Name: Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Poznaj technikę eksplantatu ślimakowego u noworodków myszy jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu. Ta metoda umożliwia analizę komórek włoskowatych i neuronów.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty Narodowego Instytutu Głuchoty i Innych Zaburzeń Komunikacyjnych R01DC015824 (K.M.S.) i T32DC00038 (wspierające S.D.), grant Departamentu Obrony W81XWH-15-1-0472 (K.M.S.), Fundację Bertarelli (K.M.S.), Fundację Nancy Sayles Day (K.M.S.) oraz Centrum Badań nad Szumami Usznymi Lauer (K.M.S.). Dziękujemy Jessice E. Sagers, B.A. za wnikliwe komentarze na temat manuskryptu.

Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) Massachusetts Eye and Ear. Eksperymenty przeprowadzono zgodnie z Kodeksem Etycznym Światowego Stowarzyszenia Lekarzy.
1. Przygotowanie sekcji
<ol>
	<li>Przygotowanie stołu operacyjnego
	<ol>
		<li>Do dezynfekcji stołu operacyjnego użyj 70% etanolu.</li>
		<li>Umieść dwie niesterylne podkładki przygotowawcze obok mikroskopu.</li>
		<li>Przygotuj tacę na narzędzia, w tym sterylizowane termicznie nożyczki operacyjne, rękojeść skalpela, mikronóż i kleszcze (po dwa z #4 i #55). Umieść tacę na instrumenty i szalkę Petriego o przezroczystych ściankach i szklanym dnie o średnicy 50 mm na jednej niesterylnej podkładce.</li>
		<li>Zaopatrz się w sterylne ostrze skalpela #15, zamykaną plastikową torbę lub pojemnik (do pozbycia się tusz zgodnie z wytycznymi instytucji), lód w wiadrze oraz zimny, sterylny Zrównoważony Roztwór Soli Hanka (HBSS). Umieść te przedmioty na drugiej niesterylnej podkładce.</li>
		<li>Przenieś HBSS do plastikowej probówki laboratoryjnej o pojemności 50 ml i umieść ją na lodzie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie kultury
	<ol>
		<li>Przygotuj wszystkie materiały w okapie z przepływem laminarnym. Na każde cztery próbki należy umieścić cztery autoklawowane okrągłe szkiełka nakrywkowe o średnicy 10 mm w czterech wkładkach 4-dołkowej płytki Petriego o średnicy 35 mm.</li>
		<li>Na każde 4 próbki należy wymieszać w probówce do mikrowirówki całkowitą objętość 300 μl, składającą się z następujących składników: 10 μl kleju tkankowego, 285 μlNaHCO3 i 5 μL NaOH.</li>
		<li>Umieścić 45 μl otrzymanego roztworu na każdym szkiełku nakrywkowym i pozostawić go tam na co najmniej 20 minut w temperaturze pokojowej; roztwór ten można pozostawić na szkiełku nakrywkowym na kilka godzin, ale nie można go pozostawić w stanie O/N.</li>
		<li>Umieścić jedną lub dwie 35-milimetrowe 4-dołkowe płytki Petriego wewnątrz 10-centymetrowej szalki Petriego w celu stworzenia dwóch barier chroniących przed zanieczyszczeniem.</li>
		<li>Przygotować pożywkę hodowlaną zawierającą 98% zmodyfikowanej pożywki Dulbecco Eagle's Medium (DMEM), 1% N-2 i 1% ampicyliny (65 μl na studzienkę w probówce (mikro)wirówkowej). Przed użyciem podgrzać roztwór do temperatury 25 °C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Mysi eksplantat ślimakowy
<ol>
	<li>Dekapitacja nowonarodzonej myszy
	<ol>
		<li>Zaopatrz się w plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm i spryskaj jej pokrywkę 70% etanolem, aby powierzchnia była mokra.</li>
		<li>Wlać zimny HBSS z plastikowej probówki laboratoryjnej do dolnej części plastikowej płytki Petriego o średnicy 60 mm i przezroczystych ściankach o średnicy 50 mm ze szklanym dnem. Przechowuj plastikową probówkę laboratoryjną i obie szalki Petriego na lodzie, aby utrzymać tkankę w niskiej temperaturze, gdy nie jest preparowana.</li>
		<li>Umieść nowonarodzoną mysz w wieku P3 - P5 na lodzie w odciętym palcu rękawicy lateksowej i poczekaj, aż hipotermia wywoła utratę przytomności (około 1-3 minut).</li>
		<li>Szybko odetnij głowę myszy nożyczkami operacyjnymi i wyrzuć ciało do zamykanej plastikowej torby. Umieść odciętą głowę noworodka w 70% etanolu w pokrywie plastikowej szalki Petriego o średnicy 60 mm.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Makroskopowe rozwarstwienie kości skroniowej
	<ol>
		<li>Usuń skórę czaszki, wykonując powierzchowne cięcie od przodu do tylnego końca (bezpośrednio na szczycie szwu strzałkowego) za pomocą ostrza skalpela.</li>
		<li>Ostrzem skalpela przeciąć oba zewnętrzne kanały słuchowe i zagiąć skórę do przodu, aby odsłonić całą czaszkę. 
		UWAGA: Chociaż na tym etapie zwykle nie jest potrzebny mikroskop preparacyjny, można go użyć do lepszej wizualizacji.</li>
		<li>Otwórz czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego za pomocą ostrza skalpela #15. Upewnij się, że przecinasz czaszkę, delikatnie przesuwając ostrze w górę iw dół od przodu do tyłu, aby uniknąć ucisku ślimaka. 
		UWAGA: Czaszka w tym wieku nie powinna być skostniała i powinna łatwo się ciąć.</li>
		<li>Usuń i wyrzuć pysk, wykonując pionowe cięcie bezpośrednio za oczodołami za pomocą ostrza skalpela #15. 
		UWAGA: Tylna część czaszki powinna nadal zawierać mózg i ślimak.</li>
		<li>Pozbądź się przodomózgowia, móżdżku i pnia mózgu poprzez rozwarstwienie za pomocą kleszczy #4.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ekstrakcja mikroskopowa ślimaka
	<ol>
		<li>Dostosuj mikroskop (powiększenie 6,5x) i źródło światła, umieszczając kleszcze pod lunetą i optymalizując oświetlenie i ostrość.</li>
		<li>Umieść dwie połówki czaszki na plastikowej szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej zimnym HBSS.</li>
		<li>Całkowicie odsłoń ślimak/e, który można zidentyfikować jako przylegający do otaczającej tętnicy strzemiączkowej (kręta tętnica w kości skroniowej) i tępo oddziel narząd od kości skroniowej za pomocą kleszczy #4.</li>
		<li>Przenieś ślimak na 50-milimetrową, przezroczystą szalkę Petriego ze szklanym dnem i umieść ją pod mikroskopem.</li>
		<li>Umieść plastikową szalkę Petriego o średnicy 60 mm z drugą połową czaszki na lodzie.</li>
		<li>Usuń ślimak z układu przedsionkowego i ostrożnie wypreparuj torebkę ślimakową (zwykle chrzęstną w tym wieku) za pomocą kleszczy #4. Użyj kleszczyków #55 do wszystkich dalszych kroków.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Końcowe etapy przetwarzania tkanek
	<ol>
		<li>Kontynuuj przetwarzanie tkanki ucha wewnętrznego, ostrożnie oddzielając więzadło spiralne przylegające do narządu Cortiego od reszty ślimaka i modiolusa za pomocą mikronoża lub dwóch kleszczy.
		<ol>
			<li>Wytnij ciemniejszy, półprzezroczysty obszar w szczelinie między więzadłem spiralnym a obszarem komórek rzęsatych i przystąp do późniejszego usunięcia więzadła spiralnego, chwytając je w najbardziej podstawowym aspekcie i delikatnie rozwijając, poruszając się wierzchołkowo.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Ustaw próbkę tak, aby uzyskać wzdłużny, strzałkowy widok ślimaka i pokrój ślimak na dwie do trzech sekcji za pomocą mikronoża, klasyfikując te sekcje jako zwoje wierzchołkowe, (środkowe) i podstawne. Usuń tkankę górną i dolną w stosunku do rzeczywistej warstwy komórek rzęsatych i neurytów, aby uzyskać fragment eksplantatu ślimaka, który może leżeć poziomo na szalce Petriego. 
		UWAGA: Odpowiedni rozmiar zapewniający stabilne przyleganie do naczynia hodowlanego to około połowa jednego obrotu ślimaka.</li>
		<li>Usuń błonę tektorialną, bardzo cienką, półprzezroczystą warstwę bezpośrednio znajdującą się nad narządem Cortiego, delikatnie odklejając ją kleszczami.</li>
		<li>Usuń membranę Reissnera, bezpośrednio znajdującą się nad SGN, dotykając jej kleszczami z obu stron i odklejając. 
		UWAGA: Usuń wszelkie boczne uszkodzone obszary komórek włosa, odcinając je mikronożem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Przenoszenie próbek na płytki hodowlane
<ol>
	<li>Usunąć 45 μl roztworu kleju tkankowego z czterech szkiełek nakrywkowych. Umyć każde szkiełko nakrywkowe 50 μl sterylnegoH2O. Zassać wodę.</li>
	<li>Podnieść pipetę o pojemności 1 ml. Zwilż końcówkę pipety około 120 μl DMEM, aby zapobiec przywieraniu próbki do wnętrza końcówki.</li>
	<li>Przenoś próbki pojedynczo za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Odpipetować maksymalnie 70 μl z wypełnionej HBSS, małej, przezroczystościennej szalki Petriego ze szklanym dnem i umieścić próbkę wraz z płynem na jednej z 4 wkładek (przygotowanych z szkiełkami nakrywkowymi) na 4-dołkowej szalce Petriego.</li>
