Name: Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Poznaj metodę izolacji populacji bocznej w białaczce limfoblastycznej T u Danio rerio. Technika ta umożliwia wyodrębnienie komórek z aktywnością komórek macierzystych nowotworu.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez University of Chicago Women's Board, Wendy Will Case Fund oraz University of Chicago Comprehensive Cancer Center Support Grant (P30 CA014599). Chcielibyśmy podziękować Flow Cytometry Core na Uniwersytecie w Chicago za pomoc w przygotowaniu tego eksperymentu, a także innym członkom laboratorium de Jong, w szczególności Leslie Pedraza i Seanowi McConnellowi.

Wszystkie procedury z danio pręgowanym zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt (IACUC) na Uniwersytecie w Chicago. University of Chicago jest akredytowany przez Stowarzyszenie Oceny i Akredytacji Opieki nad Zwierzętami Laboratoryjnymi (AAALAC).
1. Generowanie i izolowanie fluorescencyjnie znakowanych komórek T-ALL u danio pręgowanego
<ol>
	<li>Mikroiniekcja do syngenicznych zarodków danio pręgowanego
	<ol>
		<li>Korzystając z dostępnych na rynku zestawów, wyizoluj koliste DNA plazmidu rag2:c-myc i rag2:zielone białko fluorescencyjne (rag2:GFP) zawierające odwrócone powtórzenia końcowe rozpoznawane przez transpozazę tol2 (patrz Tabela materiałów dla źródła plazmidowego DNA)12 i eluuj DNA w sterylnej wodzie. 
		UWAGA: GFP jest używany w tym badaniu, ale każde białko fluorescencyjne będzie działać.</li>
		<li>Przygotuj RNA transpozazy pCS2 (tol2)
		<ol>
			<li>Wyizoluj DNA plazmidu tol2 za pomocą dostępnych na rynku zestawów (patrz Tabela materiałów dla źródła plazmidowego DNA)12 i wymyj DNA w sterylnej wodzie.</li>
			<li>Inkubować 1 μg DNA tol2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę z 5 jednostkami enzymu restrykcyjnego NotI w odpowiednim buforze w celu linearyzacji plazmidu. Dezaktywować termicznie NotI w temperaturze 65 °C przez 20 minut.</li>
			<li>Transkrybuj tol2 RNA polimerazą SP6 RNA ze zlinearyzowanego DNA za pomocą dostępnego na rynku zestawu do transkrypcji RNA13. Przechowywać RNA w jednorazowych podwielokrotnościach w temperaturze -80 °C.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Przygotować mieszankę do wstrzykiwań na lodzie, dodając 250 ng plazmidowego DNA rag2:c-myc, 250 ng plazmidowego DNA rag2:GFP, 150 ng tol2 RNA i 0,5 μl czerwieni fenolowej. Dostosuj objętość do 10 μl wodą bez nukleaz.</li>
		<li>Wstrzyknij ~1 nL mieszanki iniekcyjnej do komórki jednokomórkowego syngenicznego zarodka danio pręgowanego za pomocą mikroiniektora i igły wyciągniętej ze szklanej rurki kapilarnej, zgodnie z wcześniej ustalonymi metodami8,14. 
		UWAGA: Syngeniczne danio pręgowane wygenerowane przez partenogenezę15 są tutaj używane w celu wyeliminowania genetycznej heterogeniczności i odrzucenia immunologicznego po przeszczepie. Można jednak również użyć danio pręgowanego typu dzikiego lub dowolnej pożądanej odmiany.</li>
		<li>Usuń martwe, słabo rozwinięte lub zniekształcone zarodki po 24 i 48 godzinach od wstrzyknięcia16.</li>
		<li>Umieść wstrzyknięte ryby w systemie dla ryb po 6 dniach od wstrzyknięcia i hoduj je zgodnie ze standardowym protokołem6.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Badania przesiewowe danio pręgowanego i monitorowanie wzrostu guza
	<ol>
		<li>Po 21 dniach od wstrzyknięcia umieścić pojedynczą wstrzykniętą larwę w kropli pożywki zarodkowej na szalce Petriego i przeprowadzić badanie przesiewowe pod kątem fluorescencji GFP za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego (pasmo wzbudzenia: 470/40, pasmo przepustowe emisji: 525/50)8. 
		UWAGA: Larwy danio pręgowanego, które mają zintegrowane zarówno rag2:c-myc, jak i rag2:GFP, będą miały zieloną fluorescencyjną grasicę (ryba dodatnia) i mogą już wykazywać ekspansję złośliwych zielonych komórek fluorescencyjnych poza grasicę. Wszystkie ryby z grasicą GFP+ rozwiną T-ALL GFP+. Larwy, które nie wykazują integracji plazmidów, nie będą miały żadnych zielonych komórek fluorescencyjnych (ryby ujemne).</li>
		<li>Oddzielić ujemne ryby (na podstawie braku fluorescencji) do innego zbiornika i ponownie monitorować ryby po 28 i 35 dniach od wstrzyknięcia. Po 28 i 35 dniach od wstrzyknięcia należy znieczulić ryby 0,02% buforowaną trikainą (MS-222) w wodzie systemu rybnego przed badaniem przesiewowym.</li>
		<li>Umieść każdą larwę danio pręgowanego, która jest dodatnia dla grasicy znakowanej fluorescencyjnie lub guza znakowanego fluorescencyjnie, w indywidualnym zbiorniku w celu monitorowania wzrostu guza trzy razy w tygodniu.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zbiór znakowanych fluorescencyjnie komórek T-ALL od pierwotnej ryby nowotworowej
	<ol>
		<li>Przygotuj co najmniej 20 ml 10% inaktywowanej termicznie płodowej surowicy bydlęcej w 0,9x buforowanej fosforanem soli fizjologicznej (FBS/PBS).</li>
		<li>Dodać 1 ml FBS/PBS do jednej fiolki soli sodowej heparyny (300 jednostek).</li>
		<li>Wybierz ryby z guzami w ponad 50% ciała lub te ryby, które mają trudności z jedzeniem lub pływaniem. Poświęć rybę, przedawkowując ją tricainą lub zanurzając w lodowatej wodzie. Śmierć należy potwierdzić brakiem ruchu skrzeli i bicia serca.</li>
		<li>Użyj żyletki, aby usunąć głowę ryby.</li>
		<li>Przemyć jamę ryby roztworem heparyny w celu usunięcia nadmiaru czerwonych krwinek.
		<ol>
			<li>Za pomocą pipety wstrzyknąć 100 μl roztworu heparyny (przygotowanego w kroku 1.3.2) do jamy ciała ryby. Usuń cały płyn, który się wyleje (będzie zawierał krwinki) i odpipetuj go do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Użyj świeżej końcówki pipety, aby ponownie umyć ciało. Wykonaj co najmniej trzy prania lub do momentu, gdy wylewający się płyn będzie wyglądał na wolny od krwi.</li>
