Name: Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-10T10:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Poznaj metodę obrazowania żywych komórek do badania degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu. Technika fluorescencyjna umożliwia analizę funkcji płytek na poziomie subkomórkowym w czasie rzeczywistym.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

CM dziękuje za wsparcie finansowe od Międzynarodowej Organizacji Pacjentów z Niedoborami Inhibitora C1 (HAEi), Stichting Vrienden van Het UMC Utrecht oraz Fundacji Landsteinera na rzecz Badań nad Transfuzją Krwi (LSBR).

Lokalna Komisja Etyki Medycznej Uniwersyteckiego Centrum Medycznego w Utrechcie zatwierdziła pobieranie krwi do celów badawczych ex vivo, w tym do celów tego badania.
1. Przygotowanie roztworu
<ol>
	<li>Przygotować bufor Tyrode kwasu 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowego (HEPES), rozpuszczając 10 mM HEPES, 0,5 mM Na2HPO4, 145 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mMMgSO4 i 5,55 mM D-glukozy w wodzie destylowanej.
	<ol>
		<li>Wykonaj dwa warianty buforu: ustaw poziom pH odpowiednio na 6,5 i 7,4. Zrób nowy bufor na każdy dzień eksperymentów. Uzupełnij 10 ng/ml prostacykliny tam, gdzie jest to wskazane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotować sól fizjologiczną buforowaną TRIS (TBS), rozpuszczając 50 mM Tris i 150 mM NaCl w wodzie destylowanej i dostosować pH do 9,0.</li>
	<li>Przygotować kwaśną dekstrozę cytrynianu (ACD), rozpuszczając 85 mM cytrynianu trisodu, 71 mM kwasu cytrynowego i 111 mM D-glukozy w wodzie destylowanej.</li>
	<li>Przygotować roztwór utrwalający, dodając 2% (v/v) paraformaldehydu (PFA) do buforu HEPES Tyrode, pH 7,4. Podgrzać do rozpuszczenia (50 - 70 °C) i ustawić pH na 7,4. Podwielokrotność porcji i przechowywać w temperaturze -20 °C. Przed użyciem rozmrozić w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przygotować bufor blokujący, rozpuszczając 1% (m/v) albuminę surowicy ludzkiej (HSA) w buforze HEPES Tyrode, pH 7,4</li>
	<li>Przygotuj roztwór alkoholu poliwinylowego, dodając 4,8 g alkoholu poliwinylowego do 12 g glicerolu i dobrze wymieszaj. Dodaj 12 ml wody destylowanej i pozostaw na noc na rotatorze w temperaturze pokojowej.
	<ol>
		<li>Dodać 24 ml 0,2 M Tris-HCL o pH 8,5. Podgrzać do 50 °C, mieszając przez 30 min. Dodać 1,25 g 1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktanu (DABCO) i dobrze wymieszać. Wirować przy 1 500 x g przez 5 min. Porcję supernatantu należy podać na porcję (1 ml wystarcza na 15-20 szkiełek) i przechowywać w temperaturze -20 °C. Użyć podwielokrotności raz.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie szkła nakrywkowego
<ol>
	<li>Odtłuścić szkła nakrywkowe (25 x 50mm2) przez inkubację przez noc w nierozcieńczonym kwasie chromosiarkowym. Opłucz kieliszki nakrywkowe wodą destylowaną i wysusz je przez noc w temperaturze 60 °C w piekarniku.</li>
	<li>Przyklej pasek folii parafinowej (10 x 15 cm2) na stole laboratoryjnym z kroplą wody i usuń powietrze, wygładzając folię parafinową. Odpipetować 80 μl kropli 10 μg/ml VWF lub 100 μg/ml fibrynogenu na folię parafinową. Umieść okulary na kroplach; Roztwór białka rozprzestrzeni się między dwiema powierzchniami, pokrywając całą tylną stronę szkła. Inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze pokojowej (RT).</li>
	<li>Usunąć folię parafinową i zablokować okulary nakrywkowe, umieszczając je powlekaną stroną do góry na płytce 4-dołkowej z buforem blokującym. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C lub przez noc w temperaturze 4 °C. Jako kontrolę należy zablokować szkło nakrywkowe, które nie zostało pokryte VWF lub fibrynogenem.</li>
</ol>
3. Przygotowanie osocza bogatopłytkowego (PRP)
<ol>
	<li>Pobrać cytrynian krwi pełnej (końcowe stężenie: 0,32% cytrynian sodu (M/V)) przez nakłucie dożylne.</li>
	<li>Odwirowywać krew przez 15 minut przy 160 x g i RT bez hamulca. Zebrać supernatant (tj. PRP) za pomocą plastikowej pipety Pasteura. 
	UWAGA: Po odwirowaniu można zaobserwować trzy warstwy (od góry do dołu): PRP, białe krwinki i czerwone krwinki. Upewnij się, że nie uwzględniasz białych i czerwonych komórek. Zazwyczaj 3 ml PRP można zebrać po odwirowaniu 9 ml probówki z krwią.</li>
	<li>Przejdź do sekcji 4, jeśli doświadczenie będzie przeprowadzone z przemytymi płytkami krwi. Jeśli pożądane jest PRP, przejdź do następnego kroku.</li>
	<li>Po pobraniu PRP należy ponownie odwirować pozostałą część krwi (zawierającą osad z krwinek czerwonych) przez 10 minut przy 2 000 x g bez przerwy. Zebrać supernatant zawierający osocze ubogie w płytki krwi (PPP). 
	UWAGA: Zazwyczaj po tym drugim etapie wirowania można zebrać 2 ml.</li>
	<li>Policz liczbę płytek krwi w PRP na analizatorze komórkowym i rozcieńcz go za pomocą PPP (krok 3.4) do stężenia 150 000 płytek krwi/μL. 
	UWAGA: Całkowita objętość rozcieńczonego PRP zależy od liczby płytek krwi dawcy. Liczba płytek krwi różni się znacznie u różnych dawców, a rozcieńczenie PRP wymaga indywidualnej oceny. Liczba płytek krwi jest uważana za normalną, gdy mieści się w zakresie od 150 000 do 450 000 płytek krwi/μl.</li>
	<li>Przejdź do sekcji 5.</li>
</ol>
4. Przygotowanie umytych płytek krwi
<ol>
	<li>Określić średnią objętość płytek krwi (MPV) w PRP za pomocą analizatora komórek. 
	UWAGA: Jest to wskaźnik wstępnej aktywacji płytek krwi11. Normalny MPV dla spoczynkowych płytek krwi wynosi 7,5-11,5 fL11. MPV nie powinno wzrosnąć o więcej niż 1,5 fL podczas procedury płukania płytek krwi.</li>
	<li>Dodać 1/10 objętości ACD do PRP, aby zapobiec wstępnej aktywacji płytek krwi i wirować przez 15 minut przy 400 x g i RT bez hamulca. Usunąć supernatant i ostrożnie ponownie zawiesić osad w buforze HEPES Tyrode, pH 6,5, do pierwotnej objętości PRP.</li>
	<li>Rozmrozić porcję prostacykliny, dodając TBS do stężenia 10 μg/ml; przechowywać ją na lodzie.</li>
	<li>Aby zapobiec aktywacji płytek krwi, dodać prostacyklinę w końcowym stężeniu 10 ng/ml do ponownie zawieszonych płytek krwi i natychmiast odwirować przez 15 minut przy 400 x g i RT bez hamulca. Usunąć sklarowany osad i ostrożnie zawiesić osad w buforze HEPES Tyrode, pH 7,4.</li>
	<li>Policz liczbę płytek krwi (krok 3.5) i określ zmianę MPV (krok 4.1) (MPV nie powinno zmienić się o więcej niż 1,5 fL).</li>
	<li>Dostosuj liczbę płytek krwi za pomocą buforu HEPES Tyrode, pH 7,4, do stężenia 150 000 płytek krwi/μl. Pozostaw płytki krwi do regeneracji na 30 minut w temperaturze pokojowej przed eksperymentami. Umyte płytki krwi należy wykorzystać do eksperymentów w ciągu 4 godzin po izolacji.</li>
</ol>
5. Zespół komory przepływowej
UWAGA: Te eksperymenty wykorzystują opracowany przez nas komorę przepływową12. Można stosować różne komory przepływowe produkowane komercyjnie, o ile mogą one pomieścić szkło nakrywkowe, które preferencyjnie można zdjąć w celu dalszych analiz. Komora przepływowa używana do opisywanych eksperymentów jest wykonana z poli(metakrylanu metylu), aby precyzyjnie pasowała do stolika mikroskopowego. Zawiera wlot i wylot (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A-C; 1, 2), a także przyłącze próżniowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A i C; 3). Na górze umieszcza się niestandardowy arkusz silikonowy (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1A i D; 4). Dwa wycięcia tworzą kanały próżniowe (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A i D; 5) do szczelnego przymocowania szkła nakrywkowego (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A; 6) szczelnie przylegającego do komory. Centralne wycięcie tworzy kanał przepływowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1A i D; 7; 2,0 mm szerokości i 0,125 mm wysokości). Wlot i wylot są podłączone do kanału przepływowego, a podciśnienie jest podłączone do kanału próżniowego.
<ol>
	<li>Przykryj górną część komory przepływowej wodą destylowaną i umieść na wodzie niestandardowy arkusz silikonowy gładką stroną do dołu skierowaną w dół. Umieść arkusz na miejscu, usuwając nadmiar wody, jednocześnie utrzymując arkusz na miejscu. 
	UWAGA: Ten arkusz silikonowy nadaje się do wielokrotnego użytku (silikon jest znany ze swoich właściwości obojętnych); Ogólnie rzecz biorąc, nie zaobserwowano, aby płytki krwi przyczepiały się do niego. Arkusze można czyścić detergentem i używać ponownie, aż do uszkodzenia materiału (tj. rozdarcia, szczególnie w obszarze między kanałami). Ogólnie rzecz biorąc, arkusz może być używany przez 20 dni z wieloma eksperymentami dziennie.</li>
	<li>Inkubować komorę przepływową przez 1 godzinę w temperaturze 60 °C w celu odparowania pozostałej wody i mocno przylgnąć arkusz silikonowy do komory przepływowej.</li>
	<li>Za pomocą plastikowej pipety Pasteura dodaj kroplę buforu HEPES Tyrode, pH 7,4, do kanału przepływowego. Umieść szkło nakrywkowe (patrz rozdział 2) powlekaną stroną do dołu, na kanale przepływowym. Podłącz pompę próżniową do przyłącza podciśnienia (<silna klasa = "xfig" >rysunki 1A i C; 3). Zastosować ciśnienie ~10 kPa.</li>
