Name: Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-18T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 51 s
Description: Poznaj protokół różnicowania chondrocytów z iPSC pochodzących z krwi obwodowej w warunkach wolnych od surowicy i ksenogenicznych. Ta metoda oferuje odtwarzalne, ekonomiczne podejście do pacjentospecyficznej regeneracji chrząstki.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Autorzy pragną podziękować Xiaobinowi Zhangowi za jego plazmid. Dziękujemy również Shaorong Gao i Qianfei Wang za ich życzliwą pomoc podczas eksperymentu. Badanie to jest wspierane przez Narodową Fundację Nauk Przyrodniczych Chin (nr 81101346, 81271963, 81100331), projekt talentów wysokiego szczebla Beijing 215 (nr 2014-3-025) oraz Fundusz Szpitala Chao-Yang w Pekinie (nr 2014). CYXX-2017-01) oraz Stowarzyszenie Promocji Innowacji Młodzieży Chińskiej Akademii Nauk (Y.L.).

Protokół generowania hiPSC z PBC można znaleźć w naszym poprzednim badaniu5. Badanie zostało zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną naszej instytucji.
1. Formacja ciała zarodkowego (EB)
<ol>
	<li>Przygotuj 50 ml pożywki hiPSC: Knockout Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) uzupełnionej 15% zamiennikiem surowicy nokautującej (KSR), 5% płodową surowicą bydlęcą (FBS), 1× aminokwasami endogennymi, 55 μM 2-merkaptoetanolu, 2 mM L-glutaminy i 8 ng/ml zasadowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF).</li>
	<li>Zrób 50 ml pożywki do tworzenia EB: DMEM uzupełniony 15% KSR, 5% FBS, 1x aminokwasy endogenne, 55 μM 2-merkaptoetanol i 2 mM L-glutamina.</li>
	<li>Przygotuj 50 ml podstawowej pożywki hodowlanej: DMEM uzupełniony 20% FBS, 1× nieistotnych aminokwasów, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy.</li>
	<li>Przygotować 10 ml roztworu dypazy, 1 mg/ml w knockout DMEM.</li>
	<li>Hodowla hiPSC na 60-milimetrowych szalkach do hodowli tkankowej z komórkami zasilającymi (tj. monowarstwą napromieniowanych mysich embrionalnych komórek fibroblastów). Gdy komórki zlewają się w 80-90%, odłącz komórki od dyspazy i przechodź hiPSC 1:3 co 4-5 dni. Umieścić komórki w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	<li>Rozbioruj niezróżnicowane kolonie hiPSC na mniejsze kawałki (o średnicy około 50-100 μm) za pomocą igły szklanej ciągnionej ogniem, gdy iPSC są zlewające się w 80-90%. Ogólnie rzecz biorąc, użyj kolonii hiPSC w szalce o średnicy 60 mm, aby wygenerować EB na szalce Petriego o średnicy 100 mm.
	<ol>
		<li>Hodować mniej niż 100 małych kawałków kolonii na 100 mm, nieprzylegającej szalce Petriego zawierającej 10 ml pożywki do tworzenia EB. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zastąp około 25% początkowej pożywki równą ilością podstawowej pożywki co 2 dni. Przechyl naczynie, aby EB się uspokoiły. Ostrożnie usuń 3 ml górnej pożywki i dodaj 4 ml świeżej podstawowej pożywki hodowlanej. Nie przeszkadzaj EBs. 
	UWAGA: EB są morfologicznie scharakteryzowane przez kawałki kolonii, które pod mikroskopem przybierają okrągły wygląd z gładkimi obwódkami.</li>
	<li>Po 10 dniach hodowli na nieprzylegającej szalce Petriego, przed użyciem pokryć nową 100-milimetrową szalkę do hodowli tkankowej 4 ml 0,1% żelatyny przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Przenieść pożywkę plus EBs z nieprzylegającej płytki Petriego o średnicy 100 mm do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Pozwól EBs osiadać przez 4-5 minut. Ostrożnie odessać supernatant i pozostawić mniej niż 0,5 ml pożywki plus EB</li>
	<li>Wysiewać mniej niż 100 EB na 100 mm, pokrytym żelatyną naczyniu do hodowli tkankowych z 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Umieść naczynia w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
</ol>
2. Tworzenie osadów komórkowych i różnicowanie chondrocytów
<ol>
	<li>Przygotuj 10 ml 0,25% trypsyny/kwasu etylenodiaminotetraoctowego (EDTA). Przygotuj 80 ml podstawowej pożywki hodowlanej: DMEM uzupełniony 20% FBS, 1x aminokwasy endogenne, 55 μM 2-merkaptoetanolu i 2 mM L-glutaminy.</li>
	<li>Przygotuj 10 ml pożywki do różnicowania chondrogennego: DMEM (wysoki poziom glukozy) uzupełniony 10% roztworem insuliny-transferyny-selenu (ITS), 0,1 μM deksametazonu, 1 mM kwasu askorbinowego, 1% pirogronianu sodu i 10 ng / ml transformującego czynnika wzrostu-beta 1 (TGF-β1).</li>
	<li>Po 48 godzinach odświeżyć pożywkę za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Następnie odświeżaj pożywkę co trzy dni za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Po 10 dniach w hodowli wyrostki komórek fibroblastycznych powinny się rozszerzyć z EB.
