Name: Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 24 s
Description: Poznaj metodę wysokiej precyzji FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do identyfikacji stanów konformacyjnych domeny wiążącej ligand receptora NMDA. Technika ta umożliwia dokładne modelowanie strukturalne.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

VJ i HS potwierdzają wsparcie od NIH R01 GM094246 do VJ. HS docenia fundusze na rozpoczęcie działalności z Clemson University Creative Inquiry Program oraz Center for Optical Materials Science and Engineering Technologies na Clemson University. Projekt ten był również wspierany przez stypendium szkoleniowe z Keck Center for Interdisciplinary Bioscience Training of the Gulf Coast Consortia (grant NIGMS nr 1 T32GM089657-05) oraz stypendium Fundacji Schisslera na badania translacyjne nad powszechnymi chorobami człowieka do DD. Wyłączną odpowiedzialność za treść ponoszą autorzy i nie muszą one reprezentować oficjalnych poglądów National Institutes of Health.

Wszyscy autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych w stosunku do treści tego artykułu.

W niniejszej pracy przedstawiono protokół wyrównywania, kalibracji i pomiaru odległości między barwnikami z dużą precyzją przy użyciu eksperymentów z jednocząsteczkowymi cząsteczkami FRET PIE-MFD. Poprzez staranną kalibrację wszystkich parametrów instrumentu można zwiększyć dokładność mierzonych odległości i osiągnąć dokładność angstrema. W tym celu wykorzystuje się różne wielowymiarowe histogramy do analizy i identyfikacji populacji w celu dalszej charakterystyki. Wykorzystując średni czas makro do weryfikacji stabilnoś...

