Name: Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 27 s
Description: Poznaj metody oznaczania kinetyki wiązania przeciwciało-antygen na czterech platformach biosensorowych. Porównanie Biacore T100, ProteOn XPR36, Octet RED384 i IBIS-MX96 wspiera wybór optymalnej technologii do badań afinitetu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują Noah Ditto i Adamowi Milesowi za pomoc techniczną przy IBIS MX96.

<ol><li>Cooper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+biosensors+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Optical biosensors in drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 1 (7), 515-528 (2002).</li>
<li>Van Regenmortel, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+antigen-antibody+interactions+with+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Rec%22%5BJournal%5D)">Measurement of antigen-antibody interactions with biosensors.</a> J Mol Rec. 11 (1-6), 163-167 (1998).</li>
<li>Davidoff, S. N., Ditto, N. T., Brooks, A. E., Eckman, J., Brooks, B. D. Surface Plasmon Resonance for Therapeutic Antibody Characterization. Label-Free Biosensor Methods in Drug Discovery. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3">http://link.springer.com/10.1007/978-1-4939-2617-6_3</a> 35-76 (2015).</li>
<li>Canziani, G. A., Klakamp, S., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+screening+of+antibodies+from+crude+hybridoma+samples+using+Biacore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic screening of antibodies from crude hybridoma samples using Biacore.</a> Anal Biochem. 325 (2), 301-307 (2004).</li>
<li>Katsamba, P. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetic+analysis+of+a+high-affinity+antibody%2Fantigen+interaction+performed+by+multiple+Biacore+users%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Kinetic analysis of a high-affinity antibody/antigen interaction performed by multiple Biacore users.</a> Anal Biochem. 352 (2), 208-221 (2006).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Malashock, D. S., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+blocking+assays+using+Octet%2C+ProteOn%2C+and+Biacore+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Exploring blocking assays using Octet, ProteOn, and Biacore biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 172-180 (2009).</li>
<li>Abdiche, Y. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Epitope+Binning+Assays+on+Label-Free+Array-Based+Biosensors+Can+Yield+Exquisite+Epitope+Discrimination+That+Facilitates+the+Selection+of+Monoclonal+Antibodies+with+Functional+Activity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Epitope Binning Assays on Label-Free Array-Based Biosensors Can Yield Exquisite Epitope Discrimination That Facilitates the Selection of Monoclonal Antibodies with Functional Activity.</a> PLoS ONE. 9 (3), e92451(2014).</li>
<li>Ecker, D. M., Jones, S. D., Levine, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+therapeutic+monoclonal+antibody+market%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">The therapeutic monoclonal antibody market.</a> mAbs. 7 (1), 9-14 (2014).</li>
<li>Rich, R. L., Myszka, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Higher-throughput%2C+label-free%2C+real-time+molecular+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Higher-throughput, label-free, real-time molecular interaction analysis.</a> Anal Biochem. 361 (1), 1-6 (2007).</li>
<li>Keighley, W. <a target="_blank" href="http://www.ddw-online.com/p-149288">The need for high throughput kinetics early in the drug discovery process.</a> Drug Disc World. 12 (3), 39-45 (2011).</li>
<li>Lad, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+screening+of+hybridomas+to+identify+high-affinity+antibodies+using+bio-layer+interferometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomol+Screen%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic screening of hybridomas to identify high-affinity antibodies using bio-layer interferometry.</a> J Biomol Screen. 20 (4), 498-507 (2015).</li>
<li>Bravman, T., Bronner, V., Nahshol, O., Schreiber, G. <a target="_blank" href="http://link.springer.com/article/10.1007/s12195-008-0036-4">The ProteOn XPR36TM Array System-High Throughput Kinetic Binding Analysis of Biomolecular Interactions.</a> Cell Mol Bioeng. 1 (4), 216-228 (2008).</li>
<li>Eddings, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+continuous-flow+print+head+for+micro-array+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Improved continuous-flow print head for micro-array deposition.</a> Anal Biochem. 382 (1), 55-59 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y., Malashock, D., Pinkerton, A., Pons, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determining+kinetics+and+affinities+of+protein+interactions+using+a+parallel+real-time+label-free+biosensor+the+Octet%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Determining kinetics and affinities of protein interactions using a parallel real-time label-free biosensor the Octet.</a> Anal Biochem. 377 (2), 209-217 (2008).</li>
<li>Abdiche, Y. N., Lindquist, K. C., Pinkerton, A., Pons, J., Rajpal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expanding+the+ProteOn+XPR36+biosensor+into+a+36-ligand+array+expedites+protein+interaction+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Expanding the ProteOn XPR36 biosensor into a 36-ligand array expedites protein interaction analysis.</a> Anal Biochem. 411 (1), 139-151 (2011).</li>
<li>Rich, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+global+benchmark+study+using+affinity-based+biosensors%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A global benchmark study using affinity-based biosensors.</a> Anal Biochem. 386 (2), 194-216 (2009).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+biosensor+platforms+in+the+evaluation+of+high+affinity+antibody-antigen+binding+kinetics%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics.</a> Anal Biochem. 508, 78-96 (2016).</li>
<li>Yang, D., Singh, A., Wu, H., Kroe-Barrett, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dataset+of+the+binding+kinetic+rate+constants+of+anti-PCSK9+antibodies+obtained+using+the+Biacore+T100+ProteOn+XPR36%2C+Octet+RED384%2C+and+IBIS+MX96+biosensor+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Data+in+Brief%22%5BJournal%5D)">Dataset of the binding kinetic rate constants of anti-PCSK9 antibodies obtained using the Biacore T100 ProteOn XPR36, Octet RED384, and IBIS MX96 biosensor platforms.</a> Data in Brief. 8, 1173-1183 (2016).</li>
<li>Bouvier, E. S. P., Koza, S. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0165993614001952">Advances in size-exclusion separations of proteins and polymers by UHPLC.</a> Trends Anal Chem. 63, 85-94 (2014).</li>
</ol>

Opłaty za publikację tego artykułu zostały opłacone przez firmę Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals.

