Name: Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 26 s
Description: Poznaj metodę szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego łączenia neuronów przy użyciu mikropipet i mikrofluidycznych komór. Technika ta umożliwia badanie tempa wzrostu neuronów oraz wpływu czynników mechanicznych na rozwój połączeń nerwowych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Chcielibyśmy podziękować Yoichi Miyaharze za wiele pomocnych dyskusji i spostrzeżeń. MA i PG potwierdzają finansowanie z NSERC.

Wszystkie procedury opisane poniżej zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu McGill i były zgodne z wytycznymi Kanadyjskiej Rady Opieki nad Zwierzętami.
1. Standaryzacja kultur neuronalnych za pomocą urządzeń mikroprzepływowych: montaż urządzenia
<ol>
	<li>Wybierz odpowiednie urządzenie mikroprzepływowe do żądanego eksperymentu. Aby połączyć neurony w tej samej populacji, użyj urządzeń neurologicznych (<silna klasa="xfig">Rysunek 1), a aby połączyć neurony w różnych populacjach, użyj urządzeń do współhodowli (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
	<li>Oczyść i przygotuj żądaną liczbę sterylnych szkiełek nakrywkowych lub naczyń ze szklanym dnem. Aby uzyskać najlepsze rezultaty na powierzchniach plastikowych, używaj naczyń o średnicy 35 mm, na szkle użyj szkiełek nakrywkowych o średnicy 25 mm lub naczyń ze szklanym dnem o średnicy 35 mm. Wybierz grubość szkła w zależności od systemu obrazowania, na przykład 0,15 mm.</li>
	<li>Pokryj naczynia lub szkiełka nakrywkowe 0,5-1 ml 100 μg/ml PDL przez 2 godziny lub przez noc w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: W tym miejscu można wstrzymać protokół i w razie potrzeby wznowić go następnego dnia. Co więcej, naczynia mogą być pokryte PDL rozcieńczonym buforem boranowym, poli-L-lizyną (PLL), lamininą lub dowolną inną cząsteczką adhezyjną komórek.</li>
	<li>Umyj naczynia dwukrotnie wodą (nie używaj soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS), ponieważ kryształki soli mogą zablokować kanały), usuń cały płyn i pozostaw do wyschnięcia w sterylnym środowisku, takim jak szafka bezpieczeństwa biologicznego, przez 5-10 minut lub do całkowitego wyschnięcia powierzchni. 
	Uwaga: Należy uważać, aby szkiełka nakrywkowe były całkowicie suche, ponieważ pozostały płyn będzie zakłócał przyleganie układów mikroprzepływowych.</li>
	<li>Umieść urządzenia mikroprzepływowe z wzorami skierowanymi do góry pod wpływem światła UV w sterylnym środowisku (komora bezpieczeństwa biologicznego) na 10 minut. Upewnij się, że przestrzegasz sterylnych procedur podczas pracy w komorze bezpieczeństwa biologicznego10.</li>
	<li>Za pomocą pęsety umieść urządzenie mikroprzepływowe wzorem skierowanym w dół w kontakcie z czystym szkiełkiem nakrywkowym/naczyniem. Za pomocą pęsety delikatnie dociśnij urządzenie, aby przylegało do szkła. 
	Uwaga: Przezroczystość przyleganego obszaru będzie widoczna, gdy patrzy się pod światło. Upewnij się, że wszystkie rogi stykają się ze szkłem. Zrób to ze wszystkimi urządzeniami mikroprzepływowymi. Zobacz Rysunek 1a .</li>
	<li>Aby napełnić urządzenie jednopopulacyjne pożywką, skieruj pipetę w stronę kanałów i dodaj 50 μl kompletnej pożywki komórkowej uzupełnionej bezsurowicą B-27 (stosunek objętości 1:50) i 500 μg/ml penicyliny/streptomycyny/glutaminy (zwanych łącznie NBM) do prawej górnej studzienki, a następnie dodaj kolejne 50 μl do studzienki leżącej po przekątnej. Zrób to dla wszystkich urządzeń, upewniając się, że medium przepływa między studzienkami. Następnie dodaj 50 μl pożywki do pozostałych 2 dołków. Zobacz Rysunek 2a .
	<ol>
		<li>Aby napełnić urządzenie wielopopulacyjne pożywką, skieruj pipetę w stronę kanałów i dodaj 30 μl pełnego NBM do odpowiednich studzienek, patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 6a. Zrób to dla wszystkich urządzeń, upewniając się, że medium przepływa między studzienkami. Następnie dodaj 50 μl pożywki do pozostałych 4 studzienek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Umieścić urządzenia na większej płycie z otwartym naczyniem z autoklawowaną wodą (komora mokra) i umieścić w inkubatorze (37 °C, 5% CO2 i 95% wilgotności) na 1-2 godziny podczas przygotowywania hodowli komórkowej. Zobacz Rysunek 2b .</li>
</ol>
2. Powlekanie neuronów w układach mikroprzepływowych
<ol>
	<li>Postępując zgodnie z protokołem opisanym w Ref.8, uzyskaj zdysocjowane neurony hipokampa lub kory mózgowej z zarodków szczurów Sprague Dawley (dowolnej płci).</li>
	<li>Ponownie zawiesić neurony embrionalne w NBM w stężeniu 1-2 milionów neuronów/ml. Sprawdź stężenia komórek w mikroskopie za pomocą hemocytometru i postępuj zgodnie z odniesieniem8. Dostosuj stężenie komórek zgodnie z żądaną gęstością komórek. Aby zwiększyć szanse na uzyskanie pojedynczych aksonów hipokampa na kanał, umieść 10 000 neuronów na urządzenie. Aby mieć wiele aksonów w tym samym kanale, umieść 60 000 neuronów na urządzenie. 
	Uwaga: Liczby te różnią się w zależności od użytego typu neuronu.</li>
