Analiza promotora ligandu c-KIT z wykorzystaniem immunoprecypitacji chromatyny

Ogólnym celem tej procedury immunoprecypitacji chromatyny jest ocena indukowanego przez TGF beta 1 wiązania czynnika transkrypcyjnego SMAD2 z elementami wiążącymi SMAD w promotorze zestawu C. Metoda ta może odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii komórkowej, takie jak transkrypcja genów indukowana cytokinami. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona wykazać bezpośrednie wiązanie czynników transkrypcyjnych i innych białek regulatorowych transkrypcji z ich miejscami wiązania DNA in vivo.

Wyhoduj komórki do zbiegu od 70 do 80% na dziesięciocentymetrowych płytkach do hodowli tkankowych. Stymuluj komórki zgodnie z celami eksperymentalnymi. Usuń pożywkę do hodowli tkankowych i dodaj pięć mililitrów roztworu utrwalającego.

Następnie inkubuj komórki przez 10 minut w temperaturze pokojowej na platformie wstrząsającej. Usuń roztwór utrwalający i umyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami lodowatego zimnego jednego X PBS. Usuń jeden X PBS i dodaj pięć mililitrów roztworu glicyny.

Po inkubacji komórek przez pięć minut w temperaturze pokojowej na platformie do wytrząsania, usuń roztwór glicyny zatrzymujący i umyj komórki dwukrotnie 10 mililitrami lodowatego zimnego roztworu X PBS. Po usunięciu PBS dodaj dwa mililitry roztworu do skrobania komórek i zbierz komórki za pomocą skrobaka do komórek. Następnie przenieś zebrane komórki do stożkowej rurki na lodzie.

Odwirowywać próbki przez 10 minut w temperaturze 600 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Usunąć supernatant, ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze jednego buforu do lizy komórek X i inkubować na lodzie przez 30 minut. Gdy osad zostanie ponownie zawieszony w buforze do lizy komórek, przenieś zawiesinę komórek do lodowatego homogenizatora Dounce i odbij przez 10 pociągnięć za pomocą tłuczka typu B w celu rozerwania komórek.

Następnie przenieś zawiesinę komórkową do probówki mikrowirówkowej i odwiruj próbkę przez 10 minut w temperaturze 2 400 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Odrzucić supernatant i ponownie zawiesić osad w 350 mikrolitrach buforu do wytrawiania jąder. Po inkubacji próbek przez pięć minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj nukleazę mikrokokową i wymieszaj przez wirowanie.

Inkubować próbki w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć do 20 minut, mieszając próbki co dwie minuty metodą inwersji. Czas w pewnym stężeniu, jeśli znajdujesz się między liniami komórkowymi, może wymagać optymalizacji w przypadku nieoptymalnego ścinania enzymatycznego. Alternatywną procedurę ścinania z wykorzystaniem dostępnych na rynku sonicare można znaleźć w protokole tekstowym.

Po inkubacji z nukleazą mikrokokową dodaj siedem mikrolitrów lodowatego 0,5 molowego EDTA, aby zatrzymać reakcję. Odwirować próbki ze ściętym DNA przez 10 minut w temperaturze 16, 200 razy G i czterech stopniach Celsjusza. Przenieść ścięte DNA zawierające supernatant do świeżej probówki do mikrowirówki.

Porcję 50 mikrolitrów do oddzielnej probówki do mikrowirówki, aby potwierdzić pomyślne ścinanie DNA, jak opisano w protokole tekstowym. Pozostałą objętość należy natychmiast zużyć do immunoprecypitacji lub przechowywać w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza. Połącz od 10 do 25 mikrogramów usieciowanej chromatyny ściętej z 25 mikrolitrami kulek magnetycznych G o stopniu immunoprecypitacji chromatyny.

Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu rozcieńczającego immunoprecypitację i jeden mikrolitr koktajlu inhibitorów proteazy. Po czterech godzinach inkubacji dodaj od jednego do 10 mikrogramów przeciwciała do 1,5 mililitrowej probówki wirówkowej. I dodaj wodę destylowaną do końcowej objętości 100 mikrolitrów.