</ol>
6. Wstępne barwienie płytek krwi i przygotowanie przeciwciał
<ol>
	<li>Barwienie płytek krwi
	<ol>
		<li>Inkubować umyte płytki krwi z 10 μg/ml DAPI przez 30 minut w temperaturze 37 °C w ciemności. Aby zmyć niezwiązaną DAPI i zapobiec aktywacji płytek krwi, dodać prostacyklinę w końcowym stężeniu 10 ng/ml i natychmiast odwirować przez 15 minut przy 400 x g i RT bez hamulca.</li>
		<li>Rozpuścić osad płytek krwi w buforze HEPES Tyrode, pH 7,4, do stężenia płytek krwi 150 000 płytek krwi/μl.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie przeciwciał
	<ol>
		<li>Wymieszaj przeciwciało znakowane biotyną ze streptawidyną znakowaną Alexą w stosunku molowym 1:1. Przed użyciem inkubować przez co najmniej 10 minut w temperaturze pokojowej (krok 7.6). 
		UWAGA: Skuteczność etykietowania biotyny może się różnić w zależności od partii. W przypadku problemów z wizualizacją cząsteczek docelowych należy przeprowadzić eksperymenty kontrolne w celu potwierdzenia udanej biotynylacji, a także właściwości wiązania celu przez specyficzne przeciwciało biotynylowane.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. Perfuzja
<ol>
	<li>Uruchom mikroskop fluorescencyjny, a także oprogramowanie mikroskopu. Użyj ustawień mikroskopu podanych w tabeli 1. 
	UWAGA: Zainicjuj ustawienia mikroskopu i rejestracji w celu wizualizacji żywych komórek i zapisu płytek krwi oraz wybranych fluorescencyjnie znakowanych przeciwciał i/lub barwników, ładując odpowiedni eksperyment do oprogramowania mikroskopu. Wykonuj eksperymenty przepływu w RT.</li>
	<li>Zablokuj rurkę wlotową, podłączając strzykawkę o pojemności 10 ml do rurki i zasysając 1% bufor blokujący HSA do rurki wlotowej. Inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przepłukać rurkę dolotową, zasysając bufor HEPES Tyrode o pH 7,4 do rurki wlotowej.</li>
	<li>Podłącz zablokowaną rurkę wlotową i nieobrobioną rurkę wylotową, obie o średnicy 1,02 mm i długości ~20-30 cm, do wlotu i wylotu komory. Podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml (lub mniejszą objętość dla większej dokładności) do rurki wylotowej. Włączyć pompę strzykawkową. 
	UWAGA: Średnica strzykawki w połączeniu z natężeniem przepływu ustawionym na pompie określa objętościowe natężenie przepływu. Wraz z powierzchnią kanału przepływowego szybkość ścinania można obliczyć zgodnie ze wzorem13 poniżej. W związku z tym możliwe jest manipulowanie szybkością ścinania poprzez zmianę natężenia przepływu pompy strzykawkowej lub zmianę wymiarów kanału przepływowego. Szybkość ścinania 800-1,600 s-1 zazwyczaj modeluje przepływ krwi tętniczej, podczas gdy modele 25-100s-1 dotyczy przepływu krwi żylnej. W przypadku tej konfiguracji natężenie przepływu 7,5 μl/min daje szybkość ścinania 25 s-1, 
	Szybkość ścinania = 6Q / h2w w s-1 
	W czym: Q = objętościowe natężenie przepływu (ml/s), h = kanał wysokości (cm) (0,0125 cm; jest to grubość arkusza silikonu), w = kanał szerokości (cm) (0,2 cm w tej komorze).</li>
	<li>Umieść kroplę olejku immersyjnego na obiektywie 100X (całkowite wzmocnienie 1,000X) i zamontuj komorę na mikroskopie szklaną powierzchnią do dołu.</li>
	<li>Umieścić rurkę doprowadzającą w rurce zawierającej bufor HEPES Tyrode, pH 7.4. Ręcznie pociągnąć za tłok strzykawki podłączonej do rurki wylotowej i przeciągnąć roztwór przez komorę, aby usunąć powietrze z systemu. Umieścić strzykawkę w pompie strzykawkowej (<silna klasa="xfig">Rysunek 1B i C; 8) i krótko uruchomić pompę, aby dokręcić tłok i zapewnić stabilny przepływ.</li>
	<li>Dodać przeciwciała i/lub barwniki do zawiesiny płytek krwi lub PRP, ostrożnie wymieszać plastikową pipetą i przenieść mieszaninę do probówki o pojemności 1,5 ml. 
	UWAGA: Do typowej 30-minutowej perfuzji z szybkością ścinania 25s-1 (7,5 μL/min) potrzebne jest co najmniej 225 μL zawiesiny płytek krwi. Przeciwciała użyte do uzyskania reprezentatywnych wyników przedstawiono w tabeli 2.</li>
	<li>Przesunąć rurkę wlotową, podczas ściskania, z buforu HEPES Tyrode, pH 7,4, do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej PRP lub przemyte płytki krwi oraz przeciwciała i/lub barwniki (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 1B i C; 9). 
	UWAGA: Ważne jest, aby podczas przenoszenia rurki rurka była ściskana (wyciskanie powietrza), aby zapobiec przedostawaniu się powietrza do rurki. Możliwe jest traktowanie przylegających płytek krwi różnymi odczynnikami w kolejnym etapie, przesuwając rurkę wlotową do innej rurki w podobny sposób. Wykaz potencjalnie użytecznych odczynników znajduje się w tabeli 3.</li>
	<li>Wybierz opcję "wizualizacja na żywo" w oprogramowaniu, ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni powlekanego szkła nakrywkowego i uruchom pompę z szybkością ścinania 1 600s-1 (484 μl/min), aż płytki krwi dotrą do komory przepływowej. W tym momencie zmniejsz szybkość ścinania z powrotem do 25s-1, zmieniając ustawienia pompy strzykawkowej na natężenie przepływu 7,5 μL/min.</li>
	<li>Monitoruj powierzchnię powlekanej strony szkła nakrywkowego, poczekaj, aż pierwsza płytka krwi zacznie przylegać, skoncentruj mikroskop na tej płytce i rozpocznij nagrywanie, rozpoczynając eksperyment w oprogramowaniu. Patrz Tabela 1, aby zapoznać się z używanymi tutaj ustawieniami nagrywania.</li>
	<li>Śledź wizualnie nagranie na żywo. Po 30 minutach zatrzymać pompę strzykawkową. 
	UWAGA: Upewnij się, że płytki krwi pozostają ostre w trakcie eksperymentu. Zazwyczaj 20-30 płytek krwi przyczepia się w polu widzenia przy powiększeniu 1,000x; Jest to około 2 000-3 000 płytek krwi w całym kanale przepływowym.</li>
	<li>Mocowanie za pomocą komory przepływowej (opcjonalnie).
	<ol>
		<li>Po zatrzymaniu przepływu po zatrzymaniu pompy strzykawkowej przenieść rurkę wlotową (bez powietrza) do roztworu utrwalającego. Uruchom ponownie pompę i przepuść bufor utrwalający przez kanał przez co najmniej 10 minut przy tym samym natężeniu przepływu, jak wspomniano w kroku 7.8.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij komorę z mikroskopu, oczyść olejek immersyjny ze szkła, odłącz odkurzacz i ostrożnie wyjmij szkło nakrywkowe z komory za pomocą igły 18 G. 
	UWAGA: Zapobiegaj pękaniu szkła nakrywkowego i uszkodzeniu arkusza silikonowego.</li>
	<li>Umieść szkiełko przykrywające (z komórkami skierowanymi do góry) w 4-dołkowej płytce na chusteczce, wstępnie zwilżonej wodą destylowaną. 
	UWAGA: Zapobiega to przywieraniu szkła nakrywkowego do powierzchni studzienki i zapobiega wysychaniu.</li>
	<li>Odpipetować 750 μl roztworu utrwalającego na wierzchu szkła nakrywkowego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. W przypadku, gdy próbki nie mogą być analizowane bezpośrednio, należy je przechowywać w 0,5% PFA (rozcieńczonym buforem HEPES Tyrode, pH 7,4) w temperaturze 4 °C, aby zapewnić stabilne utrwalenie. Przejdź do sekcji 8, aby przetworzyć szkło nakrywkowe do obrazowania.</li>
	<li>Po użyciu wypłucz komorę, rurkę i blachę wodą destylowaną i inkubuj przez noc w roztworze detergentu. Przed ponownym użyciem komory i innych elementów należy spłukać wodą destylowaną.</li>
	<li>Zapisz pliki surowych danych mikroskopu zawierające wszystkie metadane. W razie potrzeby wyeksportuj filmy do folderu . MOV, h.264 lub .AVI nieskompresowany. Zapisuj osobne klatki jako pliki JPEG lub TIF.</li>
</ol>
8. Przygotowanie próbki do konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej
<ol>
	<li>Przenieść szkła nakrywkowe na nowe płytki 4-dołkowe i spłukać 5 razy 3 ml buforu HEPES Tyrode, pH 7,4. Dodać 3 ml/studzienkę buforu blokującego i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć bufor blokujący, dodać 3 ml / studzienkę 0,15% glicyny (M/V) do buforu HEPES Tyrode, pH 7,4 i inkubować przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór glicyny i przemyć 5 razy w 3 ml / studzienkę buforu blokującego. Opcjonalnie dodać przeciwciała sprzężone z fluoroforem rozcieńczone w buforze blokującym w celu dodatkowego barwienia. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	<li>Przemyć 5 razy buforem blokującym i 2 razy wodą destylowaną. Osusz szkło, usuwając nadmiar płynu chusteczką (od krawędzi do wewnątrz), nie dotykając komórek.</li>
	<li>Odpipetować 60 μl roztworu alkoholu poliwinylowego na szkiełko mikroskopowe. Umieść szkło nakrywkowe komórkami w dół na wierzchu kropli i pozwól, aby alkohol poliwinylowy rozprzestrzenił się między dwiema powierzchniami. Inkubować przez noc w RT w ciemności.</li>
	<li>Przeanalizuj komórki za pomocą mikroskopii konfokalnej14.</li>
	<li>Zapisz nieprzetworzone pliki danych zarejestrowanych danych stosu zawierające wszystkie metadane. W razie potrzeby przetwórz pliki danych pierwotnych na pliki MOV, skompresowane h.264 lub .AVI nieskompresowane. Zapisuj osobne stosy jako pliki JPEG lub TIF.</li>
</ol>

