Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Ogólnym celem tej procedury jest wygenerowanie chondrogennych komórek linii z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej lub komórek IPS. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji chrząstki dotyczące wykorzystania komórek krwi obwodowej pochodzących od pacjenta jako komórek C do generowania komórek IPS do naprawy chrząstki. Głównymi zaletami tej techniki jest to, że jest ona łatwo odtwarzalna, a różnicowanie chondrocytów zachodzi w warunkach wolnych od surowicy i ksenocytów.

Rozpocznij od posiewu ludzkich komórek IPS w czteromililitrowym ludzkim pożywce IPSC na 60-milimetrowym naczyniu do hodowli tkankowej zawierającym monowarstwę napromieniowanych mysich embrionalnych komórek odżywiających fibroblasty. Hoduj komórki w temperaturze 37 stopni Celsjusza w pięciu procentach dwutlenku węgla. Gdy komórki macierzyste są w 80 do 90 procentach zlewne, należy oddzielić komórki od roztworu dwuwarstwowego w celu podhodowli.

Po dwóch do trzech pasażach użyj szklanej igły ciągnionej ogniem, aby wyciąć 80 do 90 procent zlewającej się niezróżnicowanej kolonii IPSC na mniejsze fragmenty i przenieś nie więcej niż 100 fragmentów kultury komórkowej na nową, nieprzylegającą 100-milimetrową szalkę Petriego zawierającą 10 mililitrów pożywki do tworzenia ciała zarodka. Dysocjacja mechaniczna jest lepsza niż automatyczne trawienie, ponieważ zmniejsza uszkodzenia komórek do małych fragmentów komórek, które mają zostać przeniesione do nowego pojemnika hodowlanego i zapowiadają ręczną utylizację komórek zasilających, które hamują różnicowanie ludzkich komórek IPS. Przywrócić ludzkie komórki IPS do inkubatora hodowli komórkowych.

Po dwóch dniach przechyl naczynie, aby ciała zarodków mogły się uspokoić, i ostrożnie zastąp trzy mililitry pożywki do tworzenia ciała zarodka czterema mililitrami świeżej pożywki do hodowli podstawowej. Po 10 dniach uformują się ciała zarodkowe. Posmaruj nowe 100-milimetrowe naczynie czterema mililitrami 0,1% żelatyny przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Przenieś ciała zarodkowe z supernatantem do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i pozwól ciału osiąść na cztery do pięciu minut. Odessać wszystkie oprócz ostatnich 0,5 mililitra pożywki i ponownie zawiesić ciała zarodków w 10 mililitrach świeżej podstawowej pożywki hodowlanej. Gdy żelatyna stężeje, wyrzuć żelatynę.

Następnie wysiewaj komórki na naczyniu pokrytym żelatyną i umieść naczynie w inkubatorze do hodowli komórkowych. Po 10 dniach w hodowli ciała zarodkowe zróżnicują się w wyrostki komórek fibroblastycznych. Aby wywołać różnicowanie chondrocytów, przemyj kulturę DPBS i odłącz komórki trzema mililitrami 0,25% trypsyny EDTA w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut.

Gdy komórki podniosą się z dna płytki, zneutralizuj reakcję czterema mililitrami świeżej podstawowej pożywki hodowlanej i delikatnie miareczkuj kulturę od pięciu do 10 razy. Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko z nylonowej siatki o grubości 70 mikronów i zbierz komórki przez odwirowanie. Następnie wysiewaj komórki na nowej, pokrytej żelatyną, 100-milimetrowej płytce w 10 mililitrach świeżej podstawowej pożywki hodowlanej.

Gdy kultura osiągnie 90 do 100 procent zbieżności, zbierz komórki z trzema mililitrami 0,25% trypsyny EDTA, jak właśnie pokazano do liczenia. Przenieś trzy razy 10 do piątej porcji komórek do 15-mililitrowej probówki polipropylenowej w celu odwirowania. I ponownie zawiesić osad w jednym mililitrze chondrogennego podłoża różnicującego.

Następnie ponownie odwiruj komórki i umieść probówkę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 21 dni bez naruszania osadu. Komórki chondrogenne mogą gromadzić się in vitro, wytwarzając charakterystyczne wskaźniki zewnątrzkomórkowe w warunkach hodowli o dużej gęstości. Po 21 dniach w hodowli utworzy się ludzka chondrogenna osadka z komórek IPS.

Po 21 dniach hodowli ludzkie komórki chondrogenne IPSC są dodatnie na obecność błękitu alcyjowego i toluidyny w niebieskim zabarwieniu, co wskazuje na pomyślne różnicowanie chondrogenne osadu HIPSC. Analiza immunohistochemiczna kolagenu dwa i kolagenu 10 dodatkowo potwierdza ich fenotyp podobny do chondrocytów. Analiza siarczanowych glikozaminoglikanu ujawnia, że zawartość siarczanowanych glikozaminoglikanu w komórkach jest znacznie podwyższona w ludzkich chondrogennych granulkach IPSC w porównaniu z ludzkimi komórkami fibroblastycznymi IPSC, ciałami zarodkowymi i niezróżnicowanymi ludzkimi komórkami IPS.

Co więcej, ludzkie komórki chondrogenne IPSC wykazują wysoki poziom ekspresji genów linii chondroprogenitorowej i w pełni zróżnicowane markery chondrocytów, co sugeruje osiągnięcie udanego różnicowania chondrogennego. Wieloetapowa metoda hodowli stosowana do różnicowania ludzkich IPSC w chondrocyty, w tym spontaniczne różnicowanie poprzez tworzenie EB, wzrost komórek z EB, jednowarstwowa hodowla komórkowa po hodowli komórkowej oraz hodowla osadów 3D. Fenotyp chondrocytów ocenia się za pomocą analizy histologicznej, analizy biochemicznej i ekspresji genów chondrogennych.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak używać metody hodowli wieloetapowej do indukowania różnicowania ludzkich komórek IPS w chondrocytach. Technika ta może być bardziej dostosowana do potrzeb pacjenta i opłacalna.