Nasze bezpośrednie badanie porównawcze pokazuje, że każda platforma biosensorów ma swoje mocne i słabe strony. Mimo że profile wiązania przeciwciał są podobne w porównaniu wizualnym (ryc. 3 - 6), a kolejność rang nabytych stałych szybkości kinetycznej jest wysoce spójna we wszystkich instrumentach (ryc. 7), nasze wyniki pokazują, że instrumenty oparte na SPR z płynnością o ciągłym przepływie) są lepsze w rozwiązywaniu interakcji o wysokim powinowactwie przy powolnych szybkościach dysocjacji. W zbiorach danych (np. mAb 2, mAb 5 i mAb 9 obserwuje się dryf w górę; Rysunek 5) generowane przez przyrząd BLI wolny od płynów. Odkrycie to można w dużej mierze przypisać parowaniu próbki w czasie w mikropłytce, co jest głównym ograniczeniem systemu. Z tym nieodłącznym ograniczeniem, czas eksperymentu jest również ograniczony do mniej niż 12 godzin; Eksperymenty zostały zatem zaprogramowane z krótszymi czasami (500 s asocjacji i 30 minut dysocjacji) w porównaniu z innymi platformami (10 minut asocjacji i 45 minut dysocjacji). Wydaje się jednak, że skrócenie czasu eksperymentu nie złagodziło wpływu parowania na jakość/spójność danych, ponieważ stałe szybkości generowane przez instrument oparty na BLI wykazują mniejszą liniowość w wyniku wahań niektórych wskaźników (Rysunek 8C). Oprócz odparowania próbki, różnice w użytych odczynnikach do wychwytywania mogły również przyczynić się do różnic w uzyskanych wynikach. Podczas gdy białko A/G zostało użyte we wszystkich trzech platformach SPR opartych na fluidyce, czujniki AHC zastosowano w niepłynnej platformie BLI. Ponieważ białko A / G prawdopodobnie ma słabsze powinowactwo do mAb niż AHC, powierzchnia biosensora oparta na przeciwciałach, odstępy kompleksu mAb-antygen z powierzchni białka A / G mogą sztucznie pojawiać się szybciej niż te uzyskane z powierzchni AHC. Za taką możliwością przemawiają dane eksperymentalne, z których wynika, że wartości odchyleń generowane przez platformę BLI były konsekwentnie niższe niż te uzyskane z innych instrumentów (Rysunek 7, czerwona linia). Niemniej jednak platforma BLI ma inne zalety w porównaniu z innymi platformami. Na przykład jest bardzo elastyczny pod względem wyboru czujnika i konfiguracji testu dzięki różnym wstępnie powlekanym czujnikom do natychmiastowego użycia. W naszych eksperymentach zastosowanie czujników AHC wyeliminowało potrzebę etapów unieruchomienia liganda, skracając czas przygotowania. Co więcej, platforma BLI wymaga znacznie mniej konserwacji w porównaniu z innymi platformami SPR Fluidics, które charakteryzują się skomplikowanymi konfiguracjami przewodów i przełączników wartości. Ta funkcja jest zaletą w przypadku eksperymentów z surowymi próbkami, które mogą powodować problemy z zatykaniem i zanieczyszczeniem.
Wraz ze wzrostem zapotrzebowania na wydajną, szybką i dokładną identyfikację kandydatów terapeutycznych rośnie również zapotrzebowanie na przepustowość bioczujników. Spośród czterech platform biosensorów przepustowość z biosensora zdolnego do drukowania matrycy 96-ligandowej jest najwyższa, a następnie bioczujnik sprzężony z krzyżującym się formatem 36-ligandowym oraz bioczujnik oparty na BLI z 16-kanałowym równoczesnym odczytem, co ostatecznie zwiększa liczbę interakcji mierzonych w jednym cyklu wiązania do 96, 36 i 16, odpowiednio. Te możliwości przepustowości są znacznie wyższe niż w przypadku tradycyjnej platformy SPR, która jest ograniczona przez posiadanie tylko czterech komórek przepływowych połączonych jednym przepływem szeregowym. Ponieważ nasze eksperymenty obejmowały stosunkowo mały zestaw próbek 10 mAb ocenianych przy różnych gęstościach powierzchni z długimi czasami dysocjacji, przepustowości instrumentalne odegrały umiarkowaną rolę w określaniu efektywności eksperymentów. Nie stwierdzono istotnych różnic w czasie eksperymentów trzech wysokoprzepustowych platform i we wszystkich przypadkach eksperymenty zostały zakończone w ciągu jednego dnia. Z drugiej strony, tradycyjne eksperymenty SPR z przepływem szeregowym wymagały 3 dni na ukończenie, pomimo całkowitej automatyzacji pozyskiwania danych po konfiguracji. W innych badaniach, które obejmują dużą liczbę próbek (tj. w setkach lub tysiącach), do celów oceny poza oceną/badań kinetycznych lub kategoryzacji epitopów, przepustowość staje się czynnikiem krytycznym.
Chociaż przepustowość w IBIS MX96 jest o rzędy wielkości wyższa niż w przypadku innych biosensorów i dlatego jest optymalnym wyborem do tych celów, ma kilka wad. W szczególności drukowanie macierzy przez CFM wykazuje duże niespójności powierzchni (rysunek 1) i zmniejszoną odtwarzalność danych (rysunek 8D oraz 8E). W przypadku dokładnych pomiarów kinetycznych ilość ligandu na powierzchni biosensora jest krytycznym parametrem, który należy kontrolować, aby zapewnić, że reakcje wiązania nie zostaną zakłócone przez czynniki wtórne, takie jak transfer masy lub przeszkoda steryczna. W przypadku Biacore T100 i ProteOn XPR36 optymalne poziomy RL zostały określone na podstawie standardowych obliczeń ustawionych wartości Rmax , jak opisano w artykulebadawczym 17. Z drugiej strony, w przypadku platform Octet RED384 i IBIS MX96, poziomy wychwytu mAb osiągnięto empirycznie przy użyciu serii 2-krotnie seryjnie rozcieńczonych przeciwciał w stałych momentach. Brak wiedzy lub kontroli nad etapem wychwytywania skutkował powierzchnią o dużej gęstości i wysokimi sygnałami odpowiedzi wiązania (rysunek 2), co mogło zagrozić dokładności stałych szybkości kinetycznej. Co więcej, oddzielenie drukarki od detektora SPR stanowi również wyzwanie podczas przeprowadzania pomiarów wielu cykli wiązania obejmujących regeneracje. Jedynym sposobem na przeprowadzenie wielocyklowej konfiguracji kinetyki było bezpośrednie sprzężenie aminowe mAb, w przeciwieństwie do wychwytywania przez mAb Fc przez unieruchomioną powierzchnię białka A / G w pozostałych trzech platformach biosensorów. W związku z tym konieczny był dodatkowy eksperyment zwiadowczy w celu określenia optymalnych warunków regeneracji. Wynik tej konfiguracji był związany z ~90% niższą obserwowaną aktywnością powierzchniową w porównaniu z metodą wychwytywania Fc (Rysunek 9), a także z dłuższym czasem eksperymentu. Aby zastosować metodę wychwytywania Fc, przyjęto alternatywne podejście kinetyczne jednocyklowe. Podejście to polega na sekwencyjnym wstrzykiwaniu analitu w rosnących stężeniach bez regeneracji między każdym wstrzyknięciem (ryc. 2). To bardzo wygodne, ale rzadziej stosowane podejście nie tylko skróciło czas eksperymentu i zmniejszyło zużycie odczynników, ale także pozwoliło uzyskać kinetyczne stałe szybkości bardzo podobne do tych z innych biosensorów (rysunek 7). W związku z tym zastosowanie tego podejścia opartego na kinetyce pojedynczego cyklu pozwala przezwyciężyć nieodłączne ograniczenia konfiguracji instrumentu i stwarza możliwość uzyskania stałych szybkości kinetycznej o wysokiej rozdzielczości w sposób wysokoprzepustowy.
Pomimo tego, że przepustowość jest głównym ograniczeniem w Biacore T100, nasze wyniki pokazują, że wygenerował on najbardziej spójne dane o najwyższej jakości. Na drugim miejscu znalazł się ProteOn XPR36, który ma ~ 10-krotnie wyższą przepustowość. Ich zdolność do generowania wysokiej jakości danych staje się zaletą przy charakteryzowaniu interakcji przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie, które mogą być technicznie trudne po osiągnięciu limitów wykrywalności urządzeń. Podczas gdy systematyczne ograniczenia w oprzyrządowaniu Octet RED384 utrudniają dokładny pomiar stałych szybkości dysocjacji (tj. brak czułości pozwalającej na rozwiązanie wystarczającego zaniku sygnału dla spowolnienia), zarówno Biacore T100, jak i ProteOn XPR36 mogą zapewnić czułe i niezawodne wykrywanie różnicowania.