<ol><li>Springer, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((von+Willebrand+factor%2C+Jedi+knight+of+the+bloodstream%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">von Willebrand factor, Jedi knight of the bloodstream.</a> Blood. 124 (9), 1412-1425 (2014).</li>
<li>Fitch-Tewfik, J. L., Flaumenhaft, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+granule+exocytosis%3A+a+comparison+with+chromaffin+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Platelet granule exocytosis: a comparison with chromaffin cells.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 4, 11(2013).</li>
<li>May, B., Menkens, I., Westermann, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+release+of+serotonin+and+histamine+from+blood+platelets+of+the+rabbit+by+aliphatic+and+aromatic+amines%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Differential release of serotonin and histamine from blood platelets of the rabbit by aliphatic and aromatic amines.</a> Life Sci. 6 (19), 2079-2085 (1967).</li>
<li>Schmaier, A. H., Smith, P. M., Colman, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+C1-+inhibitor.+A+secreted+alpha-granule+protein%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">Platelet C1- inhibitor. A secreted alpha-granule protein.</a> J. Clin. Invest. 75 (1), 242-250 (1985).</li>
<li>Battinelli, E. M., Markens, B. A., Italiano, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Release+of+angiogenesis+regulatory+proteins+from+platelet+alpha+granules%3A+modulation+of+physiologic+and+pathologic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Release of angiogenesis regulatory proteins from platelet alpha granules: modulation of physiologic and pathologic angiogenesis.</a> Blood. 118 (5), 1359-1369 (2011).</li>
<li>Kamykowski, J., Carlton, P., Sehgal, S., Storrie, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+immunofluorescence+mapping+reveals+little+functional+coclustering+of+proteins+within+platelet+%CE%B1-granules%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Quantitative immunofluorescence mapping reveals little functional coclustering of proteins within platelet α-granules.</a> Blood. 118 (5), 1370-1373 (2011).</li>
<li>Sakariassen, K. S., Aarts, P. A., de Groot, P. G., Houdijk, W. P., Sixma, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perfusion+chamber+developed+to+investigate+platelet+interaction+in+flowing+blood+with+human+vessel+wall+cells%2C+their+extracellular+matrix%2C+and+purified+components%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lab+Clin+Med%22%5BJournal%5D)">A perfusion chamber developed to investigate platelet interaction in flowing blood with human vessel wall cells, their extracellular matrix, and purified components.</a> J Lab Clin Med. 102 (4), 522-535 (1983).</li>
<li>Van Aelst, B., Feys, H. B., Devloo, R., Vandekerckhove, P., Compernolle, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+Flow+Chambers+Using+Reconstituted+Blood+to+Model+Hemostasis+and+Platelet+Transfusion+In+Vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microfluidic Flow Chambers Using Reconstituted Blood to Model Hemostasis and Platelet Transfusion In Vitro.</a> J Vis Exp. (109), (2016).</li>
<li>Nesbitt, W. S., Westein, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+shear+gradient-dependent+platelet+aggregation+mechanism+drives+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">A shear gradient-dependent platelet aggregation mechanism drives thrombus formation.</a> Nat Med. 15 (6), 665-673 (2009).</li>
<li>Mitchell, J. L., Lionikiene, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyphosphate+colocalizes+with+factor+XII+on+platelet-bound+fibrin+and+augments+its+plasminogen+activator+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Polyphosphate colocalizes with factor XII on platelet-bound fibrin and augments its plasminogen activator activity.</a> Blood. 128 (24), 2834-2845 (2016).</li>
<li>Park, Y., Schoene, N., Harris, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mean+platelet+volume+as+an+indicator+of+platelet+activation%3A+methodological+issues%5BTitle%5D)+AND+%22Platelets%22%5BJournal%5D)">Mean platelet volume as an indicator of platelet activation: methodological issues.</a> Platelets. 13 (5-6), 301-306 (2002).</li>
<li>Sixma, J. J., de Groot, P. G., van Zanten, H., IJsseldijk, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+perfusion+chamber+to+detect+platelet+adhesion+using+a+small+volume+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Res%22%5BJournal%5D)">A new perfusion chamber to detect platelet adhesion using a small volume of blood.</a> Thromb Res. 92, S43-S46 (1998).</li>
<li>Slack, S. M., Turitto, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+chambers+and+their+standardization+for+use+in+studies+of+thrombosis.+On+behalf+of+the+Subcommittee+on+Rheology+of+the+Scientific+and+Standardization+Committee+of+the+ISTH%5BTitle%5D)+AND+%22Thromb+Haemost%22%5BJournal%5D)">Flow chambers and their standardization for use in studies of thrombosis. On behalf of the Subcommittee on Rheology of the Scientific and Standardization Committee of the ISTH.</a> Thromb Haemost. 72 (5), 777-781 (1994).</li>
<li>Oreopoulos, J., Berman, R., Browne, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinning-disk+confocal+microscopy%3A+present+technology+and+future+trends%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Spinning-disk confocal microscopy: present technology and future trends.</a> Methods Cell Biol. 123, 153-175 (2014).</li>
<li>Nishibori, M., Cham, B., McNicol, A., Shalev, A., Jain, N., Gerrard, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+protein+CD63+is+in+platelet+dense+granules%2C+is+deficient+in+a+patient+with+Hermansky-Pudlak+syndrome%2C+and+appears+identical+to+granulophysin%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Clin.+Invest%22%5BJournal%5D)">The protein CD63 is in platelet dense granules, is deficient in a patient with Hermansky-Pudlak syndrome, and appears identical to granulophysin.</a> J. Clin. Invest. 91 (4), 1775-1782 (1993).</li>
<li>Ruiz, F. A., Lea, C. R., Oldfield, E., Docampo, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+platelet+dense+granules+contain+polyphosphate+and+are+similar+to+acidocalcisomes+of+bacteria+and+unicellular+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Human platelet dense granules contain polyphosphate and are similar to acidocalcisomes of bacteria and unicellular eukaryotes.</a> J. Biol. Chem. 279 (43), 44250-44257 (2004).</li>
<li>Tersteeg, C., Fijnheer, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keeping+von+Willebrand+Factor+under+Control%3A+Alternatives+for+ADAMTS13%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Thromb+Hemost%22%5BJournal%5D)">Keeping von Willebrand Factor under Control: Alternatives for ADAMTS13.</a> Semin Thromb Hemost. 42 (1), 9-17 (2016).</li>
<li>Tersteeg, C., de Maat, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmin+cleavage+of+von+Willebrand+factor+as+an+emergency+bypass+for+ADAMTS13+deficiency+in+thrombotic+microangiopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Plasmin cleavage of von Willebrand factor as an emergency bypass for ADAMTS13 deficiency in thrombotic microangiopathy.</a> Circulation. 129 (12), 1320-1331 (2014).</li>
<li>Basir, A., de Groot, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Vitro+Hemocompatibility+Testing+of+Dyneema+Purity+Fibers+in+Blood+Contact%5BTitle%5D)+AND+%22Innovations+%28Phila%29%22%5BJournal%5D)">In Vitro Hemocompatibility Testing of Dyneema Purity Fibers in Blood Contact.</a> Innovations (Phila). 10 (3), 195-201 (2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Na całym świecie zakrzepica jest główną przyczyną zgonów i zachorowalności, a płytki krwi odgrywają kluczową rolę w jej rozwoju. W pracy opisano metodę obrazowania żywych komórek degranulacji płytek krwi pod przepływem. Powszechnie przyjmuje się, że gdy płytki krwi ulegają aktywacji, cała ziarnista zawartość jest bezpośrednio uwalniana do roztworu. Przedstawione wyniki sugerują, że niekoniecznie tak jest. Podczas adhezji i degranulacji płytki krwi zatrzymują znaczną ilość polifosforanu (ryc. 4). Dodatkow...

