Name: Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 44 s
Description: Poznaj metodę Golgiego-Coxa do oceny złożoności dendrytycznej w hipokampie starszych myszy. Technika umożliwia wysokiej jakości wizualizację morfologii neuronów bez ryzyka uszkodzenia tkanek.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez grant pilotażowy w ramach NIH P20 GM109005 (A.R.A.) oraz przez program Center for Translational Neuroscience IDeA w GM110702.

Eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie ze standardami etycznymi zatwierdzonymi przez Instytucjonalną Komisję ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt na UAMS.
1. Zwierzęta i paradygmat wstrzykiwania 5-Fu
<ol>
	<li>Kup 6-miesięcznych samców myszy typu dzikiego C57Bl6/J i trzymaj je w stałym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność, aż osiągną wiek 1 roku.</li>
	<li>Rozcieńczyć 5-Fu w 0,9% sterylnym roztworze soli fizjologicznej. Stosować 60 mg/kg mc. jako wymaganą dawkę na mysz.</li>
	<li>Podawaj zastrzyki dootrzewnowe 5-Fu (raz w tygodniu przez trzy tygodnie).
	<ol>
		<li>Wstrzyknięcia dootrzewnowe należy wykonywać mniej więcej o tej samej porze każdego dnia. Na przykład między 0900-1200 h.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Poddaj zwierzęta eutanazji i wyekstrahuj mózgi 30 dni po ostatnim wstrzyknięciu.</li>
</ol>
2. Procedura eutanazji i ekstrakcja mózgu
<ol>
	<li>Utrzymaj gryzonia i chwyć podstawę ogona. Drugą ręką połóż kciuk lub pierwszy palec u podstawy szyi gryzonia. Szybko naciskaj na szyję gryzonia i pchaj do przodu, podczas gdy druga ręka trzymająca ogon ciągnie do tyłu.</li>
	<li>Jedną ręką trzymaj gryzonia, a drugą duże nożyczki chirurgiczne. Umieść szyję gryzonia między dwoma ostrzami i szybko odetnij głowę.</li>
	<li>Weź odciętą głowę myszy i użyj cienkich nożyczek, aby przyciąć futro nad czaszką, aż do oczu. Następnie umieść końcówki nożyczek w każdym oczodole i zamknij nożyczki z niewielką siłą.</li>
	<li>Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć czaszkę po lewej i prawej stronie móżdżku.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby podnieść część czaszki otaczającą móżdżek bezpośrednio do góry i ze zdejmij.</li>
	<li>Użyj nożyczek sprężynowych, aby przeciąć wzdłuż linii środkowej czaszki.</li>
	<li>Użyj kleszczy, aby podnieść pozostałą część czaszki z mózgu.</li>
	<li>Użyj szpatułki i sondy, aby zgarnąć mózg do żądanego pojemnika. Za pomocą ostrza ze stali nierdzewnej przetnij każdy mózg wzdłuż płaszczyzny środkowej. Wykonaj następującą metodę Golgiego-Coxa na prawej półkuli.</li>
</ol>
3. Barwienie metodą Golgiego i preparacja tkanek
<ol>
	<li>Zanurz świeżo zebrane półmózgi w 5 ml roztworu na bazie chlorku rtęci (roztwór A z zestawu) w stożkowej probówce o pojemności 10 ml. Roztwór chlorku rtęci jest wrażliwy na światło; Przykryj tubę folią. Próbkę należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej. 
	UWAGA: Roztwór A znajduje się w zestawie wymienionym w tabeli materiałów. Ostrożność! Roztwór A (zwany również roztworem chlorku rtęci) zawiera toksyczne odczynniki, takie jak dwuchromian potasu, chlorek rtęci i chromian potasu. Nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Po 1 dniu powoli przelej roztwór do tymczasowego pojemnika (takiego jak duża łódka wagowa) i wyrzuć go do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne. Zanurz mózgi (nadal w oryginalnych stożkowych probówkach o pojemności 10 ml) w 5 ml roztworu chlorku rtęci i umieść próbkę w ciemności w temperaturze pokojowej na kolejne 13 dni.</li>
	<li>Dodać 30 g buforu po impregnacji do 90 ml wody destylowanej lub dejonizowanej (dH2O). Napełnij każdą studzienkę 6-dołkowej płytki 6,5 ml buforu po impregnacji, po jednym dołku na mózg 
	UWAGA: Bufor po impregnacji znajduje się w zestawie, który jest wymieniony w tabeli materiałów.
	<ol>
		<li>Po 14 dniach (łącznie) w roztworze chlorku rtęci przepłukać tkankędH2O, a następnie przenieść je na płytki 6-dołkowe z buforem po impregnacji. Przykryj talerze folią i przechowuj je w temperaturze pokojowej w ciemności.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odpipetować bufor po impregnacji po 1 dniu zanurzenia i odnowić świeżym buforem po impregnacji; przechowywać przez 1 dzień w ciemności w temperaturze pokojowej. W razie potrzeby przechowuj go w temperaturze 4 °C przez okres do 1 miesiąca22.</li>
</ol>
4. Podział na sekcje
<ol>
	<li>Oznacz 12-dołkowe płytki na ich pokrywkach numerami w porządku rosnącym od lewej do prawej i od góry do dołu.</li>