Inkubować próbki na rotatorze typu end-to-end przez cztery do 12 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji umieść probówki na stojaku magnetycznym. Gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku probówki, ostrożnie usuń i wyrzuć supernatant.

Umyj koraliki trzykrotnie 800 mikrolitrami jednego bufora do mycia. Przy każdym praniu wymieszaj koraliki, kilkakrotnie odwracając rurkę. Następnie umieść probówkę na stojaku magnetycznym i ostrożnie wyjmij bufor myjący, gdy kulki magnetyczne zgromadzą się z boku tuby.

Następnie umyj koraliki raz 800 mikrolitrami buforu do płukania dwa, stosując tę samą procedurę. Po przepłukaniu ponownie zawiesić kulki w 50 mikrolitrach buforu elucyjnego i inkubować próbki na rotatorze typu end-to-end przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie przenieś supernatant do świeżej probówki za pomocą podstawki magnetycznej.

Dodaj sześć mikrolitrów pięciomolowego chlorku sodu, aby odwrócić sieciowanie, a następnie dwa mikrolitry proteinazy K. Po wymieszaniu próbek inkubuj je przez dwie godziny w temperaturze 65 stopni Celsjusza. W tym momencie próbki mogą być bezpośrednio analizowane pod kątem miejsc wiązania białek, jak opisano w protokole tekstowym, lub mogą być przechowywane w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza. Aby potwierdzić indukowane przez TGF beta 1 wiązanie SMAD2 z promotorem SCF, przeprowadzono test immunoprecypitacji chromatyny.

Leczenie TGF beta 1 spowodowało wiązanie SMAD2 z promotorem SCF w ludzkich liniach raka wątroby, HepG2 i Hep3B. Przy braku stymulacji TGF beta 1 nie stwierdzono wiązania SMAD. Jako kontrolę pozytywną, dla aktywacji SMAD indukowanej przez TGF beta 1, przeprowadzono immunoprecypitację chromatyny dla PAI-1.

Promotor PAI-1 jest znanym celem TGF beta i SMAD. Swoistość immunoprecypitacji SMAD2 potwierdzono poprzez zastosowanie nieswoistych przeciwciał IgG. Nie stwierdzono wiązania SMAD2 z SBE po immunoprecypitacji IgG.

Aby potwierdzić indukowane przez TGF Beta 1 wiązanie STAT3 z genem liganda beta TGF, przeprowadzono testy immunoprecypitacji chromatyny przy użyciu komórek HepG2 i Hep3B traktowanych TGF beta 1. Leczenie TGF beta 1 spowodowało wiązanie STAT3 z drugim przypuszczalnym miejscem wiązania STAT3 genu TGF beta, ale nie z pierwszym. W tym przykładzie dodatnie wiązanie STAT3 z STB-2 służy jako wewnętrzna kontrola pozytywna.

Podobnie jak w innym eksperymencie immunoprecypitacji chromatyny, wiązania STAT3 z ST-2 nie zaobserwowano po immunoprecypitacji przy użyciu IgG. Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu jednego lub dwóch dni, w zależności od przeciwciała, jeśli jest wykonywana prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest, aby postępować zgodnie z laboratoryjnymi wytycznymi dotyczącymi bezpieczeństwa i być bardzo dokładnym na każdym etapie protokołu.

Podczas wykonywania tej procedury należy podjąć środki ostrożności, takie jak sprawdzenie karty charakterystyki i noszenie odzieży ochronnej, takiej jak rękawice, biały fartuch i okulary ochronne. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak analizować wiązanie białek z określonymi sekwencjami wiążącymi DNA. Zgodnie z tym protokołem można przeprowadzić inne metody, takie jak testy promotora, w celu potwierdzenia funkcjonalnego znaczenia wiązania DNA białka wykazanego przez immunoprecypitację chromatyny.