Ocena złożoności dendrytycznej hipokampa u starszych myszy przy użyciu metody Golgiego-Coxa

Ogólnym celem tej metodologii jest prawidłowe barwienie tkanki mózgowej metodą Golgiego w celu zbadania i ilościowego określenia morfologii i złożoności dendrytycznej. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii. Ponieważ barwienie metodą Golgiego barwi tylko niewielki podzbiór komórek, technika ta może być wykorzystana do śledzenia struktury neuronów.

Główną zaletą tej techniki jest to, że skrawki mózgu można łatwo zabarwić bez ryzyka ich wyschnięcia lub odpadnięcia podczas któregokolwiek z etapów mycia. Procedurę zademonstrują Fred Kiffer, Tyler Alexander i Julie Anderson, doktoranci w laboratorium dr Allena. Zacznij od zanurzenia świeżo zebranych, nieutrwalonych półmózgów gryzoni w pięciu mililitrach lub roztworze na bazie chlorku rtęci.

Ponieważ roztwór chlorku rtęci jest wrażliwy na światło, przykryj probówkę folią. Próbki należy przechowywać w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnego dnia powoli przelej roztwór do tymczasowego pojemnika przed prawidłowym wyrzuceniem go do pojemnika na odpady stanowiące zagrożenie biologiczne.

Dodaj pięć mililitrów świeżego roztworu chlorku rtęci i upewnij się, że mózgi są zanurzone. Próbki należy umieścić w ciemności w temperaturze pokojowej przez kolejne 13 dni. Po 14 dniach przygotuj bufor po impregnacji, dodając 30 gramów zasilanego buforu po impregnacji do 90 mililitrów wody destylowanej lub dejonizowanej, DH2O.

Napełnij każdą studzienkę sześciodołkowej płytki 6,5 mililitra buforu po impregnacji, po jednym dołku na mózg. Następnie usuń roztwór chlorku rtęci z tkanki mózgowej, tak jak poprzednio. Przepłukać tkankę DH2O, a następnie przenieść tkankę do płytek sześciodołkowych z buforem po impregnacji.

Przykryj talerze folią i przechowuj w temperaturze pokojowej w ciemności. Następnego dnia odessać i wymienić bufor po impregnacji. Ponownie przykryj talerz i przechowuj w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza.

Przygotuj dwie lub trzy 12-dołkowe płytki na mózg, najpierw oznaczając płytki na ich pokrywkach numerami w kolejności rosnącej od lewej do prawej i od góry do dołu. Dodaj numer identyfikacyjny mózgu poddanego sekcji. Odpipetuj dwa mililitry 1X PBS do każdego dołka każdej płytki, a następnie ustaw scenę i włącz wibratom.

Następnie nałóż taśmę na blok tkanki uchwytu próbki i dodaj trochę kleju cyjanoakrylowego na wierzch. Wyjmij mózg z sześciodołkowej płytki i umieść go na plastikowym lub szklanym naczyniu. Użyj obosiecznego ostrza ze stali nierdzewnej, aby przeciąć móżdżek doogonowo, upewniając się, że część móżdżku pozostała na mózgu jest płaska.

Następnie umieść płaską powierzchnię pozostałego móżdżku na kleju. Po wyschnięciu kleju umieść uchwyt na próbkę wraz z chusteczką w kąpieli z próbką. Umieścić kąpiel z próbką na wibratomie i przykryć próbkę tkanki PBS.

Następnie przymocuj ostrze do uchwytu ostrza wibratomu i powoli opuść ostrze do kąpieli próbki, aż zostanie całkowicie zanurzone i nieco poniżej górnej części tkanki. Następnie ustaw prędkość wibratomu na siedem, amplitudę na sześć, a kąt cięcia na 12 stopni. Rozpocznij wibracje i wytnij odcinki o grubości 200 mikronów.

Użyj dużego pędzla, aby przesunąć skrawki tkanki z kąpieli próbki do każdego wyznaczonego dołka 12-dołkowych płytek. Kontynuuj cięcie tkanki, aż zostanie osiągnięta żądana liczba odcinków tkanki. Po podziale na sekcje użyć pipety transferowej, aby zassać PBS z dołków 12-dołkowej płytki, a następnie dodać dwa mililitry PBS-T i myć przez 30 minut z mieszaniem.