			<li>Usunąć cały płyn z płukania w krokach 1.3.5.1 i 1.3.5.2, ponieważ nie będzie on używany w dalszych analizach.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Zbierz komórki białaczkowe.
		<ol>
			<li>Wstrzyknąć 100 μl FBS/PBS do jamy ciała ryby.</li>
			<li>Delikatnie uciskaj zewnętrzną część ciała ryby końcówką pipety, aby wycisnąć/wypchnąć komórki nowotworowe. 
			UWAGA: Jeśli ten krok zostanie wykonany przy użyciu mikroskopu preparacyjnego, komórki nowotworowe wylewające się z jamy ciała będą widoczne.</li>
			<li>Zbierz płyn i komórki z każdego płukania do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
			<li>Powtarzaj kroki 1.3.6.1-1.3.6.3, aż większość komórek nowotworowych zostanie zebrana (zwykle 5-10 razy). Zbierz wszystkie komórki nowotworowe do tej samej probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Wymieszaj zebrane komórki nowotworowe z kroku 1.3.6, delikatnie pipetując je, aby rozdzielić grudki komórek. Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy o wielkości 40 μm. Umyj filtr 1-2 razy 100 μl FBS/PBS. Utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Wymieszaj 2 μl zawiesiny komórek z 18 μl błękitu trypanowego (0,4%, rozcieńczonego w stosunku 1:10 i przefiltrowanego) w nowej probówce. Załaduj 10 μl na hemocytometr i policz liczbę żywych (nieniebieskich) komórek fluorescencyjnych, aby obliczyć liczbę izolowanych komórek nowotworowych. 
		UWAGA: Nieniebieskie komórki GFP-ujemne są prawdopodobnie normalnymi, niezłośliwymi limfocytami T i nie powinny być liczone. Do barwienia komórek za pomocą Hoechst 33342 wymagane są co najmniej 2 x 106 komórek.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Barwienie fluorescencyjnie znakowanych komórek T-ALL za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji populacji bocznej
<ol>
	<li>Rozcieńczyć Hoechst 33342 1:10 wolnym od nukleazH2O, aby uzyskać stężenie robocze 1 mg/ml. Barwnik należy przechowywać w temperaturze 4 °C i w ciemności.</li>
	<li>Przygotować 100 mM roztwór werapamilu, rozpuszczając 49,1 mg w 1 ml dimetylosulfotlenku (DMSO). 
	UWAGA: Werapamil jest inhibitorem transporterów ABC i jest ważną kontrolą w eksperymentach populacyjnych ubocznych. Dodanie werapamilu do próbek zahamuje zdolność transporterów ABC do wypływu barwnika Hoechst 33342. W związku z tym prawdziwa populacja poboczna zniknie po dodaniu werapamilu do próbki.</li>
	<li>Ustawić łaźnię wodną na 28 °C.</li>
	<li>Przygotuj próbki i kontrole w ciemności, dodając komórki i roztwory do probówek do sortowania komórek aktywowanych fluorescencją (FACS).
	<ol>
		<li>Przygotuj próbki, dodając 106 komórek, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 i 2,5 μl DMSO do probówki FACS. Dostosuj objętość do 1 ml za pomocą FBS/PBS.</li>
		<li>Przygotować kontrole, dodając 106 komórek, 15 μl 1 mg/ml Hoechst 33342 i 2,5 μl 100 mM werapamilu do probówki FACS. Dostosuj objętość do 1 ml za pomocą FBS/PBS. 
		UWAGA: Zalecane jest minimum 106 komórek/próbkę, ale preferowane jest barwienie większej liczby komórek, zwłaszcza jeśli komórki populacji bocznej zostaną posortowane do dalszej analizy. Nie przekraczać 106 komórek/ml i utrzymywać stężenie Hoechst 33342 na poziomie 15 μg/ml. Jeśli 10 x 106 komórek jest wybarwionych, całkowita objętość reakcji wynosi 10 ml.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 28 °C w ciemności przez 120 min.</li>
	<li>Po inkubacji umieść komórki natychmiast na lodzie i trzymaj je w ciemności.</li>
	<li>Granulować komórki w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant. Umyć 1 ml FBS/PBS.</li>
	<li>Granulować komórki w temperaturze 4 °C przez 6 minut przy 300 x g. Usunąć supernatant. Ponownie zawiesić komórki w 1 ml FBS/PBS.</li>
	<li>Przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu sortowania komórek.</li>
	<li>15 minut przed sortowaniem komórek dodać 2 μl jodku propidyny (PI) (1 mg/ml) do każdego 1 ml FBS/PBS (końcowe stężenie: 2 μg/ml). Dobrze wymieszaj.</li>
</ol>
3. Użyj FACS, aby znaleźć populację boczną w fluorescencyjnie znakowanej populacji komórek T-ALL
<ol>
	<li>Analizuj barwione zawiesiny komórek T-ALL danio pręgowanego na sortowniku komórek wyposażonym w laser UV do wzbudzania barwnikiem Hoechst 33342 i laser 488 nm do wzbudzania PI i wykrywania komórek T-ALL GFP+.</li>
	<li>Określ bramkę dla żywych komórek T-ALL GFP+.
	<ol>
		<li>Użyj obszaru rozpraszania do przodu (FSC) i bocznego rozpraszania (SSC), aby usunąć gruz. 
		UWAGA: FSC służy do rozróżniania wielkości komórki, a SSC służy do rozróżniania ziarnistości komórki.</li>
		<li>Użyj szerokości FSC i SSC, aby rozróżnić dublety. 
		UWAGA: Detektory cytometru przepływowego identyfikują trzy elementy: powierzchnię, wysokość i szerokość. Obszar jest zwykle używany do pomiaru fluorescencji komórki. Szerokość mierzy czas lotu i jest dwa razy szersza, jeśli dwie komórki są zbite razem.</li>
		<li>W przypadku żywych komórek nowotworowych narysuj bramkę wokół komórek dodatnich dla GFP i ujemnych dla PI za pomocą odpowiednich detektorów (np. FITC dla GFP i PerCP Cy5-5 dla PI).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>W bramce komórki pod napięciem zmierz fluorescencję Hoechst 33342 przez filtry pasmowoprzepustowe Hoechst Blue i Hoechst Red (odpowiednio 450/50 i 670/30). 
	UWAGA: Populacja boczna, jeśli jest obecna, będzie widoczna po jej ustawieniu. Co ważne, populacja boczna musi zniknąć w kontroli werapamilu, aby można ją było uznać za prawdziwą populację poboczną.</li>
	<li>W przypadku sortowania komórek populacji bocznej do dalszych eksperymentów należy użyć dużej końcówki dyszy (100 μm) i zebrać komórki do probówki FACS zawierającej 3 ml 100% FBS. Użyj większej końcówki dyszy (100 μm) zamiast mniejszej końcówki (70 μm), aby poprawić żywotność komórek po sortowaniu.</li>
</ol>

