Oznaczanie kinetyki wiązania przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie przy użyciu czterech platform biosensorowych

Celem tego badania biosensorów jest porównanie zdolności czterech rutynowo używanych platform biosensorów do dostarczania wysokiej jakości danych kinetycznych oraz zapewnienie wglądu w wyzwania techniczne i rozważania w projektach eksperymentalnych do oceny interakcji przeciwciało-antygen o wysokim powinowactwie. Badanie to odpowiada na kluczowe pytania w dziedzinie odkrywania leków w zakresie wyboru platform biosensorów i formatów testów, które pozwalają na uzyskanie najbardziej wiarygodnych wyników podczas oceny kandydatów na przeciwciała terapeutyczne. Główną zaletą tego badania jest to, że zapewnia ono bezpośrednie i kompleksowe porównanie różnych platform biosensorów pod względem spójności danych, jakości i wydajności operacyjnej.

Demonstracja wideo czterech protokołów ma kluczowe znaczenie, ponieważ pomaga nowym użytkownikom z niewielkim doświadczeniem praktycznym nauczyć się, jak przeprowadzać eksperymenty na tych instrumentach. W przypadku pomiarów kinetycznych w Biacore T100 kliknij Plik, Otwórz nową metodę i otwórz plik metody. Przejrzyj parametry w metodzie.

W polu Typy cykli ustaw czas kontaktu na 220 sekund dla przechwytywania 1 na ścieżce przepływu 2, 110 sekund dla przechwytywania 2 na ścieżce przepływu 3 i 55 sekund dla przechwytywania 3 na ścieżce przepływu 4. Natężenie przepływu wynosi 10 mikrolitrów na minutę dla wszystkich cykli wychwytywania. Wybierz Próbka 1 i sprawdź przykładowe rozwiązanie jako zmienną.

Następnie ustaw czas kontaktu na 600 sekund, a czas dysocjacji na 2, 700 sekund na ścieżce przepływu 1, 2, 3, 4. Natężenie przepływu jest ustawione na 30 mikrolitrów na minutę. Następnie wybierz Regeneracja 1, wprowadź HCl glicyny pH 1,5 w polu roztworu i ustaw czas kontaktu na 20 sekund na ścieżce przepływu 1, 2, 3, 4.

W polu Zmienne ustawienia wprowadź dwukrotne stężenia miareczkowania od 100 nanomolowych do 6,25 nanomolowych dla cyklu 1-3, od 50 nanomolowych do 3,12 nanomolowych dla cyklu 4-8 i od 5 nanomolowych do 0,323 nanomolowych dla cyklu 9-10. W polu Setup Run (Uruchamianie) wybierz ścieżkę przepływu wykrywania 2-1, 3-1, 4-1, a następnie kliknij przycisk Next (Dalej). Sprawdź prime przed uruchomieniem, a następnie ponownie kliknij przycisk Dalej.

Wybierz opcję Stojak na próbki i odczynniki 1 i zdefiniuj lokalizację odczynników. Odpowiednio odpipetować odczynniki do poszczególnych fiolek z próbkami i włożyć stojak do urządzenia. Kliknij przycisk Eject Rack (Wysuń stojak), aby otworzyć drzwiczki komory tacy na próbki, a następnie włóż stojak na próbki do urządzenia.

Następnie kliknij przycisk Start i wprowadź nazwę eksperymentu, która ma zostać zapisana, aby rozpocząć przebieg. W przypadku pomiarów kinetycznych w urządzeniu ProteOn XPR36 rozpocznij unieruchomienie, wybierając opcję Protocols (Protokoły), a następnie Sample (Próbki). Zdefiniuj EDC / Sulfo-NHS jako aktywator w studzienkach H1-H6, białko A / G jako ligand w G1-G6, etanoloaminę jako dezaktywator w F1-F6, glicynę jako regenerator w E1-E6, PBS-T-EDTA jako ślepą próbę w D1-D6, przeciwciało monoklonalne X jako ligand w C1-C6 i ludzki PCSK9 jako analit w studzienkach B1-B6.

Wybierz opcję Kroki, a następnie kliknij dwukrotnie pozycję Immobilizacja w edytorze protokołów. Etapy obejmują trzy kolejne poziome wstrzyknięcia EDC/Sulfo-NHS, białka A/G i jednej molowej etanoloaminy. Każde wstrzyknięcie powinno mieć natężenie przepływu 30 mikrolitrów na minutę i czas kontaktu 300 sekund.

Następnie kliknij przycisk Regeneruj. Wstrzyknij trzy 18-sekundowe impulsy glicyny w tempie 100 mikrolitrów na minutę zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym. Następnie wykonaj dwa 60-sekundowe impulsy PBS-T-EDTA z prędkością 25 mikrolitrów na minutę, również w obu kierunkach.

