Name: Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 2 s
Description: Poznaj protokół różnicowania hiPSC w mieszane kultury neuronów i gleju. Ta metoda umożliwia badanie neurotoksyczności i testowanie substancji chemicznych na ludzkich komórkach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Dr. Marc Peschanski (I-Stem, Évry, Francja) za dostarczenie IMR90-hiPSCs; Dr. Giovanna Lazzari i Dr. Silvia Colleoni (Avantea srl, Cremona, Włochy); Dr. Simone Haupt (Uniwersytet w Bonn, Niemcy); Dr. Tiziana Santini (Włoski Instytut Technologii, Rzym), za udzielenie porad dotyczących oceny barwienia immunofluorescencyjnego; Dr. Benedetta Accordi, Dr. Elena Rampazzo, oraz dr Luca Persano (Uniwersytet w Padwie, Włochy) za wkład w analizę RPPA i walidację przeciwciał. Finansowanie: prace te były wspierane przez finansowany ze środków UE projekt "SCR&Tox" (Grant Agreement No. 266753).

<ol><li>NRC. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Toxicity+Testing+in+the+21st+Century%3A+A+Vision+and+a+Strategy%22">Toxicity Testing in the 21st Century: A Vision and a Strategy</a>. , National Academy Press. Washington, DC. (2007).</li>
<li>Drews, K., Jozefczuk, J., Prigione, A., Adjaye, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells--from+mechanisms+to+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Med+%28Berl%29%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells--from mechanisms to clinical applications.</a> J Mol Med (Berl). 90 (7), 735-745 (2012).</li>
<li>Ho, P. J., Yen, M. L., Yet, S. F., Yen, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+applications+of+human+pluripotent+stem+cells%3A+possibilities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Current applications of human pluripotent stem cells: possibilities and challenges.</a> Cell Transplant. 21 (5), 801-814 (2012).</li>
<li>Krueger, W. H., Swanson, L. C., Tanasijevic, B., Rasmussen, T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natural+and+artificial+routes+to+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Natural and artificial routes to pluripotency.</a> Int J Dev Biol. 54 (11-12), 1545-1564 (2010).</li>
<li>Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Healy, L., Young, L., Stacey, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardization+of+pluripotent+stem+cell+cultures+for+toxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Standardization of pluripotent stem cell cultures for toxicity testing.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 8 (2), 239-257 (2012).</li>
<li>Pistollato, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+pluripotent+stem+cell+derived+neuronal+model+to+identify+chemically+induced+pathway+perturbations+in+relation+to+neurotoxicity%3A+effects+of+CREB+pathway+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Development of a pluripotent stem cell derived neuronal model to identify chemically induced pathway perturbations in relation to neurotoxicity: effects of CREB pathway inhibition.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 280 (2), 378-388 (2014).</li>
<li>Zagoura, D., Canovas-Jorda, D., Pistollato, F., Bremer-Hoffmann, S., Bal-Price, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+rotenone-induced+activation+of+the+Nrf2+pathway+in+a+neuronal+model+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Int%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the rotenone-induced activation of the Nrf2 pathway in a neuronal model derived from human induced pluripotent stem cells.</a> Neurochem Int. , (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for differentiation of human induced pluripotent stem cells into post-mitotic neurons and glial cells. EURL ECVAM. , Available from:
 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-differentiation-of-human-induced-pluripotent-stem-cells-into-post-mitotic-neurons-and-glial-cells-%28mixed-culture%29-protocol-no.-165/key/p_1570</a> (2016).</li>
<li>Standard operating procedure for expansion of rosette-derived neural stem cells. EURL ECVAM. , Available from:
	 <a target="_blank" href="https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571">https://ecvam-dbalm.jrc.ec.europa.eu/methods-and-protocols/protocol/standard-operating-procedure-for-expansion-of-rosette-derived-neural-stem-cells-protocol-no.-166/key/p_1571</a> (2016).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Brien, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+concordance+of+drug-induced+human+hepatotoxicity+with+in+vitro+cytotoxicity+measured+in+a+novel+cell-based+model+using+high+content+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Toxicol%22%5BJournal%5D)">High concordance of drug-induced human hepatotoxicity with in vitro cytotoxicity measured in a novel cell-based model using high content screening.</a> Arch Toxicol. 80 (9), 580-604 (2006).</li>
<li>Accordi, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+protein+network+activation+mapping+reveals+new+potential+molecular+drug+targets+for+poor+prognosis+pediatric+BCP-ALL%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Functional protein network activation mapping reveals new potential molecular drug targets for poor prognosis pediatric BCP-ALL.</a> PLoS One. 5 (10), e13552(2010).</li>