Uzyskanie wiarygodnych parametrów kinetycznych do charakteryzowania interakcji przeciwciało-antygen jest niezbędnym elementem procesu odkrywania i rozwoju leków1. Biosensory optycznego powierzchniowego rezonansu plazmonowego (SPR), "złoty standard" do wykrywania tych interakcji w czasie rzeczywistym, są używane od około dwóch dekad, aby umożliwić wczesną selekcję kandydatów na przeciwciała terapeutyczne spełniające kryteria<klasa sup='xref'>2,<klasa sup='xref'>3. Oprócz zapewnienia rankingu powinowactwa kandydatów na przeciwciała poprzez szybkie badanie przesiewowe wiązania surowych supernatantów4 oraz rygorystyczne oznaczanie stałych kinetycznych oczyszczonych preparatów5, biosensory mogą dalej różnicować aktywność funkcjonalną głównych kandydatów za pomocą badań grupowania epitopów6,7. 
Aby sprostać rosnącemu zapotrzebowaniu na produkty oparte na przeciwciałach dla różnych wskazań terapeutycznych8, w ostatnich latach opracowano szeroką gamę innowacyjnych instrumentów biosensorów, które zwiększają skuteczność identyfikacji i charakterystyki kandydatów9,10. Przyrządy te różnią się konfiguracją kanałów mikroprzepływowych i/lub zasadami optycznymi związanymi z wykrywaniem oddziaływań biomolekularnych. W szczególności Octet RED38411, ProteOn XPR3612 i IBIS MX967 zwiększyły liczbę interakcji mierzonych w jednym cyklu wiązania odpowiednio do 16, 36 i 96, co stanowi znaczną poprawę przepustowości w porównaniu z tradycyjną platformą Biacore. Chociaż wszystkie te różne platformy biosensorów dostarczają niezbędnych danych kinetycznych do scharakteryzowania interakcji przeciwciało-antygen, różnią się one konfiguracją eksperymentalną i procedurami operacyjnymi ze względu na różnice w konfiguracjach instrumentalnych. Na przykład na platformie macierzy obrazowania SPR IBIS MX96 etap immobilizacji liganda multipleksowego jest wykonywany w trybie off-line w zewnętrznym urządzeniu drukującym oddzielonym od detektora7,13; W przeciwieństwie do tego, pozostałe trzy platformy biosensorów wykorzystują konfigurację "wszystko w jednym", w której dodanie komponentu do powierzchni czujnika, niezależnie od tego, czy jest to odczynnik aktywacyjny, ligand czy analit, jest rejestrowane w czasie rzeczywistym i za pomocą wstępnie zaprogramowanych poleceń w kolejności sekwencyjnej. W Octet RED384 unikalną cechą tej platformy opartej na interferometrii BioLayer (BLI) jest dostępność wstępnie powlekanych biosensorów światłowodowych do natychmiastowego użycia "zanurz i odczytuj" 14, eliminując potrzebę przygotowania powierzchni liganda i etapów inicjacji/kondycjonowania, które są często wymagane w przypadku chipów czujników w platformach opartych na SPR. Bezpłynowa konstrukcja tego urządzenia upraszcza również mechanikę i pozwala uniknąć problemów związanych z zatykaniem i zanieczyszczeniem podczas pracy z surowymi próbkami. Dzięki nowatorskiej konstrukcji płynów 6 x 6 krzyżujących się w ProteOn XPR36 można zastosować podejście kinetyki "one-shot", przełączając kanały przepływu między kierunkiem poziomym i pionowym, aby utworzyć 36 punktów interakcji15. Zamiast oceniać kinetykę wiązania po jednym stężeniu ligandu lub analitu na raz, jak ma to miejsce w tradycyjnej platformie Biacore T100 o przepływie szeregowym, podejście to oferuje możliwość jednoczesnego monitorowania do 36 różnych interakcji w jednym cyklu wiązania. 
Pomimo różnic, te cztery platformy biosensorów są powszechnie używane przez wiele laboratoriów na całym świecie. Dla nowych użytkowników, którzy mają niewielkie doświadczenie w pracy z biosensorami, podjęcie decyzji, którego instrumentu użyć, może być trudnym zadaniem, biorąc pod uwagę różnice w konstrukcji instrumentów. Aby określić najbardziej odpowiedni instrument do celów badawczych, należy wziąć pod uwagę takie czynniki, jak jakość danych, spójność wydajności, przepustowość, łatwość obsługi i zużycie materiałów. Podczas gdy w kilku badaniach porównawczych badano zmienność stałych szybkości kinetycznej uzyskanych z wielu laboratoriów i biosensorów5,16, niedawno opublikowane bezpośrednie badanie porównawcze dalej dotyczy systematycznych czynników, które wpływają na wiarygodność danych z punktu widzenia wydajności instrumentalnej17,18. Protokoły przedstawione w tym filmie koncentrują się szczegółowo na konfiguracji i procedurach eksperymentalnych i towarzyszą im artykuł badawczy zatytułowany "Porównanie platform biosensorów w ocenie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie"17. Protokoły te mają na celu nie tylko pomoc nowym użytkownikom biosensorów we wdrażaniu tych instrumentów do celów badawczych, ale także dostarczenie dodatkowych informacji obecnym użytkownikom biosensorów na temat wyzwań technicznych i rozważań w projektach eksperymentalnych do oceny interakcji przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie.

