Name: Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Poznaj technikę ChIP do badania wiązania czynników transkrypcyjnych SMAD2 i STAT3 z promotorem c-KIT w liniach komórkowych raka wątroby człowieka. Ta metoda pozwala analizować interakcje białko-DNA in vivo.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez University of Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fundusze startowe, B.B.).

1. Przygotowanie roztworów
<ol>
	<li>Do każdego eksperymentu przygotuj świeże roztwory poniższych.
	<ol>
		<li>Do roztworu utrwalającego przygotuj 37% formaldehydu i przechowuj go w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć go w 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do końcowego stężenia 1,42%. 
		UWAGA: Formaldehyd jest klasyfikowany jako drażniący,, mutagenny, teratogenny i rakotwórczy. Nie spożywać. Nie wdychać gazu/oparów/pary/rozpylonej cieczy. W przypadku niewystarczającej wentylacji należy nosić odpowiedni sprzęt do oddychania. Unikać kontaktu ze skórą i oczami. Przechowywać z dala od niezgodnych substancji, takich jak środki utleniające, redukujące, kwasy, zasady i wilgoć.</li>
		<li>Aby uzyskać roztwór stop-fix glicyny, należy przygotować 0,125 M glicyny w 1 roztworze PBS i przechowywać w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Do roztworu do skrobania komórek przygotuj 1x roztwór PBS w dH2O i przechowuj go na lodzie. Bezpośrednio przed użyciem dodać inhibitor proteinazy fluorek fenylometylosulfonylu (PMSF) do końcowego stężenia 0,5 mM. 
		UWAGA: PMSF jest klasyfikowany jako i toksyczny; Nosić odzież ochronną i używać jej w przewiewnym miejscu.</li>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem buforu do lizy komórek (20 mM Tris-HCl; pH 8,0, 85 mM KCl i 0,5% NP40), dodać 1X Koktajl Inhibitora Proteazy (; 100X roztwór podstawowy w dimetylosulfotlenku (DMSO): 104 mM chlorowodorek 4-(2-aminoetylo)benzenosulfonylu (AEBSF), 80 μM aprotynina, 4 mM bestatyna, 1,4 mM E-64, 2 mM leupeptyna i 1,5 mM pepstatyna A) i 0,5 mM PMSF.</li>
		<li>Bezpośrednio przed użyciem buforu do lizy jąder (50 mM Tris-Cl; pH 8,0, 10 mM kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) i 1% SDS) dodać 1X i 0,5 mM PMSF.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Utrwalanie i ścinanie komórek
<ol>
	<li>Hoduj komórki do 70-80% zbieżności na 10 cm płytkach do hodowli tkankowych. Stymuluj komórki zgodnie z celami eksperymentalnymi.</li>
	<li>Usunąć pożywkę do hodowli tkankowych, dodać 5 ml roztworu utrwalającego i inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej.</li>
	<li>Usuń roztwór utrwalający i przemyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego 1x PBS.</li>
	<li>Usuń 1x PBS, dodaj 5 ml roztworu glicyny stop-fix i inkubuj komórki przez 5 minut w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej.</li>
	<li>Usuń roztwór glicyny stop-fix i umyj komórki dwukrotnie 10 ml lodowatego 1x PBS.</li>
	<li>Usuń 1x PBS, dodaj 2 ml roztworu do skrobania komórek i zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Przenieś zebrane komórki do stożkowej rurki na lodzie.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 600 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w 1 ml buforu do lizy komórek 1X i inkubować na lodzie przez 30 minut. Alternatywnie, zamrozić granulkę w ciekłym azocie i przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
	<li>Gdy osad zostanie ponownie zawieszony w buforze do lizy komórek, przenieś zawiesinę komórkową do lodowatego homogenizatora z dounce i zanurzaj przez 10 uderzeń za pomocą tłuczka typu B do rozbijania komórek.</li>
	<li>Przenieść zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej i odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 2 400 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Odrzucić supernatant, ponownie zawiesić osad w 350 μl buforu do wytrawiania jąder i inkubować próbki przez 5 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać nukleazę mikrokokową (1 U/μL) i wymieszać przez wirowanie. Inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 5–20 minut; Mieszać próbki co 2 minuty metodą inwersji. 