	<li>Przygotuj dwie lub trzy 12-dołkowe płytki na mózg, jeśli dzielisz cały mózg na sekcje.
	<ol>
		<li>Oznaczyć górną część każdej pokrywy płytki 12-dołkowej numerem identyfikacyjnym mózgu, który został podzielony na sekcje.</li>
		<li>Odpipetować 2 ml 1x PBS do każdego dołka każdej płytki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ustaw scenę i włącz wibratom; upewnij się, że w pojemniku jest wystarczająca ilość 1x PBS, aby przykryć tkankę.
	<ol>
		<li>Wytnij dwa kawałki plastikowej folii parafinowej i złóż je dwukrotnie. Umieść je nad otworami na pokrętła uchwytu próbki, aby zapobiec wyciekaniu 1x PBS na blat.</li>
		<li>Nałóż taśmę na blok tkanki uchwytu próbki, a następnie nałóż na niego klej z cyjanoakrylanu (patrz tabela materiałów).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wyjmij mózg z płytki 6-dołkowej i umieść go na plastikowym lub szklanym naczyniu. Użyj obosiecznego ostrza ze stali nierdzewnej, aby odciąć około połowy móżdżku.
	<ol>
		<li>Przetnij móżdżek doogonowo. Upewnij się, że pozostała część móżdżku jest równa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Natychmiast umieść płaską powierzchnię pozostałego móżdżku na kleju. 
	UWAGA: Grzbietowa część tkanki (kora mózgowa) powinna być skierowana w lewo lub w prawo w stosunku do ostrza. Koniec rostralny, który wcześniej zawierał przyczepioną opuszkę węchową, powinien być skierowany do góry.
	<ol>
		<li>Odczekaj co najmniej kilka minut, aby upewnić się, że klej całkowicie wyschnie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Podczas gdy klej, który utrzymuje mózg na miejscu, wysycha, wlej 1x PBS do kąpieli z próbką. Po wyschnięciu kleju umieść uchwyt na próbkę wraz z chusteczką w kąpieli z próbką.
	<ol>
		<li>Jeśli próbka tkanki nie jest całkowicie pokryta, wlej więcej 1x PBS do kąpieli z próbką.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przymocuj ostrze do uchwytu ostrza wibratomu i powoli opuść ostrze do kąpieli próbki, aż zostanie całkowicie zanurzone w 1x PBS. Kontynuuj opuszczanie ostrza, aż znajdzie się nieco poniżej górnej części tkanki.</li>
	<li>Ustaw prędkość wibratomu na 7, amplitudę na 6, a kąt cięcia na 12° (patrz tabela materiałów dla modelu wibratomu). Rozpocznij wibracje i wytnij sekcje 200 μm23.
	<ol>
		<li>Użyj dużego pędzla, aby przesunąć skrawki tkanki z kąpieli próbki do każdego wyznaczonego dołka na 12-dołkowych płytkach.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kontynuuj cięcie tkanki, aż zostanie osiągnięta żądana liczba odcinków tkanki.</li>
</ol>
5. Barwienie po
<ol>
	<li>Do każdego z kolejnych etapów barwienia i płukania użyj 2 ml wskazanego roztworu na studzienkę. Użyj zmotoryzowanego napełniacza do pipet (patrz tabela materiałów), aby przenieść roztwory do studzienek. Za pomocą pipety transferowej (patrz tabela materiałów) przenieść roztwory ze studzienek do odpowiednich pojemników na odpady.</li>
	<li>Wypłucz sekcje w jednym 30-minutowym praniu 0,01 M PBS-T (dodać 3,0 ml detergentu (patrz tabela materiałów) do 1 000 ml 0,01 M PBS).</li>
	<li>Rozcieńczyć roztwór wodorotlenku amonu (Uwaga) w stosunku objętościowym 3:5 zdH2Obezpośrednio przed użyciem. Wybarwić skrawki w rozcieńczonym roztworze wodorotlenku amonu przez 19-21 min.
	<ol>
		<li>Wrażliwy na światło roztwór wodorotlenku amonu chronić folią. 
		UWAGA: Wodorotlenek amonu w roztworze ma stężenie ~10% i jest klasyfikowany jako "niebezpieczny". Roztwór wodorotlenku amonu może powodować oparzenia, jeśli zetknie się ze skórą. Wdychanie może powodować podrażnienie dróg oddechowych. Nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wybarwić skrawki w buforze po barwieniu (dodać 90 g odczynnika D w 500 ml dH2O) przez 19-21 minut. Bufor po barwieniu jest wrażliwy na światło; Zabezpiecz go folią22.</li>
	<li>Wypłucz sekcje w trzech, 5-10 minutowych praniach 0,01 M PBS-T.</li>
</ol>
6. Montaż, czyszczenie i pokrywanie
<ol>
	<li>Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną 1% za pomocą dużego pędzla. Pozostaw je do wyschnięcia na 20-30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieść je na noc w słoiku Coplin.</li>
	<li>Wyjmij szkiełka w rękawiczkach ze słoika Coplin i umieść je w plastikowym stojaku (patrz tabela materiałów). Umieść plastikowy ruszt w naczyniu do barwienia (patrz tabela materiałów) zawierającym 100% etanolu. Odwodnij je trzema 5-minutowymi myciami.</li>