<table><tbody><tr><td>System Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>System T100 został zaktualizowany do układu czujnika T200</td></tr><tr><td>CM5&nbsp;</td>Ocena BIA <td>BR100012</td><td></td> <td>GE Healthcare</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>wersja 4.1</td></tr><tr><td>Oprogramowanie sterujące Biacore T100</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Oprogramowanie sterujące T100 zostało zaktualizowane do</td></tr><tr><td>zestawu sprzęgającego aminy</td> T200 GE <td>Healthcare</td><td>BR100050&nbsp;</td><td>Zawiera: 750 mg chlorowodorku 1-etylo-3-(3-dimetyloaminopropylo)karbodimidu (EDC), 115 mg N-hydroksysukcynimidu (NHS), 10,5 ml 1,0 M etanoloamino-HCl pH 8,5&nbsp;</td></tr><tr><td>Bufor HBS-EP+ 10 razy;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Skoncentrowany roztwór podstawowy&nbsp;</td></tr><tr><td>Fiolki plastikowe, średn. 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kapsle gumowe, typ 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Fiolki i nakrętki plastikowe, ø 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>System macierzy interakcji białkowych ProteOn XPR36</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie ProteOn Manager&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Wersja 3.1.0.6</td></tr><tr><td>Układ czujnika GLM</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>Zestaw sprzęgający aminy</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>Obejmuje EDAC (EDC), sulfo-NHS, etanoloaminę HCl&nbsp;</td></tr><tr><td>Zestaw do regeneracji i kondycjonowania oraz</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>Zawiera po 1 buforze glicyny (pH 1,5, 2,0, 2,5, 3,0) oraz NaOH, SDS, HCl, kwas fosforowy, NaCl; 50 ml każdego roztworu&nbsp;</td></tr><tr><td>2 l buforu PBS/Tween/EDTA</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>Zawiera sól fizjologiczną buforowaną hosphatem (PBS), pH 7,4, 0,005% Tween 20, 3 mM EDTA&nbsp;</td></tr><tr><td>Oktet RED384 System</td><td>Fort&eacute; </td><td></td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>biologicznych Fort&eacute; </td><td></td><td>Bio Version 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Zanurz i odczyt biosensorów anty-hIgG Fc Capture (AHC)</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5060</td><td>Jedna taca z 96 biosensorami&nbsp;</td></tr><tr><td>384-dołkowa płyta z pochylonym dnem&nbsp;</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Dozownik Biosensora</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Bufor kinetyczny 10x</td><td>Fort&eacute; Bio</td><td>18-1092</td><td>10x stężenie. Zawiera ProClin 300.&nbsp;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi System</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics Drukarka mikroskopu ciągłego przepływu (CFM)</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>wersja 2.0</td></tr><tr><td>Układ SensEye COOH-G</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Wersja 6.19.3.17</td></tr><tr><td>Oprogramowanie</td> <td>do analizy danych SPRintWasatch Microfluidics</td><td></td><td>Wersja 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Scrubber 2</td><td>Oprogramowanie</td><td></td> BioLogic <td>Wersja 2</td></tr><tr><td>Rekombinowane białko Pierce A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

Bezznacznikowe biosensory optyczne są potężnymi narzędziami do odkrywania leków do charakteryzowania oddziaływań biomolekularnych. W tym badaniu opisujemy zastosowanie czterech rutynowo używanych platform biosensorów w naszym laboratorium do oceny powinowactwa i kinetyki wiązania dziesięciu przeciwciał monoklonalnych (mAb) o wysokim powinowactwie przeciwko ludzkiej konwertazie proproteinowej subtylizyny keksynie typu 9 (PCSK9). Podczas gdy zarówno Biacore T100, jak i ProteOn XPR36 wywodzą się z dobrze znanej technologii Surface Plasmon Resonance (SPR), pierwsza z nich ma cztery ogniwa przepływowe połączone konfiguracją przepływu szeregowego, podczas gdy druga przedstawia 36 punktów reakcji równolegle za pomocą improwizowanej konfiguracji kanałów mikroprzepływowych 6 x 6. IBIS MX96 działa również w oparciu o technologię czujników SPR, z dodatkową funkcją obrazowania, która zapewnia detekcję w orientacji przestrzennej. Ta technika detekcji w połączeniu z mikroskopem o ciągłym przepływie (CFM) znacznie zwiększa przepustowość, umożliwiając drukowanie matryc multipleksowych i wykrywanie 96 sportów reakcji jednocześnie. W przeciwieństwie do tego, Octet RED384 opiera się na zasadzie optycznej interferometrii BioLayer (BLI), z sondami światłowodowymi działającymi jako bioczujnik do wykrywania zmian wzorca zakłóceń po interakcjach wiązania na powierzchni końcówki. W przeciwieństwie do platform opartych na SPR, system BLI nie opiera się na przepływie płynnym; Zamiast tego końcówki czujników zbierają odczyty, gdy są zanurzone w roztworach analitu 384-dołkowej mikropłytki podczas mieszania orbitalnego.
Każda z tych platform biosensorów ma swoje wady i zalety. Aby zapewnić bezpośrednie porównanie zdolności tych instrumentów do dostarczania wysokiej jakości danych kinetycznych, opisane protokoły ilustrują eksperymenty, które wykorzystują ten sam format testu i te same wysokiej jakości odczynniki do scharakteryzowania kinetyki przeciwciało-antygen, które pasują do prostego modelu interakcji molekularnej 1:1.