	<li>Sprawdź pod mikroskopem (50-krotne powiększenie), czy próbka jest we właściwej orientacji. Upewnij się, że obszar komórek rzęsatych, z którego usunięto błonę tektorialną, jest skierowany do góry. Upewnij się, że błona podstawna, wraz z przyciętą, podstawową częścią modiolus, jest skierowana w dół i przylega do szkiełka nakrywkowego.
	<ol>
		<li>Jeśli próbka jest zwrócona do góry nogami podczas kontroli, umieść HBSS, który pozostał na końcówce pipety, we wkładce i ponownie umieść próbkę, aż zostanie prawidłowo zorientowana. 
		UWAGA: Zapobiegnie to unoszeniu się komórek rzęsatych w pożywce hodowlanej bez wsparcia strukturalnego ze strony szkiełka nakrywkowego, co mogłoby prowadzić do zwyrodnienia.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odessać nadmiar HBSS za pomocą pipety o pojemności 1 ml. Poczekaj 15 sekund.</li>
	<li>Odpipetować 60 μl przygotowanej ciepłej pożywki hodowlanej (98% DMEM, 1% N-2 i 1% ampicyliny) bezpośrednio na próbkę. Uważaj, aby nie dotknąć próbki pipetą. Założyć wewnętrzną i zewnętrzną pokrywę szalki Petriego i inkubować O/N w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Umieść wszystkie roztwory podstawowe z powrotem na właściwych miejscach, wyrzuć tusze i odpady resztkowe, odkaż stół chirurgiczny zgodnie z wytycznymi instytucjonalnymi (np. przy użyciu etanolu lub podchlorynu), wyczyść i autoklawuj narzędzia, a ostre przedmioty wyrzuć do odpowiedniego pojemnika.</li>
</ol>
4. Dodawanie końcowych pożywek hodowlanych i substancji będących przedmiotem zainteresowania
UWAGA: Eksplantaty ślimaka będą gotowe do użycia 10-16 godzin później.
<ol>
	<li>Przygotować mieszaninę 97% DMEM, 1% płodowej surowicy bydlęcej (FBS), 1% N-2 i 1% ampicyliny (65 μl na studzienkę w probówce do mikrowirówki; przed użyciem podgrzać roztwór do 25 °C).</li>
	<li>Dodać inne interesujące substancje do roztworów dla odpowiednich grup leczenia. W przypadku dodania substancji fluorescencyjnych (np. wirusów eksprymujących białko zielonej fluorescencji (GFP); w niedawnej publikacji stężenie 1010 GC wirusów związanych z adenowirusami (AAV) stosowano przez 48 godzin w 50 μl)18, chronić przed światłem.</li>
	<li>Przenieś z inkubatora płytki Petriego zawierające eksplantaty ślimaka i umieść je pod okapem z przepływem laminarnym.</li>
	<li>Odessać starą pożywkę hodowlaną (bez FBS) za pomocą pipety z wkładów.</li>
	<li>Dodać 60 μl na studzienkę przygotowanej ciepłej pożywki hodowlanej (zabiegowej) (97% DMEM, 1% FBS, 1% N-2, 1% ampicyliny i substancje będące przedmiotem zainteresowania).</li>
	<li>Umieścić szalkę Petriego z powrotem w inkubatorze (37 °C).</li>
	<li>Oglądaj regularnie pod mikroskopem, aby zidentyfikować oznaki zanieczyszczenia, migracji komórek lub oderwania eksplantatu ślimaka i wykonaj barwienie po maksymalnie 7 dniach.</li>
</ol>
5. Immunofluorescencja - Dzień 1
<ol>
	<li>Przygotować roztwór blokujący (94% sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), 5% normalna surowica kozia lub końska (NGS/NHS, w zależności od przeciwciał drugorzędowych) i 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny (patrz tabela materiałów)) i podstawowy roztwór przeciwciał (98,6% PBS, 1% NHS i 0,4% niejonowy środek powierzchniowo czynny z odpowiednimi przeciwciałami). 
	UWAGA: Przeciwciała obejmują królicze anty-Myo7A w stężeniu 1:400+ (miozyna 7A, dla wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęsatych) i mysie anty-TuJ1 1:200+ (β-tubulina, dla SGN) LUB mysie (IgG1) anty-CtBP2 1:200+ (białko wiążące c-terminal, dla presynapsy), mysz (IgG2a) anty-PSD95 1:50+ (gęstość postsynaptyczna, dla postsynapsy) i anty-NF-H kurczaka 1:1000+ (neurofilament, dla SGN i włókien nerwowych). "+" oznacza "lub wyżej".</li>
	<li>Odessać pożywkę hodowlaną za pomocą pipety. Uważaj, aby nie dotknąć próbki.</li>
	<li>Pod okapem z przepływem laminarnym przepłucz eksplantaty ślimaka dwukrotnie sterylnym PBS, umieszczając próbki na wytrząsarce na 5 minut po każdym myciu.</li>
	<li>Utrwal tkankę w 4% paraformaldehydzie (PFA - UWAGA) na 20 minut na wytrząsarce (pod maską). Zassać PFA.</li>
	<li>Nanieść 60 μl PBS na eksplantaty ślimaka i umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce na 5 minut. Odessać PBS. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Umieść eksplantaty ślimaka w przygotowanym roztworze blokującym (94% PBS, 5% NHS i 1% niejonowy środek powierzchniowo czynny) na 30 minut na shakerze.</li>
	<li>Umieść eksplantaty ślimaka w przygotowanym roztworze przeciwciał podstawowych (98,6% PBS, 1% NHS i 0,4% niejonowy środek powierzchniowo czynny) z odpowiednimi przeciwciałami pierwszorzędowymi (wir przed użyciem) O/N na liczniku w RT. 
	UWAGA: Owiń szalki Petriego wilgotnymi ręcznikami papierowymi zamkniętymi w folii (lub folii aluminiowej, jeśli dodany roztwór zawiera materiały fluorescencyjne, takie jak wirusy wykazujące ekspresję GFP), aby utrzymać wilgotność naczyń i zapobiec parowaniu roztworu przeciwciała O/N.</li>
</ol>
6. Immunofluorescencja - Dzień 2
<ol>
	<li>Przygotować barwienie 4',6-diamidyno-2-fenyloindolem (DAPI) (300 nM) i użyć roztworu przeciwciała podstawowego w celu uzyskania właściwych mieszanin przeciwciał drugorzędowych, komplementarnych do przeciwciał pierwszorzędowych w kroku 5.1. (np. koza anty-królik 488 1:200+ i koza anty-mysz 568 1:200+ LUB koza anty-mysz (IgG1) 568 1:1000+, koza anty-mysia (IgG2a) 488 1:500+ i kozia anty-kurczak 647 1:200+ LUB falloidyna 568 1:200+ (dla wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęsatych)).</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała pierwotnego.</li>
	<li>Nanieść 60 μl PBS na eksplantaty ślimaka i umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce na 5 minut. Odessać PBS. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Umieść eksplantaty ślimaka w przygotowanym roztworze przeciwciał podstawowych (98,6% PBS, 1% NHS i 0,4% niejonowego środka powierzchniowo czynnego) z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (wir przed użyciem) na 1,5 godziny na ladzie i chronić przed światłem.</li>
	<li>Odessać roztwór przeciwciała wtórnego i przepłukać eksplantaty ślimaka barwnikiem DAPI (umieszczając na wytrząsarce na 1 minutę, a następnie aspirować).</li>
	<li>Nanieść 60 μl PBS na eksplantaty ślimaka i umieścić szalkę Petriego na wytrząsarce na 5 minut. Odessać PBS. Powtórz 3 razy.</li>
	<li>Za pomocą kleszczy usuń szkiełka nakrywkowe z próbkami z płytki 4-dołkowej, zanurz je w pojemniku wypełnionym destylowanymH2Oi wysusz szkiełka nakrywkowe, doprowadzając je pionowo do kontaktu z ręcznikami papierowymi.</li>
	<li>Umieść kroplę pożywki zapobiegającej blaknięciu na szkiełku mikroskopowym i odwróć szkiełka nakrywkowe, aby zanurzyć w pożywce tkankę skierowaną w dół.</li>
	<li>Uszczelnij szkiełko nakrywkowe za pomocą przezroczystego lakieru do paznokci, pokrywając obwodowo krawędź (bez zgniatania próbki pod szkłem). Pozostaw szkiełka leżące płasko w zadaszonym miejscu, z dala od światła, na 15 - 20 minut, aż wyschną, a następnie umieść je w pudełku lub zbadaj pod mikroskopem konfokalnym. 
	UWAGA: Barwienie fluorescencyjne najlepiej zachować, przechowując szkiełka w temperaturze 4 lub -20 °C.</li>
</ol>
7. Obrazowanie konfokalne
<ol>
	<li>Uzyskaj przegląd i powiększone zdjęcia narządu regionu Cortiego, w tym neurytów i SGNs. 
	UWAGA: Standardowe ustawienia procesu obrazowania: Format 1 024 x 1 024 pikseli, prędkość 400 Hz, średnia klatek 3, 20% ogólna intensywność lasera i zwykle obiektyw 20X i 63X z zanurzeniem w oleju (potencjalnie w połączeniu z 2-krotnym zoomem cyfrowym). Ustawienia kanałów dla protokołu barwienia DAPI, Myo7A i TuJ1 są opisane powyżej: 405 5% DAPI, "Smart Gain" 766,8 V, "Smart Offset" 0,0% - 488 15% izotiocyjanian fluoresceiny (FITC), "Smart Gain" 622,2 V, "Smart Offset" 0,0% - 561 13% izotiocyjanian tetrametyloromatyny (TRITC), "Smart Gain" 562,4 V, "Smart Offset" 0,0%.</li>
	<li>Scal obrazy w stos z za pomocą oprogramowania, aby uzyskać projekcję osi z.</li>
</ol>