	<li>Usunąć pożywkę z urządzeń mikroprzepływowych bez opróżniania studzienek. Pozostaw około 5 μl w każdym.</li>
	<li>Aby umieścić komórki w urządzeniu z pojedynczą populacją, dodaj 50 μl NBM do prawego dolnego dołka. W tym momencie medium przepływa samoistnie, aby wypełnić drugą dolną studzienkę. Dodać 20 μl roztworu komórki koncentratu do prawego górnego dołka urządzenia mikroprzepływowego, jak pokazano w <silna klasa="xfig">Rysunek 1b.
	<ol>
		<li>Do komórek płytki w urządzeniu wielopopulacyjnym dodaj 20 μl roztworu komórek koncentratu do każdej z prawych studzienek w <silna klasa="xfig">Rysunek 6a.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki znajdują się w komorach i umieść urządzenia w inkubatorze na 15-30 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek do podłoża.</li>
	<li>Sprawdź w mikroskopie, czy w komorach jest wystarczająca liczba komórek. Jeśli potrzeba więcej, powtórz kroki 2.4 i 2.5.</li>
	<li>Dodać 50 μl NBM do 2 górnych studzienek urządzenia z pojedynczą populacją i 20 μl NBM do tego samego dołka, w którym komórki zostały wstrzyknięte do urządzenia wielopopulacyjnego. Podłoże lekko wystaje, tworząc dodatni menisk, nadając studzienkom górny wygląd muffinki. Ponownie zobacz Rysunek 2a.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 37 °C, 5% CO2 i wilgotności 95%.</li>
</ol>
3. Utrzymanie kultur neuronalnych
<ol>
	<li>Usunąć NBM (około 30 μl za pomocą pipety) z komórek i nałożyć nowy, wstępnie podgrzany NBM następnego dnia po ich wprowadzeniu do urządzeń (tj. 1 d po kroku 2).</li>
	<li>Sprawdzaj co 2 dni, czy w każdym kanale jest wystarczająca ilość nośnika. Jeśli wierzch muffinek jest niski, po prostu dodaj więcej podłoża do górnych dołków.</li>
	<li>Hodować komórki przez co najmniej 7 dni przed usunięciem urządzeń mikroprzepływowych. Komórki mogą przetrwać w tych urządzeniach przez kilka tygodni. Wyjmij urządzenia 1-2 dni przed przeprowadzeniem eksperymentów na próbkach.</li>
</ol>
4. Usuwanie urządzeń mikroprzepływowych
<ol>
	<li>1 - 2 dni przed wyjęciem urządzeń mikroprzepływowych, dodać 2 ml NBM wstępnie podgrzanego do 37 °C do każdej płytki na próbkę, zalewając komory, i konserwować urządzenia w inkubatorze.</li>
	<li>Użyj sterylnej pęsety i jednej końcówki, aby usunąć urządzenia mikroprzepływowe z szkiełek nakrywkowych, pozostawiając wzorzystą konfigurację neuronów. Użyj końcówki, aby przytrzymać szkiełko nakrywkowe na miejscu, a pęsety zacisnąć krawędź urządzenia w lewym dolnym rogu studni. Delikatnie przykręć urządzenie, podnosząc urządzenie pęsetą do góry, aby odkleiło się od szkiełka nakrywkowego. Zobacz Rysunek 2c-2d.</li>
	<li>Co 2-3 dni wymieniaj połowę NBM, aż próbka zostanie wykorzystana do eksperymentów.</li>
	<li>Przed wykonaniem eksperymentów z ponownym okablowaniem na próbce należy sprawdzić, czy neuryty w kanałach urządzenia z pojedynczą populacją i populacje neuronów w urządzeniu z wieloma populacjami są izolowane, badając przerwy między nimi w mikroskopie, aby upewnić się, że nie ma włókien łączących populacje neuronów.</li>
</ol>
5. Przygotowanie koralików pokrytych PDL
<ol>
	<li>Dodaj 2 krople po 50 μl 4, 10 lub 20 μm kulek polistyrenowych rozcieńczonych w wodzie (1:500) do 1 ml PDL (100 μg/ml). Pozostawić na co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej. 
	Uwaga: Protokół może zostać wstrzymany w tym miejscu i wznowiony następnego dnia.</li>
	<li>Odwirować roztwór o stężeniu 8,820 x g przez 1 minutę. Ostrożnie usunąć supernatant, nie naruszając kulek nagromadzonych na dnie pojemnika.</li>
	<li>Umyj kulki dwukrotnie 1 ml sterylnego 10 mM roztworu HEPES o pH 8,4.</li>
	<li>Zawiesić kulki pokryte PDL w 200 ml 10 mM roztworu HEPES o pH 8,4.</li>
</ol>
6. Przygotowanie mikropipet
<ol>
	<li>Przygotuj pipety ze szklanych rurek kapilarnych (średnica wewnętrzna 1 mm, średnica zewnętrzna 1,5 mm) za pomocą poziomego ściągacza elektrod. Dostosuj ustawienia tak, aby zewnętrzna końcówka wyciągniętej mikropipety wynosiła ~ 2-5 μm. Przed pociągnięciem upewnij się, że szklane rurki są czyste.</li>
	<li>Przymocuj pipety do szkiełek podstawowych na czas przechowywania i upewnij się, że końcówka nie styka się z powierzchnią szkiełka, ponieważ końcówka jest delikatna. Przechowywać w temperaturze pokojowej w zakrytym pojemniku w celu ochrony przed kurzem. Pipet należy używać tego samego dnia, w którym zostały pobrane.</li>
</ol>
7. Adhezja PDL do neuronów
<ol>
	<li>Dodać 40-60 μl kulek pokrytych PDL przygotowanych w kroku 5 do kultury komórkowej przygotowanej w kroku 4. Wyśrodkuj końcówkę pipety nad neuronami, które są słabo widoczne na szkiełku nakrywkowym, i dodaj koraliki (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Umieść próbkę w inkubatorze na 1 godzinę, aby ułatwić tworzenie kontaktów synaptycznych 8,9.</li>
	<li>Po inkubacji usuń wszelkie nieprzylegające kulki, delikatnie myjąc kulturę wstępnie podgrzanym NBM.</li>
</ol>
8. Przygotowanie roztworu soli fizjologicznej (do eksperymentów w temperaturze pokojowej)
<ol>
