Name: Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Poznaj metodę identyfikacji komórek macierzystych nowotworowych za pomocą barwnika fioletowego i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia wykrywanie populacji SP w próbkach biologicznych poprzez pomiar aktywności transporterów ABC.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Maximilian Boesch jest wspierany przez Erwin Schrödinger Fellowship Austriackiego Funduszu Naukowego FWF (numer grantu J-3807).

Ten protokół jest w pełni zgodny ze standardowymi wytycznymi Instytucjonalnej Komisji ds. Oceny Etycznej. Jeśli tkanka ludzka lub zwierzęca jest badana przy użyciu przedstawionego tutaj protokołu, badacze są zobowiązani do uzyskania zgody odpowiedniej komisji rewizyjnej swojej instytucji lub kraju.
Uwaga: Standardowe środki ostrożności dotyczące bezpiecznego obchodzenia się z próbkami biologicznymi mają zastosowanie do tego protokołu. Obejmuje to noszenie rękawiczek i fartucha laboratoryjnego oraz wykonywanie pracy pod szafką bezpieczeństwa biologicznego, gdy tylko jest to możliwe.
1. Przygotowanie komórek
<ol>
	<li>Linie komórek nowotworowych
	<ol>
		<li>Hoduj odpowiednią ludzką lub mysią linię komórkową raka w temperaturze 37 °C w 10-30 ml odpowiedniej pożywki (np. RPMI 1640 uzupełniony 10% (v/v) FBS, 2 mM L-glutaminy i 1x penicylina/streptomycyna) i zbierz komórki w momencie konfluencji (tj. 70-90%) za pomocą trawienia 0,05% trypsyny-EDTA lub innej procedury odłączania. Określ liczbę komórek i sprawdź żywotność za pomocą komory zliczającej i barwienia błękitem trypanowym. Frakcja żywotnych komórek powinna przekraczać 85%. 
		UWAGA: Przykłady ludzkich linii komórkowych raka zawierających przedziały SP obejmują MCF7 / HTB-22 i SKBR3 / HTB-30 (rak piersi), A2780 i SKOV-3 / HTB-77 (rak jajnika) i A549 (rak płuc) 26.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Tkanka nowotworowa ex vivo
	<ol>
		<li>Weź świeżą próbkę guza chirurgicznego lub alternatywnie, zbierz tkankę nowotworową z nadającego się do przeszczepu lub genetycznie zmodyfikowanego modelu guza myszy. Weź 200-1000 mg tkanki i wygeneruj zawiesinę pojedynczej komórki poprzez mechaniczną dezagregację (np. za pomocą nożyczek lub skalpela) i trawienie enzymatyczne (np. przy użyciu koktajlu kolagenazy/dyspazy/DNazy).</li>
		<li>Przefiltrować próbkę przez sitko odcinające o średnicy 70 μm. Określ liczbę komórek i sprawdź żywotność za pomocą komory zliczającej i barwienia na niebiesko metodą trypan. 
		UWAGA: Koktajle trawienne często zawierają 200 μg/ml kolagenazy P, 0,8 U/ml dypazy i 25 μg/ml DNazy I, a czas inkubacji zwykle wynosi od 20 do 50 minut. Idealnie byłoby, gdyby dezagregacja tkanek była przeprowadzana zgodnie z protokołem zoptymalizowanym dla badanej tkanki 27,28,29.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Próbki testowe
<ol>
	<li>Dostosuj stężenie komórek do 1 x 106 komórek/ml w świeżej pożywce hodowlanej (nośnik zawierający składniki odżywcze jest ważny, ponieważ ekstruzja barwnika jest aktywnym procesem energochłonnym). Na koniec przenieś 1 ml próbki do zwykłej cytometrii przepływowej/probówki okrągłodennej FACS (oznaczonej jako "test"). 
	UWAGA: Aby uzyskać optymalne wyniki, może być konieczne miareczkowanie stężenia komórek (na przykład 5 x 105-1 x 10 6-2,5 x 106 komórek/ml), ale niższe stężenie komórek zazwyczaj daje wyższą rozdzielczość19. Tylko w przypadku sortowania, w których należy odzyskać maksymalną liczbę komórek SP, zaleca się zwiększenie stężenia komórek do maksymalnie 1 x 107 komórek/ml.</li>
	<li>Dodać 10 μM DCV do próbki i dobrze wymieszać, delikatnie wirując lub ponownie zawieszając przez 3-5 razy. Przejdź do kontroli hamowania. 
	UWAGA: Optymalne wyniki mogą zależeć od miareczkowania barwnika wyzwalającego (na przykład 2,5; 5; 10; 20 μM), ale wyższe stężenie barwnika zazwyczaj daje wyższą rozdzielczość19.</li>
</ol>
3. Kontrola hamowania
<ol>
	<li>Przenieść 250 μl zawiesiny komórek zawierających barwnik do nowej probówki okrągłodennej do cytometrii przepływowej/FACS (oznaczonej jako "kontrolna"). Dodać 50 μM werapamilu lub 20 μM FTC i dobrze wymieszać pipetując. 
	UWAGA: Werapamil i FTC są najbardziej znanymi inhibitorami do analizy SP, ale mają różną specyficzność pompy wypływowej: Werapamil hamuje kilka transporterów leków ABC, w tym ABCB1 i ABCB5, podczas gdy FTC jest specyficzny dla ABCG26,19. Jeśli status SP pojedynczej próbki jest nieznany, zaleca się stosowanie zarówno werapamilu, jak i FTC w oddzielnych probówkach.</li>
