Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie komórek populacji bocznej z modelu danio pręgowanego ostrej białaczki limfoblastycznej indukowanej przez limfocyty T indukowanej przez myc. Test populacji pobocznej został wykorzystany do identyfikacji populacji komórek macierzystych i progenitorowych w wielu tkankach normalnych i nowotworowych. Ale nie został jeszcze zastosowany do żadnych modeli raka danio pręgowanego.

Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona na prospektywną izolację populacji komórek w T-ALL danio pręgowanego, które mogą być wzbogacone o aktywność nowotworowych komórek macierzystych. Chociaż opisana przez nas metoda ma szerokie zastosowanie w badaniach nad białaczką danio pręgowanego, może mieć również zastosowanie do innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek danio pręgowanego. Osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ metoda jest wrażliwa na subtelne zmiany.

Mimo że metoda wydaje się prosta, wymagana jest optymalizacja dla każdego testowanego typu komórki. Przygotuj 20 mililitrów 10-procentowego inaktywowanego termicznie FBS w 0,9x PBS. Dodać jeden mililitr roztworu FBS/PBS do fiolki z solą sodową heparyny zawierającej 300 jednostek antykoagulantu.

Następnie, za pomocą mikroskopu epifluorescencyjnego, wybierz ryby, u których komórki nowotworowe zaatakowały 50 procent ciała lub ryby, które zostały zidentyfikowane jako mające trudności z jedzeniem lub pływaniem. Poddaj rybę eutanazji, przenosząc ją do roztworu od jednego do dwóch miligramów na mililitr tricainy w wodzie dla ryb. Obserwuj zwierzę pod kątem ruchów skrzeli i bicia serca, aby potwierdzić eutanazję.

Po usunięciu głowy ryby, wstrzyknąć pipetą 100 mikrolitrów roztworu heparyny do jej jamy ciała w celu usunięcia nadmiaru czerwonych krwinek. Odessać cały wylewający się płyn i odpipetować go do 1,5-mililitrowej probówki do mikrowirówki. Następnie, za pomocą świeżych końcówek pipet, umyj jamę ciała jeszcze dwa razy lub do momentu, gdy roztwór myjący nie będzie zawierał krwi, a następnie wylej płyn zebrany ze wszystkich płukań.

Aby pobrać komórki białaczkowe, wstrzyknij 100 mikrolitrów roztworu FBS/PBS do wstępnie umytej jamy ciała. Pod mikroskopem preparacyjnym delikatnie dociśnij ciało ryby końcówką pipety, aby wypchnąć komórki nowotworowe. Zbierz uwolnioną ciecz do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej.

Powtarzaj izolację, aż większość komórek nowotworowych zostanie pobrana. Zbierz wszystkie komórki w tej samej 1,5 mililitrowej probówce do mikrowirówki i utrzymuj uzyskaną zawiesinę w temperaturze pokojowej. Następnie wymieszaj wyizolowane komórki nowotworowe, delikatnie pipetując, aby rozdzielić grudki komórek.

Przefiltruj zawiesinę komórek przez filtr siatkowy o grubości 40 mikrometrów. I umyj filtr raz do dwóch razy 100 mikrolitrami FBS/PBS. Po przefiltrowaniu utrzymuj komórki w temperaturze pokojowej.

Na koniec, w nowej probówce, wymieszaj dwa mikrolitry zawiesiny komórek z 18 mikrolitrami 0,04% sterylnego roztworu błękitu trypanowego. Załaduj 10 mikrolitrów otrzymanej zawiesiny na hemocytometr i policz żywotne fluorescencyjne komórki nowotworowe. Ważne jest, aby pobrać czystą próbkę komórek T-ALL.

Stężenie Hoechst trzy trzy trzy dwa dwa użyte tutaj opiera się na liczbie zebranych żywych komórek nowotworowych. Dodatkowe szczątki komórkowe lub komórki nienowotworowe mogą zakłócać test. Przed barwieniem komórek rozcieńczyć barwnik Hoechst w wodzie wolnej od nukleaz, aby uzyskać jeden miligram na mililitr roztworu roboczego.

Przygotowany roztwór przechowywać przykryty folią aluminiową w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Następnie rozpuść 49,1 miligrama werapamilu w jednym mililitrze DMSO, aby uzyskać 100 mikromolowy roztwór inhibitora. Następnie przygotuj próbkę, dodając FBS / PBS, 2,5 mikrolitra DMSO, 15 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr barwnika Hoechst i 10 do sześciu komórek nowotworowych do rurki faksowej o końcowej objętości jednego mililitra.

Aby przygotować kontrolę, dodając FBS / PBS, 2,5 mikrolitra 100 milionów molowych werapamilu, 15 mikrolitrów jednego miligrama na mililitr barwnika Hoechsta, dodaj 10 do sześciu komórek nowotworowych o końcowej objętości jednego mililitra. Inkubować próbkę i kontrolę w łaźni wodnej o temperaturze 28 stopni Celsjusza w ciemności przez 120 minut. Po inkubacji umieść komórki natychmiast na lodzie i trzymaj je w ciemności.

Odwirować komórki w temperaturze 300 razy G i czterech stopni Celsjusza przez sześć minut. Następnie usuń supernatintę i umyj komórki jednym mililitrem FBS/PBS. Wiruj komórki w temperaturze 300 razy G cztery stopnie Celsjusza przez sześć minut jeszcze raz.

Po granulowaniu komórek usuń supernatintę i ponownie zawieś komórki w jednym mililitrze FBS / PBS. Utrzymuj próbki w temperaturze czterech stopni Celsjusza do czasu sortowania komórek. 15 minut przed sortowaniem komórek dodać dwa mikrolitry po jednym miligramie na mililitr roztworu podstawowego jodu propidynowego na każdy mililitr zawiesiny komórek.

Następnie dobrze zwiruj próbki. Przeanalizuj barwione zawiesiny komórek T-ALL danio pręgowanego za pomocą sortera komórek aktywowanego fluorescencją. Wzbudzaj próbki za pomocą lasera UV do analizy barwnika Hoechst i lasera o długości 488 nanometrów do wykrywania komórek T-ALL z dodatnim jodkiem propidyny lub GFP.

Liczba komórek, stężenie barwnika, temperatura inkubacji i długość inkubacji mogą wymagać optymalizacji dla każdego rodzaju użytych komórek. Zmiany w każdym z tych warunków mogą drastycznie zmienić wyniki testu. Aby zidentyfikować populację boczną wśród komórek T-ALL wyizolowanych z danio pręgowanego, wyklucza się pierwsze szczątki komórkowe i grudki komórek.

Spożycie jodku propidyny i ekspresja GFP w populacji pojedynczych komórek są następnie analizowane w celu identyfikacji żywych komórek nowotworowych. Aby zobrazować populację boczną, porównuje się następnie emisje niebieskiego i czerwonego barwnika Hoechst. Populacja boczna pojawia się jako ciemny ogon komórek rozciągający się od lewej strony głównej populacji komórek w kierunku niebieskiej osi fluorescencji.

Przedstawiono wyniki analizy populacji pobocznej przeprowadzonej dla dwóch różnych próbek komórek nowotworowych. W obu próbkach zidentyfikowano populację poboczną. Jednak różne próbki guza zawierały różną liczbę komórek populacji bocznej.

Niezależnie od analizowanej próbki guza, potraktowanie próbki inhibitorem wypływu werapamilu spowodowało zanik sygnału obserwowanego dla wcześniej zidentyfikowanych komórek, co dodatkowo potwierdza fenotyp populacji bocznej. Po opanowaniu, technikę populacji bocznej na zebry pręgowanym T-ALL można wykonać w mniej niż cztery godziny, jeśli zostanie wykonana prawidłowo i tak, jak przedstawiliśmy tutaj. Próbując tej procedury, należy pamiętać o krokach, które zostały zoptymalizowane pod kątem T-ALL danio pręgowanego, takich jak temperatura i czas inkubacji, stężenie barwnika i inhibitor wypływu.

Mogą one wymagać zmiany dla różnych systemów eksperymentalnych. Zgodnie z tą procedurą, inne metody, takie jak izolacja RNA lub testy transplantacji in vivo, mogą być wykonywane z posortowanymi komórkami populacji bocznej, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące funkcjonalności i regulacji genów komórek populacji bocznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować boczną populację komórek z ostrej białaczki limfoblastycznej z komórek T danio pręgowanego.