<ol><li>Mathers, C., Smith, A., Concha, M. Global burden of hearing loss in the year. World Health Organization (WHO). , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf">http://www.who.int/healthinfo/statistics/bod_hearingloss.pdf</a> (2000).</li>
<li>Geleoc, G. S., Holt, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sound+strategies+for+hearing+restoration%29%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sound strategies for hearing restoration).</a> Science. 344 (6184), 1241062(2014).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acceleration+of+age-related+hearing+loss+by+early+noise+exposure%3A+evidence+of+a+misspent+youth%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Acceleration of age-related hearing loss by early noise exposure: evidence of a misspent youth.</a> J Neurosci. 26 (7), 2115-2123 (2006).</li>
<li>Kujawa, S. G., Liberman, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adding+insult+to+injury%3A+cochlear+nerve+degeneration+after+%26%2334%3Btemporary%26%2334%3B+noise-induced+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Adding insult to injury: cochlear nerve degeneration after &#34;temporary&#34; noise-induced hearing loss.</a> J Neurosci. 29 (45), 14077-14085 (2009).</li>
<li>Makary, C. A., Shin, J., Kujawa, S. G., Liberman, M. C., Merchant, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Age-related+primary+cochlear+neuronal+degeneration+in+human+temporal+bones%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Age-related primary cochlear neuronal degeneration in human temporal bones.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 12 (6), 711-717 (2011).</li>
<li>Jensen, J. B., Lysaght, A. C., Liberman, M. C., Qvortrup, K., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immediate+and+delayed+cochlear+neuropathy+after+noise+exposure+in+pubescent+mice%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Immediate and delayed cochlear neuropathy after noise exposure in pubescent mice.</a> PLoS One. 10 (5), (2015).</li>
<li>Landegger, L. D., Psaltis, D., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+audiometric+thresholds+do+not+predict+specific+cellular+damage+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Hear+Res%22%5BJournal%5D)">Human audiometric thresholds do not predict specific cellular damage in the inner ear.</a> Hear Res. , 83-93 (2016).</li>
<li>Wang, H. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+Activity+of+Cochlear+Hair+Cells+Triggered+by+Fluid+Secretion+Mechanism+in+Adjacent+Support+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Spontaneous Activity of Cochlear Hair Cells Triggered by Fluid Secretion Mechanism in Adjacent Support Cells.</a> Cell. 163 (6), 1348-1359 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Ryan, A. F., Housley, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Type+I+vs+type+II+spiral+ganglion+neurons+exhibit+differential+survival+and+neuritogenesis+during+cochlear+development%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Dev%22%5BJournal%5D)">Type I vs type II spiral ganglion neurons exhibit differential survival and neuritogenesis during cochlear development.</a> Neural Dev. 6, (2011).</li>
<li>Dinh, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+interfering+RNA+against+Bax+attenuates+TNFalpha-induced+ototoxicity+in+rat+organ+of+Corti+explants%5BTitle%5D)+AND+%22Otolaryngol+Head+Neck+Surg%22%5BJournal%5D)">Short interfering RNA against Bax attenuates TNFalpha-induced ototoxicity in rat organ of Corti explants.</a> Otolaryngol Head Neck Surg. 148 (5), 834-840 (2013).</li>
<li>Mazurek, B., Yu, Y., Haupt, H., Szczepek, A. J., Olze, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salicylate+modulates+Hsp70+expression+in+the+explanted+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Salicylate modulates Hsp70 expression in the explanted organ of Corti.</a> Neurosci Lett. 501 (2), 67-71 (2011).</li>
<li>Kao, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+osteoprotegerin+expression+in+the+inner+ear+causes+degeneration+of+the+cochlear+nerve+and+sensorineural+hearing+loss%5BTitle%5D)+AND+%22Neurobiol+Dis%22%5BJournal%5D)">Loss of osteoprotegerin expression in the inner ear causes degeneration of the cochlear nerve and sensorineural hearing loss.</a> Neurobiol Dis. 56, 25-33 (2013).</li>
<li>Jan, T. A., Chai, R., Sayyid, Z. N., Cheng, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+LacZ-expressing+cells+from+mouse+inner+ear+tissues+using+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating LacZ-expressing cells from mouse inner ear tissues using flow cytometry.</a> J Vis Exp. (58), e3432(2011).</li>
<li>Haque, K. D., Pandey, A. K., Kelley, M. W., Puligilla, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Culture+of+embryonic+mouse+cochlear+explants+and+gene+transfer+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Culture of embryonic mouse cochlear explants and gene transfer by electroporation.</a> J Vis Exp. (95), e52260(2015).</li>
<li>Parker, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Primary+culture+and+plasmid+electroporation+of+the+murine+organ+of+Corti%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Primary culture and plasmid electroporation of the murine organ of Corti.</a> J Vis Exp. (36), (2010).</li>
<li>Mulvaney, J. F., Dabdoub, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+time+lapse+imaging+of+mouse+cochlear+explants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Long-term time lapse imaging of mouse cochlear explants.</a> J Vis Exp. (93), e52101(2014).</li>
<li>Wang, Q., Green, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+neurotrophin-3+in+synapse+regeneration+by+spiral+ganglion+neurons+on+inner+hair+cells+after+excitotoxic+trauma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Functional role of neurotrophin-3 in synapse regeneration by spiral ganglion neurons on inner hair cells after excitotoxic trauma in vitro.</a> J Neurosci. 31 (21), 7938-7949 (2011).</li>
<li>Landegger, L. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+AAV+vector+enables+safe+and+efficient+gene+transfer+to+the+mammalian+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear.</a> Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).</li>
<li>Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Secreted+Factors+from+Human+Vestibular+Schwannomas+Can+Cause+Cochlear+Damage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage.</a> Sci Rep. 5, 18599(2015).</li>
<li>Soares, V. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+vesicles+derived+from+human+vestibular+schwannomas+associated+with+poor+hearing+damage+cochlear+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Neuro+Oncol%22%5BJournal%5D)">Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells.</a> Neuro Oncol. , (2016).</li>
<li>Tong, M., Brugeaud, A., Edge, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regenerated+synapses+between+postnatal+hair+cells+and+auditory+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Regenerated synapses between postnatal hair cells and auditory neurons.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 14 (3), 321-329 (2013).</li>
<li>Yuan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ouabain-induced+cochlear+nerve+degeneration%3A+synaptic+loss+and+plasticity+in+a+mouse+model+of+auditory+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assoc+Res+Otolaryngol%22%5BJournal%5D)">Ouabain-induced cochlear nerve degeneration: synaptic loss and plasticity in a mouse model of auditory neuropathy.</a> J Assoc Res Otolaryngol. 15 (1), 31-43 (2014).</li>
<li>Fernandez, K. A., Jeffers, P. W., Lall, K., Liberman, M. C., Kujawa, S. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aging+after+noise+exposure%3A+acceleration+of+cochlear+synaptopathy+in+%26%2334%3Brecovered%26%2334%3B+ears%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Aging after noise exposure: acceleration of cochlear synaptopathy in &#34;recovered&#34; ears.</a> J Neurosci. 35 (19), 7509-7520 (2015).</li>
<li>Barclay, M., Constable, R., James, N. R., Thorne, P. R., Montgomery, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reduced+sensory+stimulation+alters+the+molecular+make-up+of+glutamatergic+hair+cell+synapses+in+the+developing+cochlea%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Reduced sensory stimulation alters the molecular make-up of glutamatergic hair cell synapses in the developing cochlea.</a> Neuroscience. , 50-62 (2016).</li>
<li>Zinn, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+Silico+Reconstruction+of+the+Viral+Evolutionary+Lineage+Yields+a+Potent+Gene+Therapy+Vector%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector.</a> Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).</li>
<li>Wu, Z., Yang, H., Colosi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+genome+size+on+AAV+vector+packaging%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Effect of genome size on AAV vector packaging.</a> Mol Ther. 18 (1), 80-86 (2010).</li>
<li>Shu, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+Adeno-Associated+Viral+Vectors+That+Target+Neonatal+and+Adult+Mammalian+Inner+Ear+Cell+Subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of Adeno-Associated Viral Vectors That Target Neonatal and Adult Mammalian Inner Ear Cell Subtypes.</a> Hum Gene Ther. , (2016).</li>
<li>Kao, S. Y., Soares, V. Y., Kristiansen, A. G., Stankovic, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+TRAIL-DR5+pathway+promotes+sensorineural+degeneration+in+the+inner+ear%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of TRAIL-DR5 pathway promotes sensorineural degeneration in the inner ear.</a> Aging Cell. 15 (2), 301-308 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Naukowcy muszą udoskonalić technikę sekcji przed przeprowadzeniem eksperymentów z udziałem eksplantatów ślimaka. Komórki rzęsate są często uszkadzane podczas sekcji wykonywanych na wczesnym etapie krzywej uczenia się, a szczególnie problematycznym momentem dla ich integralności jest usunięcie błony tektorialnej, co wymaga pewnych rąk, odpowiednich narzędzi i doświadczenia. Aby zaoszczędzić czas i zasoby, należy przeprowadzić kontrolę wzrokową pod mikroskopem preparacyjnym i zwrócić uwagę na potencjalnie uszkodzone obszar...