Rycina 1 przedstawia obraz macierzy przeciwciał z CFM oraz poziomy naniesionych mAb w zależności od dwóch metod unieruchomienia, a Rycina 2 pokazuje odpowiadające im sensogramy wiązania wygenerowane w MX96 z pomiarów kinetycznych wielocyklowych i jednocyklowych na tych macierzach mAb. Krzywe wiązania w czasie rzeczywistym oraz krzywe dopasowane kinetycznie z wielu powierzchni pokrytych przeciwciałami, wygenerowane na czterech platformach biosensorowych, przedstawiono na Rycynach 3 - 6. Rycina 7 przedstawia porównanie końcowych stałych szybkości kinetycznych i stałych wiązania równowagowego uzyskanych z analizy globalnej tych krzywych wiązania. Poszczególne stałe asocjacji (ka), dysocjacji (kd) i wiązania równowagowego (KD) przedstawiono w Tabeli 1. Aby zademonstrować zmienność zbiorów danych generowanych w obrębie tego samego urządzenia, na Rycynie 8 przedstawiono wykresy ka, kd oraz KD dla różnych gęstości powierzchni mAb, a Rycina 9 dodatkowo porównuje obliczone aktywności wiązania powierzchni mAb w różnych platformach biosensorowych.
<img alt="Analiza SPR; wykresy pokazujące odpowiedź stężeń przeciwciał mAb; obrazy mikrotablic z oznakowanymi studzienkami." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1. Multipleksowe tablice ligandów powierzchni przeciwciał sprzęganych aminowo (A) oraz wychwytywanych przez Fc (B) z drukowania CFM w systemie IBIS MX96. Obrazy wydrukowanych tablic przedstawiono w panelach po lewej stronie, gdzie szare obszary obramowane czerwonymi kwadratami wskazują obecność przeciwciał. Ciemniejsze obszary międzyplamiste znajdujące się pomiędzy aktywnymi plamkami przeciwciał służą do odejmowania referencyjnego. Każda kolumna zawiera przeciwciało wydrukowane w stężeniach miareczkowania podanych poniżej i po lewej stronie obrazu. Ilości wydrukowanych przeciwciał, wyznaczone poprzez obliczenie różnicy w przesunięciach masowych (bulk shifts) między miejscami aktywnymi a referencyjnymi, przedstawiono w panelach po prawej stronie. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Wykres powierzchniowego rezonansu plazmonowego pokazujący odpowiedź w funkcji czasu dla analizy oddziakiwań białkowych." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 2"> 
Rysunek 2. Porównanie sensorgramów wiązania w czasie rzeczywistym z kinetycznych eksperymentów wielocyklowych (A) i jednocyklowych (B) w urządzeniu IBIS MX96. Sekwencyjne iniekcje ludzkiego PCSK9 w zwiększających się stężeniach w macierzach przeciwciał 10 x 8 są zaznaczone nad każdym odpowiadającym segmentem sensorgramu. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres sensorgramu Biacore T100, kinetyka wiązania mAb, analiza rezonansu plazmonowego powierzchniowego." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 3"> 
Rycina 3. Sensorgramy wiązania przechwyconych przeciwciał oddziałujących z ludzkim białkiem PCSK9 oraz nałożone dopasowania kinetyczne w modelu 1:1 w systemie Biacore T100. Interakcje oceniano na powierzchniach o wysokiej (górne panele), średniej (środkowe panele) i niskiej (dolne panele) gęstości. Nałożone gładkie czarne linie reprezentują dopasowanie kinetyczne sygnałów odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach ludzkiego białka PCSK9 (linie kolorowe) do modelu interakcji 1:1. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Analiza oddziaływań białkowych, wykres sensogramu dla powinowactwa wiązania mAb, wyniki z ProteOn XPR36." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 4"> 
Rycina 4. Sensogramy wiązania unieruchomionych przeciwciał oddziałujących z ludzkim białkiem PCSK9 oraz nałożone dopasowania kinetycznego modelu 1:1 w systemie ProteOn XPR36.Oddziaływania oceniano na powierzchniach o wysokiej (panele górne), średniej (panele środkowe) i niskiej (panele dolne) gęstości. Nałożone gładkie czarne linie przedstawiają dopasowanie kinetyczne sygnałów odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach ludzkiego PCSK9 (linie kolorowe) do modelu oddziaływania 1:1. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Krzywe wiązania Octet RED384, kinetyka mAb, dane sensogramów, analiza immunoanalizy, wyniki na wykresach." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 5"> 
Rysunek 5. Sensogramy wiązania unieruchomionych przeciwciał oddziałujących z ludzkim PCSK9 oraz nałożone dopasowania modelu kinetycznego 1:1 w systemie Octet RED384. Interakcje oceniano na powierzchniach o wysokiej (górne panele), średniej (środkowe panele) i niskiej (dolne panele) gęstości. Nałożone czerwone linie reprezentują dopasowanie kinetyczne sygnałów odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach ludzkiego PCSK9 (kolorowe linie) do modelu interakcji 1:1. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wyniki testu wiązania IBIS MX96, sprzężonego z aminą i wychwyconego przez Fc, wykresy sensorgramów mikromacierzy." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 6"> 
Rysunek 6. Sensorgramy wiązania przeciwciał sprzężonych z aminą (A) i wychwyconych przez Fc (B) oddziałujących z ludzkim białkiem PCSK9 oraz nałożone dopasowania modelu kinetycznego 1:1 w systemie IBIS MX96. Profile wiązania są zorganizowane w formie paneli 10 x 8, które odpowiadają mapie płytki macierzy przedstawionej na Rysunku 1. Linie czarne reprezentują zarejestrowane sygnały odpowiedzi wiązania przy różnych stężeniach ludzkiego białka PCSK9, a nałożone linie czerwone reprezentują dopasowane krzywe. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres analizy kinetycznej przedstawiający stałe (ka, kd) i powinowactwo (KD) dla 10 przeciwciał monoklonalnych; porównanie danych." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig7.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 7"> 
Rycina 7. Porównanie stałych szybkości asocjacji ka (A), dysocjacji kd (B) oraz stałych równowagi KD (C) uzyskanych za pomocą czterech platform biosensorowych. Parametry kinetyczne zostały wyznaczone na podstawie globalnej analizy krzywych wiązania przedstawionych na Rycinnach 3 - 6. Przyrządy oznaczono w następujący sposób: Biacore T100 (niebieski), ProteOn XPR36 (zielony), Octet RED384 (czerwony), IBIS MX96, sprzęganie aminowe (fioletowy) oraz IBIS MX96, wychwyt Fc (pomarańczowy). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, należy kliknąć tutaj.</a>
<img alt="Wykres analizy kinetycznej przedstawiający gęstość wychwyconego mAb w funkcji stałych kinetycznych (kon, koff, KD) w SPR." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 8"> 
Rysunek 8. Porównanie spójności stałych szybkości kinetycznej przy wielu gęstościach powierzchniowych przeciwciał w systemach Biacore T100 (A), ProteOn XPR36 (B), Octet RED384 (C), IBIS MX96 z wiązaniem aminowym (D) oraz IBIS MX96 z wychwytem Fc (E).Parametry kinetyczne ka (górne panele), kd (środkowe panele) oraz KD (dolne panele) zostały wyprowadzone z analizy grupowej dla poszczególnych gęstości powierzchniowych przeciwciał. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tego rysunku.</a>
<img alt="Wykres słupkowy porównujący % aktywności powierzchniowej mAb w systemach biosensorowych: Biacore, ProteOn, Octet, IBIS." src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 9"> 
Rycina 9. Aktywności wiązania powierzchni przeciwciał oraz ich odchylenia standardowe (słupki błędu) w czterech platformach biosensorowych. Wartości obliczono przy użyciu równań opisanych w artykułach badawczych17. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig9large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>ka</td>
			<td>kd</td>
			<td>KD</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(M-1s-1)</td>
			<td>(s-1)</td>
			<td>(nM)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało monoklonalne 1</td>
			<td>11,7 (7,8) x 105</td>
			<td>4,89 (4,18) x 10-5</td>
			<td>0.052 (0.05)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało monoklonalne 2</td>
			<td>1,53 (0,28) x 105</td>
			<td>1,30 (1,54) x 10-5</td>
			<td>0.092 (0.12)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało monoklonalne 3</td>
			<td>11,4 (8,3) x 105</td>
			<td>27,6 (11,0) x 10-5</td>
			<td>0.333 (0.20)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało monoklonalne 4</td>
			<td>3,61 (1,6) x 105</td>
			<td>20,1 (12,3) x 10-5</td>
			<td>0.659 (0.54)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 5</td>
			<td>0,59 (0,21) x 105</td>
			<td>3,46 (2,50) x 10-5</td>
			<td>0.663 (0.46)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>przeciwciało monoklonalne 6</td>
			<td>1,19 (0,78) x 105</td>
			<td>7,21 (3,83) x 10-5</td>
			<td>0.894 (0.64)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 7</td>
			<td>1,29 (0,53) x 105</td>
			<td>16,4 (5,63) x 10-5</td>
			<td>1.57 (1.02)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 8</td>
			<td>4,02 (2,23) x 105</td>
			<td>22,8 (10,7) x 10-5</td>
			<td>0.768 (0.68)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 9</td>
			<td>4,20 (2,13) x 105</td>
			<td>6,67 (4,3) x 10-5</td>
			<td>0.197 (0.16)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mAb 10</td>
			<td>1,20 (0,49) x 105</td>
			<td>12,5 (7,64) x 10-5</td>
			<td>1.27 (0.80)</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: Szybkości kinetyczne i stałe równowagi wiązania 10 przeciwciał monoklonalnych (mAbs) uzyskane poprzez globalne dopasowanie krzywych wiązania z czterech biosensorów do modelu oddziaływania 1:1.

