Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Ogólnym celem tej procedury jest różnicowanie nerwowych komórek macierzystych pochodzących z ludzkich indukowanych kolonii pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury komórek neuronalnych i glejowych. Ten model nadaje się do badań przesiewowych toksyczności leków i substancji chemicznych. Ten model in vitro może być stosowany do oceny indukowanych chemicznie zaburzeń szlaków sygnałowych, które są aktywowane podczas procesu różnicowania neuronów i gleju.

Główną zaletą tego systemu jest wykorzystanie modelu ludzkiego pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, który stanowi alternatywę dla tradycyjnie stosowanych komórek nowotworowych i pierwotnych hodowli zwierząt oraz pozwala na badanie neurotoksyczności w mieszanej populacji komórek nerwowych i glejowych. Procedura zostanie zademonstrowana przez Francescę Pistollato, naszego post-doca i Carolinę Nunes, doktorantkę z naszego laboratorium. Zacznij od przejścia kolonii hiPSC.

Pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy czterokrotnym powiększeniu w komorze laminarnej, użyj jednomililitrowej strzykawki z igłą o rozmiarze 30. Pokrój kolonie komórek macierzystych w kwadraty o wymiarach około 200 mikronów na 200 mikronów. Wycinanie kolonii wymaga dobrych zdolności manualnych, aby uzyskać fragmenty o jednakowej wielkości.

Pomocne może być użycie dostępnych na rynku narzędzi skrawających. Następnie użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby oderwać fragmenty kolonii od powierzchni naczynia, delikatnie pipetując podłoże pod spodem, aby podnieść kawałki. Przenieś około 100 fragmentów kolonii do kwalifikowanej 60-milimetrowej pożywki DMEM F12 pokrytej matrycą, wypełnionej czterema mililitrami kompletnej pożywki hiPSC.

Następnie inkubuj nowe naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Codziennie wykonuj całkowitą zmianę pożywki i sprawdzaj morfologię kolonii za pomocą mikroskopu z kontrastem fazowym przy powiększeniach czterokrotnych i 10-krotnych. W dniu zerowym procedury różnicowania odświeżyć pożywkę hiPSC, dodając trzy mililitry pożywki na 60 milimetrów szalki Petriego.

Następnie pokrój i oderwij fragmenty o grubości 200 mikronów, tak jak poprzednio. Odłączone fragmenty i pożywkę odpipetować do 15-mililitrowej probówki. Wypłucz naczynie dwoma mililitrami kompletnej pożywki hiPSC i odzyskaj wszystkie fragmenty.

Następnie odwirować przy 112 razy G przez jedną minutę. Po odwirowaniu odessać supernatant i delikatnie zawiesić fragmenty w pięciu mililitrach kompletnej pożywki hiPSC EB. Umieść całą objętość w 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej o bardzo niskim mocowaniu.

Inkubuj danie przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia sprawdź komórki za pomocą odwróconego mikroskopu. Dzień, w którym jedno ciało embrionu powinno wydawać się zaokrąglone i odrębne od siebie, jak widać tutaj.

Następnie odpipetować ciała zarodkowe i pożywkę z naczynia i przenieść do 15-mililitrowej probówki. Odwirować ciała zarodków w temperaturze 112 razy G przez jedną minutę. W drugim dniu odessać roztwór do powlekania matrycy wzorcowej z wcześniej przygotowanego 60-milimetrowego naczynia i dodać do szalki pięć mililitrów kompletnej pożywki do indukcji neuroepitelialnej lub NRI.

Pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy czterokrotnym powiększeniu i za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów, zbierz około 50 pływających ciał embrionalnych i przenieś je do jednej powlekanej naczynia. Następnie inkubuj naczynie w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia, w trzecim dniu procedury różnicowania, sprawdź szalkę pod mikroskopem przy 10-krotnym powiększeniu, aby upewnić się, że wszystkie ciała zarodków są połączone.