<ol><li>Goodell, M., Brose, K., Paradis, G., Conner, A., Mulligan, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+properties+of+murine+hematopoietic+stem+cells+that+are+replicating+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional properties of murine hematopoietic stem cells that are replicating in vivo.</a> J. Exp. Med. 183, 1797-1806 (1996).</li>
<li>Golebiewska, A., Brons, N. H. C., Bjerkvig, R., Niclou, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Critical+appraisal+of+the+side+population+assay+in+stem+cell+and+cancer+stem+cell+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Critical appraisal of the side population assay in stem cell and cancer stem cell research.</a> Cell Stem Cell. 8, 136-147 (2011).</li>
<li>Dooley, K., Zon, L. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish%3A+a+model+system+for+the+study+of+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Zebrafish: a model system for the study of human disease.</a> Curr Opin Genet Dev. 10 (3), 252-256 (2000).</li>
<li>White, R., Rose, K., Zon, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+cancer%3A+the+state+of+the+art+and+the+path+forward%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward.</a> Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).</li>
<li>Kobayashi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+localization+of+side+population+%28SP%29+cells+in+zebrafish+kidney+hematopoietic+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Characterization and localization of side population (SP) cells in zebrafish kidney hematopoietic tissue.</a> Blood. 111 (3), 1131-1137 (2008).</li>
<li>Tsinkalovsky, O., Vik-Mo, A. O., Ferreira, S., Laerum, O. D., Fjose, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+kidney+marrow+contains+ABCG2-dependent+side+population+cells+exhibiting+hematopoietic+stem+cell+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Differentiation%22%5BJournal%5D)">Zebrafish kidney marrow contains ABCG2-dependent side population cells exhibiting hematopoietic stem cell properties.</a> Differentiation. 75 (3), 175-183 (2007).</li>
<li>Langenau, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myc-induced+T+cell+leukemia+in+transgenic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myc-induced T cell leukemia in transgenic zebrafish.</a> Science. 299, 887-890 (2003).</li>
<li>Blackburn, J. S., Liu, S., Langenau, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+the+frequency+of+tumor-propagating+cells+using+limiting+dilution+cell+transplantation+in+syngeneic+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantifying the frequency of tumor-propagating cells using limiting dilution cell transplantation in syngeneic zebrafish.</a> J Vis Exp. , e2790(2011).</li>
<li>Martelli, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+signaling+pathways+in+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia+initiating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biol+Regul%22%5BJournal%5D)">Targeting signaling pathways in T-cell acute lymphoblastic leukemia initiating cells.</a> Adv Biol Regul. 56, 6-21 (2014).</li>
<li>Smith, A. C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+cell+transplantation+establishes+that+tumor-initiating+cells+are+abundant+in+zebrafish+T-cell+acute+lymphoblastic+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">High-throughput cell transplantation establishes that tumor-initiating cells are abundant in zebrafish T-cell acute lymphoblastic leukemia.</a> Blood. 115 (16), 3296-3303 (2010).</li>
<li>Blackburn, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+evolution+enhances+leukemia-propagating+cell+frequency+in+T+cell+acute+lymphoblastic+leukemia+through+Akt%2FmTORC1+pathway+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Clonal evolution enhances leukemia-propagating cell frequency in T cell acute lymphoblastic leukemia through Akt/mTORC1 pathway activation.</a> Cancer Cell. 25, 366-378 (2014).</li>
<li><a target="_blank" href="https://www.jove.com/science-education/5062/plasmid-purification">Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Plasmid Purification.</a> JoVE Science Education Database. , JoVE. Cambridge, MA. (2016).</li>
<li>Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tol2%3A+a+versatile+gene+transfer+vector+in+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Tol2: a versatile gene transfer vector in vertebrates.</a> Genome Biol. 8, (2007).</li>
<li>Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinjection+of+zebrafish+embryos+to+analyze+gene+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function.</a> J Vis Exp. (25), (2009).</li>
<li>Mizgireuv, I. V., Revskoy, S. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transplantable+tumor+lines+generated+in+clonal+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Transplantable tumor lines generated in clonal zebrafish.</a> Cancer Research. 66 (6), 3120-3125 (2006).</li>
<li>Westerfield, M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWesterfield%2C+M+%22The+Zebrafish+Book%3A+A+Guide+for+the+Laboratory+Use+of+Zebrafish%22">The Zebrafish Book: A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish</a>. , University of Oregan Press. (1993).</li>
<li>Hirschmann-Jax, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+distinct+%22side+population%22+of+cells+with+high+drug+efflux+capacity+in+human+tumor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">A distinct "side population" of cells with high drug efflux capacity in human tumor cells.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 101 (39), 14228-14233 (2004).</li>
<li>Komuro, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+side+population+cells+%28stem-like+cell+population%29+in+pediatric+solid+tumor+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Surg%22%5BJournal%5D)">Identification of side population cells (stem-like cell population) in pediatric solid tumor cell lines.</a> J Pediatr Surg. 42 (12), 2040-2045 (2007).</li>
<li>Moshaver, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+small+subpopulation+of+candidate+leukemia-initiating+cells+in+the+side+population+of+patients+with+acute+myeloid+leukemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Identification of a small subpopulation of candidate leukemia-initiating cells in the side population of patients with acute myeloid leukemia.</a> Stem Cells. 26 (12), 3059-3067 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Test populacji pobocznej jest bardzo czuły; W związku z tym niewielkie zmiany w protokole mogą powodować trudności w wykrywaniu komórek populacji bocznej. Po pierwsze, temperatura na etapie barwienia jest specyficzna dla każdego układu zwierzęcego/komórkowego. W przypadku systemów ssaków test populacji bocznej jest zwykle wykonywany w temperaturze 37 °C2. Gdy komórki T-ALL danio pręgowanego inkubowano w temperaturze 37 °C, wiele komórek obumarło, co sprawiło, że temperatura inkubacji była niedopus...

