Metoda badania wpływu sygnałów środowiskowych na zachowania godowe u Drosophila melanogaster

Ogólnym celem tego testu behawioralnego jest ilościowe określenie wpływu kolejek środowiskowych na zachowania reprodukcyjne, takie jak zaloty i kojarzenie się. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii behawioralnej i eurogenetyki. Takich jak wnioskowanie o czynnikach genetycznych i środowiskowych dotyczących zachowań reprodukcyjnych i mechanizmów, które moderują te zachowania.

Technika ta zapewnia szybkość i elastyczność w testowaniu szerokiego zakresu kolejek środowiskowych, które wpływają na reprodukcję. I to z bardzo dużą liczbą powtórzeń. Procedurę zademonstruje Jenke Gorter, doktorantka z mojego laboratorium.

Rozpocznij eksperyment od przygotowania jednego litra bogatego podłoża muchowego. Wlej jeden litr wody z kranu do dwulitrowej szklanej zlewki z mieszadłem magnetycznym. I umieść zlewkę na magnetycznej płycie grzejnej.

Trzymaj mieszanie i zwiększ ogień do 300 stopni Celsjusza, aż do osiągnięcia temperatury wrzenia. Włącz mieszanie do 500 obr./min i dodaj składniki do wrzącej wody. Poczekaj, aż drożdże energicznie się spienią.

Następnie zmniejsz temperaturę płyty grzejnej do 120 stopni Celsjusza. Po 10 minutach zmniejsz temperaturę płyty grzejnej do 30 stopni Celsjusza. I pozwól mieszaninie mieszać, aż ostygnie do 48 stopni Celsjusza.

Monitoruj temperaturę, wkładając termometr bezpośrednio do żywności. Rozpuść dwa gramy Tegoseptu w 10 mililitrach 96% etanolu. Połącz mieszaninę i pięć mililitrów jednego molowego kwasu propionowego ze zlewką.

Mieszaj przez trzy minuty. Podgrzej igłę do zaczerwienienia w palniku Bunsena. I przebij otwór o średnicy 0,3 centymetra w górnej części plastikowej szalki Petriego o wymiarach 3,5 centymetra na 1,0 centymetra.

Przygotowując pożywkę spożywczą ze związkami zapachowymi, najpierw odpipetuj 30 mikrolitrów pożądanego związku do naczynia na 1/2 eksperymentalnych naczyń. Pozostałe 1/2 naczyń pozostaw puste dla porównania. Za pomocą pięciomililitrowej pipety serologicznej wlej trzy mililitry pożywki spożywczej, przykrywając dno naczynia.

Przykryj gazą, aby zapobiec zanieczyszczeniu i pozwól pożywce zestalać się przez godzinę w temperaturze pokojowej. Następnie przykryj naczynia pokrywką i zaklej pokrywki taśmą z dwóch stron. Przygotuj małe zatyczki z folii parafinowej, aby zakryć otwory naczyń, zwijając kawałki folii parafinowej w rolki o grubości dwóch centymetrów w punkcie zerowym.

A następnie pokrój je na segmenty o długości pięciu centymetrów w punkcie zerowym. Wytnij dwa małe otwory w przegrodzie, aby dobrze dopasować kolczaste łączniki grodziowe. Dopasuj otwarte czteropunktowe pięciocentymetrowe nakrętki do butelek z przegrodą Silcone o grubości trzech dwóch centymetrów i punkcie zerowym.

Przymocuj małą rurkę PVC do obu wylotów, które wychodzą z butelki i tylko do jednego z wlotów wchodzących do butelki. Następnie przymocuj szklaną rurkę do wylotu każdej butelki z kulturą YPD za pomocą małych rurek. Napełnij rurkę włóknem szklanym.

I autoklaw go przed użyciem. Owiń dopasowane nasadki i rurki folią aluminiową. I sterylizuj je w autoklawie przez 25 minut w temperaturze 120 stopni Celsjusza i ciśnieniu jednego bara.