	<li>Przygotuj fizjologiczny roztwór soli fizjologicznej, łącząc składniki wymienione w bibliografii7,8. Ma to na celu regulację środowiska komórkowego na zewnątrz inkubatora.</li>
	<li>Sprawdź osmolarność i poziomy pH zgodnie z odniesieniami7,8.</li>
	<li>Stale wlewaj roztwórO2, aby zminimalizować wahania pH podczas przeprowadzania eksperymentów.</li>
	<li>Podgrzać do temperatury pokojowej.</li>
	<li>Ustawić system perfuzji, wkładając jeden koniec plastikowej rurki (wymiary opcjonalne) do roztworu fizjologicznego w infuzjiO2 i mocując drugi koniec do igły wprowadzonej w uchwyt na próbkę. Umieść rurkę i roztwór wyżej niż próbka (patrz <silna klasa = "xfig" > Rysunek 4).
	<ol>
		<li>Odłączyć rurkę od igły i podłączyć ją do strzykawki. Za pomocą strzykawki wywrzeć nacisk i pobrać płyn, napełniając probówkę. Uszczelnić za pomocą zacisku rolkowego i ponownie podłączyć igłę.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
9. Mikromanipulacja koralikami
<ol>
	<li>Umieścić próbkę w układzie doświadczalnym w taki sposób, aby dwie mikropipety zamontowane w mikropipetach mogły uzyskać dostęp od góry i uzyskać do nich dostęp optycznie poniżej, na przykład za pomocą obiektywu 40-fazowego (apertura numeryczna 0,6) odwróconego mikroskopu optycznego. W tej konfiguracji należy zamontować kamerę CCD do przechwytywania obrazu w bocznym porcie mikroskopu. Podłącz każdą pipetę do strzykawek o pojemności 1 ml za pomocą plastikowej rurki. Na tym etapie zastąp NBM roztworem soli fizjologicznej (1-2 ml) (patrz <silna klasa="xfig">Rysunek 4).</li>
	<li>Podczas eksperymentów należy w sposób ciągły perflerować komórki roztworem soli fizjologicznej przygotowanym w kroku 8 z szybkością 0,5-1 ml/min.</li>
	<li>Wybierz koralik PDL, który NIE jest przyczepiony do neuronu w polu widzenia. Wyrównaj koralik z końcówką mikropipety, skupiając się na kulce, a następnie w górę na mikropipecie. Przyłóż końcówkę jak najbliżej ściegu, monitorując ją przez mikroskop.</li>
	<li>Zastosuj podciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml podłączonej do pipety, aby pobrać kulkę. Utrzymuj podciśnienie przez cały czas trwania eksperymentu.</li>
</ol>
10. Ciągnięcie neurytów
<ol>
	<li>Wybierz kulkę PDL przyczepioną do neuronu w polu widzenia i podłącz ją do drugiej mikropipety za pomocą ssania, jak opisano w krokach 9.3-9.4.</li>
	<li>Pociągnij kompleks PDL-koralik-neuron, powoli (~0,5 μm/min), przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki o 1 μm i zatrzymaj się na 5 minut, aby umożliwić inicjację neurytów.</li>
	<li>Powtórz krok 10.2 dwa razy. 
	Uwaga: Pierwsze 3 μm muszą być pobierane bardzo powoli, aby zagwarantować sukces eksperymentalny, który występuje w ponad 95% przypadków.</li>
	<li>Pociągnij kompleks PDL-koralik-neuron, powoli (~0,5 μm/min), przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki o 2 μm i zatrzymaj się na 5 minut, aby umożliwić wydłużenie neurytów.</li>
	<li>Po udanej inicjacji i rozciągnięciu neurytu przez pierwsze 5 μm, pociągnij neuryt z prędkością 20 μm/min na odległości w skali milimetrowej. 
	Uwaga: Ciągnięcie może odbywać się w sposób ciągły lub skokowo i z różną szybkością. Zobacz Rysunek 5b-5c .</li>
</ol>
11. Łączenie neuronów
<ol>
	<li>Wybierz region bogaty w neuryty i obniż kompleks PDL-koralik-neuryt, aby fizycznie się z nim stykał. Użyj innych koralików, aby ocenić wysokość końcówki nad powierzchnią szkiełka nakrywkowego. Zobacz Rysunek 5d.</li>
	<li>Pozostawić kompleks PDL-kulka-neuryt w kontakcie z docelowym neurytem podczas manipulowania drugą mikropipetą. Opuść drugą pipetę z drugą kulką PDL na nowo utworzonej neurycie około 20 μm od pierwszego koralika. Użyj drugiego koralika PDL, aby popchnąć nowy filament neurytu w kierunku komórki docelowej.</li>
	<li>Przytrzymaj oba koraliki na miejscu przez co najmniej 1 godzinę. Sprawdź za pomocą mikroskopu, czy nie ma ogniskowego obrzęku, pogrubienia neurytów stykających się z koralikiem16.</li>
	<li>W tym czasie użyj perfuzji, aby powoli zmienić pożywkę próbki z soli fizjologicznej na wstępnie podgrzany, zrównoważony CO2 NBM.</li>
	<li>Zwolnij kulkę z drugiej pipety, zwalniając ssanie. Jeśli nowy neuryt pozostaje przyczepiony, zwolnij również pierwszą kulkę. Zobacz Rysunek 5e .</li>
	<li>Delikatnie usuń roztwór soli fizjologicznej i zastąp NBM (~2 ml).</li>
	<li>Ostrożnie umieść próbkę z powrotem w inkubatorze, aby wzmocnić połączenie neuronalne do przyszłych eksperymentów. To połączenie jest stabilne dla >24 h7.</li>
</ol>
12. Weryfikacja funkcjonalności nowego połączenia za pomocą nagrań z użyciem zacisków krosowych dla całej komórki
<ol>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami references7,18,19. aby zmontować zestaw do elektrofizjologii.</li>
	<li>Postępuj zgodnie z instrukcjami references7. aby przygotować elektrody pre- i postsynaptyczne.</li>
	<li>Zbierz dane zacisku łatki, ponownie postępując zgodnie z odwołaniami18,19.</li>
	<li>Porównaj wyniki z naturalnie występującymi sygnałami7, aby określić typ połączenia.</li>
</ol>

