Testy opóźnienia w żelu agarozowym białko-tRNA do analizy funkcji TcdA N 6-treonylokarbamoiloloadenozyny

Ogólnym celem tej procedury jest zademonstrowanie testu opóźnienia żelu RNA przeznaczonego do odkrycia i scharakteryzowania białek wiążących RNA. Zastosowanie tego testu służy do badania interakcji między TcdA a transferowym RNA. Metoda opóźniania żelu agarozowego może dostarczyć odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii RNA.

Na przykład, czy dane białko oddziałuje z RNA, czy interakcja jest specyficzna dla sekwencji i jaka jest siła oddziaływania. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że wykorzystuje ona różne małe ilości próbek białek i RNA i dość szybko daje bardzo pouczające wyniki na temat interakcji białko-RNA. Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w kompleksy białko-tRNA, może być również stosowana do wielu innych systemów, takich jak rybosomalny RNA, informacyjny RNA i wszelkie inne rodzaje cząsteczek RNA.

Rano pobrać fiolkę z mrożoną E. coli BL21 DE3 przekształconą wektorem ekspresyjnym pET-23D EC triple-U. Zamieszaj bulion luria o niskiej zawartości soli lub płytkę LB uzupełnioną 100 mikrogramami na mililitr ampicyliny. Odwróć płytkę i umieść ją w inkubatorze o temperaturze 37 stopni Celsjusza, aż późnym popołudniem pojawią się kolonie.

Zaszczep jedną dobrze wyrośniętą pojedynczą kolonię w pięciu mililitrach LB plus 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i hoduj przez noc. Następnego ranka wypełzaj komórki. Po odwirowaniu zastąpić pożywkę pięcioma mililitrami świeżego LB plus 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny i ponownie zawiesić.

Użyj tej zawiesiny do zaszczepienia 200 mililitrów LB plus 100 mikrogramów na mililitr ampicyliny. Hoduj komórki przez pięć godzin w temperaturze 220 obr./min i 37 stopni Celsjusza. Gdy gęstość optyczna kultury przy 590 nanometrach osiągnie 0,6 do 0,8, atdd1 milimolowy IPTG do hodowli, aby wywołać ekspresję genu potrójnego U tRNA.

Po inkubacji komórek w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez trzy godziny, zbierz komórki, odwirowując kulturę w temperaturze 6500 razy g przez 10 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Aby przeprowadzić lizę, najpierw ponownie zawiesić osad komórkowy w pięciu mililitrach buforu do lizy. Dodać jedną objętość kwaśnego fenolu do ponownie zawieszonych osadów komórkowych w dygestorii i mieszać przez jedną minutę przez odwrócenie w celu lizy komórek.

Następnie odwirować z prędkością 10 tysięcy razy g przez 10 minut w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Zebrać górną fazę wodną zawierającą rozpuszczalny tRNA triple-U za pomocą pipety. Uważaj, aby nie zassać organicznej fazy dennej.

Wytrącić tRNA, dokładnie mieszając fazę rozpuszczalną z 2,5 objętości 100% objętości alkoholu etylowego przez inwersję przez jedną godzinę w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie odwirować w temperaturze 15 tysięcy razy g przez 30 minut w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Ostrożnie zdekantować supernatant, a następnie ponownie zawiesić osad bogaty w tRNA w czterech mililitrach żelowego buforu filtracyjnego.

Postępując zgodnie ze standardową praktyką chromatograficzną, ponownie zawieszony tRNA triple-U załadować do kolumny do filtracji żelu preparatywnego o wysokiej rozdzielczości, uprzednio zrównoważonego w żelowym buforze filtracyjnym. Ustaw natężenie przepływu na 1 mililitr na minutę, aby eluować próbki. Aby rozpocząć przygotowanie próbki, należy odpipetować odpowiednią ilość TcdA, jak wskazano w protokole tekstowym, do odpowiednio oznakowanych probówek wirówkowych o pojemności 1,5 mililitra.

Dodaj końcowe stężenie 1,6 milimolowego TCEP i delikatnie wymieszaj za pomocą pipety. Zamknij pokrywkę i inkubuj mieszaninę w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po inkubacji dodać trifosforan adenozyny i chlorek magnezu.

Wymieszać pipetą przed inkubacją mieszaniny przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Następnie dodać oczyszczone tRNA triple-U zgodnie z protokołem tekstowym i wymieszać próbkę za pomocą pipety. Po inkubacji próbki w temperaturze pokojowej przez pięć minut, dodać sól fizjologiczną buforowaną fosforanami do 100 mikrolitrów końcowej objętości.

Dokładnie wymieszaj i dodaj glicerol do końcowego stężenia 10%Odwiruj próbkę, a następnie na krótko odwiruj zawartość probówki. Przygotuj żel agarozowy zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Umieść urządzenie do elektroforezy na tacy wypełnionej kruszonym lodem, aby utrzymać komorę w temperaturze czterech stopni Celsjusza podczas przebiegu elektroforezy.

Ostrożnie odpipetować pięć mikrolitrów każdej próbki do odpowiedniego dołka. Dodaj również odpowiedni marker wielkości DNA. Następnie podłącz elektrody do odpowiednich gniazd zasilacza.

Po włączeniu zasilacza ustaw napięcie na 100 woltów i uruchom żel na 90 minut. Następnie przygotuj roztwór barwiący, mieszając 50 mililitrów KZM z 1X odpowiedniego barwnika DNA. Po 90 minutach elektroforezy ostrożnie wyjmij żel z tacki i umieść go w pojemniku z roztworem barwiącym.

Umieść pojemnik na bujaku przy niskiej prędkości kołysania i kołysz się w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Wyjmij żel agarozowy z pojemnika na plamy i ostrożnie postukaj nim w kawałek papieru celulozowego, aby usunąć nadmiar płynu. Następnie umieść żel bezpośrednio na transiluminatorze.

Włącz światło UV, aby uwidocznić prążki zawierające tRNA. Na koniec zrób zdjęcie żelu. Przedstawiono tutaj reprezentatywne wyniki oczyszczania tRNA do testów opóźniających działanie żelu.

Na chromatogramie rejestruje się absorbancję frakcji elucyjnych przy 254 nanometrach. Pula tRNA, wzbogacona w nadmierną ekspresję tRNA triple-U, eluuje w najwyższym szczycie. Jakość i ilość puli tRNA bada się za pomocą elektroforezy w żelu agarozowym.

Test opóźnienia żelu RNA ujawnia, że TcdA tworzy stabilny kompleks z potrójnym U tRNA w sposób zależny od stężenia tRNA, co skutkuje pasmem białko-tRNA, które migruje wolniej niż wolne tRNA z przodu żelu. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w mniej niż dwie godziny. Próbując tego protokołu, należy pamiętać o przestrzeganiu ścisłych technik laboratoryjnych, aby zapewnić stabilność chemiczną tRNA.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać testu opóźniającego działanie żelu agarozowego do zbadania interakcji wybranego białka z tRNA, jak w przypadku TcdA lub z dowolnym innym typem RNA.