</ol>
4. Barwienie
<ol>
	<li>Zakryć probówkę "testową" i "kontrolną" i inkubować je w temperaturze 37 °C w ciemności przez 90 minut, delikatnie mieszając co 15 minut. Większość ekstruzji barwnika w komórkach SP nastąpi w ciągu pierwszych 45 minut, ale akumulacja barwnika w komórkach innych niż SP (przyczyniająca się do rozdzielczości) jest maksymalna dopiero po 75-90 min19.</li>
	<li>Po zakończeniu barwienia umyj komórki w 3-4 ml lodowatego PBS i ponownie zawieś granulkę w objętości 100 μl (również PBS). Trzymaj komórki w ciemności i schłodzone na lodzie i przystąp do barwienia dodatkowych markerów. Alternatywnie można bezpośrednio przeprowadzić analizę cytometryczną przepływową.</li>
</ol>
5. Barwienie dla innych markerów
<ol>
	<li>Dodać żądany panel przeciwciał sprzężonych z fluorochromem do komórek barwionych DCV, dobrze wymieszać i inkubować komórki w temperaturze 4 °C w ciemności przez 20-30 minut. Umyj komórki w 3 - 4 ml lodowatego PBS i przystąp do dyskryminacji martwych komórek. 
	UWAGA: Formaty przeciwciał, które są łatwo kompatybilne z DCV i praktycznie nie wymagają kompensacji, obejmują PerCP lub PerCP-Cy5.5, PE-Cy7, APC, Alexa Fluor 647, APC-Cy7, APC-H7, BV711, Alexa Fluor 750 i BV786. Formaty, które są kompatybilne z DCV, ale mogą wymagać kompensacji, to FITC, Alexa Fluor 488, PE i BV650. Formaty, które praktycznie nie są kompatybilne z DCV, to BV421, V450 i V500.</li>
	<li>Dodać 7-AAD (lub PI) do komórek wybarwionych DCV w stężeniu zalecanym przez danego producenta i inkubować próbki przez 5 - 10 minut w ciemności. Przefiltrować próbki przez sitka odcinające o średnicy 70 μm i przystąpić do analizy metodą cytometrii przepływowej.</li>
</ol>
6. Analiza cytometryczna przepływowa
UWAGA: Zaleca się włączenie odpowiedniego instrumentu cytometrycznego przepływowego już podczas procesu barwienia, aby wszystko było ustawione, gdy tylko próbki będą gotowe. Obejmuje to również standardowe procedury konserwacyjne, takie jak śledzenie wydajności systemu i napełnianie zbiorników.
<ol>
	<li>Pobrać komórki na cytometrze przepływowym i zabramkować je na dwuwymiarowym wykresie punktowym FSC/SSC (ryc. 1B). Wyklucz dublety i agregaty, porównując różne sygnały FSC (tj. wysokość, szerokość, powierzchnia) (rysunek 1C).
	<ol>
		<li>Jeśli uwzględniono marker martwej komórki, należy zaszczepić frakcję komórek żywotnych (np. 7-AAD-ujemną) (Figura 1D). Wizualizuj żywotne komórki singletowe na dwuwymiarowym wykresie kropkowym dla "niebieskiej" i "czerwonej" emisji DCV. W tym celu należy wyświetlić "niebieski" kanał fluorescencji na osi y (np. 450/50) i "czerwony" kanał fluorescencji na osi x (np. 525/50).</li>
		<li>Przełącz oba kanały w tryb liniowy i odpowiednio dostosuj napięcia detektora tak, aby SP znajdował się z boku wykresu w lewym dolnym kwadrancie. I odwrotnie, non-SP znajduje się w prawym górnym kwadrancie wykresu, odzwierciedlając rozkład cyklu komórkowego (G1 i G2). Bramka SP i zatrzymanie akwizycji (Rysunek 1E). 
		UWAGA: Komórki SP zdefiniowane przez DCV można wykryć za pomocą przyrządów do cytometrii przepływowej wyposażonych w źródło wzbudzenia laserem fioletowym (tj. linię laserową o długości fali 405 nm). Jedną ze cech charakterystycznych analizy SP jest to, że emitowana fluorescencja jest mierzona w trybie liniowym i w dwóch oddzielnych kanałach wyświetlanych na dwuwymiarowym wykresie punktowym. "Niebieska" emisja DCV jest mierzona przy około 450 nm (np. przy standardowym filtrze 450/40), a "czerwona" emisja DCV jest mierzona przy około 510 - 585 nm (np. przy filtrze 510/50, 525/50 lub 585/15)19. Ze względu na szczególny skład chemiczny testu, separacja między komórkami SP i innymi niż SP jest na ogół wyższa w "czerwonym" kanale fluorescencji19.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Załaduj kontrolę (kontrole) hamowania i uzyskaj dane. Komórki SP zniknęły lub są znacznie zmniejszone (ryc. 1F). W razie potrzeby doprecyzuj bramkę SP na podstawie tych danych.</li>
	<li>Aby zbadać ekspresję markera powierzchniowego przez komórki SP, pozostaw "czerwoną" fluorescencję DCV na osi x i wyświetl odpowiedni kanał fluorescencji na osi y w trybie logarytmicznym (np. APC). Dostosuj odpowiednio napięcia detektora i zabramuj frakcję komórek SP barwiących się dodatnio dla badanego markera (markerów) (Rysunek 1G). Koekspresja określonego markera przez komórki SP daje odpowiedni sygnał w lewym górnym kwadrancie wykresu30.</li>
	<li>Zapisz dane i/lub posortuj komórki SP.</li>
</ol>