Płytki krwi to komórki bezjądrzające, które krążą w krwiobiegu. Ich główną funkcją jest uszczelnianie naczyń krwionośnych w miejscach urazu i zapobieganie utracie krwi. W tych miejscach uszkodzenia podśródbłonkowe włókna kolagenowe zostają odsłonięte, a następnie pokryte białkiem multimerycznym, czynnikiem von Willebranda (VWF). VWF oddziałuje z płytkami krwi w krążeniu w mechanizmie, który zależy od kompleksu glikoproteiny Ibα-IX-V na powierzchni komórki1, spowalniając prędkość płytek krwi. Jest to szczególnie ważne przy dużych prędkościach ścinania. Płytki krwi następnie ulegają zmianom morfologicznym, otrzymując impulsy aktywujące z kolagenu. Prowadzi to do nieodwracalnego rozprzestrzeniania się i ostatecznie do agregacji płytek krwi. Oba procesy zależą od wydzielania granulek w celu ułatwienia przesłuchu płytkowo-płytkowego. Granulki α płytek krwi zawierają między innymi fibrynogen i VWF, które wspomagają adhezję płytek krwi i łączą płytki krwi w sposób zależny od integryny. Granulki o dużej gęstości płytek krwi zawierają związki nieorganiczne2, w tym wapń i difosforan adenozyny (ADP), które pomagają wzmocnić aktywację płytek krwi. Ponadto płytki krwi zawierają mediatory (alergicznego) stanu zapalnego3, białka kontrolujące dopełniacz4 oraz czynniki angiogenezy5,6, co rodzi pytania, czy i w jaki sposób te treści są różnie uwalniane w różnych warunkach.
Od 1980 roku, badanie funkcji płytek krwi w modelach przepływu było cenne dla badania mechanizmów zakrzepowych7. Od tego czasu poczyniono znaczne postępy techniczne, a modele przepływu, które obejmują tworzenie fibryny, są obecnie opracowywane w celu zbadania potencjału hemostatycznego terapeutycznych koncentratów płytek krwi ex vivo8 lub zbadania wpływu zaburzeń szybkości ścinania na morfologię skrzepliny9. Różnice w mechanizmach molekularnych i komórkowo-biologicznych, które napędzają stabilną adhezję i fizjologiczne tworzenie skrzepliny (hemostaza) w porównaniu z patologicznym tworzeniem skrzepliny (zakrzepicy) mogą być bardzo subtelne i motywować do opracowania modeli przepływu, które pozwalają na wizualizację tych procesów subkomórkowych w czasie rzeczywistym.
Przykładem procesu, dla którego taka konfiguracja byłaby wartościowa, jest (re)dystrybucja wewnątrzkomórkowego polifosforanu i rekrutacja czynników krzepnięcia, aby odkryć zależny od czasu wpływ, jaki ma to na ultrastrukturę fibryny10. Badania często ograniczają się do analiz punktów końcowych. Głównym celem opisanej metody jest umożliwienie wizualnego badania w czasie rzeczywistym dynamicznych procesów subkomórkowych, które zachodzą podczas aktywacji płytek krwi pod wpływem przepływu.

