Następnie do probówki z ciałami embrionalnymi pipetować 1 ml 0,25% kolagenazy typu I, uzupełnionej 20% FBS w PBS.Inkubować mieszaninę przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Delikatnie pipetować zawiesinę za pomocą końcówki do pipety o pojemności 1 mL co 20 minut. Po inkubacji delikatnie przemyć komórki trzy razy roztworem PBS.Jeśli obecne są agregaty komórkowe, należy użyć sita komórkowego o oczkach 100 µm w celu ich usunięcia. Wysiać komórki na pokrywki szkiełkach pokryte żelatyną w medium IMDM, a następnie inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Przemyć 2D lub dysocjowane ciała embrionalne 3D za pomocą PBS.Następnie utrwalone próbki inkubuje się w 4% paraformaldehydzie i PBS przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Po trzykrotnym przemyciu utrwalonych komórek PBS w celu usunięcia pływających resztek komórkowych, dodaje się 1% Triton X-100 w PBS, aby przeprowadzić permeabilizację komórek przez 20 minut w temperaturze pokojowej. Po ponownym przemyciu, w taki sam sposób jak poprzednio, usuwa się ostatni roztwór płuczący i blokuje próbki w 5% BSA w PBS przez 30 minut.Pod koniec inkubacji należy przygotować rozcieńczenie przeciwciała pierwszorzędowego w 1% BSA w PBS z dodatkiem 0,03% triton X-100. Po upływie 30 minut roztwór blokujący należy zastąpić roztworem przeciwciała pierwszorzędowego. Inkubować przez trzy godziny w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4°C.Po przemyciu należy nałożyć przeciwciało wtórne w PBS i inkubować przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej. Na koniec przykrywki należy zamocować na szkiełkach przedmiotowych, używając medium zapobiegającego blaknięciu do mikroskopii optycznej. Obraz ten przedstawia wyłanianie się pędów z ciała embrionoidalnego wygenerowanego z ESCs, pozytywnego pod kątem dwóch kopii genu Syx, który koduje czynnik wymiany guaniny aktywujący GTPazę RhoA.Zdjęcie wykonano po sześciu dniach hodowli 3D. To ciało embrionoidalne utworzone z ESC z nokautem genu Syx wykazuje zwiększone pączkowanie po tym samym czasie hodowli. Tutaj obrazy fazowe krawędzi 2D ciała embrionoidalnego pokazują, że komórki z nokautem Syx rozprzestrzeniały się szybciej niż komórki Syx typu dzikiego.Niniejsze obrazy immunofluorescencyjne ilustrują, że marker różnicowania neuronalnego, Nestin, zaznaczony na czerwono, występował w większej ilości w komórkach namnażanych z sześciodniowych ciał embrionalnych 2D6 KnockOut niż w ich odpowiednikach Syx typu dzikiego. Tutaj obrazy immunofluorescencyjne pokazują, że markery różnicowania neuronalnego Nestin i beta III Tubulin występowały w większej ilości w komórkach dysocjowanych z 13-dniowych ciał embrionalnych 3D6 KnockOut niż w ich odpowiednikach Syx typu dzikiego. Jest to procedura czasochłonna ze względu na czas trwania wzrostu i różnicowania ciał embrionalnych.Proces ten wymaga nie tylko co najmniej ośmiu dni, lecz w niektórych przypadkach śledzimy różnicowanie aż do 24 dnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby ograniczyć średnicę ciał embrionoidalnych w celu zapewnienia podobnego tempa różnicowania we wszystkich ciałach embrionoidalnych.

analysis-retinoic-acid-induced-neural-differentiation-mouse-embryonic

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opracowaliśmy protokół indukcji neuroblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z zastosowaniem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów neuronalnych oraz typów komórek neuronalnych rozwijającego się OUN w celu regeneracji tkanki nerwowej.