	<li>Umyj szkiełka dwukrotnie po 5 minut w 99% ksylenie. Umieść szkiełka w szklanym stojaku i opuść ruszt do szklanego naczynia do barwienia zawierającego ksylen z metalowym uchwytem (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA, ksylen jest szkodliwy w przypadku wdychania i powoduje podrażnienie, jeśli dotknie skóry. Jest wysoce łatwopalny w stanie ciekłym i parowym. Nosić rękawice ochronne i pracować pod wyciągiem.</li>
	<li>Wyjmuj szkiełka z ksylenu pojedynczo i szybko przykryj tkankę ~0,25 ml podłoża montażowego (patrz tabela materiałów). Następnie weź prowadnice i połóż je na nośniku.
	<ol>
		<li>Wepchnij wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza pod osłonami prowadnic do krawędzi przedmiotem, takim jak końcówka pędzla.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieść szkiełka w miejscu z dala od światła słonecznego i pozostaw do wyschnięcia na 2-3 dni.</li>
	<li>Przejdź do pozyskiwania obrazów za pomocą mikroskopu i analizy za pomocą odpowiedniego oprogramowania.</li>
</ol>
7. Zdobądź stos obrazów
<ol>
	<li>Otwórz program do obrazowania (patrz Tabela materiałów). Umieść szkiełko na stoliku mikroskopu. W menu u góry programu kliknij "Akwizycja", a następnie kliknij "Obraz na żywo".</li>
	<li>Ustaw mikroskop na 10X. Zidentyfikuj preferowany neuron, a następnie przesuń kursor, który wygląda jak czerwony X, na środek somy. Kliknij lewym przyciskiem myszy, aby ustawić punkt odniesienia.</li>
	<li>Ustaw mikroskop na 40X. Kliknij "Przenieś" w menu u góry programu, a następnie kliknij "Do punktu odniesienia".</li>
	<li>Rozpocznij tworzenie stosu obrazów, ręcznie przewijając z precyzyjnym obiektywem nad tkanką, aż będzie lekko nieostry.
	<ol>
		<li>Kliknij "Ustaw górę" w prawym dolnym rogu programu pod nagłówkiem "Akwizycja obrazu".</li>
		<li>Przewiń lekko pod tkanką, aż będzie nieco nieostra, a następnie kliknij "Ustaw dół" w sekcji "Akwizycja obrazu". Następnie kliknij "Pobierz stos obrazów".</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po pobraniu stosu obrazów wpisz żądaną nazwę pliku obrazu w wyświetlonym oknie. Zapisz jako "MBF plik Ascii".
	<ol>
		<li>Po wyświetleniu monitu wybierz typ pliku jako "MBF JPEG2000 plik stosu", a następnie kliknij "Zapisz".</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
8. Śledzenie neuronów
<ol>
	<li>Na pasku narzędzi pod menu kliknij pole zatytułowane "Nazwa konturu". Wybierz "Soma" z menu rozwijanego.</li>
	<li>Ręcznie prześledź somę. Następnie kliknij prawym przyciskiem myszy i wybierz "Zakończ treść komórki" po zakończeniu śledzenia.</li>
	<li>Wybierz "AutoNeuron", aby wyświetlić kolejną zakładkę zatytułowaną "AutoNeuron Workflow".</li>
	<li>W sekcji "Typ konfiguracji" wybierz "Nowa". Ustaw parametry, a następnie kliknij "Następny krok", aby wyświetlić podtytuł "Wykrywanie somy".
	<ol>
		<li>Aby ustawić parametry, wybierz "Jasne pole". Następnie w sekcji "Maksymalna średnica procesu" kliknij "Rozpocznij pomiar". Za pomocą kursora przejdź do podstawy dendrytu i ręcznie ustaw średnicę.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kliknij "Tak" w oknie, które prosi użytkownika o prześledzenie całego obrazu. Ręcznie prześledź somę. Odznacz, a następnie kliknij "Następny krok", aby wyświetlić podtytuł "Umieszczenie nasion".</li>
	<li>Kliknij "Sprawdź poprawność nasion", a następnie kliknij "Następny krok", aby wyświetlić podtytuł "Rekonstrukcja neuronów".</li>
	<li>W sekcji "Neuron" kliknij "Interaktywny". Wykonaj interaktywne śledzenie, postępując zgodnie ze wskazówkami programu dendrytów i klikając prawym przyciskiem myszy, aby zakończyć podświetlony obszar śledzony przez program. Po prześledzeniu wszystkich dendrytów kliknij "Następny krok".</li>
	<li>Po wyświetleniu nowego okna zapisz nową konfigurację z żądanym tytułem. Kliknij "Zapisz".</li>
</ol>
9. Analiza
<ol>
	<li>Otwórz program analityczny (patrz tabela materiałów).</li>
	<li>Kliknij "Plik" w górnym menu, a następnie kliknij "Otwórz plik danych". Wybierz interesujący Cię plik.</li>
	<li>Pod podnagłówkiem analizy wybierz opcję "Analiza Sholla".</li>
	<li>W oknie "Analiza Sholla" ustaw promień początkowy na 10 μm. W sekcji "Analiza" kliknij pola "Dendryty" i "Zamówienia gałęzi".</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo otwarte okna i kliknij "Eksport Excela". Kliknij "Zapisz".</li>
	<li>Pod analizą kliknąć "Analizy struktury rozgałęzionej". Wybrać "Wszystkie możliwe analizy".</li>
	<li>Kliknij prawym przyciskiem myszy nowo otwarte okno i kliknij "Eksport Excela"24.</li>
</ol>