<table><tbody><tr><td>Kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES)&nbsp;</td><td>VWR</td><td>441476L</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>31248</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Merck KGaA</td><td>1.05886</td><td></td></tr><tr><td>D-glukoza</td><td>Merck KGaA</td><td>1.04074</td><td></td></tr><tr><td>Prostacyklina&nbsp;</td><td>Cayman Chemical</td><td>18220</td><td></td></tr><tr><td>Cytrynian trisodowy</td><td>Merck KGaA</td><td>1.06448</td><td></td></tr><tr><td>Kwas cytrynowy&nbsp;</td><td>Merck KGaA</td><td>1.00244</td><td></td></tr><tr><td>Okulary nakrywkowe</td><td>Menzel-Gl&auml; ser</td><td>BBAD02400500#A</td><td>24 x 50 mm, Nr 1 = 0,13 - 0,16 mm grubości.</td></tr><tr><td>Kwas chromosiarkowy (2% CrO3)</td><td>Riedel de Haen</td><td>07404</td><td>CAS [65272-70-0].</td></tr><tr><td>Czynnik von Willebranda (VWF)</td><td>we własnym zakresie oczyszczone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>laboratoria badawcze enzymów</td><td>fibrynogenu</td><td>FIB3L</td><td></td></tr><tr><td>4-dołkowa, niepoddawana działaniu</td><td>Thermo Scientific</td><td>267061</td><td></td></tr><tr><td>Frakcja albuminy ludzkiej surowicy V</td><td>Haem Technologies Inc.</td><td></td><td></td>823022</tr><tr><td>Probówki do pobierania krwi, 9 mL, 9NC Koagulacja Cytrynian sodu 3,2%</td><td>Greiner Bio-One</td><td>455322</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek&nbsp;</td><td>Analizator</td><td>hematologiczny Abbott Diagnostics CELL-DYN</td> Paraformaldehyd <td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma</td><td>30525-89-4&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa strzykawkowa</td><td>Aparat Harvard, Holliston, MA</td><td>Aparat Harvard 22</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 10 ml o średnicy 14,5 mm</td><td>BD biosciences</td><td>305959</td><td>Strzykawka Luer-Lok</td></tr><tr><td>Anty-CD63-biotyna&nbsp;</td><td>Biblioteka&nbsp;</td><td></td><td></td>AB134331</tr><tr><td>Anty-CD62P-biotyna&nbsp;</td><td>R& D Systems</td><td>Dy137</td><td></td></tr><tr><td>Dichlorowodorek 4',6-diamidyn-2-fenyloindolu (DAPI)</td><td>Polysciences Inc.&nbsp;</td><td>9224</td><td></td></tr><tr><td>Streptawidyna, koniugat Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Scientific</td><td>S11223&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Olejek immersyjny</td><td>Zeiss</td><td>444963-0000-000</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór detergentu</td><td>Unilever, Biotex</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma</td><td>56-40-6&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol poliwinylowy</td><td>Sigma</td><td>9002-89-5</td><td>Mowiol 40-88.</td></tr><tr><td>Chlorowodorek tris</td><td>Sigma</td><td>1185-53-1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>1,4-diazabicyklo[2.2.2]oktan (DABCO)</td><td>Sigma</td><td>280-57-9</td><td></td></tr><tr><td>Owca anty-hVWF pAb</td><td>Abcam&nbsp;</td><td>AB9378</td><td></td></tr><tr><td>Alexa fluor 488-NHS</td><td>Thermo Scientific</td><td>A20000</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>15523-1L-R</td><td></td></tr><tr><td>Folia parafińska</td><td>Bemis</td><td>PM-996</td><td>4 cale x 125 stóp Rolka.</td></tr><tr><td>Arkusz silikonowy niezbrojony</td><td>Nagor</td><td>NA 500-1</td><td>200 mm x 150 mm x 0,125 mm.</td></tr><tr><td>Indywidualnie cięty arkusz silikonowy z kanałami perfuzyjnymi i próżniowymi</td><td>wykonanymi</td><td></td> we własnym zakresie <td>Wykonany z arkusza silikonowego niewzmocnionego (Nagor, NA 500-1)</td></tr> <tr><td>Probówki 1,5 ml</td><td>Eppendorf AG</td><td>T9661-1000AE</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Zeiss Observer Z1&nbsp;</td><td></td><td>Wyposażony w światła wzbudzenia LED.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie mikroskopowe</td><td>Zeiss ZEN 2</td><td>blue edition</td><td></td></tr><tr><td>Igła 18 G (18 G x 1 1/2")</td><td>BD biosciences</td><td>305196</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Riedel de Haen</td><td>31248375</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Roche</td><td>10708976</td><td></td></tr><tr><td>Plastikowa pipeta Pasteura</td><td>VWR</td><td>612-1681</td><td>&nbsp; 7 ml niesterylny, z podziałką do 3 ml.</td></tr><tr><td>Rurka silikonowa</td><td>VWR</td><td>228-0656</td><td>Średnica wewnętrzna. x Średnica zewnętrzna x Grubość ścianki = 1,02 x 2,16 x 0,57 mm.</td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe</td><td>Thermo Scientific</td><td>ABAA000001##12E</td><td>76 x 26 x 1 mm, szlifowane krawędzie 45 & stopni, matowy koniec.</td></tr></tbody></table>

obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Płytki krwi odgrywają kluczową rolę w hemostazie, tworzeniu skrzeplin w celu uszczelnienia naczyń krwionośnych. Są również zaangażowane w zakrzepicę, tworzenie skrzeplin, które zamykają naczynia krwionośne i uszkadzają narządy, co ma zagrażające życiu konsekwencje. Motywuje to do prowadzenia badań naukowych nad funkcją płytek krwi i opracowywania metod śledzenia procesów biologicznych zachodzących w warunkach przepływu.
Dostępne są różne modele przepływu do badania adhezji i agregacji płytek krwi, dwóch kluczowych zjawisk w biologii płytek krwi. W pracy opisano metodę badania degranulacji płytek krwi w czasie rzeczywistym pod wpływem przepływu podczas aktywacji. Metoda wykorzystuje komorę przepływową sprzężoną z konfiguracją strzykawka-pompa, która jest umieszczona pod szerokokątnym, odwróconym mikroskopem fluorescencyjnym opartym na diodach LED. Opisana tutaj konfiguracja pozwala na jednoczesne wzbudzenie wielu fluoroforów, które są dostarczane przez fluorescencyjnie znakowane przeciwciała lub barwniki fluorescencyjne. Po eksperymentach z obrazowaniem żywych komórek, szkła nakrywkowe mogą być dalej przetwarzane i analizowane za pomocą mikroskopii statycznej (tj. mikroskopii konfokalnej lub skaningowej mikroskopii elektronowej).

Rysunek 1 przedstawia obrazy komory przepływowej i układu eksperymentalnego, położenie i wymiary arkusza krzemowego oraz połączenia rurek. Rysunek 2 zawiera szczegółowe informacje o wymiarach komory przepływowej. Rysunek 3 oraz Film 1 przedstawiają serię obrazów czasowych adhezji i rozprzestrzeniania się płytek krwi na unieruchomionym VWF. CD63 jest białkiem transbłonowym wbudowanym ...