Następnie kliknij Ligand i wstrzyknij przeciwciało monoklonalne 1, przeciwciało monoklonalne 2 w kierunku pionowym, wykorzystując natężenie przepływu 25 mikrolitrów na minutę i czas kontaktu 160 sekund. Po kliknięciu Analitu wstrzyknij pięć stężeń ludzkiego PCSK9 do ślepego buforu przez sześć kanałów poziomych jednocześnie. Użyj 40 mikrolitrów na minutę przez 600 sekund czasu asocjacji, a następnie 2 700 sekund czasu dysocjacji.

Następnie kliknij przycisk Regeneruj i wstrzyknij dwa 18-sekundowe impulsy glicyny o stężeniu 100 mikrolitrów na minutę zarówno w kierunku poziomym, jak i pionowym. Następnie przygotuj próbki i odczynniki na jednej 96-dołkowej płytce zgodnie ze zdefiniowanymi pozycjami odczynników. Przenieś płytkę do urządzenia, a następnie kliknij kartę Uruchom, wybierz protokół i kliknij przycisk Start.

Demonstrowano równoległe wstrzykiwanie sześcioigłowe w zapisie danych eksperymentalnych na żywo. W przypadku pomiarów kinetycznych w Octet RED384 skonfiguruj metodę eksperymentalną, klikając najpierw Eksperyment, a następnie Kreator nowego eksperymentu, Nowy eksperyment kinetyczny, a następnie Podstawowa kinetyka w oprogramowaniu do akwizycji danych. Następnie kliknij przycisk Modyfikuj płyty i zmień wartość 96 dołków na 384 dołki zarówno w Płycie 1, jak i Płycie 2.

Zdefiniuj typy próbek i pozycje na płycie zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przejdź do definicji testu, aby zdefiniować konfigurację eksperymentalną. Układ eksperymentalny definiuje się jako czas bazowy wynoszący 30 sekund, czas regeneracji wynoszący 30 sekund, czas równowagi wynoszący 18 sekund, obciążenie o czasie 200 sekund, czas asocjacji wynoszący 500 sekund i czas dysocjacji wynoszący 1 800 sekund.

Prędkość wytrząsania jest ustawiona na 1 000 obr./min. Aby dodać kroki do listy kroków testu, najpierw kliknij krok, a następnie kliknij studzienki znajdujące się w próbce lub płytce odczynnika. Po pierwsze, wprowadź instrukcje regeneracji równowagi, aby wstępnie przygotować anty-ludzkie czujniki wychwytywania Fc przez trzy cykle 15-sekundowych zanurzeń w glicynie na przemian z 15-sekundowymi spadkami w 1XKB.

Następnie wprowadź instrukcje ładowania, aby przechwycić próbki przeciwciał monoklonalnych na anty-ludzkich czujnikach wychwytywania Fc przez 200 sekund. Następnie wprowadź instrukcje linii bazowej, aby ustalić sygnał interferometrii warstwy biologicznej na 60 sekund przed etapem asocjacji. Wprowadź krok asocjacji, aby zanurzyć czujniki w studzienkach zawierających różne stężenia ludzkiego PCSK9 na 500-sekundowy okres asocjacji.

Wejdź w etap dysocjacji, aby zanurzyć czujniki związane z PCSK9 w nowych studzienkach 1XKB na 1 800-sekundowy okres dysocjacji. Na koniec, na etapie regeneracji, zanurz czujniki związane z przeciwciałem monoklonalnym PCSK9 w studzienkach glicyny z dwoma 18-sekundowymi impulsami między każdym cyklem wiązania. Przejdź do sekcji Przeglądanie eksperymentów, przesuń palcem po kolejnych krokach, a następnie kliknij zielony przycisk otwierania, aby otworzyć przegródkę na próbki.

Przenieś płytki próbek do urządzenia. Przejdź do pozycji Uruchom eksperymenty, wprowadź 60-sekundowy czas opóźnienia i potrząśnij płytką próbki podczas oczekiwania. Ustaw temperaturę płytki na 25 stopni Celsjusza, wprowadź nazwę przebiegu eksperymentu, a następnie naciśnij Go.Live pokazano tutaj zbieranie danych.

W przypadku wielocyklowych pomiarów kinetycznych w IBIS-MX96 zainstaluj chip czujnika w mikroskopie o ciągłym przepływie. Otwórz oprogramowanie CFM2.0, a następnie kliknij Ustawienia ładowania i 96 Amine Couple. Umieść dwie płytki z próbką i odczynnikiem w drukarce CFM.