<ol><li>Pattabiraman, D. R., Weinberg, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tackling+the+cancer+stem+cells+-+what+challenges+do+they+pose%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Tackling the cancer stem cells - what challenges do they pose?</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (7), 497-512 (2014).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+Cancer+Stem+Cells%3A+Rationale+for+Targeting+the+Stem+Cell+Niche%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of Cancer Stem Cells: Rationale for Targeting the Stem Cell Niche.</a> Biochim Biophys Acta. 1866 (2), 276-289 (2016).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+cancer+relapse+and+metastasis+by+inhibiting+cancer+stemness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of cancer relapse and metastasis by inhibiting cancer stemness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (6), 1839-1844 (2015).</li>
<li>Greve, B., Kelsch, R., Spaniol, K., Eich, H. T., Götte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+in+cancer+stem+cell+analysis+and+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry in cancer stem cell analysis and separation.</a> Cytometry A. 81 (4), 284-293 (2012).</li>
<li>Marcato, P., Dean, C. A., Giacomantonio, C. A., Lee, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aldehyde+dehydrogenase%3A+its+role+as+a+cancer+stem+cell+marker+comes+down+to+the+specific+isoform%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Aldehyde dehydrogenase: its role as a cancer stem cell marker comes down to the specific isoform.</a> Cell Cycle. 10 (9), 1378-1384 (2011).</li>
<li>Golebiewska, A., Brons, N. H., Bjerkvig, R., Niclou, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8 (2), 136-147 (2011).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%26%2334%3Bside+population%26%2334%3B+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A distinct &#34;side population&#34; of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Zhou, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ABC+transporter+Bcrp1%2FABCG2+is+expressed+in+a+wide+variety+of+stem+cells+and+is+a+molecular+determinant+of+the+side-population+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The ABC transporter Bcrp1/ABCG2 is expressed in a wide variety of stem cells and is a molecular determinant of the side-population phenotype.</a> Nat Med. 7 (9), 1028-1034 (2001).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+side+population+of+ovarian+cancer+cells+defines+a+heterogeneous+compartment+exhibiting+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">The side population of ovarian cancer cells defines a heterogeneous compartment exhibiting stem cell characteristics.</a> Oncotarget. 5 (16), 7027-7039 (2014).</li>
<li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (30), 11154-11159 (2006).</li>
<li>Brown, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+benign+and+malignant+prostate+epithelial+Hoechst+33342+side+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Prostate%22%5BJournal%5D)">Characterization of benign and malignant prostate epithelial Hoechst 33342 side populations.</a> Prostate. 67 (13), 1384-1396 (2007).</li>
<li>Mathew, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ABCG2-mediated+DyeCycle+Violet+efflux+defined+side+population+in+benign+and+malignant+prostate%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">ABCG2-mediated DyeCycle Violet efflux defined side population in benign and malignant prostate.</a> Cell Cycle. 8 (7), 1053-1061 (2009).</li>
<li>Engelmann, K., Shen, H., Finn, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MCF7+side+population+cells+with+characteristics+of+cancer+stem%2Fprogenitor+cells+express+the+tumor+antigen+MUC1%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">MCF7 side population cells with characteristics of cancer stem/progenitor cells express the tumor antigen MUC1.</a> Cancer Res. 68 (7), 2419-2426 (2008).</li>
<li>Ho, M. M., Ng, A. V., Lam, S., Hung, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+lung+cancer+cell+lines+and+tumors+is+enriched+with+stem-like+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population in human lung cancer cell lines and tumors is enriched with stem-like cancer cells.</a> Cancer Res. 67 (10), 4827-4833 (2007).</li>
<li>Kato, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endometrial+cancer+side-population+cells+show+prominent+migration+and+have+a+potential+to+differentiate+into+the+mesenchymal+cell+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Endometrial cancer side-population cells show prominent migration and have a potential to differentiate into the mesenchymal cell lineage.</a> Am J Pathol. 176 (1), 381-392 (2010).</li>
<li>Bleau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PTEN%2FPI3K%2FAkt+pathway+regulates+the+side+population+phenotype+and+ABCG2+activity+in+glioma+tumor+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">PTEN/PI3K/Akt pathway regulates the side population phenotype and ABCG2 activity in glioma tumor stem-like cells.</a> Cell Stem Cell. 4 (3), 226-235 (2009).</li>
<li>Harris, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+stem+cells+are+enriched+in+the+side+population+cells+in+a+mouse+model+of+glioma%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Cancer stem cells are enriched in the side population cells in a mouse model of glioma.</a> Cancer Res. 68 (24), 10051-10059 (2008).</li>
<li>Murase, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+cells+have+the+characteristics+of+cancer+stem-like+cells%2Fcancer-initiating+cells+in+bone+sarcomas%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Side population cells have the characteristics of cancer stem-like cells/cancer-initiating cells in bone sarcomas.</a> Br J Cancer. 101 (8), 1425-1432 (2009).</li>
<li>Boesch, M., Wolf, D., Sopper, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+Stem+Cell+Detection+Using+the+DyeCycle-Triggered+Side+Population+Phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Optimized Stem Cell Detection Using the DyeCycle-Triggered Side Population Phenotype.</a> Stem Cells Int. 2016, 1652389(2016).</li>
<li>Golebiewska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+in+human+glioblastoma+is+non-tumorigenic+and+characterizes+brain+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Side population in human glioblastoma is non-tumorigenic and characterizes brain endothelial cells.</a> Brain. 136 (PT 5), 1462-1475 (2013).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transporter-mediated+protection+of+cancer+stem+cells+from+ionophore+antibiotics%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Transl+Med%22%5BJournal%5D)">Drug transporter-mediated protection of cancer stem cells from ionophore antibiotics.</a> Stem Cells Transl Med. 4 (9), 1028-1032 (2015).</li>
<li>Fukunaga-Kalabis, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tenascin-C+promotes+melanoma+progression+by+maintaining+the+ABCB5-positive+side+population%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Tenascin-C promotes melanoma progression by maintaining the ABCB5-positive side population.</a> Oncogene. 29 (46), 6115-6124 (2010).</li>
<li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumour+stem+cells+and+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5 (4), 275-284 (2005).</li>
<li>Goodell, M. A., Brose, K., Paradis, G., Conner, A. S., Mulligan, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J Exp Med. 183 (4), 1797-1806 (1996).</li>
<li>Telford, W. G., Bradford, J., Godfrey, W., Robey, R. W., Bates, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+analysis+using+a+violet-excited+cell-permeable+DNA+binding+dye%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Side population analysis using a violet-excited cell-permeable DNA binding dye.</a> Stem Cells. 25 (4), 1029-1036 (2007).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+prevalence+of+side+population+in+human+cancer+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Oncoscience%22%5BJournal%5D)">High prevalence of side population in human cancer cell lines.</a> Oncoscience. 3 (3-4), 85-87 (2016).</li>
<li>Ali, M. Y., Anand, S. V., Tangella, K., Ramkumar, D., Saif, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+Primary+Human+Colon+Tumor+Cells+from+Surgical+Tissues+and+Culturing+Them+Directly+on+Soft+Elastic+Substrates+for+Traction+Cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of Primary Human Colon Tumor Cells from Surgical Tissues and Culturing Them Directly on Soft Elastic Substrates for Traction Cytometry.</a> J Vis Exp. (100), e52532(2015).</li>
<li>Azari, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+expansion+of+human+glioblastoma+multiforme+tumor+cells+using+the+neurosphere+assay%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and expansion of human glioblastoma multiforme tumor cells using the neurosphere assay.</a> J Vis Exp. (56), e3633(2011).</li>
<li>Hasselbach, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+high+grade+glioma+cell+culture+from+surgical+specimens+for+use+in+clinically+relevant+animal+models+and+3D+immunochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Optimization of high grade glioma cell culture from surgical specimens for use in clinically relevant animal models and 3D immunochemistry.</a> J Vis Exp. (83), e51088(2014).</li>
<li>Boesch, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DyeCycle+Violet+used+for+side+population+detection+is+a+substrate+of+P-glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry+A%22%5BJournal%5D)">DyeCycle Violet used for side population detection is a substrate of P-glycoprotein.</a> Cytometry A. 81 (6), 517-522 (2012).</li>
<li>Patrawala, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Side+population+is+enriched+in+tumorigenic%2C+stem-like+cancer+cells%2C+whereas+ABCG2%2B+and+ABCG2-+cancer+cells+are+similarly+tumorigenic%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Side population is enriched in tumorigenic, stem-like cancer cells, whereas ABCG2+ and ABCG2- cancer cells are similarly tumorigenic.</a> Cancer Res. 65 (14), 6207-6219 (2005).</li>
<li>Guha, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nicotine+promotes+apoptosis+resistance+of+breast+cancer+cells+and+enrichment+of+side+population+cells+with+cancer+stem+cell-like+properties+via+a+signaling+cascade+involving+galectin-3%2C+alpha9+nicotinic+acetylcholine+receptor+and+STAT3%5BTitle%5D)+AND+%22Breast+Cancer+Res+Treat%22%5BJournal%5D)">Nicotine promotes apoptosis resistance of breast cancer cells and enrichment of side population cells with cancer stem cell-like properties via a signaling cascade involving galectin-3, alpha9 nicotinic acetylcholine receptor and STAT3.</a> Breast Cancer Res Treat. 145 (1), 5-22 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają do zadeklarowania konfliktu interesów. W przygotowanie manuskryptu nie uczestniczy również osoba niebędąca autorem.