<li>Vassallo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+multi-laboratory+evaluation+of+microelectrode+array-based+measurements+of+neural+network+activity+for+acute+neurotoxicity+testing%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">A multi-laboratory evaluation of microelectrode array-based measurements of neural network activity for acute neurotoxicity testing.</a> Neurotoxicology. , (2016).</li>
<li>Shamblott, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+embryonic+germ+cell+derivatives+express+a+broad+range+of+developmentally+distinct+markers+and+proliferate+extensively+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Human embryonic germ cell derivatives express a broad range of developmentally distinct markers and proliferate extensively in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 98 (1), 113-118 (2001).</li>
<li>Bryan, H. K., Olayanju, A., Goldring, C. E., Park, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2+cell+defence+pathway%3A+Keap1-dependent+and+-independent+mechanisms+of+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The Nrf2 cell defence pathway: Keap1-dependent and -independent mechanisms of regulation.</a> Biochem Pharmacol. 85 (6), 705-717 (2013).</li>
<li>Tufekci, K. U., Civi Bayin, E., Genc, S., Genc, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2%2FARE+Pathway%3A+A+Promising+Target+to+Counteract+Mitochondrial+Dysfunction+in+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Parkinsons+Dis%22%5BJournal%5D)">The Nrf2/ARE Pathway: A Promising Target to Counteract Mitochondrial Dysfunction in Parkinson's Disease.</a> Parkinsons Dis. , 314082(2011).</li>
<li>Kovac, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2+regulates+ROS+production+by+mitochondria+and+NADPH+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Nrf2 regulates ROS production by mitochondria and NADPH oxidase.</a> Biochim Biophys Acta. 1850 (4), 794-801 (2015).</li>
<li>Lee, J. M., Shih, A. Y., Murphy, T. H., Johnson, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NF-E2-related+factor-2+mediates+neuroprotection+against+mitochondrial+complex+I+inhibitors+and+increased+concentrations+of+intracellular+calcium+in+primary+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">NF-E2-related factor-2 mediates neuroprotection against mitochondrial complex I inhibitors and increased concentrations of intracellular calcium in primary cortical neurons.</a> J Biol Chem. 278 (39), 37948-37956 (2003).</li>
<li>Itoh, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Nrf2%2Fsmall+Maf+heterodimer+mediates+the+induction+of+phase+II+detoxifying+enzyme+genes+through+antioxidant+response+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">An Nrf2/small Maf heterodimer mediates the induction of phase II detoxifying enzyme genes through antioxidant response elements.</a> Biochem Biophys Res Commun. 236 (2), 313-322 (1997).</li>
<li>Li, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nrf2%2FARE+pathway+activation%2C+HO-1+and+NQO1+induction+by+polychlorinated+biphenyl+quinone+is+associated+with+reactive+oxygen+species+and+PI3K%2FAKT+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol+Interact%22%5BJournal%5D)">Nrf2/ARE pathway activation, HO-1 and NQO1 induction by polychlorinated biphenyl quinone is associated with reactive oxygen species and PI3K/AKT signaling.</a> Chem Biol Interact. , 56-67 (2014).</li>
<li>Cannon, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+rotenone+model+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible rotenone model of Parkinson's disease.</a> Neurobiol Dis. 34 (2), 279-290 (2009).</li>
<li>Sherer, T. B., Kim, J. H., Betarbet, R., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+rotenone+exposure+causes+highly+selective+dopaminergic+degeneration+and+alpha-synuclein+aggregation%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous rotenone exposure causes highly selective dopaminergic degeneration and alpha-synuclein aggregation.</a> Exp Neurol. 179 (1), 9-16 (2003).</li>
<li>Testa, C. M., Sherer, T. B., Greenamyre, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rotenone+induces+oxidative+stress+and+dopaminergic+neuron+damage+in+organotypic+substantia+nigra+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res+Mol+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Rotenone induces oxidative stress and dopaminergic neuron damage in organotypic substantia nigra cultures.</a> Brain Res Mol Brain Res. 134 (1), 109-118 (2005).</li>
<li>Tukey and Dunnett methods. GraphPad. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm">http://www.graphpad.com/guides/prism/7/statistics/index.htm?stat_the_methods_of_tukey_and_dunne.htm</a> (2017).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+induction+of+neural+conversion+in+human+ESCs+and+human+induced+pluripotent+stem+cells+with+a+single+chemical+inhibitor+of+transforming+growth+factor+beta+superfamily+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">High-efficiency induction of neural conversion in human ESCs and human induced pluripotent stem cells with a single chemical inhibitor of transforming growth factor beta superfamily receptors.</a> Stem Cells. 28 (10), 1741-1750 (2010).</li>
<li>Topol, A., Tran, N. N., Brennand, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Guide+to+Generating+and+Using+hiPSC+Derived+NPCs+for+the+Study+of+Neurological+Diseases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Guide to Generating and Using hiPSC Derived NPCs for the Study of Neurological Diseases.</a> J Vis Exp. (96), e52495(2015).</li>
