In vitro Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy w symulowanej mikrograwitacji
17 grudnia 2017
Wysoce obiecującą techniką generowania konstruktów tkankowych bez użycia matrycy jest hodowla komórek w symulowanych warunkach mikrograwitacji. Korzystając z systemu hodowli rotacyjnej, zbadaliśmy wzrost pęcherzyków jajnikowych i dojrzewanie oocytów pod kątem przeżycia pęcherzyków, morfologii, wzrostu i funkcji oocytów w symulowanych warunkach mikrograwitacji.
Wzrost pęcherzyków przedantralnych myszy in vitro w warunkach symulowanej mikrograwitacji. Całą procedurę można podzielić na cztery etapy. W pierwszej części pęcherzyki są mechanicznie izolowane z jajników za pomocą igieł pod stereomikroskopem.
Część druga: enkapsulacja pojedynczego pęcherzyka poprzez pipetowanie go do wnętrza każdego kuleczki alginianowej. Część trzecia: przeniesienie kuleczek alginianowych zawierających pojedyncze pęcherzyki do kropli pożywki w rotacyjnym systemie hodowlanym, który generuje symulowaną mikrograwitację. Część czwarta: pobranie kuleczek alginianowych i dekapsulacja pęcherzyków poprzez inkubację w pożywce uzupełnionej o alginianiazę przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
Izolacja i enkapsulacja mieszków. Pobrać jajniki do medium transportowego, a następnie umieścić je w płytce z dołkami. Pod mikroskopem stereoskopowym odizolować mieszki z jajników za pomocą dwóch igieł.
Należy uważać, aby nie uszkodzić błony naczyniowej. Przygotować szalkę z kroplami pożywki i pokryć ją olejem. Przenieść pęcherzyki do przygotowanej szalki.
Przepłucz mieszyki w nowym medium, a następnie przenieś je do kropel medium. Jedna kropla medium zawiera pojedynczy mieszyk. Przygotuj scentrowaną szalkę hodowlaną i dodaj roztwór enkapsulujący do zewnętrznego okręgu.
Przygotuj fiolkę z 0,8% roztworem alginianu. Dodaj 0,5 µL roztworu alginianu do środka szalki. Dodaj krople roztworu alginianu do roztworu enkapsulującego w zewnętrznym kręgu szalki.
Przenieś pęcherzyk do roztworu alginianu w centrum naczynia. Przepłucz pęcherzyki roztworem alginianu. Przenieś pęcherzyki do środka każdej kulki alginianowej poprzez miękką powierzchnię roztworu.
Każda kuleczka alginianowa zawiera pojedynczy pęcherzyk. Przepłucz kuleczki alginianowe roztworem do enkapsulacji, aby je utwardzić. Przenieś kuleczki alginianowe do nowej płytki z podłożem manipulacyjnym.
Kultura in vitro enkapsulowanych pęcherzyków poddanych symulowanej mikrograwitacji. W przypadku grupy kontrolnej należy dodać 150 mililitrów pożywki hodowlanej do nowej szalki i przykryć ją olejem. Przenieść trzy kule alginianowe do kropli pożywki.
Inkubuj szalkę w inkubatorze z dwutlenkiem węgla w celu hodowli. Do zabiegu z symulowaną mikrograwitacją przygotuj szalkę z olejem, zdejmij nasadkę portu, a następnie wlej olej do naczynia przez otwarty port, aż naczynie będzie prawie pełne. Dodaj 50 ml pożywki hodowlanej do oleju.
Przenieś trzy kule alginianowe do kropli medium. Załóż z powrotem zatyczkę otworu. Należy usunąć pęcherzyki powietrza z naczynia.
Zdejmij nasadkę portu strzykawkowego. Umieść dwie strzykawki z olejem w porcie strzykawkowym. Usuń pęcherzyki powietrza znajdujące się pod portem strzykawkowym.
Wciągnij pęcherzyki powietrza do strzykawki i wypchnij taką samą objętość oleju za pomocą drugiej strzykawki. Upewnij się, że w naczyniu nie ma pęcherzyków powietrza. Zamknij zawory, wyjmij strzykawki i załóż zatyczkę portu strzykawkowego.
Przygotowaliśmy już cztery naczynia z kuleczkami alginianowymi. Teraz należy zamocować naczynia w podstawie rotacyjnej. Dostosuj prędkość obrotową, aż kropla medium osiągnie stan równowagi.