	UWAGA: Czas i stężenie enzymu różnią się w zależności od linii komórkowych i mogą wymagać optymalizacji w przypadku nieoptymalnego ścinania enzymatycznego.</li>
	<li>Alternatywnie, osiągnij ścinanie chromatyny przez sonikację przy użyciu dostępnych na rynku sonikatorów. 
	UWAGA: Warunki sonikacji będą wymagały optymalizacji. Poniżej przedstawiono przykładowy protokół optymalizacji wykorzystujący objętość próbki 300 μl i moc przetwarzania próbki 25%.
	<ol>
		<li>Po kroku 2.10 wyrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad jądrowy w 1,0 ml komercyjnego buforu ścinającego.</li>
		<li>Porcję 300 μl zawieszonego osadu jądrowego rozmieścić w trzech probówkach do mikrowirówek o pojemności 1,7 ml. Umieść je na lodzie.</li>
		<li>Ścinanie 3 porcji ustalonej chromatyny przy 25% mocy przy użyciu 3 różnych warunków, aby określić optymalne warunki sonikacji: 
		5 impulsów po 20 s każdy, z 30-sekundowym odpoczynkiem na lodzie pomiędzy każdym impulsem. 
		10 impulsów po 20 s każdy, z 30-sekundowym odpoczynkiem na lodzie pomiędzy każdym impulsem. 
		20 impulsów po 20 s każdy, z 30-sekundowym odpoczynkiem na lodzie pomiędzy każdym impulsem.</li>
		<li>Przejdź do kroku 2.15, jak opisano poniżej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po inkubacji z nukleazą mikrokokową dodać 7 μl lodowatego 0,5 M EDTA, aby zatrzymać reakcję.</li>
	<li>Odwirować próbki ze ściętym DNA przez 10 minut w temperaturze 16 200 x g i temperaturze 4 °C.</li>
	<li>Przenieść ścięty supernatant zawierający DNA do świeżej probówki do mikrowirówki. Podaniec 50 μl do oddzielnej probówki mikrowirówkowej w celu potwierdzenia pomyślnego ścinania DNA (sekcja 3). Pozostałą objętość należy natychmiast zużyć do immunoprecypitacji (punkt 4) lub przechowywać w temperaturze -80 °C.</li>
</ol>
3. Potwierdzenie skuteczności ścinania
<ol>
	<li>Dodać 150 μl wolnego od nukleazdH2O i 10 μl 5 M NaCl do 50 μl podwielokrotności ściętej chromatyny z kroku 2.16.</li>
	<li>Inkubować próbki w temperaturze 65 °C przez 4 godziny w celu odwrócenia powwiązań krzyżowych.</li>
	<li>Dodać 2 μl RNazy A (10 μg/μl) i inkubować próbki w temperaturze 37 °C przez 15 minut.</li>
	<li>Dodać 10 μl proteinazy K (0,5 μg/μl) i inkubować próbki w temperaturze 42 °C przez 90 minut.</li>
	<li>W celu oczyszczenia DNA należy przeprowadzić ekstrakcję fenolem/chloroformem12.
	<ol>
		<li>Dodać wodę wolną od nukleaz do końcowej objętości 200 μl. Dodać 200 μl fenolu:chloroformu:alkoholu izoamylowego (25:24:1) do próbki i wirować przez 20 s.</li>
		<li>Wirować w temperaturze pokojowej przez 5 minut przy 16 000 x g. Ostrożnie usunąć górną fazę wodną i przenieść ją do świeżej probówki. Należy pamiętać, aby nie przenosić fenolu podczas pipetowania.</li>
		<li>Dodać 0,1 objętości 3 M octanu sodu (NH4OAc) o pH 5,2 i wymieszać, kilkakrotnie przesuwając probówkę palcem. Dodaj 2,5 objętości lodowatego 100% etanolu i mieszaj wirując przez 5 sekund. Inkubować próbkę O/N w temperaturze -20 °C lub przez co najmniej 1 godzinę w temperaturze -80 °C.</li>
		<li>Odwirować próbkę przez 30 minut w temperaturze 4 °C i 16 000 x g w celu osadzenia cDNA.</li>
		<li>Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając osadu. Dodaj 1 ml RT, 70% etanolu i kilkakrotnie odwróć probówkę.</li>
		<li>Odwirować próbkę przez 2 minuty w temperaturze 4 °C i 16 000 x g. Ostrożnie usunąć sklarowany osad.</li>
		<li>Suszyć osad przez 5-10 minut w temperaturze pokojowej. Zawiesić osad w 30 μL dH2O.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Użyć 5 i 10 μl podwielokrotności oczyszczonego DNA do elektroforezy żelowej z 1% żelem agarozowym TAE. 
	UWAGA: Udane ścinanie chromatyny skutkuje wzorem DNA o długości 200-1,500 pz. Jeśli ścinanie się nie powiedzie, określ optymalne warunki ścinania dla określonych komórek, modyfikując czas inkubacji etapu ścinania (krok 2.12) na 5, 10 i 15 minut.</li>