<li>Jiang, Y., Zhang, M. J., Hu, B. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+functional+neurons+and+glia+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Specification of functional neurons and glia from human pluripotent stem cells.</a> Protein Cell. 3 (11), 818-825 (2012).</li>
<li>Parsons, X. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+derivation+of+human+neuronal+progenitors+and+neurons+from+pluripotent+human+embryonic+stem+cells+with+small+molecule+induction%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient derivation of human neuronal progenitors and neurons from pluripotent human embryonic stem cells with small molecule induction.</a> J Vis Exp. (56), e3273(2011).</li>
<li>Shi, Y., Kirwan, P., Livesey, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+to+cerebral+cortex+neurons+and+neural+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human pluripotent stem cells to cerebral cortex neurons and neural networks.</a> Nat Protoc. 7 (10), 1836-1846 (2012).</li>
<li>Zeng, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+region-specific+neurons+including+forebrain+glutamatergic+neurons+from+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Specification of region-specific neurons including forebrain glutamatergic neurons from human induced pluripotent stem cells.</a> PLoS One. 5 (7), e11853(2010).</li>
<li>Zeng, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+human+dopaminergic+neurons+derived+from+embryonic+stem+cells%3A+MPP%2B+toxicity+and+GDNF+neuroprotection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychopharmacology%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of human dopaminergic neurons derived from embryonic stem cells: MPP+ toxicity and GDNF neuroprotection.</a> Neuropsychopharmacology. 31 (12), 2708-2715 (2006).</li>
<li>Paşca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Almeida, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+key+pathological+features+of+frontotemporal+dementia+with+C9ORF72+repeat+expansion+in+iPSC-derived+human+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol%22%5BJournal%5D)">Modeling key pathological features of frontotemporal dementia with C9ORF72 repeat expansion in iPSC-derived human neurons.</a> Acta Neuropathol. 126 (3), 385-399 (2013).</li>
<li>Urbán, N., Guillemot, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+embryonic+and+adult+brain%3A+same+regulators%2C+different+roles%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the embryonic and adult brain: same regulators, different roles.</a> Front Cell Neurosci. 8, 396(2014).</li>
<li>Kriegstein, A., Alvarez-Buylla, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glial+nature+of+embryonic+and+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The glial nature of embryonic and adult neural stem cells.</a> Annu Rev Neurosci. 32, 149-184 (2009).</li>
<li>Krencik, R., Weick, J. P., Liu, Y., Zhang, Z. J., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+transplantable+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Specification of transplantable astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Biotechnol. 29 (6), 528-534 (2011).</li>
<li>Krencik, R., Zhang, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+functional+astroglial+subtypes+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of functional astroglial subtypes from human pluripotent stem cells.</a> Nat Protoc. 6 (11), 1710-1717 (2011).</li>
<li>Nguyen, T., Nioi, P., Pickett, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Nrf2-antioxidant+response+element+signaling+pathway+and+its+activation+by+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Nrf2-antioxidant response element signaling pathway and its activation by oxidative stress.</a> J Biol Chem. 284 (20), 13291-13295 (2009).</li>
<li>Bal-Price, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+adverse+outcome+pathways+relevant+to+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Rev+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Putative adverse outcome pathways relevant to neurotoxicity.</a> Crit Rev Toxicol. 45 (1), 83-91 (2015).</li>
<li>Cabezas, R., El-Bacha, R. S., Gonzalez, J., Barreto, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+functions+in+astrocytes%3A+neuroprotective+implications+from+oxidative+damage+by+rotenone%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial functions in astrocytes: neuroprotective implications from oxidative damage by rotenone.</a> Neurosci Res. 74 (2), 80-90 (2012).</li>
<li>Swarnkar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Astrocyte+activation%3A+a+key+step+in+rotenone+induced+cytotoxicity+and+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Astrocyte activation: a key step in rotenone induced cytotoxicity and DNA damage.</a> Neurochem Res. 37 (10), 2178-2189 (2012).</li>