<ol><li>Stuart, G. J., Spruston, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+integration%3A+60+years+of+progress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic integration: 60 years of progress.</a> Nat Neurosci. 18 (12), 1713-1721 (2015).</li>
<li>Jan, Y. N., Jan, L. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Branching+out%3A+mechanisms+of+dendritic+arborization%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Branching out: mechanisms of dendritic arborization.</a> Nat Rev Neurosci. 11 (5), 316-328 (2010).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
<li>Kasai, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Dynamics+of+Dendritic+Spines+in+Memory+and+Cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Structural Dynamics of Dendritic Spines in Memory and Cognition.</a> Trends Neurosci. 33 (3), 121-129 (2010).</li>
<li>von Bohlen Und Halbach, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+and+function+of+dendritic+spines+within+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Anat%22%5BJournal%5D)">Structure and function of dendritic spines within the hippocampus.</a> Ann Anat. 191 (6), 518-531 (2009).</li>
<li>Wayman, G. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activity-dependent+dendritic+arborization+mediated+by+CaM-kinase+I+activation+and+enhanced+CREB-dependent+transcription+of+Wnt-2%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Activity-dependent dendritic arborization mediated by CaM-kinase I activation and enhanced CREB-dependent transcription of Wnt-2.</a> Neuron. 50 (6), 897-909 (2006).</li>
<li>Bourne, J. N., Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Balancing+structure+and+function+at+hippocampal+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Balancing structure and function at hippocampal dendritic spines.</a> Ann Rev Neurosci. 31, 47-67 (2008).</li>
<li>Lai, K. O., Ip, N. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+dendritic+spines%3A+the+underlying+mechanisms+and+its+dysregulation+in+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of dendritic spines: the underlying mechanisms and its dysregulation in brain disorders.</a> Biochim Biophys Acta. 1832 (12), 2257-2263 (2013).</li>
<li>Harris, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure%2C+development%2C+and+plasticity+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Op+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Structure, development, and plasticity of dendritic spines.</a> Current Op Neurobiol. 9 (3), 343-348 (1999).</li>
<li>Harris, K. M., Kater, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spines%3A+cellular+specializations+imparting+both+stability+and+flexibility+to+synaptic+function%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dendritic spines: cellular specializations imparting both stability and flexibility to synaptic function.</a> Ann Rev Neurosci. 17, 341-371 (1994).</li>
<li>Leuner, B., Shors, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stress%2C+anxiety%2C+and+dendritic+spines%3A+what+are+the+connections%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Stress, anxiety, and dendritic spines: what are the connections.</a> Neuroscience. 251, 108-119 (2013).</li>
<li>Harris, K. M., Fiala, J. C., Ostroff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+changes+at+dendritic+spine+synapses+during+long-term+potentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Philos+Trans+R+Soc+Lond+B+Biol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural changes at dendritic spine synapses during long-term potentiation.</a> Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 358 (1432), 745-748 (2003).</li>
<li>Kasai, H., Matsuzaki, M., Noguchi, J., Yasumatsu, N., Nakahara, H. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12850432">Structure-stability-function relationships of dendritic spines.</a> Trends Neurosci. 26 (7), 360-368 (2003).</li>
<li>Das, G., Reuhl, K., Zhou, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23681640">The Golgi-Cox method.</a> Methods Mol Biol. 1018, 313-321 (2013).</li>
<li>Koyama, Y. <a target="_blank" href="http://www.oapublishinglondon.com/images/article/pdf/1397256114.pdf">The unending fascination with the Golgi method.</a> OA Anat. 1 (3), 24(2013).</li>
<li>Pasternak, J. F., Woolsey, T. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/46234">On the "selectivity" of the Golgi-Cox method.</a> J Comp Neurol. 160 (3), 307-312 (1975).</li>
<li>Friedland, D. R., Los, J. G., Ryugo, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modified+Golgi+staining+protocol+for+use+in+the+human+brain+stem+and+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A modified Golgi staining protocol for use in the human brain stem and cerebellum.</a> J Neurosci Methods. 150 (1), 90-95 (2006).</li>
<li>Rosoklija, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Golgi+methods+for+impregnation+of+brain+tissue+from+humans+and+monkeys%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Optimization of Golgi methods for impregnation of brain tissue from humans and monkeys.</a> J Neurosci Methods. 131 (1-2), 1-7 (2003).</li>
<li>de Castro, F., Lopez-Mascaraque, L., De Carlos, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cajal%3A+lessons+on+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Rev%22%5BJournal%5D)">Cajal: lessons on brain development.</a> Brain Res Rev. 55 (2), 481-489 (2007).</li>
<li>Gabbott, P. L., Somogyi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+%22single%22+section+Golgi-impregnation+procedure%3A+methodological+description%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">The "single" section Golgi-impregnation procedure: methodological description.</a> J Neurosci Methods. 11 (4), 221-230 (1984).</li>
<li>Zaqout, S., Kaindl, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golgi-Cox+staining+step+by+step%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Golgi-Cox staining step by step.</a> Front Neuroanat. 10 (38), (2016).</li>
<li>superGolgi Kit. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf">http://www.ihcworld.com/products/ssdatasheets/superGolgi%20Kit%20Datasheet%20Protocol.pdf</a> (2017).</li>
<li>Vibroslice NVSL & Vibroslice NVSLM123. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf">https://www.wpiinc.com/clientuploads/pdf/NVSL_NVSLM1_IM.pdf</a> (2000).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Neurolucida+11.03%22">Neurolucida 11.03</a>. , MBF Bioscience. Williston, VT USA. (2017).</li>
<li>Sholl, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+organization+in+the+neurons+of+the+visual+and+motor+cortices+of+the+cat%5BTitle%5D)+AND+%22J+Anat%22%5BJournal%5D)">Dendritic organization in the neurons of the visual and motor cortices of the cat.</a> J Anat. 87 (4), 387-406 (1953).</li>
<li>Pillai, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+morphology+of+hippocampal+and+amygdalar+neurons+in+adolescent+mice+is+resilient+to+genetic+differences+in+stress+reactivity%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Dendritic morphology of hippocampal and amygdalar neurons in adolescent mice is resilient to genetic differences in stress reactivity.</a> PLoS ONE. 7 (6), (2012).</li>
<li>Morley, B. J., Mervis, R. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+spine+alterations+in+the+hippocampus+and+parietal+cortex+of+alpha7+nicotinic+acetylcholine+receptor+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Dendritic spine alterations in the hippocampus and parietal cortex of alpha7 nicotinic acetylcholine receptor knockout mice.</a> Neuroscience. 233, 54-63 (2013).</li>
<li>Titus, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypobaric+hypoxia-induced+dendritic+atrophy+of+hippocampal+neurons+is+associated+with+cognitive+impairment+in+adult+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Hypobaric hypoxia-induced dendritic atrophy of hippocampal neurons is associated with cognitive impairment in adult rats.</a> Neuroscience. 145 (1), 265-278 (2007).</li>
<li>Groves, T. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Fluorouracil+chemotherapy+upregulates+cytokines+and+alters+hippocampal+dendritic+complexity+in+aged+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Behavioral+Brain+Research%22%5BJournal%5D)">5-Fluorouracil chemotherapy upregulates cytokines and alters hippocampal dendritic complexity in aged mice.</a> Behavioral Brain Research. 316, 215-224 (2017).</li>
<li>Risher, W. C., Ustunkaya, T., Singh Alvarado, J., Eroglu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+Golgi+analysis+method+for+efficient+and+unbiased+classification+of+dendritic+spines%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Rapid Golgi analysis method for efficient and unbiased classification of dendritic spines.</a> PloS One. 9 (9), (2014).</li>
<li>Kaufmann, W. E., Moser, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+anomalies+in+disorders+associated+with+mental+retardation%5BTitle%5D)+AND+%22Cerebral+cortex%22%5BJournal%5D)">Dendritic anomalies in disorders associated with mental retardation.</a> Cerebral cortex. 10 (10), 981-991 (2000).</li>
<li>Kulkarni, V. A., Firestein, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+dendritic+tree+and+brain+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The dendritic tree and brain disorders.</a> Mol Cell Neurosci. 50 (1), 10-20 (2012).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

