Technika eksplantatu ślimakowego u noworodków jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach słuchu

Ogólnym celem niniejszej procedury jest przygotowanie, hodowla, traktowanie oraz immunobarwienie eksplantów ślimaka noworodków myszy, które mają służyć jako narzędzie przesiewowe in vitro w badaniach nad słuchem. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie badań nad słuchem, umożliwiając jednoczesne badanie komórek rzęsistych ślimaka, synaps, neurytów i neuronów w modelu ex vivo oraz dostarczając wglądu w mechanizmy działania cząsteczek nowych dla ślimaka, w tym czynników występujących w wydzielinach ludzkich. Główną zaletą tej techniki jest możliwość przyspieszenia procesu przesiewowego potencjalnych związków terapeutycznych przed ich przetestowaniem in vivo.

Zacznij od świeżo pobranej głowy noworodka przechowywanej w 70% etanolu w pokrywce szalki Petriego. Za pomocą ostrza skalpela wykonaj powierzchowne nacięcie skóry od przedniego do tylnego końca czaszki. Następnie przetnij oba kanały słuchowe zewnętrzne i odchyl skórę do przodu, aby odsłonić całą czaszkę.

Następnie należy otworzyć czaszkę wzdłuż szwu strzałkowego, delikatnie przesuwając ostrze skalpela w górę i w dół od strony przedniej do tylnej, aby uniknąć ucisku ślimaka. Usunąć i odrzucić pysk, wykonując cięcie pionowe bezpośrednio za oczodołami. Tylna część czaszki powinna nadal zawierać mózg i ślimaka.

Następnie za pomocą pincety przeprowadzono tępe rozczłonkowanie i usunięto przedmózgowie, móżdżek oraz pień mózgu. Obie połowy czaszki umieszczono w plastikowej szalce Petriego o średnicy 60 mm wypełnionej zimnym HBSS. Następnie za pomocą pincety całkowicie odsłonięto ślimaka, który znajduje się sąsiadująco z otaczającą go tętnicą strzemiączkową, i tępo oddzielono ten organ od kości skroniowej.

Przenieś ślimaka do 50 milimetrowej szalki Petriego z przezroczystą ścianką i szklanym dnem zawierającej HBSS i umieść szalkę pod mikroskopem. Umieść 60 milimetrową plastikową szalkę Petriego z drugą połową czaszki na lodzie. Następnie, używając 4 pincet, ostrożnie wypreparuj torebkę kostną ślimaka.

Następnie przy użyciu mikronożyczek lub dwóch pincet 55 należy ostrożnie oddzielić więzadło spiralne przylegające do narządu Cortiego od pozostałej części ślimaka oraz od ściany przyśrodkowej. Można to osiągnąć, chwytając więzadło spiralne w jego najbardziej podstawnej części i delikatnie je rozwijając, przesuwając się w kierunku wierzchołkowym. Po usunięciu więzadła spiralnego należy ustawić preparat tak, aby uzyskać podłużny przekrój strzałkowy ślimaka.

Następnie podziel ślimaka na dwa lub trzy fragmenty za pomocą mikronża, klasyfikując te sekcje jako zakręty wierzchołkowy i podstawowy. Usuń tkankę znajdującą się powyżej w przypadku fragmentu bardziej wierzchołkowego oraz poniżej w przypadku fragmentu bardziej podstawowego, aż do właściwej warstwy komórek rzęskowych i neurytów, aby eksplant ślimaka mógł spoczywać poziomo na szalce Petriego. Następnie, używając pęsety, delikatnie chwyć i odwarstw błonę tectorialną, która jest bardzo cienką, półprzezroczystą warstwą znajdującą się bezpośrednio nad organem Cortiego.

Najbardziej wymagającym technicznie etapem jest prawdopodobnie usunięcie cienkiej, półprzezroczystej błony tectorialnej, ponieważ łatwo można uszkodzić znajdujące się pod nią komórki rzęsate. Rozpoczynając od krawędzi tkanki, zachowuje się komórki rzęsate wzdłuż całego eksplantu, z wyjątkiem samego brzegu, od którego rozpoczęto oddzielanie błony tectorialnej. Na koniec usuwa się błonę Reissnera, znajdującą się bezpośrednio nad neuronami zwoju spiralnego, dotykając jej pęsetą z obu stron i odrywając ją.