<li>Canovas-Jorda, D., Louisse, J., Pistollato, F., Zagoura, D., Bremer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerative+toxicology%3A+the+role+of+stem+cells+in+the+development+of+chronic+toxicities%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Metab+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Regenerative toxicology: the role of stem cells in the development of chronic toxicities.</a> Expert Opin Drug Metab Toxicol. 10 (1), 39-55 (2014).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W niniejszej pracy opisano solidny i stosunkowo szybki protokół różnicowania IMR90-hiPSC w neurony postmitotyczne i komórki glejowe. Wcześniej opublikowane protokoły różnicowania neuronów oparte na hESC i hiPSC zwykle dają wysoki odsetek prekursorów neuronalnych25,26 i znaczną liczbę neuronalnych komórek docelowych 27,28,29,30,31,32,33. Analogicznie, opisany tutaj protokół różnicowania jest odpowiedni do generowania heterogenicznych kultur komórek neuronalnych GABA-ergicznych, glutaminergicznych i dopaminergicznych, wraz z glejem i dyskretną proporcją komórek nestin+. Obecność komórek nerwowych glutaminergicznego (~35-42%) i GABAergicznego (~15-20%) sugeruje, że kultura ta posiada przodomózgowie, cechy podobne do kory mózgowiowej, a obecność dyskretnej liczby neuronów dopaminergicznych (~13-20%) może również wskazywać na specyficzność śródmózgowia. Dodatkowo, trwałość skromnej proporcji komórek nestin+ może okazać się odpowiednia do badania neurogenezy i możliwego wpływu substancji chemicznych na NSC, które są głównie ograniczone zarówno do hipokampa, jak i strefy podkomorowej (SVZ) przodomózgowia34. Dalsze analizy immunocytochemiczne i ekspresji genów pomogłyby lepiej określić regionalną specyficzność zróżnicowanych pochodnych komórek.
Dwa najbardziej krytyczne etapy w protokole różnicowania opisanym w niniejszym dokumencie to: (i) cięcie kolonii hiPSC na jednorodne fragmenty (co ma kluczowe znaczenie dla wytwarzania EB o jednorodnych rozmiarach) oraz (ii) cięcie struktur neuroektodermalnych (rozet) w celu różnicowania NSC, co wymaga znacznych umiejętności manualnych i precyzji, aby uniknąć pobierania komórek mezodermalnych i endodermalnych, które mogą zmniejszyć proporcje neuronów i komórek glejowych uzyskanych po różniczkowanie.
Kluczowe znaczenie ma scharakteryzowanie fenotypów komórek podczas ekspansji (jako niezróżnicowanych kolonii lub NSC) oraz podczas wszystkich etapów różnicowania. W szczególności profile ekspresji genów i białek pochodnych komórek neuronalnych/glejowych powinny wykazywać regulację w górę i aktywację szlaków sygnałowych związanych z neuronami, podczas gdy ekspresja markerów pluripotencji powinna być zmniejszona.
Generowanie EB i pochodnych neuroektodermalnych (rozet) może być trudne manualnie i podatne na zmienność. Z tego powodu opracowaliśmy protokół ekspansji NSC pochodzących z rozety i ich dalszego różnicowania w komórki neuronalne/glejowe.
Możliwymi ograniczeniami tego protokołu różnicowania są głównie (i) stosunkowo niski odsetek zróżnicowanych pochodnych gleju oraz (ii) brak dojrzałych funkcji sieci neuronalnej (na co wskazuje brak impulsów). Co więcej, określone subpopulacje astrocytów mogą funkcjonować jako pierwotni pregentorzy lub NSC35. Chociaż w tej zróżnicowanej hodowli komórkowej nie zaobserwowano podwójnie dodatnich komórek nestyny/GFAP (dane nie pokazane), przypuszcza się, że komórki GFAP + w tych mieszanych kulturach są astrocytami progenitorowymi i astrocytami. Jest prawdopodobne, że wydłużając czas różnicowania, liczba astrocytów może wzrosnąć, a ich morfologia może stać się bardziej dojrzała, na co wskazują już wcześniejsze prace z grupyZhanga 36,37.
W nowym paradygmacie badania toksyczności wiedza na temat wywołanych chemikaliami zaburzeń szlaków biologicznych ma ogromne znaczenie przy ocenie przeciwności chemicznych. W związku z tym systemy badań in vitro powinny być w stanie powiązać niekorzystne skutki z zakłóceniami szlaków sygnałowych, zgodnie z koncepcją ścieżki niepożądanych skutków (AOP). Jako dowód słuszności koncepcji, rotenon może być wykorzystany do oceny aktywacji szlaku Nrf2, który bierze udział w obronie komórkowej przed stresem oksydacyjnym lub elektrofilowym38, a stres oksydacyjny jest ważnym i powszechnym kluczowym zdarzeniem w różnych AOP istotnych dla neurotoksyczności rozwojowej i dorosłej39.
Rotenon powinien wywołać aktywację szlaku Nrf2, co można wykazać poprzez translokację jądrową białka Nrf2 i zwiększoną ekspresję enzymów docelowych Nrf2, w tym NQO1 i SRXN1. Stwierdzono, że rotenon indukuje zależny od dawki wzrost poziomu białka GFAP, co wskazuje na aktywację astrocytów40,41. Rotenon zmniejsza również liczbę komórek dopaminergicznych (TH+), co jest zgodne z wcześniejszymi badaniami in vitro i in vivo wykazującymi zależną od rotenonu śmierć komórek dopaminergicznych, ponieważ ten typ neuronów jest szczególnie wrażliwy na stres oksydacyjny 21,22,23.
Podsumowując, ten model hodowli neuronów i komórek glejowych pochodzący z hiPSC jest cennym narzędziem do oceny neurotoksycznych skutków substancji chemicznych, które wywołują stres oksydacyjny powodujący aktywację szlaku Nrf2. Ponieważ ten protokół różnicowania pozwala na generowanie mieszanych kultur komórek neuronalnych (neuronów GABA-ergicznych, dopaminergicznych i glutaminergicznych) i astrocytów, może okazać się odpowiedni do badania przesłuchów między neuronami a glejem w stanach fizjologicznych i patologicznych, takich jak choroby neurodegeneracyjne (np . Choroba Parkinsona). Co więcej, obecność znacznej części NSC może pomóc w ocenie możliwego wpływu substancji chemicznych na progenitory nerwowe, o których wiadomo, że są głównym celem mutacji indukowanych chemicznie lub infekcji wirusowych42.