W porównaniu z bardziej nowoczesnymi technikami, metoda Golgiego-Coxa ma kilka zalet, które sprawiają, że jest preferowaną metodą badania morfologii kręgosłupa: 1) barwienie może być stosowane do praktycznie każdej tkanki, 2) podstawowa konfiguracja mikroskopu świetlnego to wszystko, co jest potrzebne do uzyskania obrazów opartych na Golgim, 3) obrazowanie Golgiego-Coxa jest szybsze niż obrazowanie konfokalne oraz 4) wybarwione skrawki Golgiego są żywotne przez kilka miesięcy do lat dłużej niż próbki znakowane fluorescen...

Dendryty to największa część neuronów, które odbierają i przetwarzają presynaptyczne dane wejściowe1. Ich wyrostki dendrytyczne mają złożoną geometrię, w której gałęzie proksymalne mają większą średnicę niż gałęzie dystalne. W miarę rozwoju dendrytów tworzą one kilka połączeń z innymi neuronami w procesie zwanym arboryzacją dendrytyczną. Zakres i wzorzec tego rozgałęzienia określa ilość wejść synaptycznych, które dendryt może odpowiednio przetworzyć2.
Arboryzacja dendrytyczna jest niezbędnym procesem dla plastyczności zależnej od aktywności i prawidłowego rozwoju obwodów neuronalnych. Wydłużanie, retrakcja, rozgałęzianie i synaptogeneza to skomplikowane procesy, które obejmują wewnętrzne programy genetyczne i wpływy czynników zewnętrznych. Morfologiczne i rozgałęzione odmiany dendrytów neuronalnych w hipokampie są zaangażowane w procesy poznawcze i tworzenie pamięci3,4. Zmiany w złożoności dendrytycznej są związane ze zmianami patofizjologicznymi i behawioralnymi5. Nieprawidłowości są związane z kilkoma stanami chorobowymi, w tym zespołem łamliwego chromosomu X i zespołem Downa6.
Kolce dendrytyczne to wyspecjalizowane subkomórkowe przedziały altan dendrytycznych, które otrzymują bodźce pobudzające w obrębie ośrodkowego układu nerwowego. Istnieją trzy klasy morfologiczne kolców dendrytycznych, których nazwa zależy od ich wielkości i kształtu: 1) kolce grzybowe, które mają złożone gęstości postsynaptyczne z większą liczbą receptorów glutaminianu niż inne kolce7; 2) przysadziste kolce, które nie mają łodygi; oraz 3) cienkie kolce, które składają się z wydłużonego, wąskiego trzonu i kulistej głowy8. Objętość grzbietu dendrytycznego jest częściowo używana do ich zdefiniowania, przy czym cienkie kolce są na ogół mniejsze (0,01 μm3) w porównaniu z kolcami grzybów (0,8 μm3)9,10. Kolce stabilizują się wraz z dojrzewaniem. Na przykład cienkie kolce albo chowają się po kilku dniach, albo przekształcają się w kolce grzybowe. Alternatywnie, kolce grzybów są stosunkowo stabilne i mogą przetrwać przez dłuższy czas. Uważa się, że siła połączeń neuronalnych zależy od liczby kolców i/lub ich objętości11,12,13.
Klasyczna metoda barwienia metodą Golgiego i jej bardziej nowoczesne odmiany były przydatne do badania morfologii i gęstości kolców dendrytycznych. Jednym z unikalnych aspektów barwienia Golgiego jest to, że losowo barwi około 5% wszystkich neuronów, co pozwala na śledzenie poszczególnych neuronów14,15. Chociaż dokładny mechanizm, w którym metoda Golgiego barwi poszczególne neurony, jest nadal nieznany, zasada metody opiera się na krystalizacji chromianu srebra (Ag2CrO4)16,17. Istnieją trzy główne typy metody Golgiego: szybki Golgi, Golgi-Cox i Golgi-Kopsch18,19. Wszystkie trzy metody rozpoczynają się od początkowej fazy inkubacji w solach chromu przez kilka dni do miesięcy, ale istnieją między nimi pewne kluczowe różnice. Szybki Golgi wykorzystuje w pierwszym etapie tetratlenek osmu, podczas gdy Golgi-Kopsch zawiera paraformaldehyd. Po barwieniu zarówno w rapid-Golgi, jak i Golgi-Kopsch następuje inkubacja w 1-2% roztworze azotanu srebra przez około 7 dni. Metoda Golgiego-Coxa wykorzystuje chlorek rtęci i dwuchromian potasu zamiast azotanu srebra, a czas impregnacji wynosi 2-4 tygodnie. Tkanki są następnie cięte na sekcje i szybko umieszczane w rozcieńczonym roztworze amoniaku, a następnie utrwalaczem fotograficznym w celu usunięcia soli. Spośród tych trzech typów, metoda Golgiego-Coxa jest uważana za najlepszą w barwieniu dendrytycznych altan bez dużej ingerencji tła, częściowo dlatego, że artefakty kryształowe nie występują na powierzchni tkanki (w przeciwieństwie do szybkiej metody Golgiego)17,20,21.
Obecna metoda jest niewielką odmianą protokołu dostarczanego z komercyjnym zestawem do barwienia Golgiego i została zaprojektowana, aby ocenić, jak stosunkowo niska dawka 5-Fu wpłynie na dendrytyczne cechy morfologiczne i gęstość kręgosłupa. Wszelkie uzyskane dane mogą dostarczyć dalszych informacji na temat tego, jak chemioterapia wpływa na obwody neuronalne.