Pod koniec okresu płukania rozcieńczyć trzy części roztworu wodorotlenku amonu pięcioma częściami DH2O. Następnie, po usunięciu PBS-T, dodać rozcieńczony roztwór wodorotlenku amonu. Chronić przed światłem za pomocą folii i bejcować sekcje przez 19 do 21 minut.

Następnie, po bezpiecznym usunięciu roztworu wodorotlenku amonu, dodać bufor po barwieniu. Zabezpiecz folią i bejcą przez kolejne 19 do 21 minut. Na koniec przepłucz skrawki w PBS-T trzy razy przez pięć do 10 minut za każdym razem.

Zamontuj sekcje na szkiełkach pokrytych żelatyną 1% za pomocą dużego pędzla. Pozostaw je do wyschnięcia na 20 do 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie umieść je w słoiku Coplin i pozostaw na noc. Wyjmij szkiełka z Coplin Jar i umieść je w plastikowym stojaku w dygestorium.

Umieść w naczyniu barwiącym zawierającym 100% etanol na pięć minut. Odwodnić sekcje przez dwa kolejne pięciominutowe płukanie etanolem. Następnie umieść szkiełka w szklanym stojaku i za pomocą metalowego uchwytu opuść ruszt do szklanego naczynia do barwienia zawierającego 99% ksylenu.

Myć szkiełka w dwóch zmianach ksylenu przez pięć minut każda. Po upływie czasu na drugie pranie wyjmij szkiełka z ksylenu pojedynczo i szybko przykryj chusteczkę około 0,25 mililitra podłoża montażowego. Następnie weź przesuwną osłonę i połóż ją na nośniku.

Wepchnij wszelkie uwięzione pęcherzyki powietrza pod osłonami prowadnic do krawędzi przedmiotem, takim jak koniec pędzla. Umieść szkiełka w miejscu wolnym od bezpośredniego światła słonecznego i pozostaw do wyschnięcia na dwa do trzech dni. Po wysuszeniu przystąp do akwizycji obrazu za pomocą mikroskopu i analizy za pomocą odpowiedniego oprogramowania.

Ten obraz w jasnym polu pokazuje neuron zabarwiony metodą Golgiego, który spełnia kryteria obrazowania i dalszej analizy. Wszystkie trzy typy kręgosłupa są łatwo widoczne. Barwienie jest spójne na całej długości dendrytu, a dendryt jest izolowany od innych neuronów.

Rysunek ten pokazuje, że neurony barwione metodą Golgiego w zakręcie zębatym wykazywały zmniejszoną długość w czwartym i szóstym rzędzie po leczeniu 5-fluorouracylem w porównaniu z grupą leczoną solą fizjologiczną. Barwienie metodą Golgiego może być stosowane do wykrywania znacznych różnic w gęstości kręgosłupa. W dendrytach piramidowych wierzchołkowych CA1 podawanie 5-fluorouracylu żywym myszom znacznie zmniejszyło gęstość kręgosłupa.

W dendrytach podstawnych nie zaobserwowano istotnych zmian w ogólnej gęstości kolców. Analiza Sholla wierzchołkowych dendrytów piramidowych CA1 wykazała, że leczenie 5-fluorouracylem znacznie zmniejszyło arboryzację dendrytyczną w odległości od 40 do 160 mikronów od somy. W podstawowych dendrytach leczenie 5-fluorouracylem zmniejszyło arboryzację dendrytyczną w odległości od 30 do 110 mikronów od somy.

Po opanowaniu, technika ta, uwzględniająca zarówno proces barwienia metodą Golgiego, jak i montaż, czyszczenie i pokrywanie można wykonać w ciągu trzech godzin na mózg, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do badania połączeń neuroanatomicznych w modelu mysim. Próbując tej procedury, ważne jest, aby pamiętać, aby trzymać skrawki w roztworze wodorotlenku amonu tylko przez 19 do 21 minut, aby nie przebarwić neuronów.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak prawidłowo barwić, ciąć i płukać tkankę mózgową. Nie zapominaj, że praca z roztworem na bazie chlorku rtęci, roztworem wodorotlenku amonu i ksylenem może być bardzo niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zachować środki ostrożności i nosić rękawice laboratoryjne oraz pracować pod wyciągiem.