Podstawowym celem badań biologii strukturalnej jest odkrycie związku między strukturą a funkcją maszyn biomolekularnych. Pierwsze wizualne wrażenie biomolekuł (np. białek i kwasów nukleinowych) pojawiło się w latach pięćdziesiątych XX wieku dzięki rozwojowi krystalografii rentgenowskiej1,2. Krystalografia rentgenowska dostarcza wysokiej rozdzielczości, statycznych informacji strukturalnych ograniczonych przez upakowanie kryształów. W związku z tym nieodłączny bezruch rentgenowskich modeli strukturalnych unika dynamicznej natury biomolekuł, czynnika, który wpływa na większość funkcji biologicznych3,4,5. Magnetyczny rezonans jądrowy (NMR)6,7,8 dostarczył alternatywnego rozwiązania problemu, rozwiązując modele strukturalne w roztworach wodnych. Ogromną zaletą NMR jest jego zdolność do odzyskiwania wewnętrznej dynamicznej natury biomolekuł i zespołów konformacyjnych, co pomaga wyjaśnić wewnętrzne relacje między strukturą, dynamiką i funkcją3,4,5. Niemniej jednak NMR, ograniczony wielkością próbki i dużymi ilościami próbki, wymaga złożonych strategii etykietowania dla większych systemów. W związku z tym istnieje pilna potrzeba opracowania alternatywnych metod w biologii strukturalnej.
Historycznie, transfer energii rezonansu Förstera (FRET)9 nie odgrywał ważnej roli w biologii strukturalnej z powodu błędnego przekonania, że FRET zapewnia niskie dokładności pomiary odległości. Celem tego protokołu jest ponowne zbadanie zdolności FRET do określania odległości w skali nanometrowej, tak aby odległości te można było wykorzystać do budowy modeli strukturalnych biomolekuł. Pierwsza eksperymentalna weryfikacja zależności R-6 od wydajności FRET została przeprowadzona przez Stryera w 1967 roku10, mierząc poliproliny o różnych długościach jako "linijka spektroskopowa". Podobny eksperyment został przeprowadzony na poziomie pojedynczej cząsteczki w 2005 roku11. Cząsteczki poliproliny okazały się nieidealne, w związku z czym później zastosowano dwuniciowe cząsteczki DNA12. Otworzyło to okno do precyzyjnych pomiarów odległości i pomysłu wykorzystania FRET do identyfikacji właściwości strukturalnych biomolekuł.
FRET jest optymalny, gdy zakres odległości interdye wynosi od ~0,6-1,3 R0, gdzie R0 to odległość Förstera. Dla typowych fluoroforów stosowanych w jednocząsteczkowych eksperymentach z fretem, R0 wynosi ~50 A. Zazwyczaj FRET ma wiele zalet w porównaniu z innymi metodami pod względem zdolności do rozwiązywania i różnicowania struktur i dynamiki w układach heterogenicznych: (i) Ze względu na najwyższą czułość fluorescencji, eksperymenty z pojedynczą cząsteczką FRET13,14,15,16 potrafi rozwiązywać heterogeniczne zespoły, bezpośrednio licząc i jednocześnie charakteryzując struktury swoich poszczególnych członków. (ii) Złożone szlaki reakcji można bezpośrednio rozszyfrować w badaniach FRET na pojedynczych cząsteczkach, ponieważ nie jest potrzebna synchronizacja zespołu. (iii) FRET może uzyskać dostęp do szerokiego zakresu domen czasowych, które obejmują ponad 10 dekad w czasie, obejmując szeroki zakres biologicznie istotnych dynamik. (iv) Eksperymenty FRET mogą być przeprowadzane w dowolnych warunkach roztworu, zarówno in vitro, jak i in vivo. Połączenie FRET z mikroskopią fluorescencyjną pozwala na badanie struktur molekularnych i interakcji bezpośrednio w żywych komórkach15,16,17,18,19, nawet z dużą precyzją20. (v) FRET może być stosowany do systemów o niemal każdej wielkości (np. oligomery poliprolinowe21,22,23,24, Hsp9025, HIV reverse transcriptase26 i rybosomy27). (vi) Wreszcie, sieć odległości, która zawiera wszystkie wymiarowości biomolekuł, może być wykorzystana do wyprowadzenia modeli strukturalnych cząsteczek statycznych lub dynamicznych18,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37.
Dlatego spektroskopia FRET pojedynczej cząsteczki może być używana do wyznaczania odległości, które są na tyle precyzyjne, że można je wykorzystać do modelowania strukturalnego z ograniczeniem odległości26. Jest to możliwe dzięki wykorzystaniu wieloparametrowego wykrywania fluorescencji (MFD)28,38,39,40,41,42, który wykorzystuje osiem wymiarów informacji fluorescencyjnej (tj. widmo wzbudzenia, widmo fluorescencji, anizotropia, czas życia fluorescencji, wydajność kwantowa fluorescencji, czas makroskopowy, intensywność fluorescencji i odległość między fluoroforami), aby dokładnie i precyzyjnie zapewnić ograniczenia odległości. Dodatkowo, impulsowe wzbudzenie z przeplotem (PIE) jest połączone z MFD (PIE-MFD)42 w celu monitorowania fluorescencji akceptora bezpośredniego wzbudzenia i wyboru zdarzeń jednocząsteczkowych wynikających z próbek zawierających stechiometrię 1:1 donor-akceptor. Typowa konfiguracja PIE-MFD wykorzystuje dwuimpulsowe lasery wzbudzające z przeplotem połączone z korpusem mikroskopu konfokalnego, w którym detekcja fotonów jest podzielona na cztery różne kanały w różnych oknach spektralnych i charakterystyce polaryzacji. Więcej szczegółów można znaleźć na rysunku 1.
Ważne jest, aby pamiętać, że FRET musi być połączony z metodami obliczeniowymi, aby uzyskać atomistyczne modele strukturalne, które są zgodne z wynikami FRET26,30. Celem niniejszego protokołu nie jest omówienie powiązanej metodologii budowy modeli strukturalnych z odległościami pochodzącymi z FRET. Jednak podejścia te zostały zastosowane w połączeniu z innymi technikami (np. rozpraszaniem promieniowania rentgenowskiego pod małym kątem lub elektronowym rezonansem paramagnetycznym), dając początek dziedzinie integracyjnej biologii strukturalnej43,44,45,46. Obecnym celem jest utorowanie drogi dla FRET jako narzędzia ilościowego w biologii strukturalnej. Na przykład metodologia ta została wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand (LBD) receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Ostatecznym celem jest przezwyciężenie wyżej wymienionych ograniczeń i włączenie FRET do metod integracyjnych stosowanych do oznaczania strukturalnego biomolekuł poprzez dostarczanie zmierzonych odległości z dużą precyzją.

