Przeprogramowanie obwodów neuronalnych: nowa metoda szybkiego wydłużania neurytów i funkcjonalnego połączenia neuronalnego

Ogólnym celem tej procedury jest zainicjowanie nowych neurytów, szybkie ich wydłużenie i precyzyjne połączenie z komórkami docelowymi. Ta procedura jest możliwa tylko przy użyciu komórek hodowanych w kontrolowanym i powtarzalnym środowisku. Ta metoda pozwala nam odpowiedzieć na kluczowe pytania w neurobiologii.

Co ogranicza tempo wzrostu neuronów? Jak szybko mogą rosnąć? Czy mechaniczne wskazówki odgrywają jakąś rolę?

Możemy również badać, jak powstają synapsy, jak neurony znajdują komórkę docelową? Jak synapsy starzeją się, dojrzewają? I po trzecie, możemy zacząć systematycznie budować sieci neuronowe, badać, jak neurony się obliczają.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że umożliwia łatwą manipulację, odtwarzalność eksperymentalną, a ostatecznie wysoki stopień kontroli na poziomie pojedynczej komórki. Aby rozpocząć tę procedurę, wyczyść i przygotuj żądaną liczbę sterylnych szkiełek nakrywkowych. Następnie pokryj każde szkiełko nakrywkowe 0,5 do 1 mililitra 100 mikrogramów na mililitr PDL przez co najmniej dwie godziny w temperaturze pokojowej.

Następnie dwukrotnie umyj szkiełka okładki wodą i usuń cały płyn. Pozostaw je do wyschnięcia w sterylnym środowisku przez 5 do 10 minut lub do momentu, gdy powierzchnia całkowicie wyschnie. Następnie umieść urządzenia mikroprzepływowe z wzorami skierowanymi do góry pod światłem UV w komorze bezpieczeństwa biologicznego na 10 minut.

Po 10 minutach umieść urządzenie mikroprzepływowe wzorem skierowanym w dół w kontakcie z czystym szkiełkiem nakrywkowym. Użyj pęsety, aby delikatnie docisnąć urządzenie, aby przylegało do szkła. Aby napełnić urządzenie z pojedynczą pożywką pożywką, dodaj 50 mikrolitrów kompletnej pożywki komórkowej do prawej górnej studzienki.

A następnie dodaj kolejne 50 mikrolitrów kompletnej pożywki komórkowej do studni po przekątnej. Aby napełnić urządzenie do wielu populacji pożywką, dodaj 30 mikrolitrów kompletnego NBM do jednego rzędu studzienek. Upewnij się, że medium przepływa między studzienkami.

Następnie dodaj 50 mikrolitrów pożywki do każdego z pozostałych dołków. Umieść urządzenia na większej płycie z otwartym naczyniem z autoklawowaną wodą i umieść naczynie w inkubatorze na jedną do dwóch godzin, przygotowując hodowlę komórkową. Teraz usuń pożywkę z górnych studzienek urządzeń mikroprzepływowych bez opróżniania studzienek.

Następnie dodaj 20 mikrolitrów stężonego roztworu komórkowego do prawego górnego dołka urządzenia mikroprzepływowego i sprawdź w mikroskopie, jak komórki przepływają wewnątrz urządzenia mikroprzepływowego z pojedynczą populacją. Aby ułożyć komórki w urządzeniu do wielu populacji, dodaj 20 mikrolitrów stężonego roztworu komórkowego do każdej z górnych studzienek. Pod mikroskopem sprawdź, czy komórki znajdują się w komorach.

Następnie umieść urządzenia w inkubatorze na 15 do 30 minut, aby ułatwić przyczepienie komórek do podłoża. Po przyczepieniu się komórek do podłoża dodaj 40 mikrolitrów NBM do dwóch górnych studzienek pojedynczego urządzenia populacyjnego. Pomoże to usunąć pęcherzyki powietrza z mikrokanałów.

Dodaj 20 mikrolitrów MBM do górnych studzienek urządzenia do badania wielu populacji, tych samych studzienek, w których wstrzyknięto komórki. Podłoże powinno lekko wystawać, aby utworzyć dodatni menisk i nadać studzienkom górny wygląd muffinki. Na jeden do dwóch dni przed usunięciem urządzenia mikroprzepływowego dodaj dwa mililitry wstępnie podgrzanego NBM do każdej naczynia na próbkę i zalej komory.

Następnie trzymaj urządzenia w inkubatorze. Następnie użyj sterylnej pęsety i końcówki do pipety, aby usunąć urządzenia mikroprzepływowe z szkiełek nakrywkowych, pozostawiając wzorzystą konfigurację neuronów. W tej procedurze i od 40 do 60 mikrolitrów przygotowanych kulek powlekanych PDL do hodowli komórkowej.