Odbiorczy ubytek słuchu (SNHL) odzwierciedla uszkodzenie ucha wewnętrznego lub wstępującej ścieżki słuchowej. Podczas gdy ubytek słuchu jest najczęstszym deficytem sensorycznym u ludzi1, terapie lecznicze jeszcze nie istnieją2. Chociaż implanty ślimakowe lub słuchowe pnia mózgu mogą przywrócić pewien stopień słuchu pacjentom z ciężkim lub głębokim SNHL, słuch zapewniany przez te urządzenia nadal bardzo różni się od "naturalnego" słyszenia, zwłaszcza podczas prób rozumienia mowy w hałasie lub słuchania muzyki.
Chociaż zwyrodnienie komórek rzęsatych od dawna uważane jest za główną konsekwencję traumatycznych zdarzeń słuchowych (np. narażenie na głośny hałas), istnieje coraz więcej dowodów na to, że synapsy przekazujące informacje z komórek rzęsatych do nerwu słuchowego są co najmniej tak samo podatne na uraz akustyczny3,4,5,6. Ponieważ progi audiometryczne u ludzi, obecny złoty standard oceny funkcji słuchu, nie przewidują specyficznych uszkodzeń komórek w uchu wewnętrznym, potrzebne są bardziej wyrafinowane narzędzia, aby jak najszybciej wykryć zwyrodnienie komórkowe i rozpocząć odpowiednie leczenie7.
Obiecujące metody leczenia ubytku słuchu są często testowane na homogenicznych hodowlach komórkowych in vitro, ale takie systemy nie modelują dokładnie mikrośrodowiska ślimaka. Wiadomo, że komórki ślimakowe wydzielają czynniki troficzne, które wpływają na inne typy komórek w obrębie ślimaka 8,9, kluczowy proces in vivo, który jest tracony, gdy narząd Corti10,11 lub spiralne neurony zwojowe (SGNs)12 są hodowane w izolacji lub podczas analizy markerów molekularnych13. Jednak badania in vivo, które mogą być niezbędne do walidacji danych in vitro w celu opracowania nowych, spersonalizowanych metod leczenia ubytku słuchu w pogoni za "medycyną precyzyjną", wymagają znacznych zasobów i czasu. Jest to szczególnie istotne, gdy weźmie się pod uwagę, ile wysiłku wymaga udoskonalenie i wykonanie iniekcji do ucha środkowego lub błony okiennej z badaniami słuchu i późniejszym rozwarstwieniem całych mocowań ślimaka. Skuteczne badania przesiewowe obiecujących związków w organotypowych kulturach ex vivo, znanych jako eksplantaty ślimakowe, stanowią ekonomiczną i niezawodną alternatywę14,15,16,17.
Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół, za pomocą którego można generować, utrzymywać i oceniać eksplantaty ślimakowe leczone. Podkreślono konkretne zastosowania tego modelu, w tym jego zastosowanie w badaniach przesiewowych potencjalnie terapeutycznych związków oraz ocenę porównawczą wektorów wirusowych w terapii genowej. Podejście oparte na eksplantacji ex vivo pozwala naukowcom na wizualizację wpływu danego leczenia na różne populacje komórek in situ, ułatwiając identyfikację mechanizmów specyficznych dla typu komórki i późniejsze udoskonalenie celowanych środków terapeutycznych.
Ogólnie rzecz biorąc, ta technika dostarcza modelu do badania ślimaka ex vivo, zachowując przy tym istotne wzajemne oddziaływanie między bardzo różnymi typami komórek, które współistnieją w ślimaku.