	<li>Pozostałą próbkę należy wykorzystać do analizy stężenia DNA w próbce. Obliczyć wstecznie stężenie DNA w ściętej próbce chromatyny (krok 2.16); stosować te same ilości DNA dla każdej grupy poddanej działaniu substancji w celu immunoprecypitacji (punkt 4).</li>
</ol>
4. Immunoprecypitacja
<ol>
	<li>Połącz 10-25 μg ściętej, usieciowanej chromatyny (krok 2.16) z 25 μl kulek magnetycznych białka G klasy ChIP, 10 μl buforu rozcieńczającego immunoprecypitację (roztwór podstawowy: 0,01% SDS, 1,1% Triton X-100, 16,7 mM Tris-HCl; pH 8,0, 1,2 mM EDTA i 167 mM NaCl) i 1 μl.</li>
	<li>Po 4 godzinach inkubacji dodać 1-10 μg przeciwciała (stężenie przeciwciała będzie się różnić w zależności od powinowactwa przeciwciała; początkowo należy je stosować zgodnie z zaleceniami producenta i w razie potrzeby zoptymalizować eksperymentalnie) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml i dodaćdH2Odo końcowej objętości 100 μL. 
	UWAGA: Zamiast opisanej powyżej metody immunoprecypitacji bezpośredniej, można zastosować metodę immunoprecypitacji pośredniej, najpierw łącząc chromatynę z przeciwciałami, a następnie dodając kulki magnetyczne białka G.</li>
	<li>Próbki inkubować na rotatorze typu end-to-end przez 4–12 godzin w temperaturze 4 °C.</li>
</ol>
5. Elucja
<ol>
	<li>Umieść rurki na stojaku magnetycznym. Gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku probówki, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.</li>
	<li>Przemyć kulki trzykrotnie 800 μl buforu do płukania 1 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA pH 8, 20 mM Tris-HCl; pH 8 i 150 mM NaCl); wymieszać, kilkakrotnie odwracając probówkę. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij i wyrzuć bufor do mycia, gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku probówki.</li>
	<li>Umyj kulki raz 800 μl buforu do płukania 2 (0,1% SDS, 1% Triton X-100, 2 mM EDTA; pH 8, 20 mM Tris-HCl pH 8 i 500 mM NaCl); wymieszaj, kilkakrotnie odwracając probówkę. Umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij i wyrzuć bufor do mycia, gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku probówki.</li>
	<li>Zawiesić kulki w 50 μl buforu elucyjnego (1% SDS i 100 mMNaHCO3) i inkubować próbki na rotatorze typu end-to-end przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Umieść probówki na stojaku magnetycznym, a gdy kulki magnetyczne zbiorą się z boku probówki, przenieś supernatant do świeżej probówki.</li>
	<li>Dodaj 6 μl 5 M NaCl, aby odwrócić sieciowanie, i 2 μl proteinazy K (0,5 μg/μL). Po wymieszaniu próbek inkubować próbki przez 2 godziny w temperaturze 65 °C.</li>
	<li>W celu oczyszczenia DNA należy przeprowadzić ekstrakcję fenolem/chloroformem12 (krok 3.5), a następnie ponownie zawiesić osad w 30 μL dH2O. 
	UWAGA: Próbki mogą być bezpośrednio analizowane pod kątem miejsc wiązania białek (sekcja 5) lub mogą być przechowywane w temperaturze -20 °C.</li>
</ol>
6. Analiza miejsca wiązania
<ol>
	<li>Wykonaj analizę określonych miejsc wiązania w znanej sekwencji kwasu nukleinowego za pomocą PCR lub qRT-PCR. W przypadku projektowania starterów postępuj zgodnie z konwencjonalnymi protokołami PCR lub qRT-PCR. Zaprojektuj startery tak, aby zsyntetyzować amplikon o masie 150-400 pz, który mostkuje miejsce wiązania białka (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Ustaw PCR przy użyciu czterech różnych matryc DNA, aby zapewnić swoistość: i) DNA z ChIP immunoprecypitowanego badanym przeciwciałem, ii) DNA z ChIP immunoprecypitowanego niespecyficznym przeciwciałem IgG, iii) wejściowego DNA oraz iv) H2O jako negatywnej kontroli dla PCR w celu wykluczenia zanieczyszczenia. W przypadku stymulacji szlaku należy wybrać piątą matrycę, używając innego zestawu starterów specyficznych dla znanego miejsca wiązania białka immunoprecypitowanego. 
	UWAGA: W przypadku analizy promotora liganda c-KIT należy użyć konwencjonalnego PCR, aby wykazać wiązanie SMAD indukowane przez TGF-β w SBE w regionie promotora liganda c-KIT. Jako kontrolę pozytywną należy przeprowadzić PCR na inhibitorze aktywatora plazminogenu-1 (PAI-1) jako znanym celu wiązania SMAD indukowanego przez TGF-β.</li>
</ol>