	<ol>
		<li>Przed użyciem pokryć szalki o średnicy 100 mm 4 ml 0,1% żelatyny przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Wyrzuć supernatant komórek i przemyj je jednokrotnie roztworem soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (DPBS) firmy Dulbecco.</li>
		<li>Trawić komórki 3 ml 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut i neutralizować 4 ml podstawowej pożywki hodowlanej.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zdysocjuj komórki na pojedyncze komórki, pipetując w górę iw dół 5-10 razy i przepuszczając je przez nylonową siatkę o grubości 70 μm. Odwirować zawiesinę komórkową o sile 200 x g przez 5 minut. Ponownie zasiać komórki na nowym, pokrytym żelatyną naczyniu do hodowli tkankowych o średnicy 100 mm z 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Po 48 godzinach odświeżyć pożywkę za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Następnie odświeżaj pożywkę co trzy dni za pomocą 10 ml podstawowej pożywki hodowlanej. 
	UWAGA: Komórki uzyskują jednorodną, podobną do fibroblastów morfologię.</li>
	<li>Po osiągnięciu ~90-100% konfluencji (tj. około 5-7 dni), zbierz komórki z 3 ml 0,25% trypsyny/EDTA w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Zneutralizuj 4 ml podstawowej pożywki hodowlanej. Zdysocjuj komórki na pojedyncze komórki, pipetując w górę iw dół 5 razy. Użyj hemocytometru, aby policzyć liczbę komórek.
	<ol>
		<li>Umieść 3 x 105 komórek w probówce polipropylenowej o pojemności 15 ml. Wirować przy 200 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej (RT). Ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki do różnicowania chondrogennego.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie odwirować komórki przy 300 x g przez 3 minuty i utrzymywać komórki w postaci małych granulek. Umieścić probówkę w inkubatorze o temperaturze 37 °C i 5% CO2 na 21 dni. Nie dokręcaj mocno pokrywy i nie pozwól, aby gaz się wymienił.</li>
	<li>Zastąpić 3/4 pożywki hodowlanej co trzy dni świeżą pożywką do różnicowania chondrogennego. 
	UWAGA: Po 21 dniach w hodowli powinny powstać pastylki chondrogenne hiPSC (hiPSC-Chon). Ludzkie mezenchymalne komórki macierzyste (MSC), jako kontrola pozytywna, są również pobierane i hodowane w pożywce różnicowania chondrogennego przez 21 dni w celu wytworzenia chondrogennych osadów (hMSC-Chon).</li>
</ol>
3. Analiza różnicowania chondrogennego
<ol>
	<li>Przygotuj 10 ml 10% neutralnie buforowanej formaliny.</li>
	<li>Przygotować 50 ml 0,1% odczynnika błękitu alcyjnego i 50 ml 1% odczynnika błękitu toluidynowego.</li>
	<li>Przygotuj 1 ml przeciwciał pierwszorzędowych: króliczych przeciwciał poliklonalnych przeciwko kolagenowi II (1:50) lub mysich przeciwciał monoklonalnych przeciwko kolagenowi X (1:50). Przygotuj również przeciwciała drugorzędowe przeciwko królikom lub myszy.</li>
	<li>Przygotuj 1 ml roztworu papainy: 10 U/ml w PBS z 0,1 M octanem sodu, 2,4 mM EDTA i 5 mM L-cysteiną.</li>
	<li>Przygotować 100 ml roztworu barwnika błękitu dimetylometylenowego (DMMB): 100 μl 1,9 mg/l błękitu 1,9-dimetylometylenowego, 40 mM glicyny, 40 mM NaCl i 9,5 mM HCl; pH 3,0.</li>
	<li>Ocenić różnicowanie chondrogenne za pomocą barwienia błękitem alcyjnym i błękitem toluidynowym w skrawkach osadu.