<table><tbody><tr><td>Zestaw superGolgi&nbsp;</td><td>Bioenno Nauki Przyrodnicze</td><td>30100</td><td>&nbsp; Zawiera materiały niebezpieczne.&nbsp;</td></tr><tr><td>PBS 10x koncentrat w proszku</td><td>Fisher&nbsp;</td><td>BP665-1</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>9002-93-1</td><td></td></tr><tr><td>Permount&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>SP 15-100</td><td></td></tr><tr><td>Pokrywa przesuwna&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>12-546-14</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta transferowa 7 ml&nbsp;</td><td>Globe Naukowy&nbsp;</td><td>135030</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Falcon 10 ml&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>352099 Folia&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>01-213-105</td><td></td></tr><tr><td>Płytka 12-dołkowa&nbsp;</td><td>BD Nauki Biologiczne&nbsp;</td><td></td><td></td>353043</tr><tr><td>200 proof Etanol&nbsp;</td><td>Pharmco-AAPER</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Ksyleny&nbsp;</td><td>Acros Organics&nbsp;</td><td>1330-20-7</td><td>Niebezpieczne.&nbsp;</td></tr><tr><td>Permabond 200</td><td>Permabond LLC</td><td>GF2492</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta serologiczna 25 ml</td><td>Sigma</td><td>SIAL1489</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Midsci</td><td>HS234526C&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Wibratom&nbsp;</td><td>Światowe instrumenty precyzyjne&nbsp;</td><td>Myszy męskie NVSLM1</td><td></td></tr><tr><td>C57Bl/6&nbsp;</td><td>Laboratorium Jacksona&nbsp;</td><td></td><td></td>000664</tr><tr><td>Axio Imager 2</td><td>ZEISS</td><td>Wiele komponentów, szczegółowe informacje można znaleźć na stronie internetowej.&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Kamera AxioCam MRc</td><td>ZEISS</td><td>426508-9902-000</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do barwienia, zestaw</td> naczyń do barwienia Green <td>Tissue-Tek</td><td>62541-12</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Nauki o mikroskopii elektronowej&nbsp;</td><td>70312-20</td><td></td></tr><tr><td>Zmotoryzowany napełniacz do pipet&nbsp;</td><td>Rybacy&nbsp;</td><td>03-692-168</td><td></td></tr><tr><td>Neurolucida&nbsp;</td><td>mbf Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Odkrywca Neurolucida&nbsp;</td><td>mbf Bioscience&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pryzmat&nbsp;</td><td>Podkładka</td><td></td><td></td> graficzna</tr></tbody></table>

ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody golgiego-coxa

Assessment of Hippocampal Dendritic Complexity in Aged Mice Using the Golgi-Cox Method

Kolce dendrytyczne to wypukłości z neuronalnych trzonów dendrytycznych, które zawierają synapsy pobudzające. Morfologiczne i rozgałęzione odmiany dendrytów neuronalnych w hipokampie są zaangażowane w poznanie i tworzenie pamięci. Istnieje kilka podejść do barwienia metodą Golgiego, z których wszystkie były przydatne do określania cech morfologicznych altan dendrytycznych i tworzenia wyraźnego tła. Obecna metoda Golgiego-Coxa (niewielka odmiana protokołu, która jest dostarczana z komercyjnym zestawem do barwienia Golgiego) została zaprojektowana w celu oceny, w jaki sposób stosunkowo niska dawka leku chemioterapeutycznego 5-flurouracylu (5-Fu) wpłynie na morfologię dendrytów, liczbę kolców i złożoność arboryzacji w obrębie hipokampa. 5-Fu znacząco modulował złożoność dendrytyczną i zmniejszał gęstość kręgosłupa w całym hipokampie w sposób specyficzny dla regionu. Przedstawione dane pokazują, że metoda barwienia Golgiego skutecznie wybarwiła dojrzałe neurony w CA1, CA3 i zakręcie zębatym (DG) hipokampa. Protokół ten informuje o szczegółach każdego kroku, dzięki czemu inni badacze mogą niezawodnie barwić tkanki w całym mózgu, uzyskując wysokiej jakości wyniki i minimalizując rozwiązywanie problemów.

Oddziaływanie leczenia 5-Fu na drzewiaste rozgałęzienia i złożoność w hipokampie na barwionych metodą Golgiego przekrojach mózgu zostało zmierzone ilościowo i prześledzone za pomocą komercyjnie dostępnego oprogramowania do analizy obrazów. Po zakończeniu śledzenia, analizie poddano drzewiaste rozgałęzienia, gęstość kolców oraz morfologię kolców, wykorzystując analizę Sholla i indeks złożoności dendrytycznej (DCI). Analiza Sholla to ilościowa metoda analityczna, która może być używana do o...

Tutaj prezentujemy szczegółowo protokół Golgi-Cox. Ta niezawodna metoda barwienia tkanek pozwala na wysokiej jakości ocenę cytoarchitektury w hipokampie i w całym mózgu, przy minimalnym rozwiązywaniu problemów.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Dendritic spines are the protuberances from the neuronal dendritic shafts that contain&#160; excitatory synapses. The morphological and branching ...

