Nagrania całokomórkowe patch-clamp izolowanych pierwotnych komórek nabłonka z najądrza

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek nabłonka od najądrza szczura i zmierzenie właściwości elektrycznych tych pierwotnie zdysocjowanych komórek za pomocą metody patch-clamp dla całych komórek. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie biologii rozrodu, takie jak funkcja najądrza, która jest ważna dla dojrzewania plemników i dziedziczenia cech ojcowskich. Technika ta pozwala użytkownikowi na kauteryzację właściwości elektrycznych izolowanych komórek nabłonka najądrza, dzięki czemu można następnie zilustrować nieznaną funkcję fizjologiczną tych komórek.

Procedurę zademonstruje Bao Li Zhang, doktorant z mojego laboratorium. Aby rozpocząć procedurę, zdezynfekuj narzędzia preparacyjne przez zanurzenie w 70% etanolu. Następnie pozwól im wyschnąć na powietrzu.

Następnie przygotuj pełny IMDM. Następnie utwórz 50 ml porcji w warunkach aseptycznych, uszczelnij Parafilmem i przechowuj w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie przygotuj roztwór do trawienia enzymów kolagenowych, rozpuszczając kolagenazę typu I i kolagenazę typu II w RPMI, co daje jeden miligram na mililitr każdej kolagenazy w roztworze.

Przefiltrować roztwór przez membranę o średnicy 0,22 mikrometra. Następnie oznacz go jako roztwór kolagenazy i utrzymuj roztwór w temperaturze pokojowej do czasu użycia. Następnie dostosuj objętość roztworu enzymu w zależności od masy enzymu.

Minimalna objętość wymagana dla obu najądrzy ogona od jednego szczura wynosi dwa mililitry. Aby wypreparować najądrza ogona szczura, należy uśmiercić zwierzę za pomocą pentobarbitalu sodu we wstrzyknięciu IP lub przy użyciu komory izofluranowej, aż zwierzę nie zareaguje na stymulację szczypania ogona, po której nastąpi zwichnięcie szyjki macicy. Następnie zdezynfekuj dolną część brzucha, przecierając ją 70% etanolem.

Delikatnie wepchnij oba jądra w dół do dolnej części brzucha, a następnie otwórz dolną część brzucha w pobliżu moszny. Następnie usuń tłuszcz najądrza i wypreparuj wszystkie narządy rozrodcze. Następnie przenieś je do naczynia z RPMI.

Na czystej stacji roboczej z kontrolowanym przepływem powietrza wypreparuj najądrza ogona z tkanki łącznej i tłuszczowej oraz torebki najądrza. Umieść jeden najądrz z 0,2 mililitra roztworu kolagenazy w 1,5 mililitrowej probówce. Aby oddzielić pojedyncze komórki od najądrzy ogona, pokrój najądrza w roztworze kolagenazy za pomocą cienkich nożyczek, aż tkanka stanie się płynem podobnym do pasty.

Następnie delikatnie opłucz nożyczki resztą roztworu enzymu w probówce. Następnie umieść rurkę na metalowym termomikserze na 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza z prędkością wytrząsania 1 000 obr./min. Następnie odwiruj mieszaninę enzymów tkankowych w temperaturze pokojowej przez trzy minuty.

Następnie zdekantuj lepki supernatant, który zawiera głównie plemniki. Następnie ponownie zawieś osad w jednym mililitrze pełnego IMDM, aby ugasić całą aktywność enzymatyczną. Następnie przenieś zawiesinę ogniw do 50-mililitrowej probówki zawierającej 49 mililitrów RPMI.

Odwirować mieszaninę komórek i zdekantować supernatant. Zawiesić osad w jednym mililitrze pełnego IMDM z delikatnym rozcieraniem przez co najmniej pięć minut, aby oddzielić pojedyncze komórki od mieszaniny tkanek najądrza poddanych działaniu enzymatyki. Oddzielić komórki nabłonka od innych komórek w warunkach aseptycznych i hodować zawiesinę komórek na 10-centymetrowej szalce Petriego zawierającej pełny IMDM przez co najmniej osiem godzin lub przez noc w inkubatorze w temperaturze 32 stopni Celsjusza.

Następnego ranka przygotuj sterylne szkiełka nakrywkowe, zanurzając je w 100% alkoholu. Wysuszyć na powietrzu, a następnie zanurzyć je w niewielkiej ilości pożywki hodowlanej. Następnie umieść szkiełka nakrywkowe w sześciocentymetrowych naczyniach hodowlanych lub w pojedynczych dołkach na 24-dołkowej płytce.

Teraz zbierz zdysocjowane komórki nabłonka, delikatnie zbierając zawiesinę komórkową z szalki Petriego, która składa się głównie z komórek nabłonkowych. Odwirować zawiesinę komórek o stężeniu 30 razy G w temperaturze pokojowej przez pięć minut, a następnie zdekantować supernatant. Następnie ponownie zawieś osad ogniwa w dwóch mililitrach pełnego IMDM.

Wysiew 0,2 mililitra zawiesiny pobranych komórek na środku każdego sterylnego szkiełka nakrywkowego. Pozwól, aby zawiesina komórek osiadła w kropelce cieczy przez co najmniej 10 minut, aby komórki luźno przylegały do szkiełek nakrywkowych. Następnie ostrożnie dodaj jeden mililitr pełnego IMDM na krawędzi sześciocentymetrowej naczynia lub 0,3 mililitra pełnego IMDM do każdego dołka 24-dołkowej płytki, nie naruszając komórek.