<ol><li>Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+challenges+of+long-distance+axon+regeneration+in+the+injured+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Prog.+Brain.+Res%22%5BJournal%5D)">The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS.</a> Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).</li>
<li>Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+a+new+growth+cone+after+axotomy%3A+the+precursor+to+axon+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to axon regeneration.</a> Nat. Rev. Neurosci. 13 (4), 189-193 (2012).</li>
<li>Aguayo, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+made+by+axons+regenerating+in+the+central+nervous+system+of+adult+mammals%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections made by axons regenerating in the central nervous system of adult mammals.</a> J. Exp. Biol. 153, 199-224 (1990).</li>
<li>Lamoureux, P., Ruthel, G., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+can+specify+axonal+fate+in+hippocampal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension can specify axonal fate in hippocampal neurons.</a> J Cell Biol. 159 (3), 499-508 (2002).</li>
<li>Goslin, K., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Experimental+observations+on+the+development+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Experimental observations on the development of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J Cell Biol. 108 (4), 1507-1516 (1989).</li>
<li>Dotti, C. G., Sullivan, C. A., Banker, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Establishment+of+polarity+by+hippocampal+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The Establishment of polarity by hippocampal neurons in culture.</a> J. Neurosci. 8 (4), 1454-1468 (1988).</li>
<li>Magdesian, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+mechanically+controlled+rewiring+of+neuronal+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid mechanically controlled rewiring of neuronal circuits.</a> J. Neurosci. 36 (3), 979-987 (2016).</li>
<li>Lucido, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+functional+presynaptic+boutons+triggered+by+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of functional presynaptic boutons triggered by adhesive contacts.</a> J. Neurosci. 29 (40), 12449-12466 (2009).</li>
<li>Suarez, F., Thostrup, P., Colman, D., Grutter, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+presynaptic+protein+recruitment+induced+by+local+presentation+of+artificial+adhesive+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Dynamics of presynaptic protein recruitment induced by local presentation of artificial adhesive contacts.</a> Dev. Neurobiol. 73, 1123-1133 (2013).</li>
<li>General Laboratory Techniques. An Introduction to Working in the Hood. JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. 
 <a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood">https://www.jove.com/science-education/5036/an-introduction-to-working-in-the-hood</a> (2016).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monitoring cell growth.</a> Curr Protoc Immunol. A-3A, (2001).</li>
<li>Beaudoin, G. M. 3rd, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culturing+pyramidal+neurons+from+the+early+postnatal+mouse+hippocampus+and+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Culturing pyramidal neurons from the early postnatal mouse hippocampus and cortex.</a> Nat. Protoc. 7 (9), 1741-1754 (2012).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+mechanical+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied mechanical tension.</a> Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Lamoureux, P., Buxbaum, R. E., Heidemann, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+outgrowth+of+cultured+neurons+is+not+limited+by+growth+cone+competition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Axonal outgrowth of cultured neurons is not limited by growth cone competition.</a> J. Cell Sci. 111, 3245-3252 (1998).</li>
<li>Pfister, B. J., Bonislawski, D. P., Smith, D. H., Cohen, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sketch-grown+axons+retain+the+ability+to+transmit+active+electrical+signals%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Sketch-grown axons retain the ability to transmit active electrical signals.</a> FEBS Lett. 580, 3525-3531 (2006).</li>
<li>Magdesian, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atomic+force+microscopy+reveals+important+differences+in+axonal+resistance+to+injury%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Atomic force microscopy reveals important differences in axonal resistance to injury.</a> Biophys. J. 103 (3), 405-414 (2012).</li>
<li>Polleux, F., Snider, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiating+and+growing+an+axon%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Persp.+Biol%22%5BJournal%5D)">Initiating and growing an axon.</a> CSH Persp. Biol. 2 (4), 001925(2010).</li>
<li>Debanne, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paired-recordings+from+synaptically+coupled+corticol+and+hippocampal+neurons+in+acute+and+cultured+brain+slices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Protoc%22%5BJournal%5D)">Paired-recordings from synaptically coupled corticol and hippocampal neurons in acute and cultured brain slices.</a> Nat. Protoc. 3, 1559-1568 (2008).</li>
<li>Qi, G., Radnikow, G., Feldmeyer, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+and+Morphological+Characterization+of+Neuronal+Microcircuits+in+Acute+Brain+Slices+Using+Paired+Patch-Clamp+Recordings%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological and Morphological Characterization of Neuronal Microcircuits in Acute Brain Slices Using Paired Patch-Clamp Recordings.</a> J. Vis. Exp. (95), e52358(2015).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://rspb.royalsocietypublishing.org/content/118/808/155">On the origin and development of the nervous system studied by the methods of experimental embryology.</a> Proc. R. Soc. Lond. B. , 155-196 (1935).</li>
<li>Weiss, P. <a target="_blank" href="http://www.worldcat.org/title/nerve-patterns-the-mechanics-of-nerve-growth/oclc/537059321">Nerve patterns: the mechanics of nerve growth.</a> Growth 5 (Suppl. Third Growth Symposium). , 153-203 (1941).</li>
<li>Gray, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+neural+growth%3A+calcitonin+gene-related+peptide+and+substance+P-containing+nerves+attain+exceptional+growth+rates+in+regenerating+deer+antler%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci%22%5BJournal%5D)">Rapid neural growth: calcitonin gene-related peptide and substance P-containing nerves attain exceptional growth rates in regenerating deer antler.</a> Neurosci. 50 (4), 953-963 (1992).</li>
<li>Heidemann, S. R., Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tension-driven+axon+assembly%3A+a+possible+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Tension-driven axon assembly: a possible mechanism.</a> Front. Cell Neurosci. 9, (2015).</li>
<li>Bray, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axonal+growth+in+response+to+experimentally+applied+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Biol%22%5BJournal%5D)">Axonal growth in response to experimentally applied tension.</a> Dev. Biol. 102, 379-389 (1984).</li>
<li>Heidemann, S. R., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+tension+as+a+regulator+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">Mechanical tension as a regulator of axonal development.</a> Neurotoxicology. 15, 95-107 (1994).</li>
<li>Heidemann, S. R., Lamoureux, P., Buxbaum, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytomechanics+of+axonal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Biochem.+Biophys%22%5BJournal%5D)">Cytomechanics of axonal development.</a> Cell Biochem. Biophys. 27 (3), 135-155 (1995).</li>
<li>Pfister, B. J., Iwata, A., Meaney, D. F., Smith, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extreme+stretch+growth+of+integrated+axons%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extreme stretch growth of integrated axons.</a> J. Neurosci. 24 (36), 7978-7983 (2004).</li>
<li>Waxman, S. G., Kocsis, J. D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWaxman%2C+SG+%22The+axon%3A+structure%2C+function+and+pathophysiology%22">The axon: structure, function and pathophysiology</a>. , Oxford University Press, USA. (1995).</li>
<li>Cho, E. Y., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+of+regrowth+of+damaged+retinal+ganglion+cell+axons+regenerating+in+a+peripheral+nerve+graft+in+adult+hamsters%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rate of regrowth of damaged retinal ganglion cell axons regenerating in a peripheral nerve graft in adult hamsters.</a> Brain Res. 419, 369-374 (1987).</li>
<li>Davies, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrinsic+differences+in+the+growth+rate+of+early+nerve+fibres+related+to+target+distance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Intrinsic differences in the growth rate of early nerve fibres related to target distance.</a> Nature. 337, 553-555 (1989).</li>
</ol>