<ol><li>Brenowitz, M., Senear, D. F., Shea, M. A., Ackers, G. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0076687986300119">Quantitative DNase footprint titration: a method for studying protein-DNA interactions.</a> Methods Enzymol. 130, 132-181 (1986).</li>
<li>Garner, M. M., Revzin, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gel+electrophoresis+method+for+quantifying+the+binding+of+proteins+to+specific+DNA+regions%3A+application+to+components+of+the+Escherichia+coli+lactose+operon+regulatory+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">A gel electrophoresis method for quantifying the binding of proteins to specific DNA regions: application to components of the Escherichia coli lactose operon regulatory system.</a> Nucleic Acids Res. 9 (13), 3047-3060 (1981).</li>
<li>Gilmour, D. S., Lis, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+protein-DNA+interactions+in+vivo%3A+distribution+of+RNA+polymerase+on+specific+bacterial+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Detecting protein-DNA interactions in vivo: distribution of RNA polymerase on specific bacterial genes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 81 (14), 4275-4279 (1984).</li>
<li>Gilmour, D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC366919/">Lis J.T. In vivo interactions of RNA polymerase II with genes of Drosophila melanogaster.</a> Mol Cell Biol. 5 (8), 2009-2018 (1985).</li>
<li>Mundade, R., Ozer, H. G., Wei, H., Prabhu, L., Lu, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+ChIP-seq+in+the+discovery+of+transcription+factor+binding+sites%2C+differential+gene+regulation+mechanism%2C+epigenetic+marks+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of ChIP-seq in the discovery of transcription factor binding sites, differential gene regulation mechanism, epigenetic marks and beyond.</a> Cell Cycle. 13 (18), 2847-2852 (2014).</li>
<li>Mukhopadhyay, A., Deplancke, B., Walhout, A. J., Tissenbaum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+coupled+to+detection+by+quantitative+real-time+PCR+to+study+transcription+factor+binding+to+DNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Chromatin immunoprecipitation (ChIP) coupled to detection by quantitative real-time PCR to study transcription factor binding to DNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nat Protoc. 3 (4), 698-709 (2008).</li>
<li>Weinmann, A. S., Bartley, S. M., Zhang, T., Zhang, M. Q., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+chromatin+immunoprecipitation+to+clone+novel+E2F+target+promoters%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Use of chromatin immunoprecipitation to clone novel E2F target promoters.</a> Mol Cell Biol. 21 (20), 6820-6832 (2001).</li>
<li>Weinmann, A. S., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+unknown+target+genes+of+human+transcription+factors+using+chromatin+immunoprecipitation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Identification of unknown target genes of human transcription factors using chromatin immunoprecipitation.</a> Methods. 26 (1), 37-47 (2002).</li>
<li>Weinmann, A. S., Yan, P. S., Oberley, M. J., Huang, T. H., Farnham, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+human+transcription+factor+targets+by+coupling+chromatin+immunoprecipitation+and+CpG+island+microarray+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22GenesDev%22%5BJournal%5D)">Isolating human transcription factor targets by coupling chromatin immunoprecipitation and CpG island microarray analysis.</a> GenesDev. 16 (2), 235-244 (2002).</li>
<li>Massague, J., Seoane, J., Wotton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Smad+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Smad transcription factors.</a> Genes Dev. 19 (23), 2783-2810 (2005).</li>
<li>Rojas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Positive+TGF-beta%2Fc-KIT+Feedback+Loop+Drives+Tumor+Progression+in+Advanced+Primary+Liver+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Neoplasia%22%5BJournal%5D)">A Positive TGF-beta/c-KIT Feedback Loop Drives Tumor Progression in Advanced Primary Liver Cancer.</a> Neoplasia. 18 (6), 371-386 (2016).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+nucleic+acids+by+extraction+with+phenol%3Achloroform%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of nucleic acids by extraction with phenol:chloroform.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Dennler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+binding+of+Smad3+and+Smad4+to+critical+TGF+beta-inducible+elements+in+the+promoter+of+human+plasminogen+activator+inhibitor-type+1+gene%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Direct binding of Smad3 and Smad4 to critical TGF beta-inducible elements in the promoter of human plasminogen activator inhibitor-type 1 gene.</a> EMBO J. 17 (11), 3091-3100 (1998).</li>
<li>Shi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+a+Smad+MH1+domain+bound+to+DNA%3A+insights+on+DNA+binding+in+TGF-beta+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of a Smad MH1 domain bound to DNA: insights on DNA binding in TGF-beta signaling.</a> Cell. 94 (5), 585-594 (1998).</li>
<li>Seidel, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spacing+of+palindromic+half+sites+as+a+determinant+of+selective+STAT+%28signal+transducers+and+activators+of+transcription%29+DNA+binding+and+transcriptional+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Spacing of palindromic half sites as a determinant of selective STAT (signal transducers and activators of transcription) DNA binding and transcriptional activity.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 92 (7), 3041-3045 (1995).</li>
<li>Nelson, J. D., Denisenko, O., Bomsztyk, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+the+fast+chromatin+immunoprecipitation+%28ChIP%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for the fast chromatin immunoprecipitation (ChIP) method.</a> Nat Protoc. 1 (1), 179-185 (2006).</li>
<li>Tian, B., Yang, J., Brasier, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-step+cross-linking+for+analysis+of+protein-chromatin+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Two-step cross-linking for analysis of protein-chromatin interactions.</a> Methods Mol Biol. 809, 105-120 (2012).</li>
<li>O'Neill, L. P., Turner, B. M. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1046202303000902">Immunoprecipitation of native chromatin: NChIP.</a> Methods. 31 (1), 76-82 (2003).</li>
<li>Horz, W., Altenburger, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequence+specific+cleavage+of+DNA+by+micrococcal+nuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Sequence specific cleavage of DNA by micrococcal nuclease.</a> Nucleic Acids Res. 9 (12), 2643-2658 (1981).</li>
<li>Chung, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+micrococcal+nuclease+digestion+on+nucleosome+positioning+data%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of micrococcal nuclease digestion on nucleosome positioning data.</a> PLoS One. 5 (12), 15754(2010).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W tym raporcie pokazujemy indukowane przez TGF-a1 wiązanie SMAD2 z SBE w promotorze liganda c-KIT oraz indukowane przez TGF-a1 wiązanie STAT3 z jego sekwencją rozpoznawczą w genie liganda TGF-a1. Wykazujemy indukowane cytokinami wiązanie obu czynników transkrypcyjnych za pomocą immunoprecypitacji chromatyny.
Immunoprecypitacja chromatyny jest potężnym narzędziem do wykazania bezpośredniego wiązania białka będącego przedmiotem zainteresowania z DNA, do scharakteryzowania bodźców, które indukują...