Raport Narodowej Rady ds. Badań Naukowych Stanów Zjednoczonych1 przewidział nowy paradygmat testowania toksyczności, w którym regulacyjne testy toksyczności zostałyby zmienione z podejścia polegającego na zmianach fenotypowych obserwowanych u zwierząt na podejście skupiające się na mechanistycznych testach in vitro z wykorzystaniem ludzkich komórek. Pochodne pluripotencjalnych komórek macierzystych (PSC) mogą stanowić alternatywę dla modeli komórek nowotworowych, ponieważ uzyskane komórki mogą bardziej przypominać warunki fizjologiczne tkanek ludzkich i dostarczać bardziej odpowiednich narzędzi do badania niepożądanych skutków wywołanych chemikaliami. Dwa główne typy kultur PSC, które są najbardziej obiecujące do badań toksyczności, to ludzkie embrionalne komórki macierzyste (hESC) i ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC), które są obecnie szeroko stosowane w obszarach badań podstawowych i medycyny regeneracyjnej2,3. Wiedza ta może być teraz wykorzystana do opracowania nowej klasy badań toksykologicznych in vitro, których celem jest identyfikacja zaburzonych szlaków fizjologicznych związanych z rozwojem niekorzystnych skutków in vivo. Jest jednak mało prawdopodobne, aby metody badawcze do regulacyjnej oceny bezpieczeństwa oparte na hESC były akceptowane przez wszystkie państwa członkowskie UE i kraje na całym świecie ze względu na możliwe obawy etyczne i zróżnicowane krajowe polityki legislacyjne regulujące wykorzystanie komórek pochodzących z zarodków.
hiPSCs mają cechy podobne do hESCs4,5 i mają duży potencjał dla metod in vitro, zarówno do identyfikacji celów terapeutycznych, jak i do oceny bezpieczeństwa. Ponadto technologia hiPSC łagodzi ograniczenia związane z ograniczoną pulą dawców oraz obawy etyczne związane z komórkami pochodzącymi z zarodków. Głównym wyzwaniem dla hiPSC jest wykazanie, że komórki te mogą w sposób powtarzalny wytwarzać znaczny zakres istotnych z toksykologicznego punktu widzenia pochodnych komórkowych, o cechach i reakcjach typowych dla tkanek ludzkich. Predefiniowane poziomy wybranych markerów są zazwyczaj wykorzystywane do charakteryzowania populacji komórek po procesie różnicowania oraz do zapewnienia wglądu w stabilność procesu różnicowania.
Poprzednie prace oceniały przydatność hiPSC do generowania mieszanych kultur komórek neuronalnych i glejowych oraz do oceny wpływu rotenonu, inhibitora mitochondrialnego kompleksu oddechowego I, na aktywację szlaku Nrf2, kluczowego regulatora mechanizmów obrony przed antyoksydantami w wielu typach komórek6,7.
Ta praca opisuje protokół używany do różnicowania hiPSC na mieszane kultury neuronalne i glejowe, dostarczając szczegółów na temat szlaków sygnałowych (poziom genów i białek), które są aktywowane podczas różnicowania neuronalnego/glejowego. Ponadto praca przedstawia reprezentatywne wyniki pokazujące, w jaki sposób ten model komórek neuronalnych i glejowych pochodzący z hiPSC może być wykorzystany do oceny aktywacji sygnalizacji Nrf2 indukowanej ostrym (24-godzinnym) leczeniem rotenonem, co pozwala na ocenę indukcji stresu oksydacyjnego.
IMR90 fibroblasty zostały przeprogramowane na hiPSC w I-Stem (Francja) przez wirusową transdukcję 2 czynników transkrypcyjnych (Oct4 i Sox2) przy użyciu wektorów pMIG6. Można również zastosować analogiczne modele hiPSC. Opisane poniżej protokoły podsumowują wszystkie etapy różnicowania się hiPSC w nerwowe komórki macierzyste (NSC), a następnie w mieszane hodowle postmitotycznych neuronów i komórek glejowych (kroki 1 i 2, szczegółowy opis protokołu można znaleźć również na stronie internetowej EURL ECVAM DBALM)8.
Dodatkowy protokół do izolacji, ekspansji, krioprezerwacji i dalszego różnicowania NSC na mieszane neurony i komórki glejowe jest szczegółowo opisany w krokach 3 i 4 (zobacz również na stronie EURL ECVAM DBALM w celu szczegółowego opisu tego protokołu)9. Krok 5 opisuje analizy, które można przeprowadzić, aby ocenić tożsamość fenotypową komórek podczas kilku etapów zaangażowania i różnicowania.

protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Protocol for the Differentiation of Human Induced Pluripotent Stem Cells into Mixed Cultures of Neurons and Glia for Neurotoxicity Testing

Ludzkie pluripotencjalne komórki macierzyste mogą różnicować się w różne typy komórek, które mogą być stosowane do testów toksyczności in vitro na ludziach. Jedną z głównych zalet jest to, że przeprogramowanie komórek somatycznych w celu wytworzenia ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) pozwala uniknąć problemów etycznych i legislacyjnych związanych z wykorzystaniem ludzkich embrionalnych komórek macierzystych (hESC). Komórki HiPSC mogą być namnażane i skutecznie różnicowane w różne typy komórek nerwowych i glejowych, służąc jako systemy testowe do badania toksyczności, a w szczególności do oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność. W pracy opisano protokół różnicowania hiPSC w mieszane kultury komórek neuronalnych i glejowych. Zdefiniowano szlaki sygnałowe, które są regulowane i/lub aktywowane przez różnicowanie neuronów. Informacje te mają kluczowe znaczenie dla zastosowania modelu komórkowego do nowego paradygmatu badania toksyczności, w którym substancje chemiczne są oceniane na podstawie ich zdolności do zakłócania szlaków biologicznych. Jako dowód słuszności koncepcji, rotenon, inhibitor mitochondrialnego kompleksu oddechowego I, został wykorzystany do oceny aktywacji szlaku sygnałowego Nrf2, kluczowego regulatora mechanizmu obrony komórkowej przed stresem oksydacyjnym napędzanego przez element odpowiedzi przeciwutleniającej (ARE).

Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) są uważane za potężne narzędzie do badań przesiewowych leków i substancji chemicznych oraz do rozwoju nowych modeli in vitro do testowania toksyczności, w tym neurotoksyczności. W tym miejscu opisano szczegółowy protokół różnicowania hiPSC w neurony i komórki glejowe.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Human pluripotent stem cells can differentiate into various cell types that can be applied to human-based in vitro toxicity assays. One major advantage is ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zróżnicowanie komórek macierzystych neuronów pochodzących z kolonii ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury komórek neuronalnych i glejowych. Model ten jest odpowiedni do screeningu toksyczności leków i substancji chemicznych. Niniejszy model in vitro może być zastosowany do oceny wywołanych chemicznie zaburzeń szlaków sygnalizacyjnych, które są aktywowane podczas procesu różnicowania neuronalnego i glejowego.Główną zaletą tego systemu jest wykorzystanie modelu ludzkiego pochodzącego z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, który stanowi alternatywę dla tradycyjnie stosowanych komórek nowotworowych i pierwotnych kultur zwierzęcych, umożliwiając badanie neurotoksyczności w mieszanej populacji komórek neuronalnych i glejowych. Procedurę zaprezentują Francesca Pistollato, nasza stażystka podoktorska, oraz Carolina Nunes, doktorantka z naszego laboratorium. Rozpocznij od pasażowania kolonii hiPSC.Pracując pod mikroskopem stereoskopowym z powiększeniem 4X w komorze z laminarnym przepływem powietrza, należy użyć strzykawki o pojemności 1 ml z igłą o rozmiarze 30 G. Kolonie komórek macierzystych należy pociąć na kwadraty o wymiarach około 200 µm na 200 µm. Wycinanie kolonii wymaga wysokich umiejętności manualnych, aby uzyskać fragmenty o jednakowej wielkości.Pomocne może być zastosowanie dostępnych w sprzedaży narzędzi tnących. Następnie należy użyć pipety 200 µL, aby odłączyć fragmenty kolonii od powierzchni płytki, delikatnie pipetując pożywkę pod nimi w celu uniesienia kawałków. Przenieś około 100 fragmentów kolonii na odpowiednią płytkę 60 mm pokrytą Matrix DMEM F12 i wypełnioną czterema ml pełnej pożywki hiPSC.Następnie inkubuj nową szalkę w temperaturze 37 °C i 5% carbon dioxide. Codziennie wymieniaj całkowicie pożywkę i sprawdzaj morfologię kolonii za pomocą mikroskopu fazowo-kontrastowego przy powiększeniach 4X i 10X. W dniu zerowym procedury różnicowania odśwież pożywkę hiPSC, dodając 3 mL pożywki na każdą szalkę Petriego o średnicy 60 mm.Następnie wyciąć i oddzielić fragmenty o wielkości 200 mikronów w taki sam sposób jak wcześniej. Przenieść pipetą oddzielone fragmenty wraz z pożywką do probówki o pojemności 15 mililitrów. Przepłukać szalkę dwiema mililitrami pełnej pożywki hiPSC i odzyskać wszystkie fragmenty.Następnie wiruj z prędkością 112 ×g przez jedną minutę. Po wirowaniu odessij nadsącz i delikatnie resuspenduj fragmenty w pięciu mililitrach kompletnego pożywki do hiPSC EB. Przenieś całą objętość do 60 milimetrowej szalki hodowli tkankowej o ultra niskiej adhezji.Inkubować płytkę przez noc w temperaturze 37°C i 5% dwutlenku węgla. Następnego dnia sprawdzić komórki za pomocą mikroskopu odwróconego. Ciała embrionalne w pierwszym dniu powinny być okrągłe i wyraźnie oddzielone od siebie, tak jak pokazano tutaj.Następnie pipetą przenieś ciała zarodkowe wraz z pożywką z szalki do probówki o pojemności 15 ml. Odwiruj ciała zarodkowe z prędkością 112 ×g przez jedną minutę. Drugiego dnia odessij standardowy roztwór powlekający matrycą z wcześniej przygotowanej szalki o średnicy 60 mm i dodaj do niej 5 ml pełnej pożywki do indukcji neuroepithelialnej, czyli NRI.Pracując pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 4X i używając pipety 200 µL, należy zebrać około 50 pływających ciał embrionoidalnych i przenieść je do jednej powlekanej szalki. Następnie szalkę inkubuje się w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Następnego dnia, czyli w trzecim dniu procedury różnicowania, należy sprawdzić szalkę pod mikroskopem przy powiększeniu 10X, aby upewnić się, że wszystkie ciała embrionoidalne przywarły do podłoża.Następnie należy delikatnie przeprowadzić całkowitą wymianę pożywki na kompletną pożywkę NRI. Pożywkę NRI należy wymieniać co drugi dzień aż do siódmego dnia, kiedy powinny być widoczne neuroepitelialne agregaty przypominające rozety. W siódmym dniu należy pokryć płytkę 96-dołkową, pipetując 100 µL standardowej macierzy rozcieńczonej w pożywce hodowlanej do każdego dołka.Ósmego dnia, w warunkach sterylnych, należy pociąć agregaty przypominające rozety na fragmenty pod mikroskopem stereoskopowym przy powiększeniu 10X. Należy zauważyć, że rozety mają tendencję do łatwego odrywania się od naczynia podczas dotykania je igłą. W takim przypadku należy częściowo rozbić oderwaną rozetę za pomocą czubka igły.Jeśli rozety pozostaną częściowo przytwierdzone, należy użyć pipety 200 µL, aby dokończyć oddzielanie fragmentów rozet. Wycinanie rozet wymaga dobrych umiejętności manualnych i precyzji, aby uniknąć przecięcia pochodnych neuroektodermalnych. Następnie należy zebrać fragmenty rozet wraz z pożywką do probówki stożkowej o pojemności 15 mL.Opłucz szalkę dwiema mililitrami medium NRI, aby odzyskać wszystkie fragmenty. Następnie odwiruj fragmenty rozety z przyspieszeniem 112 ×g przez jedną lub dwie minuty. Po odessaniu nadsączu, ostrożnie resuspenduj osad w jednym mililitrze uprzednio ogrzanego 1X DPBS bez wapnia i magnezu.Delikatnie pipetuj fragmenty rozet w górę i w dół, aby częściowo je rozdzielić. Następnie dodaj cztery mililitry pełnej pożywki NRI i policz komórki, wykorzystując błękit trypanu oraz automatyczny licznik komórek. Następnie odessij standardowy roztwór powlekający matrycę z płytki 96-dołkowej i nanieś komórki do dołków w pożywce NRI z gęstością wynoszącą około 15 000 komórek na centymetr kwadratowy.Inkubuj płytkę przez noc w temperaturze 37 °C i 5% dwutlenku węgla. W 10. dniu przeprowadź całkowitą wymianę pożywki, stosując kompletną pożywkę do różnicowania neuronów. Ten reprezentatywny obraz przedstawia rozety po 12 dniach in vitro, barwione na nestinę (kolor zielony) oraz beta-III tubulinę (kolor czerwony).Tutaj komórki hodowane in vitro przez 28 dni zostały zabarwione na beta-tubulinę III (kolor czerwony) oraz NF200 (kolor zielony). Ten reprezentatywny obraz przedstawia komórki neuronalne zróżnicowane z NSC po 21 dniach in vitro, zabarwione na NF200 (kolor czerwony) oraz tow (kolor zielony). Tutaj komórki glejowe z tej samej hodowli są zabarwione na GFAP (kolor czerwony).Ten histogram porównuje ilościowe oznaczenie komórek wykazujących pozytywną ekspresję nestyny, MAP2, GFAP, kwasu gamma-aminomasłowego, pęcherzykowego transportera glutaminianu 1 oraz tyrozynohydroksylazy w pochodnych hiPSC IMR90 oraz komórkach zróżnicowanych z pochodnych NSCs z hiPSC IMR90. Te obrazy w kontraście fazowym, wykonane przy użyciu obiektywu 10X, przedstawiają neuronalne komórki macierzyste poddawane różnicowaniu przez 21 dni. Postępując zgodnie z tymi procedurami, można przeprowadzić inne analizy, takie jak ilościowa PCR w czasie rzeczywistym i wielostronna reanaliza, w celu oceny fizjologii i fenotypu komórek neuronalnych i glejowych oraz oceny wpływu substancji chemicznych.Należy pamiętać, że praca ze związkami chemicznymi może być niezwykle niebezpieczna. Dlatego zawsze należy przestrzegać odpowiednich środków ostrożności, używając okularów ochronnych, rękawiczek lub maski pod dygestorium, szczególnie podczas przeprowadzania zabiegów chemicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak uzyskać mieszaną, zróżnicowaną populację neuronów i komórek glejowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, co stanowi odpowiedni model in vitro do rozwoju testów neurotoksyczności.