Test populacji pobocznej wykorzystuje zwiększoną zdolność niektórych komórek w tkance do wypływu barwnika wiążącego DNA Hoechst 33342 z powodu wysokiego poziomu białek transportujących kasetę wiążącą ATP (ABC) na błonie komórkowej. Komórki, które wydzielają barwnik Hoechst 33342, można zidentyfikować za pomocą analizy cytometrycznej przepływu o podwójnej długości fali po wzbudzeniu barwnika przez laser UV. Test ten został po raz pierwszy użyty do identyfikacji mysich hematopoetycznych komórek macierzystych (HSC)1, ale od tego czasu został użyty do identyfikacji populacji komórek macierzystych/progenitorowych w wielu tkankach i nowotworach (przegląd w odnośniku 2). Jednak nie wszystkie populacje komórek mają populację poboczną i nie wszystkie populacje boczne są wzbogacone o komórki macierzyste/progenitorowe.
Danio pręgowany to potężny system modeli genetycznych kręgowców do badania ludzkiego raka3,4, z wieloma zaletami w porównaniu z tradycyjnymi mysimi modelami raka. Zarodki danio pręgowanego są zapłodnione zewnętrznie i są optycznie czyste, co ułatwia transgenezę i obserwację in vivo procesów patologicznych, w tym inicjacji i progresji nowotworu. Do tej pory test populacji bocznej w celu wykrycia potencjalnych komórek macierzystych lub progenitorowych był stosowany tylko do szpiku nerkowego danio pręgowanego w celu identyfikacji HSC, a nie do jakichkolwiek modeli raka danio pręgowanego5,6.
Model ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) z komórek T jest morfologicznie i genetycznie podobny do ludzkiego T-ALL7,8,11. T-ALL jest agresywnym nowotworem złośliwym, który u ludzi stanowi 10-15% przypadków u dzieci i 25% u dorosłych9. Chociaż leczenie T-ALL uległo poprawie, nawrót choroby jest nadal powszechny i wiąże się ze złym rokowaniem. Guzy T-ALL są niejednorodne i zawierają wiele różnych subpopulacji komórek nowotworowych, w tym komórki inicjujące białaczkę (LIC). LIC są definiowane przez ich zdolność do odrastania całego guza z pojedynczej komórki, a częstość LIC w populacji komórek nowotworowych można obliczyć, przeszczepiając różne dawki komórek biorcom za pomocą testu transplantacji z ograniczeniem rozcieńczenia (LDA). Chociaż eksperymenty LDA zostały przeprowadzone na danio pręgowanym w celu obliczenia częstości występowania LICs8,10,11, to określenie jest dokonywane z perspektywy czasu i nie pozwala na prospektywną izolację LICs. W związku z tym brakuje metody prospektywnego izolowania populacji wzbogaconej o aktywność nowotworowych komórek macierzystych. Identyfikacja i wyizolowanie komórek populacji bocznej z T-ALL danio pręgowanego jest pierwszym krokiem w kierunku rozwiązania tego problemu.
Protokół przedstawiony tutaj opisuje, jak efektywnie generować guzy T-ALL u danio pręgowanego za pomocą transgenezy za pośrednictwem tol2, zbierać komórki nowotworowe T-ALL i barwić je za pomocą Hoechst 33342 w celu identyfikacji bocznej populacji komórek. Przyszłe eksperymenty in vivo z T-ALL danio pręgowanego mogą dotyczyć tego, czy komórki populacji bocznej są wzbogacone o LIC, czy też mają inne właściwości podobne do macierzystych lub progenitorowych.