Przenieś oba naczynia oraz podstawę do inkubatora z dwutlenkiem węgla w celu hodowli. Wymiana pożywki hodowlanej. Zdejmij zatyczkę otwartego portu, a następnie zbierz kule alginianowe i olej do nowej szalki.
Znaleźć i przenieść kuleczki alginianowe do naczynia z medium manipulacyjnym. Ponownie ustanowić system hodowli pęcherzyków w naczyniu, analogicznie jak poprzednio. Odzyskanie pęcherzyków.
Zdejmij nasadkę otwartego portu, a kuleczki alginianowe wraz z olejem zbierz do nowejy naczynia. Oddziel kuleczki alginianowe i uwolnione z nich pęcherzyki poprzez inkubację w medium transportowym z dodatkiem alginianowej liazazy przez 30 minut w temperaturze 37 °C.Wyniki. Test żywotności komórek wykazał, że pojedyncze pęcherzyki hodowane w warunkach normalnej grawitacji zawierają więcej żywych i mniej martwych komórek niż pęcherzyki hodowane w warunkach symulowanej mikrograwitacji.
Wielkość pęcherzyka zwiększyła się znacząco w obu warunkach grawitacyjnych. Wniosek. Nasza metoda dostarcza modelu do badania mechanizmów zaangażowanych w procesy rozwojowe oocytów i komórek ziarnistych in vitro w warunkach symulowanej mikrograwitacji.
Przegląd
Niniejsze badanie opisuje protokół hodowli przedantralnych mieszków jajowych myszy w warunkach symulowanej mikrograwitacji przy użyciu rotacyjnego systemu hodowlanego. Podejście to obejmuje izolację i enkapsulację mieszków w kuleczkach alginianowych, ich hodowlę zarówno w normalnej, jak i symulowanej mikrograwitacji oraz ocenę przeżywalności mieszków, ich wzrostu i ultrastruktury oocytów. Wyniki podkreślają wpływ mikrograwitacji na żywotność mieszków i rozwój oocytów, stanowiąc model do dalszych badań nad folliculogenesis in vitro w warunkach zmiennej grawitacji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Biologia rozrodu
- Biologia rozwoju
- Inżynieria tkankowa
Wstęp
- Środowiska mikrograwitacyjne mogą wpływać na rozwój komórek i tkanek.
- Hodowla pęcherzyków in vitro jest cennym narzędziem do badania rozwoju oocytów i komórek ziarnistych.
- Systemy symulowanej mikrograwitacji umożliwiają badanie roli grawitacji w folliculogenezie.
- Enkapsulacja w alginian wspomaga trójwymiarową hodowlę pęcherzyków.
Cel badania
- Opracowanie protokołu hodowli przedantralnych pęcherzyków jajnikowych myszy w warunkach symulowanej mikrograwitacji.
- Porównanie przeżywalności i rozwoju pęcherzyków w warunkach normalnej grawitacji oraz symulowanej mikrograwitacji.
- Ocena wpływu mikrograwitacji na rozwój oocytów i komórek ziarnistych.
Zastosowane metody
- Mechaniczna izolacja pęcherzyków przedantralnych z jajników 14-dniowych myszy przy użyciu igieł pod stereomikroskopem.
- Enkapsulacja pojedynczych pęcherzyków w kuleczkach 0,8% alginianu.
- Kultywowanie enkapsulowanych pęcherzyków w systemie rotacyjnego naczynia w celu symulacji mikrograwitacji, z równoległymi kulturami kontrolnymi w normalnej grawitacji.
- Odzyskiwanie i dekapsulacja pęcherzyków przy użyciu liazy alginianowej.
- Ocena przeżywalności pęcherzyków, pomiar średnic pęcherzyków i oocytów oraz analiza ultrastrukturalna oocytów.
Główne wyniki
- Mieszki hodowane w warunkach normalnej grawitacji wykazały wyższą żywotność komórek w porównaniu do tych poddanych symulowanej mikrograwitacji.
- Rozmiar mieszków zwiększył się znacząco w obu warunkach grawitacyjnych.
- Symulowana mikrograwitacja doprowadziła do zmniejszenia przeżywalności mieszków oraz obniżenia ekspresji antygenu jądrowego proliferujących komórek (PCNA) i czynnika różnicowania wzrostu 9 (GDF9).
- Oocyty z grupy mikrograwitacyjnej wykazały nieprawidłowości ultrastrukturalne.