Autorka Margaret H. Magdesian jest dyrektorem generalnym firmy Ananda Devices, która produkuje instrumenty używane w tym artykule.

Wykorzystując standardowe mikromanipulacje i innowacyjne urządzenia mikroprzepływowe, opracowano nową technikę szybkiego inicjowania, wydłużania i precyzyjnego łączenia nowych funkcjonalnych obwodów neuronalnych na duże odległości. Mikromanipulacja pipetami jest powszechnym narzędziem w większości laboratoriów neurobiologicznych 4,13. Prawdziwym wyzwaniem dla osiągnięcia powtarzalnych i wiarygodnych wyników była standaryzacja zdrowych, precyzyjnie ustawionych kul...

Urazy ośrodkowego układu nerwowego (OUN) u dorosłych mogą prowadzić do trwałego kalectwa z powodu wielu mechanizmów ograniczających odrastanie aksonów1. Po urazie wiele aksonów OUN nie tworzy nowego stożka wzrostu i nie jest w stanie wytworzyć skutecznej odpowiedzi regeneracyjnej2. Ponadto uszkodzenia i blizny otaczające zmiany w OUN znacznie hamują wzrost aksonów1,2,3. Obecne terapie wspomagające regenerację ośrodkowego układu nerwowego po urazie koncentrują się na zwiększaniu wewnętrznego potencjału wzrostu uszkodzonego neuronu i maskowaniu inhibitorów wydłużenia aksonów związanych z resztkami mieliny i blizną glejową1,3. Mimo to zdolność do regeneracji długich aksonów do odległych celów i tworzenia odpowiednich funkcjonalnych synaps pozostaje poważnie ograniczona4,5,6,7.
W obecnej pracy, mikrogranulki, mikromanipulacja pipetami i urządzenia mikroprzepływowe są używane do szybkiego inicjowania, wydłużania i precyzyjnego łączenia nowych funkcjonalnych obwodów neuronalnych na duże odległości. Wcześniejsze prace wykazały, że kulki pokryte poli-D-lizyną (kulki PDL) indukują adhezję błony, a następnie grupowanie kompleksów pęcherzyków synaptycznych i tworzenie funkcjonalnych butonów presynaptycznych8. Wykazano również, że gdy koralik PDL jest mechanicznie odciągany po różnicowaniu presynaptycznym, klaster białek synaptycznych podąża za koralikiem, inicjując nową klasę neurite<sup="xref">9. Poniższa procedura wykorzystuje ten fakt wraz ze zdolnością do hodowli embrionalnych neuronów hipokampa szczurów w zorganizowanych regionach na szkiełku nakrywkowym za pomocą urządzeń mikroprzepływowych z polidimetylosiloksanu (PDMS) w celu precyzyjnego przeprogramowania obwodu neuronalnego.
Te urządzenia mikroprzepływowe PDMS są nietoksyczne, optycznie przezroczyste i składają się z dwóch komór połączonych systemem mikrokanałów. Po zamontowaniu na szkiełku nakrywkowym każde urządzenie służy jako forma do kierowania wzrostem neuronów i utrzymywania zdrowych kultur neuronalnych na precyzyjnych wzorcach przez okres dłuższy niż 4 tygodnie in vitro.
Tutaj przedstawiono ramy, w których można badać granice rozszerzenia i funkcjonalności nowego neurytu. Tworzone są nowe, funkcjonalne neuryty, które są pozycjonowane w celu kontrolowanego (prze)łączenia sieci neuronowych. Osiągane prędkości wydłużania są większe niż 20 μm/min na odległości w skali milimetrowej i ustanawiane są funkcjonalne połączenia. Wyniki te pokazują nieoczekiwanie, że wewnętrzna zdolność tych neurytów do wydłużania jest znacznie szybsza niż wcześniej sądzono. To proponowane mechaniczne podejście omija powolne strategie chemiczne i umożliwia kontrolowane połączenie z określonym celem. Technika ta otwiera nowe możliwości w badaniach in vitro nad nowymi terapiami w celu przywrócenia połączeń neuronalnych po urazie. Umożliwia również manipulowanie i ponowne okablowanie sieci neuronowych w celu zbadania podstawowych aspektów przetwarzania sygnałów neuronalnych i funkcji neuronów in vitro.

<table><tbody><tr><td>Urządzenia do wspólnej hodowli</td><td>Urządzenia</td><td></td> Ananda <td>Dostępne w handlu w http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>Neuro devices</td><td>Urządzenia</td><td></td> Ananda <td>Dostępne w handlu pod adresem http://www.anandadevices.com</td></tr><tr><td>No. 1 Szkiełko nakrywkowe szklane 25 mm okrągłe</td><td>Warner Instruments</td><td>64-0705</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Naczynia ze szklanym dnem #0, niepowlekane, napromieniowane promieniami gamma</td><td>MatTex Incorporation</td><td>P35G-0-20-C</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych 35 mm, niepirogenne, sterylne</td><td>Corning Inc</td><td>430165</td><td></td></tr><tr><td>95 mm x 15 mm szalka Petriego, pokrywa ślizgowa, sterylny polistyren</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875714G</td><td></td></tr><tr><td>50 ml Probówki wirówkowe z nadrukowaną podziałką i płaskimi nakrętkami</td><td>VWR</td><td>89039-656</td><td></td></tr><tr><td>15 ml Polipropylenowa probówka stożkowa, 17 x 120 mm, bez pirogeny, sterylny</td><td>Falcon</td><td></td><td></td>352097</tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Life Technologies</td><td>21103-049</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Suplement B-27 (50X),</td> suplement <td>B-27 bez surowicy (50X), bez surowicy</td><td>17504044</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>Pennicylina, Streptomyocyna, Glutamina</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>11995-065</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>200 &mu; L Pipety</td><td>VWR</td><td>89079-458</td><td></td></tr><tr><td>2 - 20 &mu; L Pipety</td><td>Końcówki odporne na aerozole</td><td>2149P</td><td></td></tr><tr><td>Pipety transferowe BD Falcon 3 ml [niesterylne]</td> <td>BD Falcon</td><td>357524</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Gibco</td><td>15023-021</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy/Koraliki</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td>Roztwór</td></tr> <tr><td>zewnątrzkomórkowyKCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7447-40-7</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10043-52-4</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>7786-30-3</td><td>Roztwór zewnątrzkomórkowy</td></tr><tr><td>#5 Pęseta Dumont Dumostar 11 cm</td><td>World Precision Instruments</td><td>500233</td><td></td></tr><tr><td>Narzędzia do preparacji</td><td>Braun, Aesculap</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bromowodorek poli-D-lizyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6407</td><td></td></tr><tr><td>Mikrocząsteczki na bazie polistyrenu, 10 &mu; m</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72986</td><td></td></tr><tr><td>Rury borokrzemianowe</td><td>King Precision Glass, Inc.</td><td>14696-2</td><td></td></tr><tr><td>Poziomy ściągacz do pipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>Brązowo-płonące mikromanipulatory P-97</td><td></td></tr><tr><td>, seria PCS-5000</td><td>Instrumenty SD</td><td>MC7600R</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 1 ml</td><td>BD Luer-Lok</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop odwrócony</td><td>Olympus&nbsp;</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>Obiektyw</td><td>Olympus</td><td>UIS2, LUCPLFLN 40X</td><td></td></tr><tr><td>Kamera CCD</td><td>Kaskada fotometryczna</td><td>II: 512</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's (1x) L-15 Medium</td><td>Life Technologies</td><td>11415-064</td><td>Tysyna do rozwarstwiania szczurów</td></tr><tr><td>(0,05%), czerwień fenolowa</td><td>Life Technologies</td><td>25300054</td><td>Sekcja</td></tr> <tr><td>szczurówDMEM (1x) Dulbecco's Modified Eagle Medium [+4,5 g/L D-glukozy, + L-glutamina, + 110 mg/l pirogronianu sodu]</td><td>Life Technologies</td><td>11995-065</td><td>Analiza szczurów</td></tr><tr><td>HBSS (1x) Zbilansowany roztwór soli Hanka [- Chlorek wapnia, - Chlorek magnezu, - Siarczan magnezu]</td><td>Life Technologies</td><td>14170-112</td><td>Sekcja szczurów</td></tr></tbody></table>

przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Rewiring Neuronal Circuits: A New Method for Fast Neurite Extension and Functional Neuronal Connection

Uraz mózgu i rdzenia kręgowego może prowadzić do trwałego kalectwa i śmierci, ponieważ nadal nie jest możliwe zregenerowanie neuronów na duże odległości i dokładne połączenie ich z odpowiednim celem. Tutaj opisano procedurę szybkiego inicjowania, wydłużania i precyzyjnego łączenia nowych funkcjonalnych obwodów neuronalnych na duże odległości. Osiągnięte tempo wydłużania sięga ponad 1,2 mm/h, 30-60 razy szybciej niż tempo in vivo najszybciej rosnących aksonów z obwodowego układu nerwowego (0,02 do 0,04 mm/h)28 i 10 razy szybciej niż wcześniej zgłaszano dla tego samego typu neuronu na wcześniejszym etapie rozwoju4. Po pierwsze, izolowane populacje neuronów hipokampa szczurów są hodowane przez 2-3 tygodnie w urządzeniach mikroprzepływowych w celu precyzyjnego pozycjonowania komórek, umożliwiając łatwą mikromanipulację i odtwarzalność eksperymentalną. Następnie kulki pokryte poli-D-lizyną (PDL) są umieszczane na neurytach w celu utworzenia kontaktów adhezyjnych, a mikromanipulacja pipetami jest stosowana do przesuwania powstałego kompleksu koraliko-neuryt. Gdy koralik jest poruszany, wyciąga nowy neuryt, który można rozciągnąć na setki mikrometrów i funkcjonalnie połączyć z komórką docelową w czasie krótszym niż 1 godzina. Proces ten umożliwia eksperymentalną powtarzalność i łatwość manipulacji przy jednoczesnym ominięciu wolniejszych strategii chemicznych w celu wywołania wzrostu neurytów. Przedstawione tu wstępne pomiary wskazują na tempo wzrostu neuronów znacznie przewyższające tempo fizjologiczne. Połączenie tych innowacji pozwala na precyzyjne tworzenie sieci neuronalnych w kulturze z niespotykanym dotąd stopniem kontroli. Jest to nowatorska metoda, która otwiera drzwi do mnóstwa informacji i wglądów w transmisję sygnałów i komunikację w sieci neuronalnej, a także jest placem zabaw, na którym można badać granice wzrostu neuronów. Potencjalne zastosowania i eksperymenty są szeroko rozpowszechnione i mają bezpośrednie implikacje dla terapii, które mają na celu ponowne połączenie obwodów neuronalnych po urazie lub w chorobach neurodegeneracyjnych.

Neurony hipokampa noworodkowych szczurów hodowane są w urządzeniach mikroprzepływowych, co umożliwia precyzyjne rozmieszczanie komórek, kulek PDL oraz mikromanipulatorów. Pierwszym krokiem jest prawidłowe zamontowanie urządzenia mikroprzepływowego na szklanym pokryciu lub w płytkach. Istotne jest, aby urządzenie mikroprzepływowe było dobrze przyklejone do podłoża, aby zapobiec wydostawaniu się komórek z komór i ich przemieszczaniu się pod części urządzenia, które powinny być uszczelnione ...

Ta procedura opisuje, jak szybko inicjować, rozszerzać i łączyć neuryty zorganizowane w komorach mikroprzepływowych za pomocą pokrytych poli-D-lizyną koralików przymocowanych do mikropipet, które kierują wydłużaniem neurytu.