Opisujemy tutaj protokoły pomiaru powinowactwa i kinetyki wiązania przeciwciało-antygen przy użyciu czterech powszechnie używanych platform biosensorów.

Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

Celem niniejszego badania nad biosensorami jest porównanie zdolności czterech rutynowo stosowanych platform biosensorycznych do dostarczania wysokiej jakości danych kinetycznych oraz przedstawienie spostrzeżeń dotyczących wyzwań technicznych i kwestii projektowania eksperymentów służących do oceny wysokowydajnych oddziaływań przeciwciało-antygen. Badanie to odpowiada na kluczowe pytania w dziedzinie poszukiwania leków dotyczące wyboru platform biosensorycznych i formatów testów, które pozwalają na uzyskanie najbardziej wiarygodnych wyników podczas oceny kandydatów na przeciwciała terapeutyczne. Główną zaletą tego badania jest to, że zapewnia ono bezpośrednie i kompleksowe porównanie różnych platform biosensorycznych pod kątem spójności danych, ich jakości oraz wydajności operacyjnej.Demonstracja wideo czterech protokołów jest kluczowa, ponieważ pomaga nowym użytkownikom z niewielkim doświadczeniem praktycznym nauczyć się, jak przygotowywać eksperymenty na tych urządzeniach. W celu wykonania pomiarów kinetycznych w Biacore T100 należy kliknąć Plik, Otwórz nową metodę i otworzyć plik metody. Następnie należy sprawdzić parametry w metodzie.W sekcji Typy Cykli (Cycle Types) ustaw czas kontaktu na 220 s dla przechwytywania 1 w ścieżce przepływu 2, 110 s dla przechwytywania 2 w ścieżce przepływu 3 oraz 55 s dla przechwytywania 3 w ścieżce przepływu 4. Szybkość przepływu dla wszystkich cykli przechwytywania wynosi 10 µL/min. Wybierz Próbkę 1 (Sample 1) i zaznacz roztwór próbki jako zmienną.Następnie ustaw czas kontaktu na 600 sekund, a czas dysocjacji na 2 700 sekund dla ścieżek przepływu 1, 2, 3, 4. Prędkość przepływu ustawiono na 30 µL/min. Następnie wybierz Regenerację 1, wpisz glicynę w HCl o pH 1,5 w polu roztworu i ustaw czas kontaktu na 20 sekund dla ścieżek przepływu 1, 2, 3, 4.W sekcji Variable Settings wprowadź dwukrotne stężenia miareczkowania od 100 nM do 6,25 nM dla cykli 1-3, od 50 nM do 3,12 nM dla cykli 4-8 oraz od 5 nM do 0,323 nM dla cykli 9-10. W Setup Run wybierz ścieżkę przepływu detekcji 2-1, 3-1, 4-1, a następnie kliknij next. Zaznacz opcję prime before run i ponownie kliknij next.Wybierz Statyw z Próbkami i Odczynnikami 1 i określ lokalizację odczynników. Pipetuj odczynniki do poszczególnych fiolek z próbkami zgodnie z przeznaczeniem, a następnie wsuń statyw do urządzenia. Kliknij Wsuń statyw, aby otworzyć drzwiczki przegrody tacki na próbki, a następnie umieść statyw z próbkami w urządzeniu.Następnie kliknij Start i wprowadź nazwę eksperymentu, pod którą zostanie zapisany pomiar, aby rozpocząć analizę. W przypadku pomiarów kinetycznych w systemie ProteOn XPR36, rozpocznij imobilizację, wybierając opcję Protocols, a następnie Samples. Zdefiniuj EDC/Sulfo-NHS jako aktywator w dołkach H1-H6, białko A/G jako ligand w G1-G6, etanolaminę jako deaktivator w F1-F6, glicynę jako regenerator w E1-E6, PBS-T-EDTA jako próbkę ślepą w D1-D6, próbkę przeciwciała monoklonalnego X jako ligand w C1-C6 oraz ludzkie PCSK9 jako anality w dołkach B1-B6.Wybierz opcję Steps, a następnie dwukrotnie kliknij Immobilization w edytorze protokołu. Kroki obejmują trzy następujące po sobie wstrzyknięcia poziome EDC/Sulfo-NHS, białka A/G oraz jednej molarnej etanolaminy. Każde wstrzyknięcie powinno odbywać się przy szybkości przepływu 30 µL/min i czasie kontaktu wynoszącym 300 s.Następnie kliknij Regenerate. Wstrzyknij trzy 18-sekundowe impulsy glicyny z prędkością 100 µL/min zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym. Następnie podaj dwa 60-sekundowe impulsy PBS-T-EDTA z prędkością 25 µL/min, również w obu kierunkach.Następnie kliknij Ligand i wstrzyknij przeciwciało monoklonalne 1 oraz przeciwciało monoklonalne 2 w kierunku pionowym, przy zastosowaniu szybkości przepływu 25 µL/min i czasie kontaktu wynoszącym 160 s. Po kliknięciu Analyte wstrzyknij pięć stężeń ludzkiego białka PCSK9 w buforze pustym jednocześnie przez sześć kanałów poziomych. Zastosuj szybkość przepływu 40 µL/min przez 600 s czasu asocjacji, a następnie 2 razy po 700 s czasu dysocjacji.Następnie kliknij Regenerate i wstrzyknij dwa 18-sekundowe impulsy glicyny z prędkością 100 µL/min zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym. Następnie przygotuj próbki i odczynniki w jednej płytce 96-dołkowej zgodnie z określonymi pozycjami odczynników. Przenieś płytkę do instrumentu, a następnie kliknij kartę Run, wybierz protokół i kliknij Start.Przedstawiono technikę równoległego wtryskiwania sześcioma igłami podczas rejestracji rzeczywistych danych eksperymentalnych. W celu przeprowadzenia pomiarów kinetycznych w urządzeniu Octet RED384, skonfiguruj metodę eksperymentalną w oprogramowaniu do akwizycji danych, klikając kolejno: Experiment, New Experiment Wizard, New Kinetics Experiment, a następnie Basic Kinetics. Następnie kliknij Modify Plates i zmień wartość 96 Wells na 384 Wells dla Plate 1 oraz Plate 2.Zdefiniuj typy próbek i ich pozycje na płytce zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przejdź do definicji testu (assay definition), aby skonfigurować ustawienia eksperymentalne. Ustawienia eksperymentalne obejmują czas bazowy wynoszący 30 sekund, czas regeneracji 30 sekund, czas równoważenia 18 sekund, ładowanie trwające 200 sekund, czas asocjacji 500 sekund oraz czas dysocjacji 1 800 sekund.Prędkość wstrząsania jest ustawiona na 1 000 RPM. Aby dodać kolejne etapy do listy kroków analizy, najpierw kliknij dany krok, a następnie kliknij studzienki znajdujące się na płytce z próbkami lub płytce z odczynnikami. W pierwszej kolejności wprowadź instrukcje regeneracji równoważącej, aby przygotować sensory przechwytujące anty-ludzkie Fc poprzez trzy cykle 15-sekundowych zanurzeń w glicynie naprzemiennie z 15-sekundowymi zanurzeniami