W jądrze eukariontów DNA oddziałuje z białkami histonowymi i niehistonowymi i jest kondensowane do chromatyny. W kontekście fizjologicznym, patofizjologicznym i biologicznym komórki funkcje komórkowe są przestrzennie i tymczasowo kontrolowane przez skoordynowaną ekspresję genów chromatyny. Interakcje DNA-białko odgrywają zasadniczą rolę w regulacji procesów komórkowych, takich jak replikacja, rekombinacja i naprawa DNA, a także ekspresja białek. Dlatego analiza oddziaływań DNA-białko jest niezbędnym narzędziem w ocenie ekspresji genów i funkcji komórki.
Istnieje kilka technik oceny interakcji DNA-białko in vitro, takich jak test EMSA (Electroforeza (żel) Mobility Shift Assay i ślad DNase I1,2. Jednak techniki te nie analizują interakcji białko-DNA w kontekście chromatyny i komórki. ChIP to technika, która wychwytuje białka związane z ich specyficznymi miejscami wiązania DNA, a tym samym ułatwia identyfikację interakcji DNA-białko w kontekście chromatyny. Technika ta została pierwotnie opracowana przez Gimoura i Lisa do oceny wiązania polimerazy II RNA z określonymi genami w Escherichia coli i Drosophila melanogaster3,4. Odbywa się to poprzez utrwalenie kompleksów DNA-białko, a następnie przeprowadzenie ekstrakcji chromatyny i ścinanie DNA na fragmenty ~ 200 par zasad (bp). Następnie białko związane z DNA, będące przedmiotem zainteresowania, jest izolowane przez immunoprecypitację. Po odwróceniu wiązania krzyżowego DNA-białko DNA jest oczyszczane i analizowane. Do analizy miejsc wiązania białek można zastosować kilka metod, które zależą od sekwencji kwasu nukleinowego miejsca wiązania białka w docelowym genie5. W przypadkach, gdy sekwencja DNA jest znana, można zastosować standardowe reakcje łańcuchowe polimerazy (PCR), używając określonych par starterów flankujących znane miejsce wiązania. Można również użyć ilościowego PCR w czasie rzeczywistym (qRT-PCR)6. W przypadkach, gdy sekwencja jest nieznana, ChIP można połączyć z mikromacierzami DNA (ChIP-on-chip), sekwencjonowaniem DNA (ChIP-seq) lub technikami klonowania7,8,9.
Szlak TGF-β ma silne funkcje tłumienia nowotworów i jest kluczowym szlakiem w różnicowaniu komórek. Jest aktywowany poprzez wiązanie liganda TGF-β1 z pokrewnym kompleksem receptorowym, co powoduje fosforylację seryny czynników transkrypcyjnych SMAD2/3. Po ich połączeniu ze wspólnym mediatorem, SMAD4, kompleks SMAD przemieszcza się do jądra i wiąże się z SBE w regionie promotorowym genów docelowych, gdzie reguluje geny kontrolujące cykl komórkowy, apoptozę i różnicowanie komórek. Odpowiedź transkrypcyjna na stymulację TGF-β jest specyficzna dla typu komórki i kontekstu10. Niedawno opisaliśmy pętlę dodatniego sprzężenia zwrotnego między TGF-β a ścieżką c-KIT11. W tym modelu SMAD2 aktywowany TGF-β1 wiąże się z promotorem liganda c-KIT i indukuje jego ekspresję i wydzielanie. Następnie ligand c-KIT aktywuje receptor c-KIT w sposób auto- i parakrynny. Aktywacja receptora c-KIT powoduje fosforylację STAT3 Tyr705 przez JAK1/2. Po aktywacji STAT3 i translokacji jądrowej, STAT3 wiąże się z genem ligandu TGF-β1 i reguluje jego ekspresję.
Tutaj pokazujemy kluczową rolę analizy ChIP w identyfikacji wiązania SMAD2 z promotorem ligandu receptora c-KIT oraz w identyfikacji przetwornika sygnału (i) aktywatora (z) transkrypcji 3 (wiązanie STAT3 z genem TGF-β1).