Aby utworzyć matrycę przeciwciał, naciśnij Uruchom, aby uruchomić drukarkę i dostarczyć EDC/Sulfo-NHS w górnej połowie płytki odczynnika do czujnika za pomocą 48 mikrokanałów i cyklicznie przesuwać je po powierzchni czujnika przez pięć minut. Dostarczyć próbki przeciwciał monoklonalnych w górnej połowie płytki źródłowej do czujnika i przechodzić je cyklicznie po aktywowanych powierzchniach przez 10 minut. Następnie dostarczyć bufor immobilizacyjny z 50-mililitrowej stożkowej rurki na powierzchnię przeciwciała przez pięć minut.

Zadokuj wydrukowany chip czujnika w urządzeniu. W oprogramowaniu sterującym kliknij Plik, Otwórz pomiar, Istniejący pomiar i wybierz plik metody. Przenieś wydrukowany chip czujnika do urządzenia.

W menu ogólnym wybierz G-System Prime w obszarze Pełny skrypt systemowy. Następnie wybierz G-Quench, aby dezaktywować powierzchnie przeciwciał monoklonalnych poprzez wstrzyknięcie 150 mikrolitrów jednej molowej etanoloaminy. W polu Analysis Cycle (Cykl analizy) wybierz opcję A-AP Standard Run (Przebieg standardowy) w obszarze IBIS Scripts (Skrypty IBIS).

Ustaw 1,0 minuty dla linii bazowej, 10,0 minut dla asocjacji i 90 kroków dla dysocjacji z prędkością ośmiu mikrolitrów na sekundę. Wewnątrz cykli wstrzykuje się ludzki PCSK9 po jednym stężeniu na raz, po pięciu wstrzyknięciach buforu. Regeneruj powierzchnie przeciwciał monoklonalnych glicyną między każdym cyklem wiązania.

Zarejestrowane sensorgramy wiązania w nakładkach dopasowania modelu kinetycznego jeden do jednego przedstawiono dla przeciwciał oddziałujących z ludzkim PCSK9 w czterech instrumentach. Profile wiązania przeciwciał o różnej gęstości są podobne we wszystkich instrumentach. Mimo że stałe szybkości związane z każdym z przeciwciał różniły się w zależności od instrumentu, ich kolejność rang pozostała w większości taka sama.

Zbadano odtwarzalność i spójność powinowactwa we wskaźnikach kinetycznych na wielu powierzchniach przeciwciał. Jak pokazano tutaj, zaobserwowano silną liniowość dla wszystkich stałych szybkości wygenerowanych za pomocą Biacore T100 i ProteOn XPR36. Jednak stałe szybkości generowane przez Octet RED384 były mniej liniowe ze względu na wahania niektórych współczynników wyłączenia.

Było to potencjalnie spowodowane parowaniem próbki w czasie w mikropłytce. Stałe szybkości generowane przez IBIS-MX96 były również mniej liniowe ze względu na wahania niejednorodności powierzchni. Aktywność wiązania przeciwciał związana z większością układów była spójna, podczas gdy około dziesięciokrotnie niższą aktywność zaobserwowano w przypadku metody sprzężonej aminami z IBIS-MX96.

Było to prawdopodobnie spowodowane inaktywacją przeciwciał lub generowaniem orientacji przeciwciał, które nie przewodziły wiązaniu antygenu. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak skonfigurować eksperymenty na każdej z czterech platform biosensorów oraz jak wybrać odpowiednią technologię biosensorów do własnych celów badawczych. Nasze bezpośrednie badanie porównawcze pokazuje, że każda platforma biosensorów ma swoje zalety i wady.

Pomimo pewnych nieodłącznych ograniczeń systematycznych w oprzyrządowaniu, bezpośrednia kolejność zarówno stałych asocjacji, jak i szybkości dysocjacji była silnie skorelowana między tymi instrumentami. Do celów klasyfikacji kandydatów, zakładając, że liczba próbek i ilość materiałów nie są czynnikami ograniczającymi, można użyć dowolnego z tych przyrządów, ponieważ mogą one porównywać przeciwciała, niezależnie od instrumentu przywozowego. Istnieje kompromis między wiarygodnością danych a przepływnością próbki.

Biacore T100, a następnie ProteOn XPR36R, wykazały się najlepszą jakością i spójnością danych. Natomiast Octet RED384 i IBIS-MX96 wykazują wysoką elastyczność i przepustowość przy jednoczesnym kompromisie w zakresie dokładności i spójności danych. Do badań, które wymagają czułego i niezawodnego wykrywania, najlepiej nadaje się Biacore T100 lub ProteOn XPR36.

W przypadku badań, w których szybkość jest czynnikiem krytycznym i w grę wchodzi duża liczba próbek, preferowany jest Octet Red384 lub IBIS-MX96. Instrumenty z płynem o ciągłym przepływie X dostarczają wysokiej jakości danych do rozwiązywania interakcji z powolnym tempem dysocjacji. Głównym ograniczeniem dla instrumentu BRI do płynów ex-a-fray jest parowanie próbki w czasie w mikropłytce, co może skutkować dryftem w górę, co pogarsza dokładność danych.