	<ol>
		<li>Utrwal jedną pastylkę hiPSC-Chon lub pastylkę hMSC-Chon w 1 ml 10% neutralnie buforowanej formaliny przez 24 godziny.</li>
		<li>Przenieść osad do 1 ml 70% etanolu w H2O. Odwodnić osad 1 ml sortowanego etanolu (tj. 25, 50, 75, 90, 95, 100 i 100%, po 3 minuty).</li>
		<li>Sklarować osad w 1 ml 100% ksylenu trzy razy. Osad naciekać parafiną przez 1 godzinę w piecu o temperaturze 65 °C. Osadź granulat w blokach parafinowych za pomocą formy bazowej 7 x 7 x 5 mm3, postępując zgodnie z rutynowymi procedurami histologicznymi6.</li>
		<li>Wykonaj sąsiednie sekcje za pomocą mikrotomu o grubości około 4 μm7. Przyklej sekcje do szkiełek szkiełkowych.</li>
		<li>Szkiełka suszyć przez 2 godziny w temperaturze 60 °C w piekarniku. Odparafinować skrawki w trzech cyklach (każdy po 3 minuty) przy użyciu 100% ksylenu.</li>
		<li>Do nawodnienia należy użyć serii zmniejszających się alkoholi (tj. 100, 100, 95, 95, 70, 50 i 25% wH2O, po 3 minuty), a następnie wykonać końcowe płukanie wodą dejonizowaną przez 5 minut.</li>
		<li>Zabarwić skrawki 0,1% odczynnikiem błękitu alcyjnego lub 1% błękitem toluidynowym przez 4-5 godzin, a następnie spłukać je wodą destylowaną.</li>
		<li>Odwodnić za pomocą serii stopniowanych etanoli (tj. 25, 50, 75, 90, 95, 100 i 100%, po 3 minuty każdy), a następnie wykonać trzy kolejne etapy klarowania w 100% ksylenie. Zamontuj szkiełka i zwizualizuj je pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj immunohistochemię. 
	UWAGA: Dodatkowe skrawki osadu są dalej oceniane za pomocą immunohistochemii.
	<ol>
		<li>Po odparafinowaniu i ponownym nawodnieniu doprowadzić szkiełka do wrzenia w 1 mM EDTA, pH 8,0 (wodoodporne w wodzie zagotowanej w autoklawie). Pozostaw je na 8 minut w temperaturze poniżej wrzenia, a następnie pozwól szkiełkom ostygnąć w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Opłucz szkiełka 3 razy wodą dejonizowaną. Inkubować skrawki w 3% roztworzeH2O2w metanolu w temperaturze pokojowej przez 15 minut, aby zablokować endogenną aktywność peroksydazy.</li>
		<li>Przepłukać szkiełka wodą dejonizowaną i zanurzyć je w DPBS na 5 min. Na skrawki na szkiełkach nanieść 50-100 μl odpowiednio rozcieńczonego (1:50) przeciwciała pierwszorzędowego, a następnie inkubować je w wilgotnej komorze w temperaturze pokojowej przez 1 godzinę.</li>
		<li>Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut) za pomocą DPBS. Próbki należy inkubować z odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi (tj. przeciwciałami anty-króliczymi lub myszymi) przez 15 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Umyj szkiełka 3 razy (po 5 minut każde) za pomocą DPBS. Wykonaj detekcję DAB pod mikroskopem.</li>
		<li>Umyj szkiełka DPBS 3 razy (po 2 minuty). Przeciwbarwić jądra komórkowe, zanurzając szkiełka w hematoksylinie na 1-2 min. Odwodnić za pomocą serii stopniowanych etanoli (25, 50, 75, 90, 95, 100 i 100% każdy; 3 minuty każdy), a następnie wykonać trzy kolejne etapy klarowania ksylenem. Na koniec zamontuj szkiełka i zwizualizuj je pod mikroskopem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykrywanie zawartości sGAG.
	<ol>
		<li>Trawić chondrogenne granulki w roztworze papainy w temperaturze 60 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Określ zawartość DNA za pomocą zestawu do oznaczania dsDNA i systemu fluorometru. Zmierz zawartość sGAG, mieszając ją z roztworem barwnika DMMB przy pomiarze absorbancji przy 525 nm8.</li>
		<li>Oblicz stężenie sGAG w stosunku do krzywej wzorcowej siarczanu chondroityny rekina.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj analizę PCR w czasie rzeczywistym markerów różnicowania chondrogennego w granulkach hiPSC-Chon.