<table><tbody><tr><td>Ampicylina, sól sodowa</td><td>Invitrogen</td><td>11593-027</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-CtBP2, mysie (IgG1)</td> <td>Laboratoria Transdukcji BD</td><td>612044</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-Myo7A, królik</td><td>Proteus Biosciences</td><td>25-6790</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-NF-H, kurczak</td><td>EMD Millipore</td><td>AB5539</td><td></td></tr><tr><td>przeciwciało anty-PSD95, przeciwciała myszy (IgG2a)</td><td> Inc.</td><td>75-028</td><td></td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-TuJ1, mysie</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td></td></tr><tr><td>Cell-Tak Klej do komórek i tkanek, 5 mg</td><td>Corning</td><td>354241</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe CELLSTAR 15 mL, stożkowe dno, podziałka, sterylne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>188161</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 100 x 20 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>664160</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 35 x 10 mm, 4 pierścienie wewnętrzne</td><td>Greiner Bio-One</td><td>627170</td><td></td></tr><tr><td>Naczynie do hodowli komórkowych CELLSTAR, 60 x 15 mm</td><td>Greiner Bio-One</td><td>628160</td><td></td></tr><tr><td>Probówki wirówkowe CELLSTAR 50 mL, stożkowe dno, podziałka, sterylny</td><td>Greiner Bio-One</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>Przezroczysty lakier do paznokci</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>72180</td><td></td></tr><tr><td>Naczynia z przezroczystym dnem (szkło 40 mm), PELCO&reg;, tuleja/20, 50 x 7 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>14027-20</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka nakrywkowe, okrągłe, szkło, średnica 10 mm, grubość #1, 0.13 - 0.16mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td></td><td></td>260368</tr><tr><td>DAPI (4',6-diamidyn-2-fenyloindol, dichlorowodorek)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>D1306</td><td></td></tr><tr><td>Woda destylowana, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15230-162&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM), wysoka glukoza, pirogronian, bez glutaminy, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10313-039</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #4 Kleszcze</td><td>Fine Science Tools</td><td>11241-30</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #55 Kleszcze (Dumostar)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11295-51</td><td></td></tr><tr><td>Alkohol etylowy (EtOH), czysty, 200 proof, bezwodny, &ge; 99.5%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836-1L</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS), kwalifikowana, regiony zatwierdzone przez USDA, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10437-028&nbsp;</td><td>Podwielokrotność porcji w probówkach o pojemności 50 ml i przechowywać w temperaturze -20 stopni Celsjusza; C zamrażarka</td></tr><tr><td>koza przeciwciało drugorzędowe anty-kurczak-647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21469</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie (IgG)-568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-11004</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie (IgG1)-568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21124</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało anty-mysie (IgG2a)-488 przeciwciało drugorzędowe</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21131</td><td></td></tr><tr><td>kozie przeciwciało drugorzędowe anty-królicze-488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>R37116</td><td></td></tr><tr><td>H2O, sterylne, EmbryoMax Ultra Pure Water, 500 ml</td><td>EMD Millipore</td><td>TMS-006-B</td><td></td></tr><tr><td>Zbilansowany roztwór soli Hanka (HBSS), wapń, magnez, bez czerwieni fenolowej, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Taca na instrumenty z pokrywką Nóż</td><td>do</td> mikro (preparowania) ze stali nierdzewnej <td>Mountainside Medical TechMed4255</td><td></td></tr><tr><td>&ndash; kątowy 30&deg;</td><td>Fine Science Tools</td><td>10056-12</td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka mikroskopowe, VistaVision, oznaczone kolorami, 75 x 25 mm (3 x 1"), grubość 1 mm, białe, opakowanie 72 szt</td>. <td>VWR</td><td>16004-382</td><td></td></tr><tr><td>Suplement N-2 (100X), 5 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3, roztwór wodorowęglanu sodu 7,5%, 100 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25080-094</td><td></td></tr><tr><td>NaOH, roztwór wodorotlenku sodu, 1 l</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>SS266-1</td><td></td></tr><tr><td>Normalna surowica końska (NHS)</td><td>Invitrogen</td><td>16050130</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki operacyjne</td><td>Roboz Surgical Instruments Co.</td><td>RS-6806</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd (PFA), klasa odczynnika, krystaliczna</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>Przed użyciem: Ustal standardowe procedury operacyjne w oparciu o protokoły dostępne online</td></tr><tr><td>PBS, pH 7,4, 500 ml</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010-023&nbsp;</td><td>Autoklaw przed użyciem</td></tr><tr><td>Falloidyna, Alexa Fluor 568&nbsp;</td><td>Podkładka przygotowawcza Thermo Fisher Scientific</td><td>A12380</td><td></td></tr><tr><td>, niesterylna&nbsp;</td><td>Medline</td><td>05136CS</td><td></td></tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 0.5 ml</td><td>Autoklaw</td><td>Eppendorf</td><td>022363719</td> przed użyciem</tr><tr><td>Probówki do mikrowirówek Safe-Lock, polipropylen, 1,5 ml</td><td>Autoklaw</td><td>Eppendorf</td><td>022363204</td> przed użyciem</tr><tr><td>Ostrza skalpela - #15</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td></td></tr><tr><td>Rękojeść skalpela - #4</td><td>Narzędzia do nauki</td><td>10004-13</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop stereoskopowy Stemi 2000-C</td><td>Zeiss&nbsp;</td><td>000000-1106-133</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop konfokalny TCS SP5</td><td>Leica</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X (niejonowy środek powierzchniowo czynny)</td><td>Integra</td><td>T756.30.30</td><td></td></tr><tr><td>Antyblakowy środek montażowy VectaShield do fluorescencji</td><td>Vector Laboratories, Inc.</td>Torba na zamek błyskawiczny <td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>, zamykana, 4 x 6'' - grubość 2 mm</td><td>Zipline</td><td>0609132541599</td><td></td></tr></tbody></table>

technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Neonatal Murine Cochlear Explant Technique as an In Vitro Screening Tool in Hearing Research

Chociaż w ciągu ostatnich kilku dekad nastąpił znaczny postęp w badaniach nad słuchem, nadal nie ma lekarstwa na Odbiorczy Ubytek Słuchu (SNHL), stan, który zazwyczaj wiąże się z uszkodzeniem lub utratą delikatnych struktur mechanosensorycznych ucha wewnętrznego. W ostatnich latach pojawiły się zaawansowane testy in vitro i ex vivo, które umożliwiają badania przesiewowe coraz większej liczby potencjalnie terapeutycznych związków przy jednoczesnej minimalizacji zasobów i przyspieszeniu wysiłków na rzecz opracowania leków na SNHL. Chociaż jednorodne kultury niektórych typów komórek nadal odgrywają ważną rolę w obecnych badaniach, wielu naukowców polega obecnie na bardziej złożonych hodowlach organotypowych mysich uszu wewnętrznych, znanych również jako eksplantaty ślimaka. Zachowanie zorganizowanych struktur komórkowych w uchu wewnętrznym ułatwia ocenę in situ różnych elementów infrastruktury ślimakowej, w tym wewnętrznych i zewnętrznych komórek rzęsatych, neuronów spiralnych, neurytów i komórek podporowych. W tym miejscu przedstawiamy przygotowanie, hodowlę, leczenie i barwienie immunologiczne eksplantatów ślimaka mysiego u noworodków. Staranne przygotowanie tych eksplantatów ułatwia identyfikację mechanizmów, które przyczyniają się do SNHL i stanowi cenne narzędzie dla społeczności badaczy słuchu.

Podczas gdy wiele protokołów koncentruje się na eksplantach narządu Cortiego, technika ta ma na celu zachowanie anatomii całego zwoju ślimaka, w tym SGNs. Daje to badaczom możliwość analizy wpływu danego leczenia na neuryty i somata SGNs, oprócz samego narządu Cortiego. Wykonanie sekcji zachowującej część modiolusa, zgodnie z opisem w niniejszym materiale, jest trudniejsze technicznie niż sam eksplant narządu Cortiego. Jednak obszar neurytów i SGN jest istotny, ponieważ w dwóch ostatnich ...