Postęp w klinicznym leczeniu nowotworów zależy również od opracowania metod leczenia ukierunkowanych na CSC. Metody pozwalające na wiarygodną izolację CSC od próbek biologicznych przyspieszą identyfikację odpowiednich celów i dlatego mają kluczowe znaczenie w tym przedsięwzięciu. Analiza SP jest uznaną i cenną techniką identyfikacji populacji CSC, w których dochodzi do ekspresji transporterów leków ABC, a wdrożenie DCV rozszerzyło jej zastosowanie na standardowe instrumenty cytometrii przepływowej. Mechanistycznie dyskry...

Skuteczność podstawowych terapii przeciwnowotworowych znacznie się poprawiła w ciągu ostatniej dekady dzięki znaczącym postępom w genetycznym i molekularnym zrozumieniu choroby oraz pojawieniu się leków celowanych, takich jak przeciwciała terapeutyczne i inhibitory małych cząsteczek. Natomiast choroba przerzutowa i nawrotowa jest nadal zazwyczaj nieuleczalna, a zachorowalność i śmiertelność pozostają wysokie w tych warunkach klinicznych. CSC reprezentują odrębną subpopulację w obrębie nowotworów i są obdarzone kanonicznymi właściwościami komórek macierzystych, takimi jak klonogenność/rakotwórczości, oporność wielolekowa i asymetryczny podział komórek1,2. W ten sposób CSC nie tylko napędzają progresję przerzutów i niejednorodność guza, ale także utrzymują się podczas leczenia, predysponując pacjenta do nawrotu. Terapeutyczna eliminacja CSC jest zatem ważną potrzebą medyczną, aby zapobiec nawrotom choroby i umożliwić długotrwałe wyleczenie raka3.
Identyfikacja podatności i wyjaśnienie strategii eliminacji CSC w dużym stopniu zależy od metod, które pozwalają na ich oczyszczanie z próbek biologicznych w celu późniejszego profilowania ekspresji i/lub badania funkcjonalnego. Z kolei takie metody opierają się na markerach powierzchniowych, wewnątrzkomórkowych lub funkcjonalnych, które są specyficzne dla tych komórek. Markery powierzchniowe specyficzne dla CSC obejmują między innymi CD44, CD133, CD24 i CD90 i były używane do identyfikacji populacji CSC w różnych jednostkach nowotworowych, w tym raku piersi i raku jelita grubego4. Inny marker, dehydrogenaza aldehydowa (ALDH), wykazuje lokalizację wewnątrzkomórkową i może być funkcjonalnie wykryty, dostarczając odpowiedni substrat, którego enzymatyczna konwersja wytwarza światło. Za pomocą tego testu zidentyfikowano również populacje CSC w różnych jednostkach nowotworowych5. Metoda uzupełniająca, powszechnie nazywana analizą SP i przedstawiona tutaj w szczegółach metodologicznych, wykorzystuje aktywny wypływ barwnika przez transportery leków ABC do identyfikacji małych populacji komórek macierzystych o dimencie fluorescencji6,7,8. Aby to osiągnąć, dana próbka jest inkubowana w obecności lipofilowego fluoroforu wiążącego DNA, który dostaje się do wszystkich komórek poprzez dyfuzję bierną i jest ukierunkowany na jądrowe i mitochondrialne DNA do wiązania. Nie-CSC pozbawione ekspresji transportera leków ABC akumulują barwnik, powodując jasną fluorescencję, podczas gdy CSC aktywnie wytłaczają barwnik, co zmniejsza fluorescencję. Farmakologiczne hamowanie aktywności transportera leków znosi i funkcjonalnie potwierdza fenotyp SP i powinno być stosowane w celach kontrolnych. Populacje CSC wykazujące cechy SP zostały ujawnione m.in. w raku jajnika9,10, rak prostaty11,12, rak piersi13, rak płuc14, rak endometrium15, glejak16,17 i mięsak kości18. Co ważne, test SP jest kompatybilny zarówno z liniami komórek rakowych, jak i pierwotną tkanką nowotworową, mimo że materiał pierwotny stwarza dodatkowe wyzwania, takie jak wymóg specyficznej strategii dyskryminacji komórek nowotworowych (niektóre populacje komórek gospodarza mogą również wykazywać cechy SP)19,20.
Dwa najbardziej znane transportery leków nadające SP to ABCB1/P-glikoproteina/MDR1/CD243 i ABCG2/Bcrp1/CD3388,9,21; jednak inne transportery leków mogą być również molekularnym wyznacznikiem fenotypu SP (np. ABCB5)22. ABCB1 może być skutecznie blokowany za pomocą werapamilu, podczas gdy aktywność ABCG2 może być specyficznie zniesiona za pomocą fumitremorginy C (FTC)6,19. Szczególną zaletą analizy SP jest to, że można ją łączyć z innymi barwieniami (np. markerami powierzchniowymi i ALDH) oraz że umożliwia regenerację żywych komórek, a tym samym jest kompatybilna z dalszymi badaniami funkcjonalnymi. Co więcej, wykrywanie SP ma szerokie zastosowanie ze względu na wysoką ochronę transporterów leków ABC w populacjach CSC9,23.
Pierwotnie, wykrywanie SP było wykonywane przy użyciu Hoechst 33342 jako wyzwalającego barwnika class<="xref">24. Barwnik ten osiąga doskonałą rozdzielczość, ale wymaga wzbudzenia laserem ultrafioletowym; stąd jego zastosowanie jest naturalnie ograniczone do wysokiej klasy przyrządów do cytometrii przepływowej. Pojawienie się DyeCycle Violet (DCV)25 otworzyło nowe możliwości analizy SP i rozszerzyło zastosowanie tej metody na standardowe instrumenty cytometryczne przepływowe, które nie mają źródła lasera ultrafioletowego (źródło lasera fioletowego wystarcza do rozdzielenia komórek DCV-SP). Co ważne, Hoechst 33342 i DCV mają wspólną specyfikę pompy, co wskazuje, że każdy barwnik powinien identyfikować te same populacje komórek.
Tutaj udostępniamy szczegółowy protokół eksperymentalny analizy SP opartej na DCV do szybkiej i łatwej reprodukcji w niezależnych laboratoriach. W związku z tym postrzegamy nasz artykuł jako źródło informacji dla badaczy CSC, które powinno przyczynić się do optymalizacji i standaryzacji tej użytecznej metody komórkowo-biologicznej.