Preparat ślimaka jest teraz gotowy do hodowli po usunięciu wszelkich uszkodzonych obszarów na krawędziach. Procedurę hodowli należy rozpocząć od zwilżenia końcówki pipety o pojemności 1 ml około 120 µL DMEM, aby zapobiec przywieraniu eksplantatu do wnętrza końcówki. Następnie, używając uprzednio zwilżonej końcówki, należy pobrać maksymalnie 70 µL z płytki Petriego z szklanym dnem i umieścić preparat wraz z cieczą w jednym z czterech wkładów w czterooddziałowej płytce Petriego.

Sprawdzić pod mikroskopem, czy eksplant jest ustawiony w odpowiedniej orientacji. Upewnić się, że obszar komórek rzęskowych, z którego usunięto błonę tectorialną, jest skierowany do góry, a błona podstawna wraz z przyciętą podstawową częścią ślimaka jest skierowana w dół i przylega do wkładki szkiełka nakrywkowego. Jeśli podczas inspekcji okaże się, że preparat jest odwrócony do góry nogami, jak pokazano tutaj, dodać HBSS za pomocą końcówki pipety i przemieścić fragment, aż zostanie on prawidłowo zorientowany.

Po prawidłowym zorientowaniu eksplantu należy odessać nadmiar HBSS, a następnie odczekać 15 sekund. Teraz należy nanieść pipetą 60 µL ciepłej pożywki hodowlanej bezpośrednio na preparat, uważając, aby nie dotknąć go końcówką pipety. Należy założyć pokrywy wewnętrznej i zewnętrznej szalki Petriego i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C.

Następnego dnia przenieś szalki Petriego zawierające eksplanty ślimaków z inkubatora do komory z laminarnym przepływem powietrza. Odessij ze wkładki starą pożywkę hodowlaną niezawierającą FBS. Do każdego dołka dodaj 60 µL przygotowanej, ciepłej pożywki traktującej.

Umieść szalkę Petriego z powrotem w inkubatorze aż do czasu barwienia kultur, po maksymalnie siedmiu dniach. Jak widać na tym obrazie konfokalnym, technika ta pozwala zachować anatomię całego zwoju ślimaka, w tym neurony zwoju spiralnego (SGNs), co umożliwia analizę wpływu leczenia na neurydy i somata SGNs, oprócz analizy narządu Cortiego. Jak tu widać, eksplanty te mogą być wykorzystane do jednoczesnego porównania efektu leczenia w obrębie części szczytowej i podstawowej ślimaka po barwieniu immunofluorescencyjnym.

Komórki rzęsiste są zaznaczone na zielono, a struktury neuronalne na czerwono. Nienaruszone synapsy można ocenić poprzez jednoczesne znakowanie białek presynaptycznych (na czerwono) i białek postsynaptycznych (na zielono) wraz z barwieniem struktur neuronalnych na niebiesko. Rysunek przedstawia reprezentatywne obrazy eksplantów szczytowych i podstawowych ślimaka po siedmiu dniach hodowli z dodatkiem 3% FBS (po lewej) lub 1% FBS (po prawej).

Komórki inkubowane w 3% FBS zaczynają migrować między czwartym a piątym dniem, co wskazują jasnoszare strzałki dla komórek słuchowych oraz czerwone strzałki dla neurytów. Eksplanty w 1% FBS zachowują integralność organizacyjną do siódmego dnia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby wizualnie upewnić się co do integralności strukturalnej i orientacji tkanki ślimaka przed dodaniem końcowej pożywki hodowlanej i badanych substancji.

Po przeprowadzeniu tej procedury można wykonać rekonstrukcję 3D, aby potwierdzić specyficzną dla typu komórek lokalizację komórek wykazujących ekspresję GFP w obrębie medialis.