Celem tego protokołu jest zademonstrowanie przygotowania, hodowli, leczenia i barwienia immunologicznego eksplantatów ślimakowych u noworodków myszy. Technika ta może być wykorzystana jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu.

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

While there have been remarkable advances in hearing research over the past few decades, there is still no cure for Sensorineural Hearing Loss (SNHL), a ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie, hodowla, traktowanie oraz immunobarwienie eksplantów ślimaka noworodków myszy, które mają służyć jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach nad słuchem. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad słuchem, umożliwiając jednoczesne badanie komórek rzęsistych ślimaka, synaps, neurytów i neuronów w modelu ex vivo oraz dostarczając wglądu w mechanizmy działania cząsteczek nowych dla ślimaka, w tym czynników występujących w wydzielinach ludzkich. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przyspieszenia procesu przesiewowego potencjalnych związków terapeutycznych przed ich przetestowaniem in vivo.Zacznij od świeżo pobranej głowy noworodka przechowywanej w 70% etanolu w pokrywce szalki Petriego. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj powierzchowne nacięcie skóry od przedniego do tylnego końca czaszki. Następnie przetnij oba kanały słuchowe zewnętrzne i odchyl skórę do przodu, aby odsłonić całą czaszkę.Następnie należy otworzyć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego, delikatnie przesuwając ostrze skalpela w górę i w dół od strony przedniej do tylnej, aby uniknąć ucisku ślimaka. Usunąć i odrzucić pysk, wykonując cięcie pionowe bezpośrednio za oczodołami. Tylna część czaszki powinna nadal zawierać mózg i ślimaka.Następnie za pomocą pincety przeprowadzono tępe rozczłonkowanie i usunięto przedmózgowie, móżdżek oraz pień mózgu. Obie połowy czaszki umieszczono w plastikowej szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej zimnym HBSS. Następnie za pomocą pincety całkowicie odsłonięto ślimaka, który znajduje się sąsiadująco z otaczającą go tętnicą strzemiączkową, i tępo oddzielono ten organ od kości skroniowej.Przenieś ślimaka do 50 milimetrowej szalki Petriego z przezroczystą ścianką i szklanym dnem zawierającej HBSS i umieść szalkę pod mikroskopem. Umieść 60 milimetrową plastikową szalkę Petriego z drugą połową czaszki na lodzie. Następnie, używając 4 pincet, ostrożnie wypreparuj torebkę kostną ślimaka.Następnie przy użyciu mikronożyczek lub dwóch pincet 55 należy ostrożnie oddzielić więzadło spiralne przylegające do narządu Cortiego od pozostałej części ślimaka oraz od ściany przyśrodkowej. Można to osiągnąć, chwytając więzadło spiralne w jego najbardziej podstawnej części i delikatnie je rozwijając, przesuwając się w kierunku wierzchołkowym. Po usunięciu więzadła spiralnego należy ustawić preparat tak, aby uzyskać podłużny przekrój strzałkowy ślimaka.Następnie podziel ślimaka na dwa lub trzy fragmenty za pomocą mikronża, klasyfikując te sekcje jako zakręty wierzchołkowy i podstawowy. Usuń tkankę znajdującą się powyżej w przypadku fragmentu bardziej wierzchołkowego oraz poniżej w przypadku fragmentu bardziej podstawowego, aż do właściwej warstwy komórek rzęskowych i neurytów, aby eksplant ślimaka mógł spoczywać poziomo na szalce Petriego. Następnie, używając pęsety, delikatnie chwyć i odwarstw błonę tectorialną, która jest bardzo cienką, półprzezroczystą warstwą znajdującą się bezpośrednio nad organem Cortiego.Najbardziej wymagającym technicznie etapem jest prawdopodobnie usunięcie cienkiej, półprzezroczystej błony tectorialnej, ponieważ łatwo można uszkodzić znajdujące się pod nią komórki rzęsate. Rozpoczynając od krawędzi tkanki, zachowuje się komórki rzęsate wzdłuż całego eksplantu, z wyjątkiem samego brzegu, od którego rozpoczęto oddzielanie błony tectorialnej. Na koniec usuwa się błonę Reissnera, znajdującą się bezpośrednio nad neuronami zwoju spiralnego, dotykając jej pęsetą z obu stron i odrywając ją.Preparat ślimaka jest teraz gotowy do hodowli po usunięciu wszelkich uszkodzonych obszarów na krawędziach. Procedurę hodowli należy rozpocząć od zwilżenia końcówki pipety o pojemności 1 ml około 120 µL DMEM, aby zapobiec przywieraniu eksplantatu do wnętrza końcówki. Następnie, używając uprzednio zwilżonej końcówki, należy pobrać maksymalnie 70 µL z płytki Petriego z szklanym dnem i umieścić preparat wraz z cieczą w jednym z czterech wkładów w czterooddziałowej płytce Petriego.Sprawdzić pod mikroskopem, czy eksplant jest ustawiony w odpowiedniej orientacji. Upewnić się, że obszar komórek rzęskowych, z którego usunięto błonę tectorialną, jest skierowany do góry, a błona podstawna wraz z przyciętą podstawową częścią ślimaka jest skierowana w dół i przylega do wkładki szkiełka nakrywkowego. Jeśli podczas inspekcji okaże się, że preparat jest odwrócony do góry nogami, jak pokazano tutaj, dodać HBSS za pomocą końcówki pipety i przemieścić fragment, aż zostanie on prawidłowo zorientowany.Po prawidłowym zorientowaniu eksplantu należy odessać nadmiar HBSS, a następnie odczekać 15 sekund. Teraz należy nanieść pipetą 60 µL ciepłej pożywki hodowlanej bezpośrednio na preparat, uważając, aby nie dotknąć go końcówką pipety. Należy założyć pokrywy wewnętrznej i zewnętrznej szalki Petriego i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.Następnego dnia przenieś szalki Petriego zawierające eksplanty ślimaków z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Odessij ze wkładki starą pożywkę hodowlaną niezawierającą FBS. Do każdego dołka dodaj 60 µL przygotowanej, ciepłej pożywki traktującej.Umieść szalkę Petriego z powrotem w inkubatorze aż do czasu barwienia kultur, po maksymalnie siedmiu dniach. Jak widać na tym obrazie konfokalnym, technika ta pozwala zachować anatomię całego zwoju ślimaka, w tym neurony zwoju spiralnego (SGNs), co umożliwia analizę wpływu leczenia na neurydy i somata SGNs, oprócz analizy narządu Cortiego. Jak tu widać, eksplanty te mogą być wykorzystane do jednoczesnego porównania efektu leczenia w obrębie części szczytowej i podstawowej ślimaka po barwieniu immunofluorescencyjnym.Komórki rzęsiste są zaznaczone na zielono, a struktury neuronalne na czerwono. Nienaruszone synapsy można ocenić poprzez jednoczesne znakowanie białek presynaptycznych (na czerwono) i białek postsynaptycznych (na zielono) wraz z barwieniem struktur neuronalnych na niebiesko. Rysunek przedstawia reprezentatywne obrazy eksplantów szczytowych i podstawowych ślimaka po siedmiu dniach hodowli z dodatkiem 3% FBS (po lewej) lub 1% FBS (po prawej).Komórki inkubowane w 3% FBS zaczynają migrować między czwartym a piątym dniem, co wskazują jasnoszare strzałki dla komórek słuchowych oraz czerwone strzałki dla neurytów. Eksplanty w 1% FBS zachowują integralność organizacyjną do siódmego dnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wizualnie upewnić się co do integralności strukturalnej i orientacji tkanki ślimaka przed dodaniem końcowej pożywki hodowlanej i badanych substancji.Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać rekonstrukcję 3D, aby potwierdzić specyficzną dla typu komórek lokalizację komórek wykazujących ekspresję GFP w obrębie medialis.