Wnioski
- Opisana metoda umożliwia badanie rozwoju pęcherzyków i oocytów in vitro w warunkach symulowanej mikrograwitacji.
- Symulowana mikrograwitacja negatywnie wpływa na przeżywalność pęcherzyków oraz jakość oocytów.
- Dalsza optymalizacja systemu hodowli jest niezbędna, aby lepiej modelować folikulogenezę in vitro w warunkach zmienionej grawitacji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Hodowla pęcherzyków przedantralnych myszy w warunkach symulowanej mikrograwitacji zapewnia kontrolowany system do badania mechanistycznego wpływu zmienionych sił fizycznych na wczesną folliculogenezę. Model ten umożliwia ilościową ocenę przeżywalności pęcherzyków, wzrostu oocytów oraz markerów molekularnych, co zwiększa wiarygodność prognostyczną w badaniach z zakresu biologii rozwoju. Podejście to dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji uwzględniających ryzyko w badaniach translacyjnych w ramach rozwoju medycyny reprodukcyjnej oraz inżynierii tkankowej.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad rozwojem mieszyków i oocytów w warunkach zmiennej grawitacji.
- Wspiera walidację funkcjonalną markerów molekularnych, takich jak PCNA i GDF9, w procesach dojrzewania komórek ziarnistych i oocytów.
- Zapewnia ilościową platformę do testowania hipotez w biologii rozrodu i inżynierii tkankowej.
Przesiewanie i opracowanie testu
- Ustanawia powtarzalny system hodowli 3D do oceny żywotności mieszków oraz parametrów wzrostu.
- Ułatwia standaryzację ilościowych odczytów, w tym średnic mieszków i oocytów.
- Umożliwia analizę porównawczą przeżywalności i ekspresji molekularnej w zmiennych warunkach fizycznych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Oferuje model do badania istotnych dla choroby mechanizmów wpływających na jakość oocytów i przeżywalność mieszków płodnościowych.
- Wspiera uzgadnianie wyników in vitro z rozwojem translacyjnych biomarkerów w obszarze zdrowia reprodukcyjnego.
- Dostarcza informacji dla strategii przedklinicznych w celu optymalizacji systemów hodowli tkankowych w warunkach niestandardowych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda ta wpisuje się w kontinuum od odkrycia do badań przedklinicznych, umożliwiając wczesne badania mechanistyczne oraz rozwój ilościowych analiz w biologii rozrodu i inżynierii tkankowej.
- Biologia odkrywcza: Wspiera badanie hipotez dotyczących wpływu grawitacji na folikulogenezę i dojrzewanie oocytów.
- Screening: Zapewnia zestandaryzowane, ilościowe wyniki dotyczące żywotności i wzrostu w kontrolowanych warunkach.
- Analityka: Dostarcza mierzalne punkty końcowe, takie jak wskaźniki przeżywalności, ekspresja markerów molekularnych oraz analiza ultrastrukturalna.
- Badania translacyjne: Łączy wyniki in vitro z modelami przedklinicznymi w medycynie reprodukcyjnej i regeneracyjnej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy platformę wielokrotnego użytku do badań mechanistycznych nad różnymi typami tkanek i komórek.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność predykcyjną w modelach biologii rozwoju i rozrodu.
- Wartość operacyjna: Sprzyja standaryzacji i powtarzalności w kulturach 3D oraz w procesach ilościowej oceny.
- Wartość strategiczna: Dostarcza informacji niezbędnych do podejmowania decyzji o kontynuacji lub przerwaniu programów inżynierii tkankowej i zdrowia reprodukcyjnego.
- Wpływ na portfolio: Wspiera priorytetyzację inicjatyw badawczych o charakterze mechanistycznym i translacyjnym z uwzględnieniem analizy ryzyka.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w izolacji mieszków, enkapsulacji i technikach hodowli 3D.
- Wymaga dostępu do specjalistycznych rotacyjnych systemów hodowlanych oraz infrastruktury analitycznej do oceny ilościowej.
- Konieczna jest standaryzacja testów żywotności i analizy markerów molekularnych pomiędzy zespołami.
- W zależności od celu badań może być wymagana adaptacja dla różnych typów tkanek lub gatunków.
- Optymalizacja parametrów symulacji mikrograwitacji jest kluczowa dla wiarygodności i powtarzalności modelu.