Zanurz sterylną końcówkę pipety o pojemności 100 mikrolitrów w jednej z kolonii drożdży z płytki agarowej YPD i wrzuć ją do autoklawizowanej pożywki z płynem YPD. Zakręć tę butelkę z płynnym podłożem YPD z drożdżami i okulowanymi, a także butelkę kontrolną z pożywką YPD, bez drożdży, z autoklawowanymi nakrętkami, zamontowaną w wylocie. Aby zapobiec zanieczyszczeniu pożywki YPD mikroorganizmami, należy przymocować małą rurkę do sterylnego filtra strzykawkowego w punkcie zerowym o długości czterech pięciu mikrometrów, z plastikowym naciskiem na łącznik rurki grodziowej, idąc w kierunku filtra.

I śruba na plastikowym łączniku grodziowym opuszczającym filtr. Następnie podłącz rurkę do wlotu butelki z kulturą YPD. Umieść butelki na osobnych płytkach magnetycznych.

I mieszaj roztwór przy 100 obr./min, w temperaturze pokojowej, przez 24 godziny przed rozpoczęciem eksperymentu. Podłącz wloty obu butelek do rurki podłączonej do sprężonego powietrza. Upewnij się, że wylot eksperymentalnej butelki z drożdżami jest podłączony do rurki odprowadzającej zapach drożdży z pomieszczenia eksperymentalnego, aby zapobiec zakłóceniom eksperymentu.

Przymocuj rurkę PVC do strony wylotowej szklanej rurki i poprowadź ją w kierunku dolnych otworów pudełka do eksperymentów. Za pomocą rozdzielacza T o średnicy zewnętrznej większej lub równej punktowi zerowemu wynoszącemu pięć centymetrów i krótkich kawałków małych rurek z PVC, przymocuj dwie pipety serologiczne do każdego z dwóch wylotów po obu stronach. Przyklej pipety płasko na białym arkuszu papieru pod aparatami, w stalowym pudełku.

Użyj pipety doustnej, aby umieścić jedną eksperymentalną samicę na małej szalce Petriego na szóstej zt. I pozwól muszce zaaklimatyzować się na arenie godowej przez godzinę. Po godzinie, o siódmej ZT, przenieś samca typu dzikiego na szalkę Petriego.

I kliknij Rozpocznij monitorowanie na 24 godziny. W eksperymencie z pompą powietrza umieść naczynie w taki sposób, aby wylot pipety był podłączony do otworu wejściowego areny łączącej. Aby przeanalizować zachowanie godowe pary, wybierz otwarte wszystkie zdjęcia w oprogramowaniu do przeglądania obrazów.

I przejrzyj je w porządku chronologicznym. Zapisz datę, numer eksperymentu, numer dania i godzinę rozpoczęcia w arkuszu kalkulacyjnym w tym samym wierszu. Weź czas rozpoczęcia każdej areny od momentu umieszczenia jej pod kamerą internetową kamery.

Zapisz znacznik czasu ze zdjęć. Zaznacz czas rozpoczęcia każdej kopulacji w tym samym wierszu w arkuszu kalkulacyjnym. Krycie należy traktować jako incydent, gdy samiec dosiada samicy, a para pozostaje umiarkowanie nieruchoma i w tej samej pozycji przez co najmniej pięć kolejnych klatek.

Analiza powietrza drożdży, oddzielonego na pożywkę spożywczą, pokazuje, że para kojarząca się nie reaguje na zapachy drożdży, gdy w pożywce nie ma drożdży. Ale zwiększają częstotliwość krycia w powietrzu drożdży, gdy drożdże są również dodawane do pożywki spożywczej. Kobieca receptywność wzrasta w obecności kwasu octowego.

Ale tylko wtedy, gdy pepton jest obecny w pożywce, co pokazuje, że muszki muszą jednocześnie wyczuwać aminokwasy i kwas octowy, aby zwiększyć częstotliwość krycia. Po opanowaniu tej techniki można skonfigurować w ciągu sześciu godzin. A analizę behawioralną można przeprowadzić w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.