neonatal-murine-cochlear-explant-technique-as-an-vitro-screening-tool

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

Niniejsza procedura opisuje metodę izolacji i hodowli mysiego narządu Cortiego z lub bez listka spiralnego i neuronów zwoju spiralnego. Prezentujemy również metodę ekspresji egzogennego genu reporterowego w eksplantacie narządu Cortiego za pomocą elektroporacji.

Kultura pierwotna i elektroporacja plazmidowa mysiego narządu Cortiego.

Wewnętrzne ucho myszy jest organem zmysłowym pochodzącym z placody, którego program rozwojowy realizowany jest podczas ciąży. Opisujemy technikę transferu genu in utero, składającą się z trzech etapów: brzusznej laparotomii myszy, mikrowstrzyknięcia do macicy oraz elektroporacji in vivo. Wykorzystujemy cyfrową mikroskopię wideo, aby zademonstrować kluczowe eksperymentalne techniki embriologiczne.

Transfer genów do rozwijającego się ucha wewnętrznego myszy za pomocą elektroporacji in vivo

Obrazowanie na żywo ślimaka embrionalnego ssaka jest wyzwaniem, ponieważ procesy rozwojowe przebiegają w tempie czasowym przez dziesięć dni. W tym miejscu przedstawiamy metodę hodowli, a następnie obrazowania embrionalnej tkanki eksplantatu ślimaka pobranej od fluorescencyjnej myszy reporterowej w ciągu pięciu dni.

Długoterminowe obrazowanie poklatkowe eksplantatów ślimaka myszy

Prezentujemy metodę, która opisuje izolację i hodowlę eksplantatów ślimaka z embrionalnego ucha wewnętrznego myszy.  Demonstrujemy również metodę transferu genów do eksplantatów ślimakowych za pomocą elektroporacji fali prostokątnej. Hodowla eksplantatów in vitro w połączeniu z techniką transferu genów umożliwia naukowcom badanie skutków zmiany ekspresji genów podczas rozwoju.

Hodowla embrionalnych eksplantatów ślimakowych myszy i transfer genów za pomocą elektroporacji

Istnieją różne metody wprowadzania czynników ototoksycznych do ślimaków modeli zwierzęcych. Przedstawiono protokół chirurgiczny dostarczania środków ototoksycznych do wnęki okrągłego okna. Procedura jest niezawodna, tworzy ukierunkowane zmiany wewnątrzślimakowe i pozwala uniknąć mechanicznych uszkodzeń mikroarchitektury. Możliwe jest badanie samonaprawy/regeneracji ślimaka.

Mysie podejście oparte na okrągłym oknie do dostarczania czynników ototoksycznych: szybka i niezawodna technika indukowania zwyrodnienia komórek ślimakowych

W tym badaniu opisujemy dostęp do tylnego kanału półkolistego jako niezawodną metodę dostarczania genów do ucha wewnętrznego u noworodków myszy. Pokazujemy, że dostarczenie genu przez tylny kanał półkolisty jest w stanie przeniknąć do całego ucha wewnętrznego.

Dostęp do tylnego kanału półkolistego do dostarczania genów do ucha wewnętrznego u nowonarodzonych myszy

Zwierzęce modele implantów ślimakowych mogą poszerzyć wiedzę na temat technologicznych podstaw leczenia trwałego odbiorczego ubytku słuchu za pomocą stymulacji elektrycznej. W badaniu przedstawiono protokół chirurgiczny ogłuszenia i implantacji ślimakowej zestawu elektrod u myszy, a także ocenę funkcjonalną z odpowiedzią słuchową pnia mózgu.

Operacja wszczepienia implantu ślimakowego i elektrycznie wywołane nagrania słuchowej odpowiedzi pnia mózgu u myszy C57BL/6

Ten artykuł przedstawia zmodyfikowaną metodę przygotowania powierzchni ślimaka, która wymaga odwapnienia i użycia kleju komórkowego i tkankowego do przyklejenia kawałków nabłonka ślimaka do 10 mm okrągłych szkiełek nakrywkowych do immunohistochemii u dorosłych ślimaków myszy.

Przygotowanie powierzchni ślimaka u dorosłej myszy

Pisklę jest opłacalnym, dostępnym i szeroko dostępnym organizmem modelowym do różnych badań. W tym miejscu szczegółowo opisano szereg protokołów, aby zrozumieć mechanizmy molekularne leżące u podstaw rozwoju i regeneracji ucha wewnętrznego ptaków.

Metody in ovo i ex ovo do badania rozwoju ucha wewnętrznego ptaków

Obecny protokół aktualizuje poprzednie protokoły i zawiera stosunkowo proste podejścia do hodowli wysokiej jakości eksplantatów ślimakowych. Zapewnia to niezawodne pozyskiwanie danych i obrazowanie w wysokiej rozdzielczości w żywych i stałych komórkach. Protokół ten wspiera trwający trend badania komórek ucha wewnętrznego.

Eksplantaty ślimakowe całego noworodka jako model in vitro

Tutaj prezentujemy szczegółowy protokół izolacji i hodowli pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od myszy. Początkowo narząd Cortiego został wypreparowany z noworodków (w wieku 3-5 dni) mysich ślimaków pod mikroskopem. Następnie komórki trawiono enzymatycznie do zawiesiny jednokomórkowej i identyfikowano za pomocą immunofluorescencji po kilku dniach w hodowli.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek rzęsatych ślimaka od nowonarodzonych myszy

Poznaj technikę eksplantatu ślimakowego u noworodków myszy jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu. Ta metoda umożliwia analizę komórek włoskowatych i neuronów.

Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Przeglądaj więcej filmów