w 1XKB.Następnie wprowadź instrukcje ładowania, aby uchwycić próbki przeciwciał monoklonalnych na sensorach wychwytujących przeciw-Fc ludzkich przez 200 sekund. Następnie wprowadź instrukcje linii bazowej, aby ustalić sygnał interferometrii warstwy biologicznej przez 60 sekund przed etapem asocjacji. Wprowadź etap asocjacji, aby zanurzyć sensory w studzienkach zawierających różne stężenia ludzkiego PCSK9 przez 500-sekundowy okres asocjacji.Przejdź do etapu dysocjacji, aby zanurzyć sensory z wiązanym PCSK9 w nowych studzienkach z 1XKB na 1 800-sekundowy okres dysocjacji. Na koniec, w kroku regeneracji, zanurz sensory z wiązanym przeciwciałem monoklonalnym PCSK9 w studzienkach z glicyną, stosując dwa 18-sekundowe impulsy pomiędzy każdym cyklem wiązania. Przejdź do sekcji Review Experiments, przesuń przez poszczególne kroki, a następnie kliknij zielony przycisk otwierania, aby otworzyć komorę na próbki.Przenieś płytki z próbkami do urządzenia. Przejdź do sekcji Run Experiments, wprowadź 60-sekundowy czas opóźnienia i wstrząśnij płytką z próbkami podczas oczekiwania. Ustaw temperaturę płytki na 25 °C, wprowadź nazwę uruchomionego eksperymentu, a następnie naciśnij Go. Tutaj przedstawiono zbieranie danych w czasie rzeczywistym.W celu przeprowadzenia wielocyklowych pomiarów kinetycznych w systemie IBIS-MX96 należy zainstalować chip sensoryczny w mikrospotterze do przepływu ciągłego. Otwórz oprogramowanie CFM2.0, a następnie kliknij Load Settings, a następnie 96 Amine Couple. Umieść dwie płytki z próbkami i odczynnikami w drukarce CFM.Aby stworzyć macierz przeciwciał, należy kliknąć Run, aby uruchomić drukarkę i dostarczyć EDC/Sulfo-NHS z górnej połowy płytki z odczynnikami do sensora, wykorzystując 48 mikrokanałów, i cyrkulować je nad powierzchnią sensora przez pięć minut. Następnie należy dostarczyć próbki przeciwciał monoklonalnych z górnej połowy płytki źródłowej do sensora i cyrkulować je nad aktywowanymi powierzchniami przez 10 minut. Na koniec należy dostarczyć bufor immobilizacyjny z 50 mililitrowej probówki stożkowej nad powierzchnię przeciwciał przez pięć minut.Umieść wydrukowany chip sensoryczny w urządzeniu. W oprogramowaniu sterującym kliknij Plik, Otwórz pomiar, Istniejący pomiar i wybierz plik metody. Przenieś wydrukowany chip sensoryczny do urządzenia.W menu głównym, w sekcji Full system script, wybierz G-System Prime. Następnie wybierz G-Quench, aby zneutralizować powierzchnie z przeciwciałami monoklonalnymi poprzez wstrzyknięcie 150 µL 1 M etanolaminy. W sekcji Analysis Cycle, w obszarze IBIS Scripts, wybierz A-AP Standard Run.Ustaw 1,0 minuty dla linii bazowej, 10,0 minut dla asocjacji i 90 kroków dla dysocjacji przy prędkości ośmiu µL/s. W ramach cykli wstrzyknij ludzkie PCSK9, stosując jedną koncentrację na raz, po pięciu wstrzyknięciach buforu. Regeneruj powierzchnie przeciwciał monoklonalnych przy użyciu glicyny pomiędzy każdym cyklem wiązania.Przedstawiono nałożone na siebie sensorygramy wiązania dopasowane do modelu kinetyki jeden do jednego dla przeciwciał oddziałujących z ludzkim białkiem PCSK9 w czterech instrumentach. Profile wiązania przeciwciał przy różnych gęstościach są podobne dla wszystkich instrumentów. Mimo że stałe szybkości przypisane do poszczególnych przeciwciał różniły się w zależności od instrumentu, ich kolejność w rankingu pozostała w dużej mierze niezmieniona.Zbadano powtarzalność i spójność powinowactw w szybkościach kinetycznych dla wielu powierzchni przeciwciał. Jak pokazano tutaj, zaobserwowano silną liniowość dla wszystkich stałych szybkości uzyskanych przy użyciu Biacore T100 oraz ProteOn XPR36. Jednak stałe szybkości uzyskane za pomocą Octet RED384 wykazały mniejszą liniowość ze względu na wahania niektórych szybkości dysocjacji.Mogło to być spowodowane odparowywaniem próbek z mikropłytki w czasie. Stałe szybkości uzyskane za pomocą urządzenia IBIS-MX96 były również mniej liniowe ze względu na fluktuacje heterogeniczności powierzchni. Aktywność wiązania przeciwciał w większości systemów była spójna, natomiast w przypadku metody z wiązaniem aminowym w urządzeniu IBIS-MX96 zaobserwowano aktywność około dziesięciokrotnie niższą.Mogło to być spowodowane inaktywacją przeciwciał lub powstaniem takich orientacji przeciwciał, które nie sprzyjały wiązaniu antygenu. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak przygotować eksperymenty na każdej z czterech platform biosensorowych oraz jak dobrać odpowiednią technologię biosensora do własnych celów badawczych. Nasze badanie porównawcze wykazuje, że każda platforma biosensorowa ma swoje własne zalety i wady.Pomimo pewnych nieuniknionych ograniczeń systemowych aparatury, bezpośrednia kolejność stałych szybkości asocjacji i dysocjacji była silnie skorelowana pomiędzy tymi instrumentami. W celu rankingowania kandydatów, przy założeniu, że liczba próbek i ilość materiałów nie stanowią czynników ograniczających, można użyć dowolnego z tych instrumentów, ponieważ pozwalają one na porównywalne rozróżnienie przeciwciał, niezależnie od wybranego urządzenia. Istnieje kompromis pomiędzy niezawodnością danych a przepustowością próbek.Biacore T100, a następnie ProteOn XPR36R, wykazały najlepszą jakość i spójność danych. Z kolei Octet RED384 oraz IBIS-MX96 charakteryzują się wysoką elastycznością i przepustowością, przy jednoczesnych kompromisach w zakresie dokładności i spójności danych. W badaniach wymagających czułej i niezawodnej detekcji najlepiej sprawdzą się urządzenia Biacore T100 lub ProteOn XPR36.W badaniach, w których kluczowym czynnikiem jest szybkość i których dotyczy duża liczba próbek, preferowany jest Octet Red384 lub IBIS-MX96. Przyrządy z ciągłym przepływem cieczy X zapewniają wysoką jakość danych przy rozdzielaniu oddziaływań o wolnych szybkościach dysocjacji. Głównym ograniczeniem przyrządu BRI fluid ex-a-fray jest parowanie próbek w mikropłytce w czasie, co może prowadzić do dryfu w górę, obniżając dokładność danych.