Izolowane pojedyncze komórki należy przechowywać na szkiełkach nakrywkowych w inkubatorze w temperaturze 32 stopni Celsjusza do czasu eksperymentów z zaciskiem krosowym. W dniu eksperymentu z patch-clamp rozmrozić jedną porcję roztworu wewnątrzkomórkowego na lodzie i przechowywać ją w chłodzie podczas eksperymentu patch-clamp, aby zapobiec degradacji. Następnie przenieś komórki nabłonka hodowlanego na szkiełku nakrywkowym do komory rejestracyjnej wypełnionej standardowym PSS w temperaturze pokojowej.

Ostrożnie wymień PSS kąpieli co najmniej dwa razy za pomocą pipety przed jakimikolwiek eksperymentami z zaciskiem krosowym. Aby ustalić konfigurację całej komórki, zanurz pipetę w roztworze kąpieli z najwyższą prędkością mikromanipulatora. Znajdź końcówkę pipety na ekranie podłączonym do aparatu cyfrowego.

Następnie zmniejsz prędkość mikromanipulatora do trybu średnio-wysokiego. Szybko sprawdź rezystancję mikropipety za pomocą polecenia interfejsu akwizycji danych, stosując krok napięcia generowany przez wzmacniacz sterowany komputerowo. Wymień mikropipetę na nową, jeśli rezystancja znacznie wykracza poza ten zakres.

Potencjał złącza cieczy między pipetą a roztworem do kąpieli należy wyzerować za pomocą polecenia przesunięcia pipety w interfejsie sterownika oprogramowania. Monitoruj rezystancję za pomocą testu membranowego. Jeśli rezystancja jest większa niż 500 megaomów, ale mniejsza niż jeden gigaom, zastosuj ujemny potencjał, aby pomóc w utworzeniu gigaseal.

W międzyczasie skompensuj przejściowy prąd pojemnościowy mikropipety. W tym momencie należy zastosować stopień hiperpolaryzacyjny o napięciu 10 miliwoltów z potencjału utrzymywania wynoszącego zero miliwoltów w celu określenia rezystancji uszczelnienia. Natychmiast po osiągnięciu udanej konfiguracji całego ogniwa zastosuj krok hiperpolaryzacyjny o napięciu 10 miliwoltów od potencjału utrzymywania ujemnych 60 miliwoltów.

Przełącz tryb napięcia na tryb prądu zerowego i wykonaj 10-sekundowe nagrywanie bez przerw, aby zmierzyć spoczynkowy potencjał błonowy ogniwa. Następnie szybko przełącz się z powrotem na tryb napięcia i pozostań w nim. Zastosuj protokoły napięciowe zgodnie z zaplanowanymi eksperymentami i zmierz odpowiedzi prądowe.

Oto przykłady komórek nabłonkowych wyizolowanych z najądrzy ogona szczura przed i po ponownym zbiorze nocnej hodowli na szalce przed eksperymentami z klamrą. Rysunek ten przedstawia typowe prądy całokomórkowe rejestrowane z pojedynczych komórek nabłonka najądrza przy użyciu protokołu wywołującego impulsy. Przerywana linia oznaczała zerowy poziom prądu.

Oto zależność napięcia prądowego odpowiedzi prądowych mierzonych we wskazanych punktach czasowych. Są to reprezentatywne dane dotyczące spoczynkowego potencjału błonowego głównych komórek dializowanych roztworem pipety, zarówno z ATP, jak i bez ATP. Ten wykres słupkowy nie pokazuje znaczącej różnicy między początkowym potencjałem spoczynkowym błony plus ATP i minus ATP.

Liczby w nawiasach w paskach wskazują liczbę badanych komórek pochodzących od co najmniej trzech zwierząt. A oto analizy korelacji rezystancji uszczelnienia i rezystancji wejściowej wszystkich ogniw lub tylko głównych ogniw w porównaniu z potencjałami spoczynkowymi zmierzonymi na zacisku prądu zerowego wkrótce po ustanowieniu całego ogniwa oraz wielkościami prądu mierzonymi na kroku hiperpolaryzacji do minus 100 miliwoltów od potencjału utrzymywania. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu dziewięciu godzin, jeśli jest wykonywana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o natychmiastowym zatrzymaniu trawienia enzymatycznego na etapie izolacji komórek. W przeciwnym razie może dojść do nadmiernego trawienia, co może prowadzić do trudnego tworzenia uszczelnienia gigaomowego i niepowodzenia eksperymentów z zaciskiem krosowym. Aby utrzymać zdrowie hodowli, ważne jest, aby odwirować enzymatycznie zdysocjowaną mieszaninę komórek z niską prędkością 30 G przez dwie do trzech minut, a następnie zdekantować lepki supernatant, który zawiera głównie plemniki.

Po tych procedurach można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie żywych komórek i techniki hodowli jednokomórkowej, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak spoczynkowy potencjał błonowy w naiwnych komórkach nabłonkowych może regulować zachowanie zewnątrzkomórkowe w kontrolowanych warunkach. Technika ta toruje drogę naukowcom zajmującym się biologią rozrodu do badania właściwości elektrofizjologicznych komórek nabłonka najądrza w celu regulacji dojrzewania plemników i dziedziczenia cech nabytych przez ojca. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak izolować komórki nabłonkowe od najądrza szczura i jak mierzyć właściwości elektryczne tych komórek za pomocą metody patch-clamp dla całych komórek.