Wypreparowanie trzustki myszy w celu analizy histologicznej i profilowania metabolicznego

Głównym celem niniejszego artykułu wideo jest przedstawienie szczegółowych instrukcji wizualnych dotyczących sekcji trzustki myszy. Instrukcje te powinny być pomocne dla badaczy pracujących z modelami mysimi ludzkich chorób trzustki, którzy muszą wypreparować trzustkę myszy w celu przeprowadzenia analizy histologicznej lub profilowania metabolicznego. Artykuł wideo zawiera również szczegółowe instrukcje wykonania terminalnego pobrania krwi metodą nakłucia serca.

Przedstawiony jest stół operacyjny z niezbędnymi materiałami. Obejmują one: jeden szklany słoik z pokrywką, jedną probówkę typu Falcon 15 mL, jedną parę nożyczek chirurgicznych, jedną butelkę z atomizerem zawierającą 70%ethanol, dwie płyty piankowe, dwie pęsety, dwie strzykawki 1 mL o rozmiarze 21 gauge, dwie probówki typu Falcon 50 mL, jedną probówkę do wirowania, jedną probówkę kriogeniczną, cztery gaziki chirurgiczne, dziesięć szpilek, dozownik chusteczek do sterylizacji oraz pojemnik na odpady ostre. Przedstawiony jest stół pooperacyjny z niezbędnymi materiałami.

Należą do nich jedna waga analityczna, jeden czterolitrowy naczyniowe Dewara z ciekłym azotem, płytkie naczynie Dewara z szeroką szyjką, pływający stojak na mikroprowetki, jedna para nożyczek chirurgicznych, dwie pęsety, pięć krio-probówek oraz dozownik sterylnych chusteczek. Aby przeprowadzić eutanazję, mysz umieszcza się najpierw w szklanym słoiku zawierającym gazik nasączony kilkoma kroplami izofluranu, a następnie przykrywa pokrywką, aż mysz straci przytomność, co zazwyczaj zajmuje około jednej minuty. Następnie mysz wyjmuje się ze szklanego słoika i wykonuje test uszczypnięcia za stopę, aby upewnić się, że zwierzę nie odczuwa dyskomfortu.

Jeśli test ucisku stopy nie powodzi się, mysz należy umieścić z powrotem w szklanym słoiku i zamknąć go pokrywką, aż do momentu, gdy test ucisku stopy zostanie przeprowadzony pomyślnie. Połóż mysz na grzbiecie, przymocuj kończyny do chirurgicznej płyty piankowej i zwilż stronę brzuszną myszy 70% ethanol. Chwyć sierść w pobliżu otworu cewki moczowej pęsetą i lekko pociągnij do góry.

Wykonaj nacięcie przez jamę brzuszną, zaczynając od otworu cewki moczowej, prowadząc je w górę wzdłuż linii środkowej aż do brody. W pobliżu miejsca rozpoczęcia pierwszego nacięcia chwyć futro po jednej stronie i wykonaj kolejne nacięcie w dół, po przekątnej w kierunku tylnej łapy. Powtórz tę czynność w ten sam sposób po przeciwnej stronie.

Zlokalizuj serce, aby wykonać terminalną punkcję serca. W tym celu chwyć mostek pęsetą i przetnij przeponę. Szybko przetnij klatkę piersiową w górę i usuń wyciętą część, aby odsłonić bijące serce.

Po zlokalizowaniu serca należy usunąć osierdzie i przeprowadzić terminalną punkcję serca za pomocą strzykawki. Aby uzyskać optymalną ilość krwi, należy używać tłoka igły do naśladowania akcji pompowania serca i unikać zbyt szybkiego zasysania. Krew należy przenieść do probówki do wirowania, a strzykawkę wyrzucić do pojemnika na odpady ostre.

Po wykonaniu nakłucia serca przeprowadza się eutanazję poprzez usunięcie struktur mocujących serce. Zlokalizuj żołądek po lewej stronie myszy. Trzustka ma postać rozproszonej tkanki o jaśniejszym kolorze, która jest przytwierdzona do żołądka i dwunastnicy, biegnie wzdłuż jelit cienkich i grubych oraz jest połączona ze śledzioną.

Delikatnie oddziel pęcherzyk trzustki od żołądka i dwunastnicy, używając pęsety. Kontynuuj oddzielanie trzustki od jelita cienkiego, przechodząc przez odcinki jelita czczego i krętego, aż do kątnicy i jelita grubego. W obrębie kątnicy zmień położenie pęsety i kontynuuj oddzielanie trzustki wzdłuż pozostałej części okrężnicy w kierunku odbytnicy.

W tym momencie wygodnie jest wyciąć i usunąć odcinek od żołądka do obszaru okrężnicy bezpośrednio poprzedzającego odbytnicę. Zlokalizuj trzustkę oraz przytwierdzoną do niej śledzionę. Przesuń trzustkę w prawą stronę myszy.

Przetnij pozostałe połączenia między trzustką a jamą klatki piersiowej, aby całkowicie oddzielić trzustkę i przyległą śledzionę. Usuń trzustkę i rozłóż ją w celu przeprowadzenia badania. W razie potrzeby w tym momencie można usunąć inne organy.

Po ekstrakcji próbki są przenoszone do obszaru pooperacyjnego. Każdy organ należy zważyć, a następnie umieścić w odpowiedniej probówce kriogenicznej. Należy odnotować wszelkie zaobserwowane nieprawidłowości.

Po umieszczeniu organów w probówkach kriogenicznych, należy włożyć je do pływającego statywu na mikroprobówki, a następnie do naczynia Dewar z ciekłym azotem. Po zamrożeniu szokowym organy powinny być przechowywane w temperaturze -80 °C w celu długoterminowego magazynowania. Wszystkie użyte narzędzia do sekcji należy zdezynfekować za pomocą chusteczek sterylizujących.

Probówkę typu falcon wyścieloną nasączonym izofluranem gazikiem chirurgicznym należy zakręcić. Gazik chirurgiczny na tablicy piankowej należy zastąpić nowym gazikiem. Części myszy, które nie zostały pobrane, należy zutylizować zgodnie z polityką placówki dotyczącą utylizacji zwierząt.

Poniższe elementy należy traktować w odpowiedni sposób. Po ich prawidłowym przechowywaniu można przeprowadzić szereg eksperymentów, w tym między innymi mikroskopię fluorescencyjną, histologię z barwieniem hematoksyliną i eozyną, immunohistochemię, spektrometrię mas oraz spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego. Ponieważ trzustka jest głównym organem odpowiedzialnym za aktywność metaboliczną i produkcję insuliny, niniejsza procedura pozwala na zachowanie jej cech fizjologicznych.

Dzięki wyizolowaniu trzustki możliwe jest przeprowadzenie przyszłych analiz na pobranej próbce. Procedura ta pozwala na porównanie i badanie interakcji z innymi tkankami w obrębie tego samego organizmu w tym samym przedziale czasowym.