Efektywne wyprowadzanie ludzkich progenitorów neuronalnych i neuronów z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z zastosowaniem indukcji małymi cząsteczkami

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Ten film demonstruje metodę generowania in vitro nerwowych komórek progenitorowych (NPC) z embrionalnych komórek macierzystych myszy (mESC). MESC są hodowane w zawiesinie w celu wytworzenia ciał embrionalnych (EB), które są następnie kierowane do różnicowania się w NPC poprzez traktowanie kwasem retinowym w kulturze adherentnej.

Technika generowania nerwowych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Film demonstruje metodę indukowania różnicowania komórek macierzystych w progenitory nerwowe za pomocą kwasu retinowego i metody hodowli wiszącej kropli.

Różnicowanie komórek ciała zarodka w progenitory nerwowe za pomocą kwasu retinowego

Ten film demonstruje technikę oceny aktywności kwasu retinowego w zarodkach myszy. Po wyizolowaniu komórek z zarodków myszy, komórki są hodowane wspólnie z komórkami reporterowymi kwasu retinowego (RA). Komórki embrionalne wytwarzają RZS, który indukuje ekspresję beta-galaktozydazy w komórkach reporterowych, wskazując na aktywność RA w komórkach embrionalnych.

Wykorzystanie komórek reporterowych w kokulturze do badania produkcji kwasu retinowego przez komórki embrionalne myszy

Z zamiarem scharakteryzowania zmian w miRNA na zróżnicowanych ludzkich nerwowych komórkach macierzystych (hNSC) opisujemy różnicowanie hNSC w systemie trójwymiarowym, ocenę zmian w ekspresji mikroRNA za pomocą macierzy miRNA PCR oraz analizę obliczeniową do przewidywania celu miRNA i jego walidacji za pomocą testu podwójnej lucyferazy.

Różnicowanie ludzkiej linii nerwowych komórek macierzystych w hodowlach trójwymiarowych, analiza mikroRNA i przypuszczalnych genów docelowych

Ten protokół szczegółowo opisuje metodę generowania neuronalnych komórek progenitorowych z embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu metody monowarstwowej bez surowicy. Te progenitory mogą być wykorzystywane do uzyskiwania dojrzałych typów komórek nerwowych lub do badania procesu specyfikacji neuronalnej i są podatne na skalowanie w formacie wielodołkowym w celu przeprowadzenia badań przesiewowych związków.

Różnicowanie neuronalne embrionalnych komórek macierzystych myszy w hodowli jednowarstwowej bez surowicy

Metody dokładnego pomiaru poziomu kwasu retinowego (RA) w małych ilościach tkanek nie istnieją. Protokół ten opisuje łatwy, ilościowy pomiar względnych poziomów RZS w zarodkach i neurosferach E8.5 przy użyciu linii komórek reporterowych RA.

Ilościowy pomiar względnych poziomów kwasu retinowego w zarodkach E8.5 i kulturach neurosfery przy użyciu testu reporterowego F9 RARE-LACZ

Tutaj stworzyliśmy tanią i łatwą w obsłudze metodę, która kieruje szybkim i efektywnym różnicowaniem się od embrionalnych komórek macierzystych do neuronów. Metoda ta nadaje się do popularyzacji wśród laboratoriów i może być przydatnym narzędziem do badań neurologicznych.

Różnicowanie neuronalne na podstawie embrionalnych komórek macierzystych myszy in vitro

Opisujemy procedurę różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w komórki neuronalne za pomocą metody wiszącej kropli. Ponadto przeprowadzamy kompleksową analizę fenotypową za pomocą RT-qPCR, immunofluorescencji, sekwencjonowania RNA i cytometrii przepływowej.

Różnicowanie i charakterystyka neuronalnych progenitorów i neuronów z embrionalnych komórek macierzystych myszy

Poznaj analizę różnicowania neuronalnego komórek macierzystych myszy przy użyciu kwasu retinowego w ciałach embrionalnych. Ta metoda umożliwia śledzenie ekspresji genów i markerów białkowych.

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych (Wideo) | JoVE Journal

Analiza indukowanego kwasem retinowym różnicowania neuronalnego embrionalnych komórek macierzystych myszy w dwu- i trójwymiarowych ciałach embrionalnych

Przeglądaj więcej filmów