protocol-for-differentiation-human-induced-pluripotent-stem-cells

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Ten film prezentuje technikę ko-hodowli neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka wysokiego stopnia (pHGG) w urządzeniu mikroprzepływowym. Ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste są wprowadzane do układu mikroprzepływowego i inkubowane w celu promowania ich różnicowania w dojrzałe korowe neurony glutaminergiczne. Następnie komórki pHGG są wprowadzane do dojrzałych neuronów, ustanawiając kokulturę i umożliwiając interakcje między neuronami a komórkami pHGG.

Wspólna hodowla neuronów glutaminergicznego i pediatrycznych komórek glejaka o wysokim stopniu złośliwości

Ten film pokazuje generowanie nerwowych komórek progenitorowych z nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC). hPSC są różnicowane w neuronalne komórki progenitorowe za pomocą neuronalnej pożywki różnicującej. Podczas gdy różnicowanie jest indukowane w komórkach nietransgenicznych za pomocą małych cząsteczek, transgeniczne hPSC są różnicowane przez dodanie antybiotyku, który indukuje promotor dla czynnika transkrypcyjnego specyficznego dla...

Różnicowanie nietransgenicznych i transgenicznych ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w neuronalne komórki progenitorowe

Ten film pokazuje proces różnicowania ciał embrionalnych (EB) w agregaty neuroepiteliczne i ich późniejszego podziału na komórki neuronalne i glejowe. Metoda ta pozwala na efektywne generowanie komórek neuronalnych i glejowych in vitro, które służą jako systemy testowe do badania toksyczności, a także oceny różnych szlaków zaangażowanych w neurotoksyczność.

Generowanie neuronów i komórek glejowych z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych ciał embrionalnych pochodzących z komórek macierzystych

Protokoły opisują dwa systemy testów toksyczności rozwojowej in vitro (UKK i UKN1) oparte na ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych i badaniach transkryptomu. Systemy testowe przewidują zagrożenie toksycznym wpływem na rozwój człowieka i mogą przyczynić się do zmniejszenia liczby badań na zwierzętach, kosztów i czasu potrzebnego na przeprowadzenie badań bezpieczeństwa chemicznego.

Testy toksyczności rozwojowej na podstawie ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do badań przesiewowych bezpieczeństwa chemicznego i generowania danych z biologii systemowej

Opisany jest niestandardowy protokół różnicowania komórek ES myszy w zdefiniowane populacje wysoce czystych neuronów wykazujących działające synapsy i emergentne zachowanie sieci. Analiza elektrofizjologiczna wykazała utratę przekaźnictwa synaptycznego po ekspozycji na serotypy neurotoksyny botulinowej /A-/G i neurotoksynę tężcową.

Ocena funkcjonalna neurotoksyn biologicznych w sieciowych kulturach neuronów ośrodkowego układu nerwowego pochodzących z komórek macierzystych

Dendrytyczne kolce neuronów piramidowych są miejscami najbardziej pobudzających synaps w korze mózgowej ssaków. Metoda ta opisuje ilościową analizę 3D morfologii kręgosłupa w ludzkich korowych piramidowych neuronach glutaminergicznym pochodzących z indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.

Trójwymiarowa kwantyfikacja kolców dendrytycznych z neuronów piramidowych pochodzących z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje szczegółową procedurę ponownego zawieszania i hodowli neuronów pochodzących z ludzkich komórek macierzystych, które wcześniej były odróżniane od progenitorów nerwowych in vitro przez wiele tygodni. Procedura ułatwia oparte na obrazowaniu testy neurytów, synaps i markerów neuronalnych o późnej ekspresji w formacie zgodnym z mikroskopią świetlną i badaniami przesiewowymi o wysokiej zawartości.

Powtórzenie po różnicowaniu ludzkich neuronów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w celu przeprowadzenia badań przesiewowych neurytogenezy i dojrzewania synaps o wysokiej zawartości

Upośledzony transport i morfologia mitochondriów są zaangażowane w różne choroby neurodegeneracyjne. Prezentowany protokół wykorzystuje indukowane pluripotencjalne neurony przodomózgowia pochodzące z komórek macierzystych do oceny transportu mitochondrialnego i morfologii w dziedzicznej paraplegii spastycznej. Protokół ten pozwala na scharakteryzowanie transportu mitochondrialnego wzdłuż aksonów i analizę ich morfologii, co ułatwi badanie chorób neurodegeneracyjnych.

Analiza transportu i morfologii mitochondriów w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych neuronach pochodzących z komórek macierzystych w dziedzicznej paraplegii spastycznej

Opisujemy metodę różnicowania rdzenia kręgowego, indukowanych przez człowieka astrocytów i neuronów pochodzących z pluripotencjalnych źródeł oraz ich wspólnej hodowli do zapisu elektrofizjologicznego.

Stworzenie platformy elektrofizjologicznej do modelowania ALS z wykorzystaniem specyficznych regionalnie astrocytów i neuronów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

To badanie przedstawia nowatorskie podejście do pomiaru wielu parametrów funkcjonalnych mitochondriów na podstawie cytometrii przepływowej i podwójnego barwienia dwoma fluorescencyjnymi reporterami lub przeciwciałami w celu wykrycia zmian w objętości mitochondriów, potencjale błony mitochondrialnej, poziomie reaktywnych form tlenu, składzie mitochondrialnego łańcucha oddechowego i mitochondrialnym DNA.

Analiza cytometryczna przepływowa wielu parametrów mitochondrialnych w indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórkach macierzystych oraz ich pochodnych nerwowych i glejowych

Poznaj protokół różnicowania hiPSC w mieszane kultury neuronów i gleju. Ta metoda umożliwia badanie neurotoksyczności i testowanie substancji chemicznych na ludzkich komórkach.

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności (Wideo) | JoVE Journal

Protokół różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mieszane kultury neuronów i gleju do badań neurotoksyczności

Przeglądaj więcej filmów