<table><tbody><tr><td>Syngeniczny danio pręgowany (CG2)</td><td></td><td></td><td>Patrz Mizgireuv et al., 2006</td></tr><tr><td>rag2:plazmid</td><td></td><td></td> c-myc <td>Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>rag2:Plazmid GFP skonstruowany w de Jong Lab</td><td></td><td></td><td>rag2 promotorze z Langenau Laboratory</td></tr><tr><td>plazmid</td><td></td><td></td> transpozazy pCS2-transpozazy <td>Chien Laboratorium</td></tr><tr><td>NotI-enzym restrykcyjny HF</td><td>New England Bio-Labs Inc.</td><td>Jednostki R3189S</td><td>500 w rozmiarach 25 i mikro; L</td></tr><tr><td>mMessage Machine SP6 Zestaw do transkrypcji</td><td>Ambion</td><td>Thermo Fisher Scientific - AM1340</td><td>25 reakcji</td></tr><tr><td>QIAGEN Plasmid Midi Kit</td><td>Qiagen, Inc.</td><td>12643</td><td></td></tr><tr><td>Mikroskop SteREO Discovery V8</td><td>Mikroskopia Carl Zeiss</td><td>495015-0008-000</td><td></td></tr><tr><td>Mikrowtryskiwacz cyfrowy</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-D</td><td></td></tr><tr><td>Mosiężny uchwyt igły z prostym ramieniem</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-4</td><td></td></tr><tr><td>Podstawa magnetyczna i podstawa</td><td>Tritech Research</td><td>MINJ-HBMB</td><td></td></tr><tr><td>Mikromanipulator</td><td>Narishige Międzynarodowe</td><td>kapilary szklane MN153</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B100-50-10 10</td><td>cm bez filamentu</td></tr><tr><td>Ściągacz do mikropipet Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td>Końcówki do pipet <td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>do mikroładowarek</td><td>Eppendorf North America Inc.</td><td></td><td></td>930001007</tr><tr><td>Roztwór czerwieni fenolowej</td><td>Sigma Life Science</td><td>P0290</td><td>Stężenie 0,5% 100 ml</td></tr><tr><td>Plastikowe pipety transferowe</td><td>Fisherbrand</td><td>137119D</td><td>z podziałką 7,5 ml bańka</td></tr><tr><td>Metanosulfonian trikainy (MS-222)</td> <td>Western Chemical, Inc.</td><td>Fisher Scientific - NC0342409</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>HyClone Laboratories, Inc.</td><td>Fisher Scientific - SH3007103</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS)</td><td>Gibco firmy Life Technologies</td><td>1001-023</td><td>pH 7,4 (1x) - 500 mL</td></tr><tr><td>Sól sodowa heparyny</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>2106</td><td>15 - 300 fiolek jednostkowych</td></tr><tr><td>40 i mikro; m filtr siatkowy</td><td>Falcon Corning Marka</td><td>352340</td><td>Opakowanie 50</td></tr><tr><td>sztuk Trypan niebieski</td><td>Sigma Life Science</td><td>T8154</td><td>20 ml - roztwór (0,4%)</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Life Technologies</td><td>H3570</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Verapamil</td><td>Sigma Life Science</td><td>V4629</td><td>1 g</td></tr><tr><td>dimetylosulfotlenku (DMSO)</td><td>Sigma Life Science</td><td>D8418</td><td>100 mL</td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Life Technologies</td><td>P3566</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>FACSAria Fusion sorter komórek</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD FACSDiva 8.0.1</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FlowJo v10.2</td><td>FlowJo, LLC</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki t indukowanej przez myc u danio pręgowanego

Isolation of the Side Population in Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in Zebrafish