Ta praca opisuje metodę opartą na mikroskopii fluorescencyjnej do badania adhezji, rozprzestrzeniania się i wydzielania płytek krwi pod przepływem. Ta wszechstronna platforma umożliwia badanie funkcji płytek krwi w badaniach mechanistycznych nad zakrzepicą i hemostazą.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Ogólnym celem tego eksperymentu jest śledzenie degranulacji i sekrecji płytek krwi w warunkach przepływu przy użyciu obrazowania żywych komórek. Metoda ta może pomóc w znalezieniu odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu biologii płytek krwi. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wszechstronnego badania zawartości płytek krwi na poziomie subkomórkowym w żywych komórkach.Choć metoda ta pozwala na uzyskanie informacji na temat funkcji płytek krwi, może ona zostać zastosowana również do innych typów komórek, takich jak komórki tuczne. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą napotykają trudności wynikające z problemów z izolacją płytek krwi w formie preaktywacji. Pomysł na tę metodę pojawił się u nas w momencie, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że sekrecja płytek krwi mogła być oceniana jedynie w etapach końcowych.Obrazy w czasie rzeczywistym dostarczają informacji o kinetyce uwalniania zawartości ziarnistości płytek krwi. Procedura izolacji płytek krwi zostanie zaprezentowana przez Silvię Pignatellie, studentkę w naszym instytucie. Następnie Arjan Barendrecht zaprezentuje eksperymenty obrazowania w czasie rzeczywistym.W pierwszej kolejności należy odtłuścić szkiełka podstawowe, inkubując je przez noc w nierozcieńczonym kwasie chromosiarczowym. Następnego dnia opłukać je wodą destylowaną. Następnie umieścić je na noc w suszarce w temperaturze 60 °C w celu osuszenia.Następnie nanieś kroplę wody na blat laboratoryjny i przyklej do niej pasek folii parafinowej o wymiarach 10 centymetrów na 15 centymetrów, usuwając powietrze z przestrzeni między blatem a folią. Następnie nanieś pipetą krople 80 µL czynnika von Willebranda w stężeniu 10 µg/mL lub fibrynogenu w stężeniu 100 µg/mL na folię parafinową. Na krople nałóż suche szkiełka nakrywki i inkubuj je przez półtorej godziny w temperaturze pokojowej.Następnie do każdej dołki płytki czterodotykowej dodaj trzy mililitry buforu blokującego. Przenieś szkiełka nakrywki stroną powleczoną do góry do poszczególnych dołków płytki. Inkubuj je przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza.Odwiruj dziewięć mililitrów krwi pełnej z cytrynianem przez 15 minut przy 160 ×g bez przerwy. Następnie użyj plastikowej pipety Pasteura do zebrania supernatantu zawierającego osocze bogate w płytki krwi. Dodaj jedną część cytrynianu glukozy kwasowej do dziewięciu części płytek krwi (według objętości), aby zapobiec przedwczesnej aktywacji płytek.Następnie odwiruj płytki krwi przez 15 minut przy 400 ×g bez przerwy. Potem usuń supernatant, pozostawiając osad z płytek krwi. Następnie ostrożnie resuspenduj osad w buforze HEPES Tyrode o pH 6,5 do pierwotnej objętości próbki płytek krwi.Następnie do resuspendowanych płytek dodaje się prostacyklinę. Próbkę należy niezwłocznie odwirować, a następnie usunąć nadsącz. Osad należy ostrożnie resuspendować w buforze HEPES Tyrode o pH 7,4.Następnie umieść wypłukane płytki krwi w analizatorze komórek i policz liczbę płytek. Dostosuj liczbę płytek w próbce do stężenia 150 000 płytek na mikrolitr przy użyciu buforu HEPES Tyrode o pH 7,4. Po resuspensji pozostaw płytki na 30 minut w temperaturze pokojowej w celu regeneracji przed rozpoczęciem eksperymentu.Przykryj górną część komory przepływowej wodą destylowaną i połóż na niej dostosowany arkusz silikonowy gładką stroną do dołu. Przesuń arkusz na odpowiednią pozycję, usuwając nadmiar wody i utrzymując go w miejscu. Inkubuj komorę przepływową przez jedną godzinę w temperaturze 60 °C, aby odparować pozostałą wodę i trwale przytwierdzić arkusz silikonowy do komory przepływowej.Za pomocą plastikowej pipety Pasteura nanieś kroplę buforu Tyrode'a z HEPES o pH 7,4 na kanał przepływowy. Następnie umieść przygotowane szkiełko nakrywowe stroną pokrytą do dołu na kanale przepływowym. Włącz pompę próżniową, ustawiając ciśnienie na około 10 kilopaskali, i podłącz pompę próżniową do przyłącza próżniowego komory przepływowej.Dodaj barwnik DAPI w stężeniu 10 µg/ml do wypłukanych płytek krwi, a probówkę z płytkami owiń folią aluminiową. Następnie inkubuj je przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Aby zapobiec aktywacji płytek, dodaj prostacyklinę do końcowego stężenia 10 ng/ml i niezwłocznie odwiruj płytki przez 15 minut przy 400 ×g, nie używając hamulca, aby usunąć niezwiązany DAPI.Zresuspenduj pellet płytek krwi w buforze Tyroda z HEPES o pH 7,4 do pierwotnej objętości, tak aby uzyskać stężenie 150 000 płytek na µL. Następnie włącz mikroskop fluorescencyjny i uruchom oprogramowanie mikroskopu. Ustaw parametry obrazowania zgodnie z opisem w tabeli 1 dołączonego protokołu tekstowego.Zablokuj rurkę doprowadzającą, podłączając strzykawkę o pojemności 10 ml i zasysając bufor blokujący do rurki doprowadzającej. Pozostaw do zablokowania na 15 minut w temperaturze pokojowej, a następnie wypłucz rurkę doprowadzającą, zasysając do niej bufor HEPES Tyrode 7.4. Podłącz zablokowaną rurkę doprowadzającą oraz nieobrobioną rurkę odprowadzającą do wlotu i wylotu komory.Następnie podłącz strzykawkę o pojemności 10 ml do rurki wylotowej. Nanieś kroplę olejku immersyjnego na obiektyw 100x i zamocuj komorę na mikroskopie powierzchnią szklaną skierowaną w dół. Następnie umieść rurkę wlotową w probówce zawierającej bufor Tyrode'a z HEPES o pH 7,4.Ręcznie wyciągnij tłok strzykawki podłączonej do rurki wylotowej, aby przeciągnąć roztwór przez komorę i usunąć powietrze z układu. Następnie umieść strzykawkę w pompie strzykawkowej i uruchom pompę na krótko, aby dokręcić tłok i zapewnić stabilny przepływ. Po przygotowaniu układu przepływowego dodaj przeciwciała i/lub barwniki do zawiesiny płytek krwi i dokładnie wymieszaj.Następnie zaciśnij rurkę doprowadzającą i przenieś ją z buforu do probówki zawierającej znakowane płytki krwi. W oprogramowaniu wybierz wizualizację na żywo. Ustaw ostrość mikroskopu na powierzchni szkiełka nakrywki i uruchom pompę przy przepływie 484 microliters per minute.Uruchom pompę, aż płytki krwi dotrą do komory przepływowej. Następnie zmniejsz szybkość przepływu do 7.5 microliters per minute. Monitoruj powierzchnię szkiełka podstawowego.Gdy pierwsza płytka krwi zacznie przylegać, ustaw ostrość mikroskopu na tej płytce i rozpocznij rejestrację, uruchamiając eksperyment w oprogramowaniu. Nagrywaj przez 30 minut, a następnie zatrzymaj pompę strzykawkową. Zapisz surowe pliki danych z mikroskopu zawierające wszystkie metadane.W razie potrzeby wyeksportuj filmy do skompresowanego formatu MOV H 264 lub nieskompresowanego AVI. Zapisz pojedyncze klatki jako pliki JPEG lub TIF. Po zakończeniu obrazowania wyjmij komorę z mikroskopu, usuń olej immersyjny ze szkła, odłącz próżnię i ostrożnie usuń szkiełko nakrywowe z komory za pomocą igły o rozmiarze 18G.Umieść szkiełko nakrywkowe z komórkami skierowanymi do góry w nowej płytce czterodotykowej na tkance uprzednio zwilżonej wodą destylowaną. Następnie naniósz pipetą 750 µL roztworu utrwalającego na szkiełko nakrywkowe i inkubuj przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej w ciemności. W przypadku, gdy próbki nie mogą zostać przeanalizowane bezpośrednio, przechowuj je w 0,5% paraformaldehydzie w temperaturze czterech stopni Celsjusza, aby zapewnić stabilne utrwalenie.Przedstawiono szereg czasowy adhezji i rozprzestrzeniania się płytek krwi na szkiełkach przedmiotowych pokrytych unieruchomionym czynnikiem von Willebranda. Kolorem zielonym zaznaczono CD63, białko transbłonowe, które jest mobilizowane na powierzchnię płytki w sposób zależny od czasu. Podobnie, zaznaczona kolorem pomarańczowym P-selektyna jest również białkiem transbłonowym wbudowanym w błonę wewnątrzkomórkowych ziarnistości $\alpha$, zatrzymującym płytki krwi.Po zakończeniu eksperymentu z przepływem można zastosować konfokalną mikroskopię fluorescencyjną w celu wykonania serii zdjęć pod różnym kątem (tilt series) adhezji płytek krwi. Jak widać tutaj, CD63 znajduje się głównie w centralnym granulomerze, natomiast P-selectyna jest rozmieszczona w obrębie całego ciała komórki i wydaje się skoncentrowana na krawędziach. W tych eksperymentach płytki krwi, które nie posiadają jądra komórkowego z DNA, poddano preinkubacji z DAPI, który barwi na niebiesko.W tym przypadku DAPI barwi polifosforany i ziarnistości gęste. Pojawiające się później zielone barwienie wskazuje na zależną od czasu mobilizację CD63 na powierzchnię płytek krwi. Pomimo wyraźnych oznak uwalniania zawartości ziarnistości gęstych, analiza pojedynczych komórek wykazuje, że polifosforan pozostaje wewnątrz lub na zewnątrz tych płytek.Po opanowaniu tej techniki, wykonanie czterech oddzielnych eksperymentów przepływowych zajmuje sześć godzin. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest zapobieganie przedwczesnej aktywacji płytek krwi. Można to osiągnąć poprzez ostrożne obchodzenie się z zawiesiną komórkową.Po zastosowaniu tej procedury można wykorzystać inne metody, takie jak mikroskopia konfokalna, aby uzyskać dodatkowe informacje na temat trójwymiarowego rozkładu cząsteczek docelowych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat badania funkcji płytek krwi w przepływie na poziomie pojedynczej komórki.

live-cell-imaging-of-platelet-degranulation-and-secretion-under-flow

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Kaskada adhezji płytek krwi zachodzi w warunkach przepływu ścinającego, co jest czynnikiem pomijanym w konwencjonalnych (statycznych) testach na płytkach wielodołkowych. Niniejszy artykuł opisuje test agregacji płytek krwi wykorzystujący mikrofluidyczny format płytki wielodołkowej w celu emulacji fizjologicznych warunków przepływu ścinającego.

Adhezja i agregacja płytek krwi w warunkach przepływu z wykorzystaniem mikrofluidycznych komór przepływowych

Tutaj przedstawiamy eksperymentalną technikę fluorescencji pod mikroskopem przyżyciowym do wizualizacji heterotypowych interakcji płytkowo-neutrofilowych na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy. Ta mikroskopowa technologia będzie cenna w badaniu molekularnego mechanizmu chorób naczyniowych i testowaniu środków farmakologicznych w warunkach patofizjologicznych.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym heterotypowych interakcji płytk-neutrofile na aktywowanym śródbłonku podczas zapalenia naczyń i tworzenia skrzeplin u żywych myszy

Leukocyty przenikają przez monowarstwę śródbłonka drogą parakomórkową lub transkomórkową. Opracowaliśmy prosty test do śledzenia rozkładu endogennej złączowej VE-kadheryny i PECAM-1 podczas transśródbłonkowej migracji leukocytów pod przepływem fizjologicznym, aby rozróżnić dwie drogi transmigracji.

Obrazowanie w czasie rzeczywistym połączeń komórka-komórka śródbłonka podczas transmigracji neutrofili pod wpływem przepływu fizjologicznego

Transfuzja płytek krwi i hemostaza były modelowane za pomocą komór do rekonstytucji krwi i przepływu mikroprzepływowego w celu zbadania funkcji płytek krwi bankujących. Dane wskazują na wpływ zmian spichrzających płytki krwi na hemostazę in vitro.

Mikroprzepływowe komory przepływowe wykorzystujące rozpuszczoną krew do modelowania hemostazy i transfuzji płytek krwi in vitro

Ten artykuł opisuje eksperymentalny model hemostazy, który jednocześnie mierzy funkcję płytek krwi i krzepnięcie. Fluorescencja płytek krwi i fibryny jest mierzona w czasie rzeczywistym i określa się szybkość adhezji płytek krwi, szybkość krzepnięcia i początek krzepnięcia. Model służy do określania właściwości prokoagulantów płytek krwi pod wpływem przepływu w koncentratach do transfuzji.

Model mikroprzepływowej komory przepływowej do transfuzji płytek krwi i hemostazy mierzy odkładanie się płytek krwi i tworzenie fibryny w czasie rzeczywistym

Leukocyty chętnie oddziałują z komórkami naczyniowymi i płytkami krwi po uszkodzeniu ściany naczynia lub podczas stanu zapalnego. W tym miejscu opisujemy prosty test oparty na przepływie laminarnym, aby scharakteryzować mechanizmy molekularne, które leżą u podstaw interakcji między leukocytami a ich partnerami komórkowymi.

Testy oparte na przepływie laminarnym w celu zbadania rekrutacji leukocytów na hodowanych komórkach naczyniowych i przylegających płytkach krwi

Opisujemy metodę w roztworze, polegającą na zastosowaniu równomiernego ścinania do receptorów powierzchni płytek krwi za pomocą wiskozymetrii stożko-płytkowej. Metoda ta może być również stosowana w szerszym zakresie do stosowania ścinania do innych typów komórek i fragmentów komórek i nie musi być ukierunkowana na określoną parę ligand-receptor.

Jednolity test ścinania dla ludzkich receptorów płytkowych i komórkowych za pomocą wiskozymetrii stożkowo-płytkowej

Opisujemy tutaj metodę obrazowania megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kości czaszki żywych myszy za pomocą mikroskopii dwufotonowej.

In vivo (in vivo) Dwufotonowe obrazowanie megakariocytów i propłytek krwi w szpiku kostnym czaszki myszy

Tworzenie się płytek krwi z prokoagulantem jest skorelowane ze zwiększonym ryzykiem zakrzepicy. Przedstawiono dokładny protokół izolacji przemytych płytek krwi od krwi ludzkiej, mający na celu ilościowe określenie ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalnianie mikropęcherzyków, które są charakterystycznymi cechami płytek krwi prokoagulantu.

Charakterystyka płytek krwi prokoagulantu poprzez pomiar ekspozycji na fosfatydyloserynę i uwalniania mikropęcherzyków z oczyszczonych płytek krwi u ludzi

Funkcja płytek krwi pod przepływem może być oceniona, a symulowana resuscytacja hemostatyczna może być modelowana za pomocą urządzenia mikroprzepływowego, które ma zastosowanie w medycynie urazowej i transfuzjologicznej.

Mikrofluidyka w ocenie funkcji płytek krwi

Wielokolorowa cytometria przepływowa dla płytek krwi może zidentyfikować nowe podtypy płytek krwi w klasycznych subpopulacjach płytek krwi, takie jak płytki spoczynku, agregacyjne, prokoagulacyjne i apoptotyczne. Pozwala to na porównanie różnych wzorców subpopulacji indukowanych przez różnych agonistów płytek krwi. Tutaj szczegółowo opisano procedurę tworzenia wielokolorowego panelu cytometrii przepływowej.

Analiza subpopulacji płytek krwi za pomocą wielobarwnej cytometrii przepływowej

Poznaj metodę obrazowania żywych komórek do badania degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu. Technika fluorescencyjna umożliwia analizę funkcji płytek na poziomie subkomórkowym w czasie rzeczywistym.

Obrazowanie żywych komórek degranulacji i wydzielania płytek krwi pod wpływem przepływu

Przeglądaj więcej filmów