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Brain and spinal cord injury may lead to permanent disability and death because it is still not possible to regenerate neurons over long distances and ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zainicjowanie wzrostu nowych neurytów, ich szybka elongacja oraz precyzyjne połączenie ich z komórkami docelowymi. Procedura ta jest możliwa do przeprowadzenia wyłącznie przy użyciu komórek hodowanych w kontrolowanym i powtarzalnym środowisku. Metoda ta pozwala nam odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu neuronauki.Co ogranicza tempo wzrostu neuronów? Jak szybko mogą one rosnąć? Czy sygnały mechaniczne odgrywają w tym procesie rolę?Możemy również badać, w jaki sposób tworzą się synapsy, w jaki sposób neurony odnajdują komórkę docelową oraz jak synapsy starzeją się i dojrzewają. Po trzecie, możemy zacząć systematycznie budować sieci neuronowe i badać, w jaki sposób neurony przetwarzają informacje.Głównymi zaletami tej techniki są: łatwość manipulacji, powtarzalność eksperymentalna, a w konsekwencji wysoki stopień kontroli na poziomie pojedynczej komórki. Aby rozpocząć procedurę, należy wyczyścić i przygotować odpowiednią liczbę sterylnych szkiełek nakrywkowych. Następnie każde szkiełko nakrywkowe należy pokryć od 0,5 do 1 ml PDL o stężeniu 100 µg/ml i pozostawić na co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.Następnie przemyj szkiełka nakrywki dwukrotnie wodą i usuń cały płyn. Pozostaw je do wyschnięcia w sterylnym środowisku przez 5 do 10 minut lub aż powierzchnia całkowicie wyschnie. Następnie umieść urządzenia mikroprzepływowe wzorami skierowanymi do góry pod światłem UV w komorze z laminarnym przepływem powietrza na 10 minut.Po 10 minutach należy umieścić urządzenie mikrofluidyczne wzorem skierowanym w dół w kontakcie z czystym szkiełkiem zakrywowym. Za pomocą pęsety należy lekko docisnąć urządzenie, aby przylegało do szkła. Aby napełnić urządzenie z pojedynczą populacją pożywką, należy dodać 50 µL kompletnej pożywki komórkowej do prawego górnego otworu.Następnie dodaj kolejne 50 µL kompletnego medium komórkowego do studni znajdującej się po przekątnej. Aby wypełnić urządzenie do wielu populacji medium, dodaj 30 µL kompletnego NBM do jednego rzędu studni. Upewnij się, że medium przepływa między studniami.Następnie dodaj 50 µL pożywki do każdego z pozostałych dołków. Umieść urządzenia na większej płytce wraz z otwartą naczyniem z wodą autoklawowaną i wstaw naczynie do inkubatora na jedną lub dwie godziny podczas przygotowywania hodowli komórkowej. Teraz usuń pożywkę z górnych dołków urządzeń mikroprzepływowych, nie opróżniając całkowicie dołków.Następnie dodaj 20 µL skoncentrowanego roztworu komórek do górnej prawej studni urządzenia mikroprzepływowego i sprawdź pod mikroskopem, jak komórki przepływają wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego dla pojedynczej populacji. Aby zasiać komórki w urządzeniu dla wielu populacji, dodaj 20 µL skoncentrowanego roztworu komórek do każdej z górnych studni. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki znajdują się wewnątrz komór.Następnie umieść urządzenia w inkubatorze na 15 do 30 minut, aby wspomóc przyleganie komórek do podłoża. Po przytwierdzeniu się komórek do podłoża, dodaj 40 µL NBM do dwóch górnych studni urządzenia dla pojedynczej populacji. Pomoże to usunąć pęcherzyki powietrza z mikrokanałów.Dodaj 20 µL MBM do górnych otworów urządzenia do wielu populacji, do tych samych otworów, do których wstrzyknięto komórki. Pożywka powinna lekko wystawać, tworząc wypukły menisk i nadając otworom wygląd charakterystyczny dla „muffin top”. Na jeden lub dwa dni przed usunięciem urządzenia mikroprzepływowego dodaj 2 mL uprzednio ogrzanej pożywki NBM do każdej szalki z próbką i zalej komory.Następnie umieść urządzenia w inkubatorze. W dalszej kolejności, używając sterylnej pęsety i końcówki pipety, zdejmij urządzenia mikroprzepływowe z szkiełek nakrywkowych, pozostawiając wzorcowaną konfigurację neuronów. W tej procedurze dodaj od 40 do 60 µL przygotowanych kulek pokrytych PDL do hodowli komórkowej.Następnie należy przenieść próbkę z powrotem do inkubatora na jedną godzinę, aby wspomóc tworzenie kontaktów synaptycznych. Po tym czasie próbkę umieszcza się w układzie eksperymentalnym w taki sposób, aby komórki mogły być oceniane od góry za pomocą dwóch mikropipet, a także aby był możliwy dostęp optyczny. W tej konfiguracji kamera CCD znajduje się w bocznym porcie mikroskopu w celu rejestracji obrazu.Każdą pipetę wypełnioną solą fizjologiczną należy połączyć z strzykawką o objętości 1 ml, a następnie przepłukać próbkę roztworem soli fizjologicznej. Następnie, pod mikroskopem, należy sprawdzić przerwę między dwiema wyizolowanymi populacjami neuronów, aby upewnić się, że nie są one naturalnie połączone. Należy wybrać kuleczkę PDL, która nie jest przytwierdzona do neuronu w polu widzenia.Wyrównaj koralik z końcówką mikropipety, ustawiając ostrość najpierw na koraliku, a następnie na mikropipecie. Następnie, monitorując obraz przez mikroskop, zbliż końcówkę jak najbliżej koralika. Po tym zastosuj podciśnienie w pipecie, aby pobrać koralik, i utrzymuj podciśnienie przez cały czas trwania eksperymentu.Następnie należy wybrać w polu widzenia koralik PDL przytwierdzony do neuronu i przymocować go do drugiej mikropipety za pomocą ssania. Należy przeciągnąć kompleks koralik PDL-neuron, powoli przesuwając mikromanipulator lub stołem z próbką z prędkością 0,5 micrometers per minute na dystans 1 micrometer, a następnie odczekać pięć minut, aby umożliwić inicjację neurytu. Następnie należy przeciągnąć kompleks koralik PDL-neuron, powoli przesuwając go bocznie z prędkością 0,5 micrometers per minute na dystans two micrometers, a następnie odczekać pięć minut, aby umożliwić wydłużanie neurytu.Po pomyślnym zainicjowaniu i wydłużeniu neurytu o pierwsze 5 µm, należy stale przeciągać neuryt z prędkością 20 µm/min. Aby połączyć neurony, wybierz obszar bogaty w neuryty. Użyj innych kuleczek do zmierzenia wysokości końcówki pipety nad szkiełkiem podstawowym, a następnie obniż kompleks kuleczki PDL i neurytu tak, aby fizycznie zetknął się on z neurytami.Pozostaw kompleks kulek PDL i neurytów w kontakcie z docelowym neurytem podczas manipulowania drugą mikropipetą. Następnie opuść drugą pipetę z drugą kulką PDL na nowo utworzony neuryt w odległości około 20 µm od pierwszej kulki i użyj drugiej kulki PDL, aby przesunąć nowe włókno neurytu w stronę docelowej komórki. Następnie utrzymaj obie kulki w miejscu przez co najmniej jedną godzinę.Za pomocą mikroskopu zweryfikuj brak obrzęku ogniskowego, czyli pogrubienia neurytów stykających się z kuleczką. W tym czasie powoli zmień medium próbki z soli fizjologicznej na uprzednio ogrzane NBM równoważone pod względem stężenia dwutlenku węgla. Uwolnij kuleczkę z drugiej pipety poprzez zaprzestanie zasysania.Jeśli nowy neuryt pozostanie przytwierdzony, należy zwolnić również pierwszą kuleczkę. Następnie ostrożnie umieścić próbkę z powrotem w inkubatorze, aby wzmocnić połączenie neuronalne przed przyszłymi eksperymentami. Do zbadania funkcjonalności elektrycznej połączenia uzyskanego drogą mikromanipulacji można wykorzystać rejestrację metodą patch-clamp w konfiguracji whole-cell.Przedstawiono tutaj izolowane populacje neuronów oddzielone szczeliną o szerokości 100 mikrometrów w mikrourządzeniach z PDMS. Rejestracje metodą patch clamp w parach przeprowadzono w konfiguracji whole-cell; przeanalizowano i porównano połączenia indukowane mechanicznie z połączeniami w populacjach neuronów połączonych naturalnie oraz w populacjach niepołączonych. Odpowiedzi elektryczne po potencjale czynnościowym presynaptycznym, zarejestrowane z neuronów połączonych naturalnie oraz za pomocą mikromanipulacji, są znacznie wyższe i korelują czasowo z aktywnością presynaptyczną.Po opanowaniu techniki, procedura ta może zostać wykonana w ciągu ośmiu godzin, pod warunkiem właściwego przeprowadzenia prac; podczas realizacji tego procesu ważne jest zapewnienie zdrowych i dobrze uformowanych długoterminowych kultur komórkowych, aby zagwarantować szybkie i powtarzalne wyniki. Po wykonaniu tej procedury można zastosować różne metody w celu weryfikacji funkcjonalności elektrycznej micromanipulowanego połączenia. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat hodowli populacji komórek w komorach mikroprzepływowych oraz wykorzystania manipulacji pipetą do inicjowania, wydłużania i łączenia neurytów.