<table><tbody><tr><td>Komórki HepG2</td><td>ATCC</td><td>HB-8065</td><td></td></tr><tr><td>Komórki Hep3B</td><td>ATCC</td><td>HB-8064</td><td></td></tr><tr><td>TGF-&beta; 1</td><td>R& D Systems</td><td>101-B1</td><td>Stosowany w stężeniu 10 ng / ml</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-SMAD2</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5339</td><td>Ilość użyta/IP: 3 i mikro; g</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-STAT3</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>4904</td><td>Ilość użyta/IP: 3 i mikro; g</td></tr><tr><td>Białko ChIP-IT G Koraliki magnetyczne</td><td>Aktywny motyw</td><td>53033</td><td></td></tr><tr><td>Inhibitor proteazy Koktajl</td><td>Aktywny motyw</td><td>37490</td><td></td></tr><tr><td>Technologia sygnalizacji komórek</td><td>nukleazy mikrokokkowej</td><td>10011</td><td></td></tr><tr><td>Starter do przodu PCR: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: 5'-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3'</td></tr><tr><td>Odwrócony starter PCR: PAI-1</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: 5'-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3'</td></tr><tr><td>Starter do przodu PCR: SCF</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: 5'-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Starter odwrócony PCR: Sekwencja SCF</td><td></td><td></td><td>: 5'-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3'</td></tr><tr><td>Starter do PCR do przodu: TGF-&beta; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: 5'-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Starter odwrócony do PCR: TGF-&beta; 1 (STB-1)</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: 5'-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCCCC-3' &nbsp;</td></tr><tr><td>Starter do PCR do przodu: TGF-&beta; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: 5'-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3' &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp;</td></tr><tr><td>Starter odwrócony do PCR: TGF-&beta; 1 (STB-2)</td><td></td><td></td><td>Sekwencja: 5'-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3' &nbsp; &nbsp;</td></tr></tbody></table>