<table><tbody><tr><td>Vybrant DyeCycle Violet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>V35003</td><td>Produkt gotowy</td></tr><tr><td>Chlorowodorek werapamilu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V4629</td><td>Rozpuścić w etanolu</td></tr><tr><td>Fumitremorgina C</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F9054</td><td>Rozpuścić w DMSO</td></tr><tr><td>7-AAD (lub jodku propidyny - PI)</td><td>BioLegend</td><td>420403</td><td>Produkt gotowy</td></tr><tr><td>Standardowe odczynniki do hodowli komórkowych (np. , pożywka, FBS, L-glutamina, antybiotyki, PBS, trypsyna-EDTA, etc.)</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Próbka/komórki będące przedmiotem zainteresowania (np. , ludzka lub mysia linia komórkowa raka, ludzka lub mysia tkanka nowotworowa)</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Przyrząd do cytometrii przepływowej (FACS; analizator lub sorter komórek)</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Wymagane źródło fioletowego</td></tr><tr><td>lasera Lampy FACS (okrągłe dno)</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Zalecane rurki z nasadką</td></tr><tr><td>70 i mikro; m Sitka odcinające</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Opcjonalne, ale zalecane</td></tr><tr><td>Mieszanka enzymów trawiennych (np. , kolagenaza/dypaza/Dnaza)</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Dotyczy tylko dysocjacji tkanek</td></tr><tr><td>Przeciwciała sprzężone z flurochromem przeciwko markerom powierzchniowym będącym przedmiotem zainteresowania</td><td>Różni dostawcy</td><td></td><td>Opcjonalny</td></tr><tr><td>zestaw ALDEFLUOR</td><td>Technologie STEMCELL</td><td>01700</td><td>Opcjonalnie</td></tr></tbody></table>

wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem dna do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych

Harnessing the DNA Dye-triggered Side Population Phenotype to Detect and Purify Cancer Stem Cells from Biological Samples