Ogólnym celem niniejszej metodologii jest prawidłowe barwienie tkanki mózgowej metodą Golgiego w celu zbadania i ilościowego określenia morfologii oraz złożoności dendrytów. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neuronauki. Ponieważ barwienie Golgiego obejmuje jedynie niewielki podzbiór komórek, technikę tę można wykorzystać do śledzenia struktury neuronów.Główną zaletą tej techniki jest możliwość łatwego barwienia przekrojów mózgu bez ryzyka ich wyschnięcia lub odklejenia podczas któregokolwiek z etapów płukania. Procedurę zaprezentują Fred Kiffer, Tyler Alexander i Julie Anderson, doktoranci w laboratorium dr. Allena. Należy rozpocząć od zanurzenia świeżo pobranych, nieutrwalonych połówek mózgów gryzoni w pięciu mililitrach roztworu na bazie chlorku rtęci.Ponieważ roztwór chlorku rtęci jest wrażliwy na światło, należy owinąć probówkę folią. Próbki należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnego dnia należy powoli odlać roztwór do tymczasowego pojemnika, a następnie odpowiednio zutylizować go w pojemniku na odpady biologiczne.Dodaj pięć mililitrów świeżego roztworu chlorku rtęci i upewnij się, że mózgi są całkowicie zanurzone. Przechowuj próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez kolejne 13 dni. Po 14 dniach przygotuj bufor poimpregnacyjny, dodając 30 gramów sproszkowanego buforu poimpregnacyjnego do 90 mililitrów wody destylowanej lub dejonizowanej, DH2O.Napełnij każde dołkowanie płytki sześciodołkowej 6,5 mililitrami buforu poimpregnacyjnego, przeznaczając jedno dołkowanie na jeden mózg. Następnie usuń roztwór chlorku rtęci z tkanki mózgowej w sposób opisany wcześniej. Przepłucz tkankę wodą DH2O, a następnie przenieś ją do płytek sześciodołkowych z buforem poimpregnacyjnym.Przykryć płytki folią i przechowywać w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnego dnia odessać i wymienić bufor poimpregnacyjny. Ponownie przykryć płytkę i przechowywać w lodówce w temperaturze 4°C.Przygotuj dwie lub trzy płytki 12-dołkowe na jeden mózg, zaczynając od ponumerowania pokrywek płytek w kolejności rosnącej od lewej do prawej i od góry do dołu. Dodaj numer identyfikacyjny sekcjonowanego mózgu. Pipetuj 2 mL 1X PBS do każdego dołka każdej płytki, a następnie ustaw stół i włącz wibratom.Następnie naklej taśmę na blok tkankowy uchwytu do próbek i nałóż na górę niewielką ilość kleju cyjanoakrylowego. Wyjmij mózg z płytki sześciodołkowej i umieść go na plastikowym lub szklanym naczyniu. Używając dwukrawędziowego ostrza ze stali nierdzewnej, przetnij móżdżek w kierunku ogonowym, upewniając się, że część móżdżku pozostała na mózgu jest płaska.Następnie płaską powierzchnię pozostałej części móżdżku należy przyłożyć do kleju. Po wyschnięciu kleju uchwyt z tkanką umieszcza się w kąpieli dla preparatu. Kąpiel z preparatem należy umieścić w wibratomie i zalać próbkę tkanki PBS.Następnie przymocuj ostrze do uchwytu ostrza w wibrotomie i powoli opuść je do kąpieli z preparatem, aż zostanie całkowicie zanurzone i znajdzie się nieco poniżej górnej powierzchni tkanki. Następnie ustaw prędkość wibrotomu na siedem, amplitudę na sześć, a kąt cięcia na 12 stopni. Uruchom wibracje i wykonaj cięcia o grubości 200 µm.Za pomocą dużego pędzla przenieś przekroje tkankowe z kąpieli z preparatem do odpowiednich dołków płytek 12-dołkowych. Kontynuuj cięcie tkanki, aż do uzyskania pożądanej liczby przekrojów. Po sekcjonowaniu odessij PBS z dołków płytki 12-dołkowej za pomocą pipety transferowej, następnie dodaj dwa mililitry PBS-T i płucz przez 30 minut przy jednoczesnym mieszaniu.Pod koniec etapu płukania rozcieńczyć trzy części roztworu wodorotlenku amonu z pięcioma częściami DH2O. Następnie, po usunięciu PBS-T, dodać rozcieńczony roztwór wodorotlenku amonu. Chronić przed światłem za pomocą folii i barwić skrawki przez 19 do 21 minut.Następnie, po bezpiecznym usunięciu roztworu wodorotlenku amonu, należy dodać bufor po barwieniu. Osłonić folią i barwić przez kolejne 19 do 21 minut. Na koniec wypłukać skrawki w PBS-T trzykrotnie, przez 5 do 10 minut za każdym razem.Przenieść skrawki na szkiełka pokryte 1% żelatyną za pomocą dużego pędzla. Pozostawić je do wyschnięcia na 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieścić w naczyniu Coplina i pozostawić na noc. Wyjąć szkiełka z naczynia Coplina i umieścić je w plastikowym statywie w dygestorium.Umieść preparaty w kuwecie do barwienia zawierającej 100% ethanol na pięć minut. Odwodnij skrawki, przeprowadzając dwa kolejne pięciominutowe płukania w ethanolu. Następnie umieść szkiełka w statywie szklanym i za pomocą metalowego uchwytu opuść statyw do szklanej kuwety do barwienia zawierającej 99% xylene.Przemyj preparaty w dwóch kolejnych porcjach ksylenu przez pięć minut każda. Po upływie czasu drugiego płukania wyjmij preparaty z ksylenu pojedynczo i szybko pokryj tkankę około 0,25 milliliters medium montażowego. Następnie weź szkiełko nakrywkowe i połóż je na medium.Wypchnij wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza spod szkiełek nakrywkowych do krawędzi za pomocą tępego przedmiotu, np. końcówki pędzla. Umieść preparaty w miejscu osłoniętym od bezpośredniego działania promieni słonecznych i pozostaw do wyschnięcia na dwa do trzech dni. Po wyschnięciu przystąp do akwizycji obrazów przy użyciu mikroskopu oraz do analizy z zastosowaniem odpowiedniego oprogramowania.Ten obraz w polu jasnym przedstawia neuron barwiony metodą Golgiego, który spełnia kryteria obrazowania i dalszej analizy. Wszystkie trzy typy kolców są wyraźnie widoczne. Barwienie jest jednorodne na całej długości dendrytu, a sam dendryt jest odizolowany od innych neuronów.Rysunek ten pokazuje, że neurony barwione metodą Golgiego w obrębie zakrętu zębatego wykazywały zmniejszoną długość w czwartym i szóstym rzędzie po leczeniu 5-fluorouracylem w porównaniu z grupą traktowaną solą fizjologiczną. Barwienie metodą Golgiego może być wykorzystane do wykrywania istotnych różnic w gęstości kolców. W apikalnych dendrytach piramidowych obszaru CA1 podanie 5-fluorouracylu żywym myszom znacząco zmniejszyło gęstość kolców.W dendrytach bazalnych nie odnotowano istotnych zmian w ogólnej gęstości kolców. Analiza Sholla dendrytów apikalnych neuronów piramidowych obszaru CA1 wykazała, że traktowanie 5-fluorouracylem znacząco zmniejszyło arboryzację dendrytową w odległości od 40 do 160 µm od somy. W dendrytach bazalnych traktowanie 5-fluorouracylem zmniejszyło arboryzację dendrytową w odległości od 30 do 110 µm od somy.Po opanowaniu, technika ta, obejmująca zarówno proces barwienia metodą Golgiego, jak i montowanie, czyszczenie oraz przykrywanie, może zostać wykonana w ciągu trzech godzin na jeden mózg, jeśli jest przeprowadzana prawidłowo. Po opracowaniu ta metoda utorowała drogę badaczom w dziedzinie neurobiologii do eksploracji połączeń neuroanatomicznych w modelu mysim. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, aby trzymać skrawki w roztworze wodorotlenku amonu przez zaledwie 19 do 21 minut, aby nie doprowadzić do nadmiernego zabarwienia neuronów.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać rzetelną wiedzę na temat prawidłowego barwienia, krojenia i płukania tkanki mózgowej. Należy pamiętać, że praca z roztworem na bazie chlorku rtęci, roztworem wodorotlenku amonu oraz ksylenem może być niezwykle niebezpieczna, dlatego należy zachować ostrożność, używać rękawic laboratoryjnych i pracować pod wyciągiem podczas wykonywania tej procedury.