Następnie delikatnie wykonać całkowitą wymianę pożywki z kompletnym podłożem NRI. Zmieniaj pożywkę NRI co drugi dzień aż do siódmego dnia, kiedy powinny być widoczne rozetowe agregaty neuronabłonkowe. W siódmym dniu pokryj 96-dołkową płytkę, pipetując 100 mikrolitrów wzorcowej matrycy rozcieńczonej w pożywce hodowlanej do każdego dołka.

Ósmego dnia pokrój podobne do rozety agregaty na fragmenty pod mikroskopem stereoskopowym przy 10-krotnym powiększeniu w sterylnych warunkach. Zwróć uwagę, że rozety mają tendencję do łatwego odklejania się od naczynia po dotknięciu igłą. W takim przypadku częściowo zdezagreguj oderwaną rozetę za pomocą końcówki igły.

Jeśli rozety pozostaną częściowo przymocowane, użyj pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby zakończyć odłączanie fragmentów rozety. Sadzonki rozetowe wymagają dobrych zdolności manualnych i precyzji, aby uniknąć wycinania pochodnych neurefoksydermalnych. Następnie zbierz fragmenty rozety i ich podłoże do 15-mililitrowej stożkowej probówki.

Opłucz naczynie dwoma mililitrami pożywki NRI, aby odzyskać wszystkie fragmenty. Następnie wiruj fragmenty rozety pod kątem 112 razy G przez jedną lub dwie minuty. Po odessaniu supernatantu delikatnie ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze podgrzanego One X DPBS bez wapnia i magnezu.

Delikatnie pipetuj fragmenty rozety w górę i w dół, aby częściowo je rozdzielić. Następnie dodaj cztery mililitry kompletnej pożywki NRI i policz komórki za pomocą błękitu trypanowego i automatycznego licznika komórek. Następnie odessać wzorcowy roztwór powlekający matrycę z płytki 96-dołkowej i umieścić komórki w studzienkach o gęstości około 15 000 komórek na centymetr kwadratowy w podłożu NRI.

Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. W dniu 10 wykonaj całkowitą zmianę pożywki przy użyciu kompletnego podłoża różnicowania neuronów. Ten reprezentatywny obraz przedstawia rozety po 12 dniach in vitro barwione na gniazdynę na zielono i tubulinę beta trzy na czerwono.

Tutaj komórki, które były hodowane przez 28 dni in vitro, zostały wybarwione na rurkę beta 3 na czerwono i NF200 na zielono. Ten reprezentatywny obraz pokazuje komórki neuronalne zróżnicowane z NSC po 21 dniach in vitro wybarwione na obecność NF200 na czerwono i na zielono. Tutaj komórki glejowe z tej samej hodowli są barwione na czerwono pod kątem GFAP.

Na tym histogramie porównano ilościowe oznaczanie nestyny, MAP dwa, GFAP, kwasu gamma-aminomasłowego, pęcherzykowego transportera glutaminianu jeden i komórek dodatnich hydroksylazy tyrozynowej w pochodnych hiPSC IMR90 i komórkach zróżnicowanych z NSC pochodzących z hiPSC IMR90. Te obrazy z kontrastem fazowym wykonane przy użyciu obiektywu 10X pokazują neuronalne komórki macierzyste ulegające różnicowaniu przez 21 dni. Postępując zgodnie z tymi procedurami, można przeprowadzić inne odczyty, takie jak ilościowy PCR w czasie rzeczywistym i wielostronna ponowna analiza, w celu oceny fizjologii i fenotypu komórek nerwowych i glejowych oraz oceny wpływu substancji chemicznych.

Nie zapominaj, że praca ze związkami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna. Dlatego należy zawsze zachowywać odpowiednie środki ostrożności przy użyciu okularów ochronnych, rękawic lub maski pod kapturem przepływowym, zwłaszcza podczas wykonywania zabiegów chemicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak uzyskać mieszaną, zróżnicowaną populację neuronów i komórek glejowych, zaczynając od ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, które stanowią odpowiedni model, model in vitro, do rozwoju w zakresie testów neurotoksyczności.