<table><tbody><tr><td>węgiel węglowy</td><td>Merck KGaA</td><td>K42964486 320</td><td></td></tr><tr><td>filtr strzykawkowy</td><td>Fisherbrand</td><td>09-719C</td><td>rozmiar: 0,20 i mikro; m</td></tr><tr><td>komorowe szkło nakrywkowe</td><td>Fisher Scientific 155409</td><td></td><td>1,5 szkło borokrzemianowe, 8-dołkowe szkło osłonowe</td></tr><tr><td>mikroskopu</td><td>Fisher Scientific</td><td>063014-9</td><td>rozmiar: 24 x 60-1,5</td></tr><tr><td>Woda wolna od nukleaz</td><td>Fisher Scientific</td><td>148859</td> bez <td>nukleaz</td></tr><tr><td>tween-20</td><td>Thermo Scientific</td><td>28320</td> 10% roztwór nici DNA akceptora <td>polisorbatu 20</td></tr><tr><td>( Wysoka FRET)</td> <td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>178124895</td><td>5&acute;-d (CGG, CCT, ATT TCT, GAG, TTG, TAA, ACA, GAG AT(Cy5)C, GCC, TTA, AAC, GTT, CGC, CTA GAC, TAC, TCC, AAG, TAT TGC)</td></tr><tr><td>akceptor nici DNA (Low FRET)</td><td>Zintegrowane technologie DNA</td><td>177956424</td><td>5&acute;-d(CGG, CCT, ATT, TCG, GAG, TTG, TAA, ACA, GAG, ATC, GCC, TT(Cy5)A, AAC, GTT, CGC, CTA, GAC, TAG, TCC, AAG, TAT TGC)</td></tr><tr><td>Zintegrowana nić DNA dawcy</td><td> DNA Technologies</td><td>177951437</td><td>5&acute; -d(GCA ATA CTT GGA CTA GTC TAG GCG AAC GTT TAA GGC GAT CTC TGT TT(Alexa488)A CAA CTC CGA AAT AGG CCG)</td></tr><tr><td>nić DNA (bez FRET)</td><td>Zintegrowane technologie</td><td></td> DNA <td>5&acute; -d(CGG CCT ATT TCG GAG TTG TAA ACA GAG ATC GCC TTA AAC GTT CGC CTA GAC TAG TCC AAG TAT TGC)</td></tr><tr><td>termocykler</td><td>Eppendorf</td><td>E6331000025</td><td>gradient</td></tr> <tr><td>nexusAlexa Fluor 488 C5&nbsp; Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A10254</td><td>określany jako cyjanowo-zielony fluorofor w manuskrypcie</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 C2&nbsp; Maleimide</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20347</td><td>określany w manuskrypcie jako far-czerwony fluorofor</td></tr><tr><td>Rodamina 110</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83695-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Rodamina 101</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>83694-500MG</td><td></td></tr><tr><td>LB Rosół, Miller</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1426</td><td>Do hodowli E. coli</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0166</td><td>Używany przy 100 &mikro; g/ml stężenie końcowe w selektywnej pożywce LB w celu utrzymania selekcji plazmidu</td></tr><tr><td>Tetracylina&nbsp;</td><td>Calbiochem</td><td>58346</td><td>Używany przy 12,5 &mikro; g / ml końcowe stężenie w selektywnej pożywce LB w celu utrzymania mutacji gor (reduktazy flutationu) w szczepach Origami B (DE3) w celu ułatwienia utleniania wiązań dwusiarczkowych</td></tr><tr><td>Kanamycyna</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP906-5</td><td>Używany przy 15 &mikro; g / ml końcowe stężenie w selektywnej pożywce LB w celu utrzymania mutacji trxB (reduktazy ryoretoksyny) w barwieniu B(DE3) w celu ułatwienia utleniania wiązań dwusiarczkowych</td></tr><tr><td>Origami B(DE3) Kompetentne komórki</td><td>Millipore</td><td>70837-3</td><td>Kompetentne E. Komórki coli do ekspresji białka z mostkami dwusiarczkowymi</td></tr><tr><td>Izopropylo-&beta;-D-tiogalaktopiranozyd (IPTG)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1755</td><td>Do indukcji ekspresji białka