assessment-hippocampal-dendritic-complexity-aged-mice-using-golgi-cox

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

W tym nagranym protokole zaprezentowano technikę sekcji służącą do usunięcia zakrętu zębatego u dorosłej myszy przy użyciu stereomikroskopu.

Disekcja zakrętu zębatego hipokampa dorosłej myszy

W niniejszym artykule przedstawiono procedury przygotowywania skrawków hipokampa szczurów oraz myszy transgenicznych w celu badania zmian synaptycznych związanych ze starzeniem się mózgu i neurodegeneracyjnymi chorobami starczymi, takimi jak choroba Alzheimera.

Przygotowanie ostrych skrawków hipokampa szczurów i myszy transgenicznych do badania zmian synaptycznych podczas starzenia się i patologii amyloidowej

Ten artykuł opisuje procedury stymulacji dotykowej szczeniąt szczurów i późniejszego barwienia morfologii neuronów metodą Golgiego-Coxa. Stymulacja dotykowa to pozytywne doświadczenie, które podaje się w okresie okołoporodowym poprzez głaskanie szczeniąt domowym miotełkiem do kurzu. Barwienie metodą Golgiego-Coxa jest niezawodną procedurą pozwalającą na wizualizację całych neuronów.

Wizualizacja wpływu pozytywnego wczesnego doświadczenia, stymulacji dotykowej, na morfologię dendrytyczną i łączność synaptyczną za pomocą barwienia Golgiego-Coxa

Opisujemy dwie metody wizualizacji i kwantyfikacji arboryzacji dendrytycznej w hipokampie modeli mysich: obrazowanie w czasie rzeczywistym i rozszerzoną głębię ostrości. Podczas gdy pierwsza metoda pozwala na zaawansowane śledzenie topograficzne i ilościowe określenie zakresu rozgałęzień, druga pozwala na szybką wizualizację drzewa dendrytycznego.

Ocena arboryzacji dendrytycznej w zakręcie zębatym okolicy hipokampa u myszy

Przedstawiamy protokół do użycia metody barwienia Golgiego-Coxa w grubych fragmentach mózgu, w celu wizualizacji neuronów z długimi drzewami dendrytycznymi zawartymi w pojedynczych próbkach tkanek. Przedstawiono również dwa warianty tego protokołu, które obejmują barwienie przeciwstawne fioletem krezylowym i zamrażanie nieprzetworzonych mózgów w celu długotrwałego przechowywania.

Obrazowanie neuronów w grubych sekcjach mózgu metodą Golgiego-Coxa

Protokół do dokładnej identyfikacji i analizy synaps w wycinkach hipokampa za pomocą immunofluorescencji jest opisany w tym artykule.

Ocena gęstości synaps w wycinkach mózgu gryzoni w hipokampie

Celem tego protokołu jest opisanie podejścia do analizy zachowania dorosłych nerwowych komórek macierzystych/progenitorowych w odpowiedzi na manipulację chemogenetyczną specyficznego lokalnego obwodu neuronowego.

Regulacja specyficzna dla obwodu testowego dorosłych nerwowych komórek prekursorowych hipokampa

To jest protokół do przygotowania ostrych plastrów z dorosłych i starzejących się hipokampów myszy, który wykorzystuje transcardialną perfuzję i cięcie plastrów za pomocą lodowatego NMDG-aCSF w celu zmniejszenia niedotlenienia tkanki. Uzyskane w ten sposób plastry pozostają zdrowe przez wiele godzin i nadają się do długotrwałych nagrań typu patch-clamp i nagrań terenowych.

Minimalizacja niedotlenienia w plastrach hipokampa od dorosłych i starzejących się myszy

Przedstawiamy protokół przygotowania ostrych plastrów z grzbietowo-pośredniego hipokampa myszy. Porównujemy ten preparat poprzeczny z cięciem koronalnym pod względem jakości zapisów i zachowania cech morfologicznych zarejestrowanych neuronów.

Przygotowanie ostrych wycinków z grzbietowego hipokampa do zapisu całych komórek i rekonstrukcji neuronów w zakręcie zębatym dorosłych myszy

Protokół opisuje modyfikację szybkiej metody Golgiego, która może być dostosowana do dowolnej części układu nerwowego, do barwienia neuronów w hipokampie i przyśrodkowej korze przedczołowej szczura.

Szybkie barwienie Golgiego do wizualizacji dendrytycznego kręgosłupa w hipokampie i korze przedczołowej

Poznaj metodę Golgiego-Coxa do oceny złożoności dendrytycznej w hipokampie starszych myszy. Technika umożliwia wysokiej jakości wizualizację morfologii neuronów bez ryzyka uszkodzenia tkanek.

Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Przeglądaj więcej filmów