rewiring-neuronal-circuits-new-method-for-fast-neurite-extension

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Perspektywy w neuronauce

Ten film demonstruje technikę szybkiego inicjowania i rozszerzania neuronu oraz tworzenia nowych połączeń z neuronem docelowym za pomocą urządzenia mikroprzepływowego i mikromanipulacji. Można to wykorzystać w terapiach, które mają na celu ponowne połączenie obwodów neuronalnych po urazie lub w chorobach neurodegeneracyjnych.

Inicjowanie szybkiej rozbudowy neurytów i tworzenie funkcjonalnych połączeń neuronalnych

Opisano protokół generowania systemu kokulturowego składającego się z neuronów pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC), pierwotnych neuronów korowych i astrocytów. Ten system kohodowli umożliwia wykrycie powstawania kontaktów i obwodów synaptycznych między nowymi neuronami pochodzącymi z iPSC a istniejącymi wcześniej neuronami korowymi wykazującymi ekspresję rodopsyny kanałowej-2.

Optogenetyczne podejście do oceny tworzenia połączeń neuronalnych w systemie kokulturowym

Ten manuskrypt opisuje protokół do budowy in vitro modułowych sieci składających się z przestrzennie ograniczonych, funkcjonalnie połączonych obwodów neuronalnych. Maska polimerowa służy do modelowania warstwy białka w celu promowania adhezji komórkowej nad substratem hodowlanym. Platerowane neurony rosną na pokrytych obszarach, tworząc spontaniczne połączenia i wykazując aktywność elektrofizjologiczną.

Projektowanie, obróbka powierzchniowa, posiewanie komórkowe i hodowla modułowych sieci neuronowych składających się z funkcjonalnie połączonych obwodów

Modyfikujemy i wdrażamy wcześniej opublikowany protokół opisujący szybkie, powtarzalne i efektywne różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) w pobudzające neurony korowe12. W szczególności nasza modyfikacja pozwala na kontrolę gęstości komórek neuronalnych i wykorzystanie ich na układach mikroelektrod do pomiaru właściwości elektrofizjologicznych na poziomie sieci.

Szybkie różnicowanie neuronalne indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych do pomiaru aktywności sieci na układach mikroelektrod

Ten manuskrypt szczegółowo opisuje wytwarzanie mikro-tkankowych sieci neuronowych: trójwymiarowe konstrukcje o rozmiarach mikronów, składające się z długich, wyrównanych dróg aksonalnych, obejmujących zagregowane populacje neuronów, zamknięte w rurkowym hydrożelu. Te żywe rusztowania mogą służyć jako funkcjonalne przekaźniki do rekonstrukcji lub modulacji obwodów nerwowych lub jako biofideliczne stanowiska testowe naśladujące neuroanatomię istoty szarej i białej.

Inspirowane anatomią trójwymiarowe sieci neuronowe oparte na inżynierii mikrotkankowej do rekonstrukcji, modulacji i modelowania układu nerwowego

Prezentujemy rozwój samoorganizujących się, trójwymiarowych wiązek podłużnie wyrównanych somatów astrocytarnych i procesów w nowej obudowie z biomateriału. Te zaprojektowane "żywe rusztowania", wykazujące średnicę w skali mikronów, a jednocześnie wydłużające się na centymetry, mogą służyć jako stanowiska testowe do badania mechanizmów neurorozwojowych lub ułatwiać neuroregenerację poprzez kierowanie migracją neuronów i/lub odnajdywaniem ścieżek aksonalnych.

Trójwymiarowe, wyrównane sieci astrocytów oparte na inżynierii tkankowej w celu podsumowania mechanizmów rozwojowych i ułatwienia regeneracji układu nerwowego

Tutaj prezentujemy metodę dla ludzkiego modelu in vitro uszkodzenia rozciągającego w formacie 96-dołkowym w skali czasowej istotnej dla traumy uderzeniowej. Obejmuje to metody wytwarzania rozciągliwych płytek, ilościowego określania mechanicznej zniewagi, hodowli i uszkadzania komórek, obrazowania i analizy wysokiej zawartości w celu ilościowego określenia urazu.

Metoda szybkiego rozciągania indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronów pochodzących z komórek macierzystych w formacie 96-dołkowym

Oparta na inżynierii lentiwirusowej in vitro prekursorów neuronów, ich kotransplantacji do mózgów dzikich typów i sparowanej ocenie morfometrycznej pochodnych "testowych" i "kontrolnych", metoda ta pozwala na dokładne modelowanie in vivo kontroli genów morfologii neuronów kory nowej w prosty i niedrogi sposób.

Dokomorowy przeszczep zmodyfikowanych prekursorów neuronalnych do badań neuroarchitektury in vivo

W tym raporcie opisujemy prosty protokół badania wzrostu neurytów w embrionalnych neuronach korowych szczurów poprzez jednoczesną transfekcję z EGFP i interesującym nas białkiem.

Ulepszony test oparty na białku zielonej fluorescencji do badania wzrostu neurytów w neuronach pierwotnych

Testy wzrostu neurytów dostarczają ilościowej wartości na temat regeneracyjnych procesów neuronalnych. Zaletą tego półautomatycznego oprogramowania jest to, że segmentuje ciała komórek i neuryty oddzielnie, tworząc maskę i mierzy różne parametry, takie jak długość neurytów, liczba punktów rozgałęzień, obszar klastra komórka-ciało i liczba klastrów komórek.

Standaryzacja nowatorskiego półautomatycznego oprogramowania do pomiaru przyrostu neurytów

Poznaj metodę szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego łączenia neuronów przy użyciu mikropipet i mikrofluidycznych komór. Technika ta umożliwia badanie tempa wzrostu neuronów oraz wpływu czynników mechanicznych na rozwój połączeń nerwowych.

Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Przeglądaj więcej filmów