E. coli</td></tr><tr><td>Chelatacja HiTrap HP</td><td>GE Life Sciences</td><td>17-0409-01</td><td>Do oczyszczania na dużą skalę FPLC białka znakowanego Hisem</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56749</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Agaroza&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PD-10 Kolumna odsalająca</td><td>GE Nauki Przyrodnicze</td><td>17-0851-01</td><td></td></tr><tr><td>AktaPurifier</td><td>GE Nauki Przyrodnicze</td><td>28406264</td><td>FPLC</td></tr><tr><td>Rurki do dializy</td><td>Spectrum labs</td><td>132562</td><td>15 kD MWCO 24 mm Szerokość klapy, 10 metrów / rolka</td></tr><tr><td>Dichroika</td><td>Semrock</td><td>FF500/646-Di01-25x36</td><td>500/646 BrightLight</td></tr><tr><td>50/50 Rozdzielacz wiązki polaryzacyjny</td><td>Qioptiq Linos&nbsp;</td>Polaryzator foliowy <td>G33 5743 000</td><td>10 x 10</td></tr><tr><td>Filtr Green Pass</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td>ET525/50m Mocowanie o średnicy 25 mm</td></tr><tr><td>Filtr czerwonoprzepustowy</td><td>Chroma</td><td>ET720/150m</td><td>ET720/150m Średnica 25 mm Miernik</td></tr><tr><td>mocy</td><td>ThorLabd</td><td>PM200</td><td></td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-Vis</td><td>Varian</td><td>Cary300Bio</td><td></td></tr><tr><td>Fluorolog 3 fluorometr</td><td>Horiba</td><td>FL3-22-R3</td><td></td></tr><tr><td>Sterownik Fluorohub TCSPC</td><td>Horiba</td><td>Fluorohub-B</td><td>Elektronika TCSPC do pomiarów zespołowych</td></tr><tr><td>NanoLed 485L</td><td>Horiba</td><td>485L</td><td>Laser diodowy niebieski</td></tr><tr><td>NanoLed 635L</td><td>Horiba</td><td>635L</td><td>Laser diodowy czerwony</td></tr><tr><td>Olympus IX73</td><td>Olympus</td><td>IX73P2F</td><td>Ramka mikroskopu</td></tr><tr><td>PMA 40 Detektor hybrydowy</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932200, PMA 40</td><td>Zoptymalizowany do wykrywania zieleni</td></tr><tr><td>Detektor hybrydowy PMA 50</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>932201, PMA 50</td><td>Zoptymalizowany pod kątem czułości dźwigni zmiany biegów ed</td></tr><tr><td>Laser 485 nm</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-485</td><td></td></tr><tr><td>Laser 640 nm</td><td>PicoQuant GmbH</td><td>LDH-D-C-640</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozyskiwania energii Hydraharp 400 i TTTR</td><td>PicoQuant</td><td>930021</td><td>Zegar zdarzeń pikosekundowych i skorelowana w czasie jednostka kodowania pojedynczych fotonów, zawiera oprogramowanie do akwizycji TTTR</td></tr><tr><td>SEPIA II SLM 828 i oprogramowanie SEPIA</td><td>PicoQuant</td><td>910028</td><td>sterownik laserowy dla impulsów pikosekundowych, zawiera kontroler oprogramowania SEPIA.</td></tr><tr><td>komputer</td><td>Procesor Dell</td><td>Optiplex 7010</td><td>: i7-3770 ram: 16 GB</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do pozycjonowania i ekranowania (FPS) FRET</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>Zawiera klikulator Accesibel Volume dostępny w</td></tr><tr><td>pakiecie http://www.mpc.hhu.de/software/fps.html MFD</td><td>Heinrich Heine Unviersity</td><td></td><td>Zawiera pakiet oprogramowania BIFL Paris; Margarita do wizualizacji historii wieloparametrowych oraz oprogramowanie do analizy rozkładu prawdopodobieństwa dostępne na stronie http://www.mpc.hhu.de/software/software-package.html</td></tr></tbody></table>