Heterogeniczne populacje komórek, zarówno ze zdrowych, jak i złośliwych tkanek, mogą zawierać populację komórek charakteryzującą się różnicową zdolnością do wydzielania barwnika wiążącego DNA Hoechst 33342. Tę "boczną populację" komórek można zidentyfikować za pomocą metod cytometrii przepływowej po wzbudzeniu barwnika Hoechst 33342 przez laser ultrafioletowy (UV). Populacja boczna wielu typów komórek zawiera komórki macierzyste lub progenitorowe. Jednak nie wszystkie typy komórek mają możliwą do zidentyfikowania populację poboczną. Danio rerio, danio pręgowany, mają solidny model in vivo ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T (T-ALL), ale nie wiadomo, czy te T-ALL danio pręgowanego mają populację poboczną. Opisana tutaj metoda opisuje, w jaki sposób wyizolować boczne komórki populacyjne w danio pręgowanym T-ALL. Zacznijmy od tego, że T-ALL u danio pręgowanego jest generowany poprzez mikrowstrzyknięcie plazmidów tol2 do zarodków w stadium jednokomórkowym. Gdy guzy osiągną etap, w którym rozszerzają się na więcej niż połowę ciała zwierzęcia, można pobrać komórki T-ALL. Komórki są następnie barwione za pomocą Hoechst 33342 i badane za pomocą cytometrii przepływowej pod kątem komórek populacji bocznej. Metoda ta ma szerokie zastosowanie w badaniach nad T-ALL danio pręgowanego. Chociaż nie ma znanych markerów powierzchni komórek u danio pręgowanego, które potwierdzałyby, czy te komórki populacji bocznej są podobne do rakowych komórek macierzystych, możliwe są testy przeszczepu funkcjonalnego in vivo. Co więcej, transkryptomika pojedynczych komórek może być zastosowana do identyfikacji cech genetycznych tych komórek populacji bocznej.

Aby efektywnie generować fluorescencyjne guzy T-ALL indukowane myc u rybek danio prążkowanych, koliste konstrukty DNA flankowane miejscami transposazy tol2 można wstrzykiwać wspólnie z RNA tol2. Wcześniejsze badania nad wstrzykiwaniem liniowego DNA do embrionów rybek danio prążkowanych wykazały 5% wskaźnik transgenezy8. Dzięki modyfikacji protokołu o uwzględnienie transgenezy zależnej od tol2, można zaobserwować wskaźniki transgenezy w zakresie od 10-44% (T...

Tutaj opisujemy technikę izolowania komórek populacji bocznej z modelu danio pręgowanego z indukowaną przez myc ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej (T-ALL). Ten boczny test populacyjny jest bardzo czuły i jest opisany dla T-ALL danio pręgowanego, ale może mieć zastosowanie do innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek danio pręgowanego.

Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

Heterogeneous cell populations, from either healthy or malignant tissues, may contain a population of cells characterized by a differential ability to ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek populacji bocznej (side population) z modelu raka białaczkowego t-komórkowego o ostrym przebiegu indukowanego przez myc u ryb zebrafish. Test populacji bocznej był wykorzystywany do identyfikacji populacji komórek macierzystych i progenitorowych w wielu prawidłowych tkankach oraz tkankach nowotworowych, jednak nie został on dotąd zastosowany w żadnym modelu nowotworu u ryb zebrafish.Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona prospektywną izolację populacji komórek w modelu T-ALL u rybek zebrafish, która może być wzbogacona o aktywność komórek macierzystych nowotworu. Choć opisana tutaj metoda znajduje szerokie zastosowanie w badaniach nad białaczką u rybek zebrafish, może ona być również stosowana w przypadku innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek tych ryb. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ jest ona wrażliwa na subtelne zmiany.Mimo że metoda wydaje się prosta, wymagana jest optymalizacja dla każdego badanego typu komórek. Przygotować 20 milliliters 10 procent dezaktywowanego termicznie FBS w 0.9x PBS. Dodać jeden milliliter roztworu FBS/PBS do fiolki z solą sodową heparyny zawierającej 300 units przeciwzakrzepowego.Następnie, korzystając z mikroskopu epifluorescencyjnego, należy wybrać ryby, w których komórki nowotworowe zajęły 50% ciała, lub ryby wykazujące trudności w żywieniu lub pływaniu. Ryby należy poddać eutanazji, przenosząc je do roztworu tricainy w wodzie dla ryb o stężeniu od 1 do 2 mg/ml. Należy obserwować ruchy skrzeli oraz pracę serca zwierzęcia, aby potwierdzić śmierć.Po odcięciu głowy ryby, wstrzyknij pipetą 100 µL roztworu heparyny do jamy ciała, aby usunąć nadmiar erytrocytów. Odessaj cały wypływający płyn i przelej go do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Następnie, używając nowych końcówek do pipety, przemyj jamę ciała jeszcze dwa razy lub do momentu, aż roztwór płuczący nie będzie zawierał krwi; płyn ze wszystkich etapów płukania należy usunąć.Aby zebrać komórki białaczki, wstrzyknij 100 µL roztworu FBS/PBS do uprzednio wypłukanej jamy ciała. Pod mikroskopem stereoskopowym wywieraj delikatny nacisk na ciało ryby końcówką pipety, aby wypchnąć komórki nowotworowe. Zbierz uwolnioną ciecz do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.Powtarzać izolację do czasu odzyskania większości komórek nowotworowych. Wszystkie komórki zebrać do tej samej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i przechowywać otrzymaną zawiesinę w temperaturze pokojowej. Następnie wymieszać izolowane komórki nowotworowe poprzez delikatne pipetowanie w celu rozbicia skupisk komórkowych.Przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr siatkowy o oczkach 40 µm. Następnie przemyj filtr jeden lub dwa razy 100 µL FBS/PBS. Po przefiltrowaniu przechowuj komórki w temperaturze pokojowej.Na koniec, w nowej probówce, wymieszaj 2 µL zawiesiny komórkowej z 18 µL 0,04% sterylnego roztworu błękitu trypanowego. Nanieś 10 µL otrzymanej zawiesiny na komorę licznikową (hemocytometr) i policz żywe fluorescencyjne komórki nowotworowe. Ważne jest pobranie czystej próbki komórek T-ALL.Stężenie użytego tutaj barwnika Hoechst 33342 opiera się na liczbie zebranych żywych komórek nowotworowych. Dodatkowe szczątki komórkowe lub komórki nienowotworowe mogą zakłócać analizę. Przed barwieniem komórek rozcieńczyć barwnik Hoechst w wodzie wolnej od nukleaz, aby otrzymać roztwór roboczy o stężeniu 1 mg/ml.Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C, osłonięty folią aluminiową. Następnie rozpuścić 49,1 mg verapamilu w 1 ml DMSO, aby otrzymać 100 µM roztwór inhibitora. Kolejnym krokiem jest przygotowanie próbki poprzez dodanie FBS/PBS, 2,5 µl DMSO, 15 µl barwnika Hoechst w stężeniu 1 mg/ml oraz 10⁶ komórek nowotworowych do probówki typu fax, tak aby końcowa objętość wynosiła 1 ml.Aby przygotować kontrolę, należy dodać FBS/PBS, 2,5 µL verapamilu o stężeniu 100 mM oraz 15 µL barwnika Hoechst w stężeniu 1 mg/mL, a następnie dodać 10 do sześciu komórek nowotworowych do końcowej objętości 1 mL. Próbkę oraz kontrolę inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 28 °C w ciemności przez 120 minut. Po inkubacji komórki należy natychmiast umieścić na lodzie i przechowywać w ciemności.Wirować komórki przy 300 ×g w temperaturze 4 °C przez sześć minut. Następnie usunąć supernatant i przemyć komórki 1 mL FBS/PBS. Ponownie wirować komórki przy 300 ×g w temperaturze 4 °C przez sześć minut.Po odwirowaniu komórek należy usunąć nadsącz i resuspender komórki w 1 mL FBS/PBS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu sortowania komórek. Na 15 minut przed sortowaniem należy dodać 2 µL roztworu zapasowego jodku propidyny o stężeniu 1 mg/mL na każdy 1 mL zawiesiny komórkowej.Następnie dokładnie wymieszaj próbki w wstrząsarce vorteksowej. Przeanalizuj zabarwione zawiesiny komórek T-ALL rybek zebrafish za pomocą sortera komórkowego aktywowanego fluorescencją. Pobudź próbki laserem UV w celu analizy barwnika Hoechst oraz laserem o długości fali 488 nanometrów w celu detekcji komórek T-ALL wykazujących pozytywność na jodek propidyny lub GFP.Liczba komórek, stężenie barwnika, temperatura inkubacji oraz czas inkubacji mogą wymagać optymalizacji dla każdego rodzaju użytych komórek. Zmiany w którymkolwiek z tych parametrów mogą drastycznie wpłynąć na wyniki analizy. Aby zidentyfikować populację boczną (side population) wśród komórek T-ALL wyizolowanych z rybek zebrafish, w pierwszej kolejności należy wykluczyć debris komórkowy oraz agregaty komórkowe.Następnie analizuje się pobór jodku propidyum oraz ekspresję GFP w jednej populacji komórek, aby zidentyfikować żywe komórki nowotworowe. Aby zwizualizować populację boczną (side population), porównuje się emisje niebieską i czerwoną barwnika Hoechst. Populacja boczna pojawia się jako słabo fluorescencyjny „ogon” komórek rozciągający się od lewej strony głównej populacji komórek w kierunku osi fluorescencji niebieskiej.Przedstawiono tutaj wyniki analizy populacji bocznej (side population) przeprowadzonej dla dwóch różnych próbek komórek nowotworowych. Populację boczną zidentyfikowano w obu preparatach. Jednakże, różne próbki nowotworowe zawierały zróżnicowaną liczbę komórek populacji bocznej.Niezależnie od analizowanej próbki nowotworu, potraktowanie próbki inhibitorem efleksu w postaci werapamilu doprowadziło do zaniku sygnału obserwowanego w wcześniej zidentyfikowanych komórkach, co dodatkowo potwierdziło fenotyp populacji side population. Po opanowaniu techniki, analiza populacji side population w przypadku T-ALL u rybki danio może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż cztery godziny, pod warunkiem prawidłowego wykonania zgodnie z naszą prezentacją. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie o krokach zoptymalizowanych dla T-ALL u rybki danio, takich jak temperatura i czas inkubacji, stężenie barwnika oraz zastosowany inhibitor efleksu.Parametry te mogą wymagać dostosowania do różnych systemów eksperymentalnych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja RNA lub testy transplantacji in vivo, z wykorzystaniem posortowanych komórek populacji bocznej, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące funkcjonalności i regulacji genów w komórkach populacji bocznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować populację boczną komórek z ostrej białaczkowej leukemii limfoblastycznej komórek T u rybek zebrafish.

isolation-side-population-myc-induced-t-cell-acute-lymphoblastic

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Testy transplantacji komórek z rozcieńczeniem ograniczającym są stosowane do określania częstości występowania komórek propagujących nowotwór. Niniejszy protokół opisuje metodę generowania syngeneicznych rybek zebrafish, u których rozwija się białaczka z oznakowaniem fluorescencyjnym, oraz szczegółowo wyjaśnia, jak izolować i transplantować te komórki białaczkowe z rozcieńczeniem ograniczającym do jamy otrzewnej dorosłych rybek zebrafish.