analiza promotora ligandu c-kit z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Analysis of the c-KIT Ligand Promoter Using Chromatin Immunoprecipitation

Wiele procesów komórkowych, w tym replikacja i naprawa DNA, rekombinacja DNA i ekspresja genów, wymagają interakcji między białkami a DNA. Dlatego interakcje DNA-białko regulują wiele funkcji fizjologicznych, patofizjologicznych i biologicznych, takich jak różnicowanie komórek, proliferacja komórek, kontrola cyklu komórkowego, stabilność chromosomów, epigenetyczna regulacja genów i transformacja komórek. W komórkach eukariotycznych DNA oddziałuje z białkami histonowymi i niehistonowymi i jest skondensowane do chromatyny. Do analizy interakcji DNA-białko można wykorzystać kilka narzędzi technicznych, takich jak test elektroforezy (żelu) Mobility Shift Assay (EMSA) i ślad DNazy I. Jednak techniki te analizują interakcję białko-DNA in vitro, a nie w kontekście komórkowym. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) to technika, która wychwytuje białka w ich określonych miejscach wiązania DNA, umożliwiając w ten sposób identyfikację interakcji DNA-białko w kontekście chromatyny. Odbywa się to poprzez utrwalenie interakcji DNA-białko, a następnie immunoprecypitację interesującego białka. Następnie scharakteryzowano miejsce genomowe, z którym białko było związane. W tym miejscu opisujemy i omawiamy ChIP oraz wykazujemy jego wartość analityczną dla identyfikacji indukowanego przez transformujący czynnik wzrostu-β (TGF-β) wiązania czynnika transkrypcyjnego SMAD2 z elementami wiążącymi SMAD (SBE) w regionie promotorowym liganda receptora kinazy tyrozynowo-białkowej Kit (c-KIT) i czynnika komórek macierzystych (SCF).

Wiązanie ligandu TGF-β1 z jego pokrewnym kompleksem receptorowym prowadzi do fosforylacji serynowej czynników transkrypcyjnych SMAD2/3, a następnie do ich asocjacji ze wspólnym mediatorem, SMAD4. Kompleks SMAD przemieszcza się do jądra komórkowego. TGF-β może regulować transkrypcję genów bezpośrednio, poprzez wiązanie SMAD do SBE w regionach regulatorowych genów docelowych, lub pośrednio, poprzez regulowaną przez SMAD ekspresję aktywatorów lub represorów transkrypcyjnych, które następnie ...

Interakcje DNA-białko są niezbędne dla wielu procesów biologicznych. Podczas oceny funkcji komórkowych analiza interakcji DNA-białko jest niezbędna do zrozumienia regulacji genów. Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) jest potężnym narzędziem do analizy takich interakcji in vivo.

Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Multiple cellular processes, including DNA replication and repair, DNA recombination, and gene expression, require interactions between proteins and DNA. ...

Ogólnym celem tej procedury immunoprecypitacji chromatyny jest ocena indukowanego przez TGF beta 1 wiązania czynnika transkrypcyjnego SMAD2 z elementami wiążącymi SMAD w promotorze genu C kit. Metoda ta pozwala odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórki, takie jak mechanizmy transkrypcji genów indukowanej cytokinami. Główną zaletą tej techniki jest możliwość wykazania bezpośredniego wiązania czynników transkrypcyjnych i innych białek regulujących transkrypcję z ich miejsc wiązania w DNA in vivo.Hodować komórki do osiągnięcia konfluencji od 70 do 80% na dziesięciocentymetrowych płytkach do hodowli tkanek. Stymulować komórki zgodnie z celami eksperymentu. Usunąć medium hodowlane i dodać 5 ml roztworu do fiksacji.Następnie inkubować komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej. Usunąć roztwór utrwalający i dwukrotnie przemyć komórki 10 ml lodowatego 1X PBS. Usunąć 1X PBS i dodać 5 ml roztworu stopującego utrwalanie z glicyną.Po inkubacji komórek przez pięć minut w temperaturze pokojowej na platformie wytrząsającej, usunąć roztwór stopujący fiksację z glicyną i dwukrotnie przemyć komórki 10 mililitrami lodowatego 1X PBS. Po usunięciu PBS

analysis-c-kit-ligand-promoter-using-chromatin

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Przedstawiamy tutaj procedurę immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) służącą do analizy lokalizacji w całym genomie izoform białek różniących się domeną wiążącą histony. Zastosowaliśmy ją w analizie ChIP-Seq w celu zidentyfikowania celów demetylazy histonów KDM5A/JARID1A/RBP2.

Analiza całogenomowa z wykorzystaniem metody ChIP w celu identyfikacji specyficznych dla izoform celów genowych

Ten film opisuje protokół testu immunoprecypitacji chromatyny (ChIP), który jest klasyczną techniką demonstracji interakcji białko-DNA. Technika ta służy do identyfikacji docelowych genów w ludzkich komórkach przewlekłej białaczki limfocytowej.