Następnie zwróć próbkę do inkubatora na jedną godzinę, aby przyspieszyć tworzenie kontaktów synaptycznych. Następnie zainstaluj próbkę w konfiguracji eksperymentalnej, tak aby komórki mogły być oceniane od góry za pomocą dwóch mikropipet, a także miały dostęp optyczny. W tej konfiguracji kamera CCD znajduje się w bocznym porcie mikroskopu w celu przechwytywania obrazu.

Podłącz każdą pipetę wypełnioną solą fizjologiczną do jednomililitrowej strzykawki, a następnie przelej próbkę roztworem soli fizjologicznej. Następnie, pod mikroskopem, sprawdź przerwę między dwiema izolowanymi populacjami neuronów, aby upewnić się, że te dwie populacje nie są naturalnie połączone. Wybierz koralik PDL, który nie jest przyczepiony do neuronu w polu view.

Wyrównaj koralik z końcówką mikropipety, skupiając się na kulce, a następnie na mikropipecie. Następnie przyłóż końcówkę jak najbliżej koralika, monitorując ją przez mikroskop. Następnie zastosuj podciśnienie do pipety, aby podnieść koralik i utrzymuj podciśnienie przez cały czas trwania eksperymentu.

Teraz wybierz koralik PDL przyczepiony do neuronu w polu widzenia i podłącz go do drugiej mikropipety za pomocą odsysania. Pociągnij kompleks neuronów kulkowych PDL, powoli przesuwając mikromanipulator lub stolik próbki z prędkością 0,5 mikrometra na minutę przez 1 mikrometr i zatrzymaj się na pięć minut, aby umożliwić inicjację neurytu. Pociągnij kompleks neuronów koralików PDL, powoli przesuwając go na boki z prędkością 0,5 mikrometra na minutę przez dwa mikrometry, a następnie zatrzymaj się na pięć minut, aby umożliwić wydłużenie neurytu.

Po udanej inicjacji i rozciągnięciu neurytu przez pierwsze pięć mikrometrów, w sposób ciągły ciągnij neuryt z prędkością 20 mikrometrów na minutę. Aby połączyć neurony, wybierz region bogaty w neuryty. Użyj innych kulek, aby zmierzyć wysokość końcówki pipety powyżej szkiełka nakrywkowego i opuść kompleks neurytów kulek PDL tak, aby fizycznie stykał się z neurytami.

Pozostawić kompleks neurytu z kulkami PDL w kontakcie z docelowym neurytem podczas manipulowania drugą mikropipetą. Następnie opuść drugą pipetę z drugą kulką PDL na nowo utworzony neuryt około 20 mikrometrów od pierwszego koralika i użyj drugiej kulki PDL, aby popchnąć nowy filament neurytu w kierunku komórki docelowej. Następnie przytrzymaj oba koraliki na miejscu przez co najmniej godzinę.

Sprawdź pod mikroskopem brak obrzęku ogniskowego, pogrubienia neurytów stykających się ze koralikiem. W tym czasie powoli zmieniaj pożywkę próbki z soli fizjologicznej na wstępnie podgrzany NBM o równowadze dwutlenku węgla. Zwolnij koralik z drugiej pipety, zwalniając ssanie.

Jeśli nowy neuryt pozostaje przyczepiony, zwolnij również pierwszą kulkę. Następnie ostrożnie umieść próbkę z powrotem w inkubatorze, aby wzmocnić połączenie neuronalne do przyszłych eksperymentów. Możesz użyć nagrań z całych komórek patch clamp do zbadania funkcjonalności elektrycznej połączenia zmikromanipulowanego.

Pokazano tutaj izolowane populacje neuronów oddzielone 100-mikrometrową przerwą w mikrourządzeniach PDMS. Zapisy par do zacisków łatowych przeprowadzono w konfiguracji całej komórki, a połączenia indukowane mechanicznie przeanalizowano i porównano z tymi w naturalnie połączonych populacjach neuronalnych i populacjach niepołączonych. Reakcje elektryczne po presynaptycznym potencjale czynnościowym zarejestrowanym z neuronów połączonych naturalnie i za pomocą mikromanipulacji są znacznie wyższe i tymczasowo korelują z aktywnością presynaptyczną.

Po opanowaniu technikę tę można wykonać w ciągu ośmiu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo, a podczas próby tej procedury ważne jest, aby pamiętać o zdrowych i dobrze zaprojektowanych długoterminowych hodowlach komórkowych, aby zagwarantować szybkie i powtarzalne wyniki. Zgodnie z tą procedurą można zastosować różne metody w celu sprawdzenia funkcjonalności elektrycznej połączenia z mikromanipulacją. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować populacje komórek w komorach mikroprzepływowych i używać manipulacji pipetami do inicjowania, rozszerzania i łączenia neurytów.