determination-high-affinity-antibody-antigen-binding-kinetics-using

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ten film demonstruje test biosensoryczny konduktometryczny do badania interakcji przeciwciała z docelowym antygenem unieruchomionym na chipie przetwornika. Bioczujnik został zaprojektowany tak, aby zawierał dwufunkcyjne białko chimeryczne – enzym β-laktamazy z funkcjonalnym miejscem katalitycznym połączonym z nanolitem w celu związania się z unieruchomionym antygenem docelowym. Po związaniu katalityczna hydroliza substratu antybiotykowego przez enzym β-laktamazę generuje sygnał elektryczny –...

Test biosensoryczny konduktometryczny na bazie β-laktamazy do interakcji białko-białko

Protokoły tutaj opisują kinetyczne testy interakcji białko-białko za pomocą interferometrii warstwy biologicznej. Syntaza ATP typu F, która bierze udział w metabolizmie energii komórkowej, może być hamowana przez swoją ε podjednostka u bakterii. Dostosowaliśmy interferometrię biowarstw do badania oddziaływań kompleksu katalitycznego z hamującą domeną C-końcową ε.

Interferometria biowarstwowa do pomiaru kinetyki oddziaływań białko-białko i efektów ligandów allosterycznych

W tej pracy opisujemy nową metodę badania interakcji białko-białko za pomocą konduktometrycznego biosensora opartego na technologii hybrydowej β-laktamazy. Metoda ta polega na uwalnianiu protonów w wyniku hydrolizy β-laktamów.

Zastosowanie testu konduktometrycznego biosensora na bazie β-laktamazy do wykrywania oddziaływań biomolekularnych

Tutaj prezentujemy protokół opisujący rozwój i walidację cyfrowego testu ELISA z pojedynczą matrycą molekuł, który umożliwia ultraczułe wykrywanie wszystkich podtypów IFN-α w próbkach ludzkich.

Opracowanie i walidacja ultraczułego, cyfrowego testu immunoenzymatycznego z pojedynczą matrycą cząsteczek dla ludzkiego interferonu-α

Tutaj prezentujemy protokół monitorowania montażu i demontażu toksyny wąglika za pomocą interferometrii biowarstwowej (BLI). Po montażu/demontażu na powierzchni biosensora, duże kompleksy białkowe są uwalniane z powierzchni w celu wizualizacji i identyfikacji składników kompleksów za pomocą odpowiednio mikroskopii elektronowej i spektrometrii mas.

Analiza dynamicznych kompleksów białkowych składanych i uwalnianych z biosensora interferometrii biowarstwowej przy użyciu spektrometrii mas i mikroskopii elektronowej

Opisujemy jednocząsteczkowe podejście do pomiarów powinowactwa antygenu i przeciwciała za pomocą fotometrii masowej (MP). Protokół oparty na MP jest szybki, dokładny, wykorzystuje bardzo małą ilość materiału i nie wymaga modyfikacji białek.

Szybkie oznaczanie powinowactwa przeciwciało-antygen za pomocą fotometrii masowej

To badanie miało na celu przedstawienie strategii identyfikacji interakcji lek-peptyd. Strategia obejmuje biopanowanie krótkich peptydów rozpoznających leki w oparciu o bioczujnik mikrowagi kwarcowej (QCM), a następnie analizę bioinformatyczną w celu ilościowej oceny uzyskanych informacji w celu rozpoznania leku i adnotacji miejsc wiązania leku na białkach.

Oparta na biosensorach strategia wysokoprzepustowej analizy biopanningowej i bioinformatycznej do globalnej walidacji interakcji lek-białko

Biosensing (FEB) to bezznacznikowa technika wykrywania interakcji biomolekularnych. Mierzy prąd elektryczny przepływający przez bioczujnik grafenowy, do którego unieruchomione są cele wiążące. Do oceny interakcji biomolekularnych między Hsp90 i Cdc37 wykorzystano technologię FEB i wykryto silną interakcję między tymi dwoma białkami.

Badanie interakcji biomolekularnych między molekularnym chaperonem Hsp90 a jego klientem, kinazą białkową Cdc37, przy użyciu technologii biodetekcji z efektem polowym

Ten artykuł opisuje protokół badania interakcji DNA-białko za pomocą systemu interferometrii biowarstwowej (BLI) opartego na streptawidynie. Przedstawiono w nim podstawowe kroki i rozważania dotyczące wykorzystania podstawowej lub zaawansowanej kinetyki wiązania w celu określenia powinowactwa wiązania równowagi (KD) oddziaływania.

Analiza interakcji DNA-białko za pomocą interferometrii biowarstwowej opartej na streptawidynie

Termoforeza w mikroskali (MST) to czuła technologia do charakteryzowania interakcji aptamer-cel. Niniejszy manuskrypt opisuje protokół MST do charakteryzowania oddziaływań aptamer-małe cząsteczki.

Mapowanie miejsca wiązania aptameru na ATP za pomocą termoforezy w mikroskali

Poznaj metody oznaczania kinetyki wiązania przeciwciało-antygen na czterech platformach biosensorowych. Porównanie Biacore T100, ProteOn XPR36, Octet RED384 i IBIS-MX96 wspiera wybór optymalnej technologii do badań afinitetu.

Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Przeglądaj więcej filmów