Test immunoprecypitacji chromatyny: technika badania interakcji białko-DNA w komórkach

Opisujemy solidną metodę immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu pierwotnych limfocytów T. Metoda opiera się na standardowych podejściach, ale wykorzystuje określony zestaw warunków i odczynników, które poprawiają wydajność dla ograniczonej liczby komórek. Co ważne, przedstawiono szczegółowy opis fazy analizy danych.

Wydajna immunoprecypitacja chromatyny przy użyciu ograniczonych ilości biomasy

Połączenie immunoprecypitacji chromatyny i sekwencjonowania ultra-wysokoprzepustowego (ChIP-seq) może zidentyfikować i zmapować interakcje białko-DNA w danej tkance lub linii komórkowej. Przedstawiono sposób generowania wysokiej jakości szablonu ChIP do późniejszego sekwencjonowania, na przykładzie doświadczenia z czynnikiem transkrypcyjnym TCF7L2.

Generowanie wysokiej jakości matrycy DNA do immunoprecypitacji chromatyny do sekwencjonowania wysokoprzepustowego (ChIP-seq)

Łącząc natywną i sieciującą immunoprecypitację chromatyny ze spektrometrią mas o wysokiej rozdzielczości, podejście ChroP umożliwia analizę złożonej architektury proteomicznej modyfikacji histonów, wariantów i białek niehistonicznych synergizujących się w funkcjonalnie odrębnych domenach chromatyny.

Podejście ChroP łączy ChIP i spektrometrię mas w celu zbadania specyficznych dla locus krajobrazów proteomicznych chromatyny

Ta praca opisuje protokół immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) przy użyciu dojrzałej linii mysich komórek T. Protokół ten jest odpowiedni do badania rozkładu określonych znaczników histonowych w określonych miejscach promotora lub w całym genomie.

Immunoprecypitacja chromatyny (ChIP) w liniach mysich limfocytów T

Ten protokół opisuje kombinatoryczne zastosowanie ChIP-seq, 4sU-seq, total RNA-seq i profilowania rybosomów dla linii komórkowych i komórek pierwotnych. Umożliwia śledzenie zmian w wiązaniu czynnika transkrypcyjnego, transkrypcji de novo, przetwarzaniu RNA, obrocie i translacji w czasie oraz wyświetlanie ogólnego przebiegu zdarzeń w aktywowanych i/lub szybko zmieniających się komórkach.

Analiza w czasie rzeczywistym wiązania czynników transkrypcyjnych, transkrypcji, translacji i obrotu w celu wyświetlenia globalnych zdarzeń podczas aktywacji komórkowej

Elementy regulatorowe DNA, takie jak wzmacniacze, kontrolują ekspresję genów poprzez fizyczny kontakt z docelowymi promotorami genów, często poprzez interakcje chromosomowe dalekiego zasięgu obejmujące duże odległości genomowe. Promoter Capture Hi-C (PCHi-C) identyfikuje znaczące interakcje między promotorami a regionami dystalnymi, umożliwiając przypisanie potencjalnych sekwencji regulatorowych do ich docelowych genów.

Motiver Capture Hi-C: Profilowanie interakcji promotorów w całej rozdzielczości i całym genomie

Przewlekła białaczka limfocytowa (CLL) jest najczęstszą białaczką w zachodnim świecie. Czynniki transkrypcyjne NFAT są ważnymi regulatorami rozwoju i aktywacji w wielu typach komórek. W tym miejscu przedstawiamy protokół stosowania immunoprecypitacji chromatyny (ChIP) w ludzkich komórkach PBL w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2.

Test immunoprecypitacji chromatyny w celu identyfikacji nowych genów docelowych NFAT2 w przewlekłej białaczce limfocytowej

Ten protokół skupia się na przygotowaniu chromatyny z zamrożonych tkanek i nadaje się do sieciowania immunoprecypitacji chromatyny (X-ChIP), a następnie analizy ilościowej PCR (X-ChIP-qPCR) lub sekwencjonowania nowej generacji (X-ChIP-seq).

Ekstrakcja chromatyny z zamrożonej chimerycznej tkanki wątroby do analizy immunoprecypitacji chromatyny

Poznaj technikę ChIP do badania wiązania czynników transkrypcyjnych SMAD2 i STAT3 z promotorem c-KIT w liniach komórkowych raka wątroby człowieka. Ta metoda pozwala analizować interakcje białko-DNA in vivo.

Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Przeglądaj więcej filmów