wysoka precyzja fret na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

High Precision FRET at Single-molecule Level for Biomolecule Structure Determination

Protokół dotyczący wykonywania precyzyjnych pomiarów odległości między barwnikami za pomocą transferu energii rezonansu Förstera (FRET) na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie wieloparametrowej detekcji fluorescencji (MFD) jest przedstawiony tutaj. MFD maksymalizuje wykorzystanie wszystkich "wymiarów" fluorescencji w celu redukcji artefaktów fotofizycznych i eksperymentalnych oraz pozwala na pomiar odległości interdywu z dokładnością do ~1 A w sztywnych biomolekułach. Metodę tę zastosowano do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych domeny wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA) w celu wyjaśnienia aktywacji receptora po związaniu liganda. Porównując znane struktury krystalograficzne z pomiarami eksperymentalnymi, zgodzili się w zakresie mniej niż 3 A dla bardziej dynamicznych biomolekuł. Zebranie zestawu ograniczeń odległości, które obejmowałoby całą wymiarowość biomolekuł, umożliwiłoby stworzenie modelu strukturalnego dynamicznych biomolekuł.

W typowych eksperymentach smFRET z użyciem konfiguracji MFD (linie laserowe: 485 nm przy 60 μW i 640 nm przy 23 μW, sekcja 5.1), próbka fluorescencji jest rozcieńczana do niskiego stężenia pikomolarnego (10-12 M = 1 pM) i umieszczana w mikroskopie konfokalnym, gdzie sub-nanosekundowy impuls laserowy wzbudza znakowane cząsteczki, swobodnie dyfundując przez objętość wzbudzenia. Typowa objętość konfokalna wynosi &lt;4 femtolitry (fL). Przy tak niskich stężeniach wykrywane są tylko...

Protokół dla wysoce precyzyjnych eksperymentów FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki jest przedstawiony tutaj. Ponadto metodologia ta może być wykorzystana do identyfikacji trzech stanów konformacyjnych w domenie wiążącej ligand receptora N-metylo-D-asparaginianu (NMDA). Wyznaczanie precyzyjnych odległości jest pierwszym krokiem w kierunku budowy modeli konstrukcyjnych w oparciu o eksperymenty FRET.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

A protocol on how to perform high-precision interdye distance measurements using F&#246;rster resonance energy transfer (FRET) at the single-molecule ...

Ogólnym celem tego protokołu jest wykonanie bardzo precyzyjnych pomiarów odległości między barwnikami przy użyciu wieloparametrowej detekcji fluorescencji F

high-precision-fret-at-single-molecule-level-for-biomolecule

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W niniejszym artykule opisujemy sposób uzyskiwania przebiegów FRET z pojedynczych cząsteczek DNA unieruchomionych na powierzchni przy użyciu zautomatyzowanego konfokalnego mikroskopu skanującego.

Zautomatyzowany system do pomiarów fluorescencji pojedynczych cząsteczek dla unieruchomionych na powierzchni biomolekuł

Pojedyncze fluorofory mogą być lokalizowane z nanometrową precyzją za pomocą FIONA. W tym miejscu przedstawiono podsumowanie techniki FIONA oraz opisano sposób przeprowadzania eksperymentów FIONA.

Obrazowanie fluorescencyjne z dokładnością jednego nanometra (FIONA)

Przedstawiono protokół kowalencyjnego łączenia dużej różnorodności pojedynczych cząsteczek na końcówce AFM. Podano procedury i przykłady określające siłę adhezji i energię swobodną tych cząsteczek na stałych nośnikach i biointerfejsach.

Badanie adhezji pojedynczych cząsteczek za pomocą spektroskopii sił atomowych

Przedstawiamy konfigurację i eksperymentalną procedurę uzyskiwania danych smFRET z dużych sieci donor-akceptor za pomocą mikroskopu TIRF. Analiza tych pomiarów krok po kroku za pomocą oprogramowania do wnioskowania bayesowskiego Fast-NPS pozwala uzyskać informacje strukturalne o wysokiej rozdzielczości dzięki zastosowaniu dostosowanych modeli barwników.

Informacje strukturalne z eksperymentów z pojedynczymi cząsteczkami FRET przy użyciu systemu szybkiego nanopozycjonowania

Opisujemy szczegółowe procedury i strategie pomiaru właściwości mechanicznych i szlaków mechanicznego rozwijania pojedynczych cząsteczek białka za pomocą mikroskopu sił atomowych. Pokazujemy również reprezentatywne wyniki jako odniesienie do selekcji i uzasadnienia dobrych zapisów pojedynczych cząsteczek białka.

Spektroskopia sił pojedynczych cząsteczek białka przy użyciu mikroskopu sił atomowych

Ta praca przedstawia przebieg pracy dla śledzenia pozycji atomowej w obrazowaniu transmisyjnej mikroskopii elektronowej o rozdzielczości atomowej. Ten przepływ pracy jest wykonywany za pomocą aplikacji Matlab typu open source (EASY-STEM).

Pikometr-Precyzyjne śledzenie pozycji atomowej za pomocą mikroskopii elektronowej

Ten artykuł zawiera instrukcje krok po kroku, jak wykonać w pełni poprawione, dokładne pomiary FRET na indywidualnych, swobodnie dyfuzujących biomolekułach za pomocą niedrogiego smfBoxa o otwartym kodzie źródłowym, od włączenia, przez wyrównanie i skupienie, aż po zbieranie i analizę danych.

Wykonywanie precyzyjnych i dokładnych pomiarów fret pojedynczych cząsteczek za pomocą smfBox typu Open-Source

Czasowo-rozdzielcze wzmocnienie fluorescencji pojedynczej cząsteczki jest użytecznym czujnikiem zbliżeniowym spektroskopowym fluorescencji, wrażliwym na lokalne zmiany strukturalne w białkach. Tutaj pokazujemy, że można go użyć do odkrycia stabilnych lokalnych konformacji w α-synukleinie, która jest inaczej znana jako kulisto nieustrukturyzowana i niestabilna, gdy jest mierzona za pomocą linijki FRET o większym zasięgu.

Wykorzystanie czasowo rozdzielczego wzmocnienia fluorescencji indukowanego białkiem w celu identyfikacji stabilnych lokalnych konformacji po jednym monomerze α-synukleiny na raz

Ten artykuł przedstawia metodę analizy czasoprzestrzennej mobilnych, jednocząsteczkowych sond opartych na transferze energii rezonansu Förstera (smFRET) przy użyciu szerokokątnej mikroskopii fluorescencyjnej. Nowo opracowany zestaw narzędzi programowych umożliwia wyznaczanie śladów czasowych smFRET poruszających się sond, w tym prawidłowej wydajności FRET i pozycji molekularnych, jako funkcji czasu.

Zautomatyzowana dwuwymiarowa analiza czasoprzestrzenna mobilnych jednocząsteczkowych sond FRET

Badanie szczegółowo opisuje metodologię mapowania FRET, w tym wybór miejsc etykietowania, wybór barwników, akwizycję i analizę danych. Metodologia ta jest skuteczna w określaniu miejsc wiązania, zmian konformacyjnych i ruchów dynamicznych w układach białkowych i jest najbardziej użyteczna, jeśli jest wykonywana w połączeniu z istniejącymi informacjami strukturalnymi 3D.

Mapowanie transferu energii rezonansu Förster: nowa metodologia wyjaśniająca globalne cechy strukturalne

Tutaj prezentujemy protokół do badania lokalnej elastyczności i dynamiki biomolekuł za pomocą czasowo-rozdzielczej anizotropii fluorescencji na poziomie pojedynczej cząsteczki w trybie mikroskopii konfokalnej.

Anizotropia fluorescencji rozdzielczo-rozdzielczej z pojedynczych cząsteczek do charakteryzowania lokalnej elastyczności w biomolekułach

Poznaj metodę wysokiej precyzji FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do identyfikacji stanów konformacyjnych domeny wiążącej ligand receptora NMDA. Technika ta umożliwia dokładne modelowanie strukturalne.

Wysoka precyzja FRET na poziomie pojedynczej cząsteczki do określania struktury biomolekuły

Przeglądaj więcej filmów