Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych

Ogólnym celem tej procedury jest wykrycie przypuszczalnych populacji nowotworowych komórek macierzystych w próbkach biologicznych w oparciu o zdolność komórek populacji bocznej do ekstruzji barwnika. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytanie w badaniach nad nowotworowymi komórkami macierzystymi, dotyczące wiarygodnych metod wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona funkcjonalne markery, a tym samym zapewnia lepszą rozdzielczość.

Ponadto ekspresja tych transporterów leków ABC jest wysoce konserwatywna wśród nowotworowych komórek macierzystych i dlatego możemy zastosować tę technikę dla wielu różnych jednostek nowotworowych. Implikacje tej techniki rozciągają się w kierunku odkrycia terapii przeciwnowotworowych komórek macierzystych, ponieważ ułatwia ona dalsze analizy, takie jak profilowanie ekspresji genów i walidacja celu w wysoce oczyszczonych komórkach nowotworowych. Tak więc ta metoda może zapewnić wgląd w charakterystykę nowotworowych komórek macierzystych.

Możemy również użyć tej metody do scharakteryzowania jako układu zawierającego transporter leków ABC wyrażający populacje, takie jak szpik kostny. Procedurę zademonstruje Elisabeth Hoflehner, technik z mojego laboratorium. Na początek hoduj pożądaną ludzką linię komórkową raka w temperaturze 37 stopni Celsjusza w 10 do 30 mililitrach pożywki RPMI 1640 uzupełnionej 10% FBS, dwoma milimetrami L-glutaminy i antybiotykami.

Gdy komórki osiągną około 70 do 90% konfluencji, usuń pożywkę i dodaj dwa mililitry 0,05% trypsyny-EDTA, aby oderwać komórki od powierzchni naczynia hodowlanego. Następnie umyj komórki 10 mililitrami pożywki hodowlanej, przenieś zawiesinę do czystej 15-mililitrowej probówki i wiruj ją z prędkością 250 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po granulowaniu komórek wyrzuć suprenatent i ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pożywki hodowlanej.

Zmieszać małą porcję zawiesiny komórek z roztworem błękitu trypanowego i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. Aby przygotować próbki do badań, zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej, aby uzyskać zawiesinę komórek jeden raz dziesięć do sześciu komórek na mililitr. Po dostosowaniu gęstości komórek przenieś trzy mililitry próbki do 15-mililitrowej rurki z okrągłym dnem oznaczonej jako test.

Następnie dodać 10 mikromoli fioletowego barwnika do próbki i delikatnie zwirować zawiesinę. Następnie przygotuj kontrole hamowania, przenosząc 500 mikrolitrów barwnika zawierającego zawiesinę komórkową do dwóch probówek cytometrii przepływowej oznaczonych jako kontrola. Dodaj 50 mikromolów Werapamilu do pierwszego.

I 20 mikromolowców Fumitremorginy C do drugiej probówki. I wymieszać roztwory, delikatnie pipetując. Przykryj wszystkie probówki nakrętkami i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza w ciemności przez 90 minut.

Próbki należy delikatnie mieszać co 15 minut. Po zakończeniu barwienia umyj kontrole inhibicji w trzech do czterech mililitrach lodowatego PBS. I przygotować podwielokrotności próbki testowej do późniejszego współbarwienia przeciwciałami.

Umyj również te podwielokrotności i przefiltruj wszystkie próbki przez sitka o średnicy 70 mikronów, aby usunąć potencjalne agregaty komórek. A następnie odwirować zawiesiny w temperaturze 250 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Po ponownym zawieszeniu powstałego osadu w 100 mikrolitrach PBS, utrzymuj komórki na lodzie chronionym przed światłem.

Następnie dodaj odpowiedni panel przeciwciał sprzężonych z flurochromem do komórek wstępnie wybarwionych fioletowym barwnikiem. Zmieszaj zawiesiny i inkubuj je w temperaturze czterech stopni Celsjusza w ciemności przez 20 do 30 minut. Po inkubacji umyj komórki w trzech do czterech mililitrach lodowatego PBS, w razie potrzeby przefiltruj próbkę.

A następnie odwirować w temperaturze 250 razy G w czterech stopniach Celsjusza przez pięć minut. Odrzucić supernatent i ponownie zawiesić granulowane komórki w 100 mikrolitrach PBS. Na koniec dodaj 7-AAD do komórek wstępnie wybarwionych fioletowym barwnikiem.

I inkubować próbki przez pięć do 10 minut w ciemności. Aby przeanalizować komórki za pomocą cytometru przepływowego, należy przebramować odpowiednią populację komórek na wykresie punktowym FSC SSC. Następnie, korzystając z różnych sygnałów FSC, należy wykluczyć z wybranej populacji wszystkie agregaty komórek.

Wyklucz komórki wykazujące dodatnie barwienie 7-AAD, aby uzyskać populację żywotnych komórek. Aby utworzyć wykres punktowy dla emisji niebieskiego i czerwonego barwnika, wyświetl niebieski kanał fluorescencyjny na osi y i czerwony kanał fluorescencyjny na osi x. Przełącz oba kanały w tryb liniowy i odpowiednio dostosuj napięcie detektora tak, aby populacja boczna znajdowała się w lewej dolnej części wykresu.

Następnie brama populacji bocznej. I zatrzymaj przejęcie. Następnie załaduj kontrolki hamowania i uzyskaj dane.

Na koniec utwórz wykres punktowy przedstawiający czerwony kwiatostan fioletowego barwnika na osi x i odpowiedni kanał kwiatowy na osi y wykreślony w trybie logarytmicznym. Załaduj próbkę, a następnie odpowiednio dostosuj napięcia detektora i zidentyfikuj frakcję komórek populacji bocznej, które wyrażają badaną powierzchnię. Następnie zapisz dane.

Przedstawiono reprezentatywne wyniki analizy populacji pobocznej przeprowadzonej w komórkach ludzkiego raka jajnika. Populacja boczna wyróżniona analizą emisji niebieskiej i czerwono-fioletowej została zidentyfikowana w lewym dolnym kwadrancie wykresu punktowego i stanowiła 0,70% całej analizowanej populacji. Późniejsze zastosowanie inhibitorów wypływu spowodowało zanik sygnału fluorescencji obserwowany dla wcześniej zidentyfikowanych komórek, potwierdzając ich fenotyp populacji bocznej.

Wreszcie, ludzkie komórki jajnika zostały również scharakteryzowane pod kątem ekspresji ABCG2. Barwienie ABCG2 dodatnie zaobserwowano w 0,67% komórek odpowiadających zidentyfikowanej populacji bocznej. Po opanowaniu tej procedury można wykonać w ciągu około dwóch do trzech godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Podejmując się tej procedury, należy pamiętać, że fenotyp populacji bocznej ściśle zależy od optymalnego stosunku stężenia barwnika do gęstości komórek. Dlatego przed eksperymentem zdecydowanie zaleca się nawodnienie obu zmiennych. Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak profilowanie ekspresji genów, w celu dokładniejszego scharakteryzowania komórek populacji bocznej, a tym samym zidentyfikowania nowych celów specyficznych dla nowotworowych komórek macierzystych dla przyszłego rozwoju leków.

Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórek macierzystych do zbadania cech tkankowych komórek macierzystych i nowotworowych komórek macierzystych, zarówno u myszy, jak i u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać populację boczną wyzwalaną fioletowym barwnikiem SA i jak wykryć domniemane rakowe komórki macierzyste w próbkach biologicznych we własnym laboratorium. Nie zapominaj, że praca z próbkami biologicznymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas pracy z tą procedurą należy podjąć środki ostrożności, takie jak stosowanie środków ochrony osobistej i szaf bezpieczeństwa biologicznego.