Kwantyfikacja częstotliwości komórek propagujących guz za pomocą transplantacji komórek w rozcieńczeniu ograniczającym u syngeneicznych rybek zebrafish

Ten protokół opisuje technikę izolowania fluorescencyjnie znakowanych komórek nowotworowych ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) komórek nowotworowych z dorosłego danio pręgowanego i ilościowego oznaczania ich za pomocą niebieskiego barwnika trypanowego.

Fluorescencyjnie znakowana izolacja komórek T-ALL: metoda izolacji komórek T-ALL od dorosłych danio pręgowanego

Poniższy protokół opisuje metodę izolowania populacji bocznej komórek nowotworowych ostrej białaczki limfoblastycznej (T-ALL) komórek T, składającej się z komórek macierzystych, od dorosłego danio pręgowanego. W populacji bocznej brakuje wyraźnych markerów komórkowych, dlatego do ich izolacji używamy testu wypływu barwnika Hoechst 33342.

Test populacji bocznej: metoda izolowania bocznej populacji komórek nowotworowych od danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół przeszczepu komórek mięśni szkieletowych danio pręgowanego i embrionalnego mięsaka prążkowanokomórkowego (ERMS) do dorosłego homozygotycznego mutanta rag2E450fs z obniżoną odpornością. Protokół ten pozwala na sprawną analizę regeneracji i przemian złośliwych komórek mięśniowych.

Normalny i złośliwy przeszczep komórek mięśniowych dorosłym danio pręgowanym z obniżoną odpornością

Ten protokół opisuje metodę izolowania pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego, wzbogacania o interesujące komórki, przechwytywania komórek danio pręgowanego w mikroprzepływowych systemach multipleksów jednokomórkowych i oceny ekspresji genów z pojedynczych komórek.

Izolacja i charakterystyka pojedynczych komórek z zarodków danio pręgowanego

Transgeniczne lck:eGFP danio pręgowane silnie wyrażają GFP w limfocytach T i były używane do badania rozwoju limfocytów T i ostrej białaczki limfoblastycznej. Linia ta może być wykorzystana do badania limfocytów B, które wyrażają lck na niższych poziomach. Protokół ten opisuje oczyszczanie złośliwych i niezłośliwych komórek B z danio pręgowanego lck:eGFP.

Izolowanie złośliwych i niezłośliwych komórek B od lekko: eGFP danio pręgowanego

Użyliśmy barwienia proliferacji komórek, aby zidentyfikować komórki w stanie spoczynku w modelu T-ostrej białaczki limfoblastycznej u danio pręgowanego. Barwnik jest zatrzymywany w komórkach niedzielących się i redukowany podczas proliferacji komórek, co umożliwia selekcję uśpionych komórek do dalszego badania. Protokół ten zapewnia funkcjonalne narzędzie do badania samoodnowy w kontekście spoczynku komórkowego.

Identyfikacja komórek w stanie spoczynku w modelu ostrej białaczki limfoblastycznej limfoblastycznej limfocytów T danio pręgowanego za pomocą barwienia proliferacji komórek

Przedstawiamy protokół otrzymywania swoistych dla antygenu limfocytów T myszy z wykorzystaniem transdukcji...

Retrowirusowa transdukcja receptorów limfocytów T w limfocytach T myszy

Tropizm HIV można wywnioskować z regionu V3 otoczki wirusa. Region V3 jest amplifikowany w trzech powtórzeniach metodą zagnieżdżonej RT-PCR, sekwencjonowany, a następnie interpretowany przy użyciu oprogramowania bioinformatycznego. Próbki zawierające jedną lub więcej sekwencji z niskimi wartościami g2P są klasyfikowane jako wirusy non-R5.

Genotypowe wnioskowanie o tropizmie HIV-1 z wykorzystaniem sekwencjonowania populacyjnego pętli V3

Przeszczepianie szpiku kostnego u myszy jest powszechnie stosowaną techniką badania mechanizmów immunologicznych sterujących chorobą przeszczep przeciw gospodarzowi u ludzi. Możliwość monitorowania wzorców migracji limfocytów T in vivo pozwala na szczegółową analizę rozwoju i utrwalania odpowiedzi limfocytów T podczas choroby przeszczep przeciw gospodarzowi.

Indukcja choroby przeszczep przeciw gospodarzowi i monitorowanie limfocytów T in vivo z wykorzystaniem modelu mysiego dopasowanego pod kątem MHC

Poznaj metodę izolacji populacji bocznej w białaczce limfoblastycznej T u Danio rerio. Technika ta umożliwia wyodrębnienie komórek z aktywnością komórek macierzystych nowotworu.

Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów