Izolacja populacji bocznej w ostrej białaczce limfoblastycznej indukowanej przez limfokomórki T indukowanej przez Myc u danio pręgowanego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wyizolowanie komórek populacji bocznej (side population) z modelu raka białaczkowego t-komórkowego o ostrym przebiegu indukowanego przez myc u ryb zebrafish. Test populacji bocznej był wykorzystywany do identyfikacji populacji komórek macierzystych i progenitorowych w wielu prawidłowych tkankach oraz tkankach nowotworowych, jednak nie został on dotąd zastosowany w żadnym modelu nowotworu u ryb zebrafish.

Główną zaletą tej techniki jest to, że umożliwia ona prospektywną izolację populacji komórek w modelu T-ALL u rybek zebrafish, która może być wzbogacona o aktywność komórek macierzystych nowotworu. Choć opisana tutaj metoda znajduje szerokie zastosowanie w badaniach nad białaczką u rybek zebrafish, może ona być również stosowana w przypadku innych złośliwych i niezłośliwych typów komórek tych ryb. Osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ jest ona wrażliwa na subtelne zmiany.

Mimo że metoda wydaje się prosta, wymagana jest optymalizacja dla każdego badanego typu komórek. Przygotować 20 milliliters 10 procent dezaktywowanego termicznie FBS w 0.9x PBS. Dodać jeden milliliter roztworu FBS/PBS do fiolki z solą sodową heparyny zawierającej 300 units przeciwzakrzepowego.

Następnie, korzystając z mikroskopu epifluorescencyjnego, należy wybrać ryby, w których komórki nowotworowe zajęły 50% ciała, lub ryby wykazujące trudności w żywieniu lub pływaniu. Ryby należy poddać eutanazji, przenosząc je do roztworu tricainy w wodzie dla ryb o stężeniu od 1 do 2 mg/ml. Należy obserwować ruchy skrzeli oraz pracę serca zwierzęcia, aby potwierdzić śmierć.

Po odcięciu głowy ryby, wstrzyknij pipetą 100 µL roztworu heparyny do jamy ciała, aby usunąć nadmiar erytrocytów. Odessaj cały wypływający płyn i przelej go do probówki do mikrowirówki o pojemności 1,5 mL. Następnie, używając nowych końcówek do pipety, przemyj jamę ciała jeszcze dwa razy lub do momentu, aż roztwór płuczący nie będzie zawierał krwi; płyn ze wszystkich etapów płukania należy usunąć.

Aby zebrać komórki białaczki, wstrzyknij 100 µL roztworu FBS/PBS do uprzednio wypłukanej jamy ciała. Pod mikroskopem stereoskopowym wywieraj delikatny nacisk na ciało ryby końcówką pipety, aby wypchnąć komórki nowotworowe. Zbierz uwolnioną ciecz do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 mL.

Powtarzać izolację do czasu odzyskania większości komórek nowotworowych. Wszystkie komórki zebrać do tej samej probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml i przechowywać otrzymaną zawiesinę w temperaturze pokojowej. Następnie wymieszać izolowane komórki nowotworowe poprzez delikatne pipetowanie w celu rozbicia skupisk komórkowych.

Przefiltruj zawiesinę komórkową przez filtr siatkowy o oczkach 40 µm. Następnie przemyj filtr jeden lub dwa razy 100 µL FBS/PBS. Po przefiltrowaniu przechowuj komórki w temperaturze pokojowej.

Na koniec, w nowej probówce, wymieszaj 2 µL zawiesiny komórkowej z 18 µL 0,04% sterylnego roztworu błękitu trypanowego. Nanieś 10 µL otrzymanej zawiesiny na komorę licznikową (hemocytometr) i policz żywe fluorescencyjne komórki nowotworowe. Ważne jest pobranie czystej próbki komórek T-ALL.

Stężenie użytego tutaj barwnika Hoechst 33342 opiera się na liczbie zebranych żywych komórek nowotworowych. Dodatkowe szczątki komórkowe lub komórki nienowotworowe mogą zakłócać analizę. Przed barwieniem komórek rozcieńczyć barwnik Hoechst w wodzie wolnej od nukleaz, aby otrzymać roztwór roboczy o stężeniu 1 mg/ml.

Przygotowany roztwór przechowywać w temperaturze 4 °C, osłonięty folią aluminiową. Następnie rozpuścić 49,1 mg verapamilu w 1 ml DMSO, aby otrzymać 100 µM roztwór inhibitora. Kolejnym krokiem jest przygotowanie próbki poprzez dodanie FBS/PBS, 2,5 µl DMSO, 15 µl barwnika Hoechst w stężeniu 1 mg/ml oraz 10⁶ komórek nowotworowych do probówki typu fax, tak aby końcowa objętość wynosiła 1 ml.

Aby przygotować kontrolę, należy dodać FBS/PBS, 2,5 µL verapamilu o stężeniu 100 mM oraz 15 µL barwnika Hoechst w stężeniu 1 mg/mL, a następnie dodać 10 do sześciu komórek nowotworowych do końcowej objętości 1 mL. Próbkę oraz kontrolę inkubować w kąpieli wodnej o temperaturze 28 °C w ciemności przez 120 minut. Po inkubacji komórki należy natychmiast umieścić na lodzie i przechowywać w ciemności.

Wirować komórki przy 300 ×g w temperaturze 4 °C przez sześć minut. Następnie usunąć supernatant i przemyć komórki 1 mL FBS/PBS. Ponownie wirować komórki przy 300 ×g w temperaturze 4 °C przez sześć minut.

Po odwirowaniu komórek należy usunąć nadsącz i resuspender komórki w 1 mL FBS/PBS. Próbki należy przechowywać w temperaturze 4 °C do momentu sortowania komórek. Na 15 minut przed sortowaniem należy dodać 2 µL roztworu zapasowego jodku propidyny o stężeniu 1 mg/mL na każdy 1 mL zawiesiny komórkowej.

Następnie dokładnie wymieszaj próbki w wstrząsarce vorteksowej. Przeanalizuj zabarwione zawiesiny komórek T-ALL rybek zebrafish za pomocą sortera komórkowego aktywowanego fluorescencją. Pobudź próbki laserem UV w celu analizy barwnika Hoechst oraz laserem o długości fali 488 nanometrów w celu detekcji komórek T-ALL wykazujących pozytywność na jodek propidyny lub GFP.

Liczba komórek, stężenie barwnika, temperatura inkubacji oraz czas inkubacji mogą wymagać optymalizacji dla każdego rodzaju użytych komórek. Zmiany w którymkolwiek z tych parametrów mogą drastycznie wpłynąć na wyniki analizy. Aby zidentyfikować populację boczną (side population) wśród komórek T-ALL wyizolowanych z rybek zebrafish, w pierwszej kolejności należy wykluczyć debris komórkowy oraz agregaty komórkowe.

Następnie analizuje się pobór jodku propidyum oraz ekspresję GFP w jednej populacji komórek, aby zidentyfikować żywe komórki nowotworowe. Aby zwizualizować populację boczną (side population), porównuje się emisje niebieską i czerwoną barwnika Hoechst. Populacja boczna pojawia się jako słabo fluorescencyjny „ogon” komórek rozciągający się od lewej strony głównej populacji komórek w kierunku osi fluorescencji niebieskiej.

Przedstawiono tutaj wyniki analizy populacji bocznej (side population) przeprowadzonej dla dwóch różnych próbek komórek nowotworowych. Populację boczną zidentyfikowano w obu preparatach. Jednakże, różne próbki nowotworowe zawierały zróżnicowaną liczbę komórek populacji bocznej.

Niezależnie od analizowanej próbki nowotworu, potraktowanie próbki inhibitorem efleksu w postaci werapamilu doprowadziło do zaniku sygnału obserwowanego w wcześniej zidentyfikowanych komórkach, co dodatkowo potwierdziło fenotyp populacji side population. Po opanowaniu techniki, analiza populacji side population w przypadku T-ALL u rybki danio może zostać przeprowadzona w czasie krótszym niż cztery godziny, pod warunkiem prawidłowego wykonania zgodnie z naszą prezentacją. Podczas przeprowadzania tej procedury ważne jest pamiętanie o krokach zoptymalizowanych dla T-ALL u rybki danio, takich jak temperatura i czas inkubacji, stężenie barwnika oraz zastosowany inhibitor efleksu.

Parametry te mogą wymagać dostosowania do różnych systemów eksperymentalnych. Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak izolacja RNA lub testy transplantacji in vivo, z wykorzystaniem posortowanych komórek populacji bocznej, aby odpowiedzieć na pytania dotyczące funkcjonalności i regulacji genów w komórkach populacji bocznej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować populację boczną komórek z ostrej białaczkowej leukemii limfoblastycznej komórek T u rybek zebrafish.