Rak jest chorobą wywoływaną przez komórki macierzyste, a wyeliminowanie tych komórek stało się głównym celem terapeutycznym. Rozszyfrowanie podatności nowotworowych komórek macierzystych (CSC) i identyfikacja odpowiednich celów molekularnych opiera się na metodach, które umożliwiają ich specyficzną dyskryminację w heterogenicznych próbkach, takich jak linie komórkowe i tkanki nowotworowe ex vivo. Cytometria przepływowa/FACS to potężna technologia do wieloparametrycznej analizy próbek biologicznych na poziomie pojedynczej komórki i jest jak dotąd metodą z wyboru do odzyskiwania żywych komórek do dalszych analiz. Markery powierzchniowe, takie jak CD44 i CD133, a także wykrywanie aktywności enzymatycznej dehydrogenazy aldehydowej były często wykorzystywane do definiowania i sortowania CSC z próbek guza za pomocą FACS. Podejście uzupełniające, przedstawione tutaj w szczegółach metodologicznych, wykorzystuje funkcjonalną ekstruzję barwnika przez transportery leków ABC, która identyfikuje odrębną populację komórek przyciemnionych fluorescencyjnie, powszechnie określaną jako populacja boczna (SP). Komórki nowotworowe SP wykazują kanoniczne cechy komórek macierzystych i mogą być zniesione i funkcjonalnie potwierdzone za pomocą środków hamujących transport leków wytłaczających barwnik (najczęściej ABCB1/P-glikoproteina/MDR1/CD243 i ABCG2/Bcrp1/CD338). Ponadto test SP jest zgodny z innymi ocenami cytometrii przepływowej, takimi jak barwienie antygenów powierzchniowych, wykrywanie dehydrogenazy aldehydowej i dyskryminacja martwych komórek (np. za pomocą 7-AAD lub jodku propidyny (PI)). W ten sposób opisujemy cenną i szeroko stosowaną metodę identyfikacji, izolacji i podcharakterystyki CSC w sposób mechaniczny oparty na parametrze funkcjonalnym, a nie fenotypowym. Chociaż pierwotnie wykonywany z Hoechst 33342 jako barwnikiem wyzwalającym, tutaj skupiamy się na nowszym fenotypie SP na bazie barwnika fioletowego, który można rozpoznać na dowolnym cytometrze przepływowym wyposażonym w źródło fioletowego lasera.

Przedstawiono reprezentatywną analizę SP komórek A2780, ludzkiej linii komórkowej raka jajnika, w której wcześniej wykazano obecność populacji SP stanowiącej mniej niż 1% komórek9. Komórki hodowano w temperaturze 37 °C w pożywce RPMI 1640 uzupełnionej o 10% (v/v) FBS, 2 mM L-glutaminy oraz 1x penicyliny/streptomycyny i zbierano przy 85% konfluencji, stosując 0,05% trypsyny-EDTA. Komórki przemyto w PBS i przefiltrowano przez sita o oczkach 70 µm. Liczbę kom...

Metody pozwalające na charakterystykę i izolację populacji komórek macierzystych z próbek biologicznych są kluczowe dla rozwoju terapii komórek macierzystych w leczeniu raka i nie tylko. W tym miejscu przedstawiamy szczegółowy protokół izolacji nowotworowych komórek macierzystych przy użyciu fenotypu populacji bocznej wywołanego barwnikiem.

Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych

Cancer is a stem cell-driven disease and eradication of these cells has become a major therapeutic goal. Deciphering vulnerabilities of Cancer Stem Cells ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykrycie domniemanych populacji komórek macierzystych nowotworu w próbkach biologicznych na podstawie zdolności komórek populacji bocznej (side population) do usuwania barwnika. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytanie w badaniach nad komórkami macierzystymi nowotworów dotyczące wiarygodnych sposobów detekcji i oczyszczania komórek macierzystych nowotworu z próbek biologicznych. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie markerów funkcjonalnych, co zapewnia lepszą rozdzielczość.Ponadto ekspresja tych transporterów leków ABC jest silnie zachowana w komórkach macierzystych nowotworów, dzięki czemu technikę tę można zastosować w wielu różnych jednostkach nowotworowych. Znaczenie tej metody rozciąga się na odkrywanie terapeutyków przeciwnowotworowych skierowanych przeciwko komórkom macierzystym, ponieważ ułatwia ona analizy następcze, takie jak profilowanie ekspresji genów i walidacja celów w wysoko oczyszczonych komórkach nowotworowych. Zatem metoda ta może dostarczyć wglądu w charakterystykę komórek macierzystych nowotworów.Metodę tę możemy również wykorzystać do charakteryzacji systemów obejmujących populacje wykazujące ekspresję transporterów leków ABC, takich jak szpik kostny. Procedurę zademonstruje Elisabeth Hoflehner, technik z mojego laboratorium. Aby rozpocząć, należy hodować wybraną ludzką linię komórek nowotworowych w temperaturze 37 °C w 10 do 30 ml pożywki RPMI 1640 uzupełnionej o 10% FBS, 2 mM L-glutaminy oraz antybiotyki.Gdy komórki osiągną około 70 do 90% konfluencji, należy usunąć medium i dodać dwa mililitry 0,05% trypsyny-EDTA, aby odkleić komórki od powierzchni naczynia hodowlanego. Następnie komórki należy przemyć 10 mililitrami medium hodowlanego, przenieść zawiesinę do czystej probówki o pojemności 15 mililitrów i wirować przy 250 ×g w temperaturze czterech stopni Celsjusza przez pięć minut. Po osadzeniu komórek należy odlać nadsącz i resuspendować osad w jednym mililitrze medium hodowlanego.Wymieszać niewielką alikwot zawiesiny komórek z roztworem błękitu trypanu i policzyć komórki za pomocą hemocytometru. W celu przygotowania próbek testowych, zawiesić komórki w świeżej pożywce hodowlanej, aby uzyskać zawiesinę o stężeniu 1×10⁶ komórek/ml. Po dostosowaniu gęstości komórek, przenieść 3 ml próbki do probówki z okrągłym dnem o pojemności 15 ml, oznaczonej jako test.Następnie do próbki należy dodać barwnik fioletowy w stężeniu 10 µM i delikatnie wymieszać zawiesinę na wirówce typu vortex. W kolejnym kroku należy przygotować kontrole inhibicji, przenosząc 500 µL zawiesiny komórkowej z barwnikiem do dwóch probówek do cytometrii przepływowej oznaczonych jako kontrola. Do pierwszej z nich należy dodać Verapamil w stężeniu 50 µM.Do drugiej probówki dodaj 20 µM Fumitremorginy C. Następnie wymieszaj roztwory, delikatnie pipetując. Zakryj wszystkie probówki zakrętkami i inkubuj je w temperaturze 37 °C w ciemności przez 90 minut.Delikatnie mieszaj próbki co 15 minut. Po zakończeniu barwienia przemyj kontrole inhibicji w trzech do czterech mililitrach lodowatego PBS. Następnie przygotuj alikwoty próbki testowej do późniejszego współbarwienia przeciwciałami.Należy również wyprać te alikwoty, a następnie przefiltrować wszystkie próbki przez sita o rozmiarze oczek 70 µm w celu usunięcia potencjalnych agregatów komórkowych. Następnie zawiesiny należy wirować z prędkością 250 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Po resuspensji otrzymanego osadu w 100 µL PBS komórki należy przechowywać w lodzie, chroniąc je przed światłem.Następnie do komórek uprzednio barwionych barwnikiem fioletowym należy dodać odpowiedni zestaw przeciwciał sprzężonych z fluorochromami. Zawiesiny należy wymieszać w wortexie i inkubować w temperaturze czterech stopni celsiusz w ciemności przez 20 do 30 minut. Po inkubacji komórki należy przemyć w trzech do czterech mililitrów lodowatego PBS, a w razie potrzeby przefiltrować próbkę.Następnie odwiruj próbkę z prędkością 250 ×g w temperaturze 4 °C przez 5 minut. Odlej nadosad i resuspenduj osad komórkowy w 100 µL PBS. Na koniec dodaj 7-AAD do komórek uprzednio barwionych barwnikiem fioletowym.Następnie inkubuj próbki od 5 do 10 minut w ciemności. Aby przeanalizować komórki za pomocą cytometru przepływowego, wyznacz bramkę dla odpowiedniej populacji komórek na wykresie kropkowym FSC SSC. Następnie, korzystając z różnych sygnałów FSC, wyklucz z wybranej populacji wszystkie agregaty komórkowe.Wyklucz komórki wykazujące pozytywne barwienie 7-AAD, aby uzyskać populację żywych komórek. W celu utworzenia wykresu kropkowego dla emisji barwnika niebieskiego i czerwonego, wyświetl kanał fluorescencji niebieskiej na osi y oraz kanał fluorescencji czerwonej na osi x. Przełącz oba kanały w tryb liniowy i odpowiednio dostosuj napięcie detektora, tak aby populacja boczna (side population) znajdowała się w lewej dolnej części wykresu.Następnie wyznaczyć bramkę dla populacji bocznej (side population). Po tym zatrzymać akwizycję. W kolejnym kroku załadować kontrole inhibicji i przeprowadzić akwizycję danych.Na koniec utwórz wykres kropkowy (dot plot) przedstawiający czerwoną fluorescencję barwnika fioletowego na osi x oraz odpowiedni kanał fluorescencji na osi y w skali logarytmicznej. Załaduj próbkę, a następnie odpowiednio dostosuj napięcia detektorów i zidentyfikuj frakcję komórek populacji bocznej (side population), które wykazują ekspresję badanego markera powierzchniowego. Następnie zarejestruj dane.Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki analizy populacji bocznej (side population) przeprowadzonej w ludzkich komórkach raka jajnika. Populacja boczna, wyróżniona poprzez analizę emisji niebieskiej i czerwono-fioletowej, została zidentyfikowana w lewym dolnym kwadrancie wykresu kropkowego i stanowiła 0,70% całej analizowanej populacji. Następcze zastosowanie inhibitorów effluksu spowodowało zanik sygnału fluorescencji obserwowanego w wcześniej zidentyfikowanych komórkach, co potwierdziło ich fenotyp populacji bocznej.Na koniec scharakteryzowano również ludzkie komórki jajnika pod kątem ekspresji ABCG2. Pozytywne barwienie na ABCG2 zaobserwowano w 0,67% komórek, co odpowiadało zidentyfikowanej populacji side population. Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w około dwie do trzech godzin, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo.Podczas przeprowadzania tej procedury należy pamiętać, że fenotyp populacji bocznej (side population) ściśle zależy od optymalnego stosunku stężenia barwnika do gęstości komórek. Dlatego przed rozpoczęciem eksperymentu wysoce zalecana jest optymalizacja obu tych zmiennych. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak profilowanie ekspresji genów, aby dokładniej scharakteryzować komórki populacji bocznej, a tym samym zidentyfikować nowe cele specyficzne dla nowotworowych komórek macierzystych do przyszłego opracowywania leków.Po opracowaniu technika ten utorował drogę badaczom w dziedzinie biologii komórek macierzystych do zgłębiania charakterystyki tkankowych komórek macierzystych oraz nowotworowych komórek macierzystych, zarówno u myszy, jak i u ludzi. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać solidną wiedzę na temat tego, jak przeprowadzić analizę populacji bocznej (SP) wyzwalaną barwnikiem fioletowym oraz jak wykrywać domniemane nowotworowe komórki macierzyste w próbkach biologicznych we własnym laboratorium. Należy pamiętać, że praca z próbkami biologicznymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności, takie jak stosowanie Środków Ochrony Indywidualnej (PPE) oraz szafek bezpieczeństwa biologicznego.

harnessing-dna-dye-triggered-side-population-phenotype-to-detect

Research

JoVE Journal

Cancer Research

Badania nad rakiem

Komórki macierzyste nowotworu (CSCs) zidentyfikowano w wielu typach zmian złośliwych. W niniejszym protokole opisujemy metodę cytometrii przepływowej wykorzystującą aktywność dehydrogenazy aldehydowej oraz ekspresję CD44 i CD24 do izolacji CSCs z ksenoprzeszczepów gruczolakoprzewodowego raka trzustki człowieka. Te żywe komórki mogą być następnie wykorzystane w badaniach funkcjonalnych i analitycznych.

Izolacja komórek macierzystych z ksenoprzeszczepów raka trzustki człowieka

W tym filmie opisujemy izolację subpopulacji komórek macierzystych nowotworowych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją lub FACS. Wyizolowaną populację boczną komórek można wykorzystać do dalszej analizy.

Test dyskryminacji populacji po stronie raka: metoda izolowania rakowych komórek macierzystych za pomocą testu wypływu barwnika Hoechsta

Ten artykuł opisuje przygotowanie świeżo uzyskanej tkanki czerniaka do pierwotnych hodowli komórkowych oraz sposób usuwania zanieczyszczeń erytrocytów i fibroblastów z komórek nowotworowych. Na koniec opisujemy, w jaki sposób domniemane komórki macierzyste czerniaka CD133 + są sortowane od masy CD133 za pomocą sortowania komórek aktywowanych magnetycznie (MACS).

Hodowla komórkowa pochodząca od pacjenta i izolacja domniemanych komórek macierzystych raka CD133+ z czerniaka

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych (CSC) bezpośrednio z tkanek ludzkich jest niezbędna do ich biologicznej charakterystyki. Niniejszy manuskrypt opisuje metodologię izolacji CSC prostaty od tkanek ludzkich, a także zawiera wskazówki dotyczące rozwiązywania trudnych etapów.

Izolacja nowotworowych komórek macierzystych z próbek ludzkiego raka prostaty

Komórki macierzyste raka trzustki (CSC) mogą być namnażane in vitro za pomocą techniki hodowli sferycznej niezależnej od zakotwiczenia, która stanowi potężne narzędzie do badania biologii CSC i może służyć jako pierwszy krok do opracowania nowych terapii ukierunkowanych na CSC. W tym miejscu przedstawiono metodologię rozszerzania, analizowania i celowania w CSC trzustki.

Badanie charakterystyki komórek macierzystych raka trzustki w celu opracowania nowych strategii leczenia

Zrozumienie roli nowotworowych komórek macierzystych w nawrotach nowotworów i oporności na terapie stało się tematem wielkiego zainteresowania w ostatniej dekadzie. W artykule opisano izolację i charakterystykę subpopulacji nowotworowych komórek macierzystych z linii komórkowych raka płaskonabłonkowego głowy i szyi (HNSCC).

Izolacja i charakterystyka subpopulacji raka płaskonabłonkowego głowy i szyi o charakterystyce komórek macierzystych

Celem tej metodologii jest identyfikacja komórek macierzystych raka (CSC) w liniach komórek rakowych i pierwotnych próbkach guzów ludzkich za pomocą protokołu formowania kuli, w solidny sposób, przy użyciu testów funkcjonalnych i charakterystyki fenotypowej za pomocą cytometrii przepływowej i Western blot.

Pozyskiwanie kulek komórek macierzystych raka z guzów ginekologicznych i raka piersi

Prezentowana jest wygodna, szybka i opłacalna metoda pomiaru proporcji komórek populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych.

Analiza populacji bocznej w liniach komórkowych guzów litych

Prezentowany tutaj jest protokół do odkrycia nadekspresji genów napędzających, które utrzymują ustalone rakopodobne komórki macierzyste pochodzące z komórek HT29 jelita grubego. Przeprowadzono sekwencję RNAseq z dostępnymi danymi bioinformatycznymi w celu zbadania i zbadania sieci ekspresji genów w celu wyjaśnienia potencjalnego mechanizmu związanego z przetrwaniem docelowych komórek nowotworowych.

Odkrycie genów sterujących w guzach przypominających łodygi raka jelita grubego pochodzących z HT29

Ten eksperymentalny protokół opisuje izolację BCSC z próbek komórek i tkanek raka piersi, a także testy in vitro i in vivo, które mogą być użyte do oceny fenotypu i funkcji BCSC.

Izolacja i ocena funkcjonalna komórek macierzystych ludzkiego raka piersi z próbek komórkowych i tkankowych

Tutaj pokazujemy, że lasery o dużej mocy 375 nm i 405 nm mogą skutecznie wzbudzić Hoechst 33342 i służyć jako realna alternatywa dla lasera 355 nm do wykrywania komórek populacji bocznej (SP), rozszerzając tym samym zakres dostępnych laserów w zastosowaniach cytometrii przepływowej.

Skuteczne wykrywanie komórek populacji bocznej Hoechsta za pomocą cytometrii przepływowej

Poznaj metodę identyfikacji komórek macierzystych nowotworowych za pomocą barwnika fioletowego i cytometrii przepływowej. Technika ta umożliwia wykrywanie populacji SP w próbkach biologicznych poprzez pomiar aktywności transporterów ABC.

Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych (Wideo) | JoVE Journal

Wykorzystanie fenotypu populacji bocznej wyzwalanego barwnikiem DNA do wykrywania i oczyszczania nowotworowych komórek macierzystych z próbek biologicznych

Przeglądaj więcej filmów