	<ol>
		<li>Zbierz 3-4 takie same chondrogenne granulki, dodając 500 μl lodowatego odczynnika ekstrakcyjnego do jednej probówki. Dokładnie wymieszaj. Inkubować próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej.</li>
		<li>Dodać 0,1 ml chloroformu. Wirować próbkę przez 15 s i inkubować ją w temperaturze pokojowej przez 3 minuty. Odwirować próbkę przez 15 minut w temperaturze 12 000 x g i temperaturze 4 °C. Przenieść górną fazę wodną (około 250 μl) do nowej probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Do próbki dodać 25 μl octanu sodu i 1 μl glikogenu. Wytrącić RNA, mieszając je z 250 μl alkoholu izopropylowego. Dokładnie wymieszaj. Inkubować próbkę w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
		<li>Wirować przez 10 minut przy 12 000 x g i temperaturze 4 °C. Całkowicie usunąć supernatant. Przemyć osad RNA dwukrotnie 500 μl 75% etanolu.</li>
		<li>Wirować przez 5 minut w temperaturze 7 500 x g i temperaturze 4 °C. Usunąć wszystkie resztki etanolu i wysuszyć granulkę RNA na powietrzu przez 5-10 minut. Rozpuść RNA w 10 μl wody wolnej od nukleaz.</li>
		<li>Przekształć RNA w cDNA za pomocą systemu odwrotnej transkryptazy. Poddaj próbki cDNA PCR w czasie rzeczywistym przy użyciu zestawu qPCR master mix (2x) i systemu PCR w czasie rzeczywistym9. 
		UWAGA: Sekwencje starterów to: 
		hAGGRECAN-F:TCGAGGACAGCGAGGCC; 
		hAGGRECAN-R: TCGAGGGTGTAGCGTGTAGAGA; 
		hβ-ACTIN-F: TTTGAATGATGAGCCTTCGTCCCC; 
		hβ-ACTIN-R: GGTCTCAAGTCAGTGTACAGGTAAGC; 
		hCOL2-F:TGGACGATCAGGCGAAACC; 
		hCOL2-R:GCTGCGGATGCTCTCAATCT; 
		hSOX9-F:AGCGAACGCACATCAAGAC; 
		hSOX9-R:CTGTAGGCGATCTTGGGG; 
		hCOL10-F: ATGCTGCCACAAATACCCTTT; 
		hCOL10-R: GGTAGTGGGCCTTTTATGCCT.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Diekman, B. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+tissue+engineering+using+differentiated+and+purified+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Cartilage tissue engineering using differentiated and purified induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 109 (47), 19172-19177 (2012).</li>
<li>Park, I. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disease-specific+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Disease-specific induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 134 (5), 877-886 (2008).</li>
<li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+induced+pluripotent+stem+cells+from+human+blood%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Generation of induced pluripotent stem cells from human blood.</a> Blood. 113 (22), 5476-5479 (2009).</li>
<li>Zhang, X. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Genomics+Proteomics+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cellular reprogramming of human peripheral blood cells.</a> Genomics Proteomics Bioinformatics. 11 (5), 264-274 (2013).</li>
<li>Li, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+blood+cells+into+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+new+cell+source+for+cartilage+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of blood cells into induced pluripotent stem cells as a new cell source for cartilage repair.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (31), (2016).</li>
<li>Canene-Adams, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+formalin-fixed+paraffin-embedded+tissue+for+immunohistochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Preparation of formalin-fixed paraffin-embedded tissue for immunohistochemistry.</a> Methods Enzymol. 533, 225-233 (2013).</li>
<li>Solchaga, L. A., Penick, K. J., Welter, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+bone+marrow-derived+mesenchymal+stem+cells%3A+tips+and+tricks%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: tips and tricks.</a> Methods Mol Biol. 698, 253-278 (2011).</li>
<li>Oldershaw, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+toward+chondrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells toward chondrocytes.</a> Nat Biotechnol. 28 (11), 1187-1194 (2010).</li>
<li>Monje, L., Varayoud, J., Luque, E. H., Ramos, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neonatal+exposure+to+bisphenol+A+modifies+the+abundance+of+estrogen+receptor+alpha+transcripts+with+alternative+5%27-untranslated+regions+in+the+female+rat+preoptic+area%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Neonatal exposure to bisphenol A modifies the abundance of estrogen receptor alpha transcripts with alternative 5'-untranslated regions in the female rat preoptic area.</a> J Endocrinol. 194 (1), 201-212 (2007).</li>
<li>Teramura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mesenchymal+progenitor+cells+with+chondrogenic+property+from+mouse-induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Reprogram%22%5BJournal%5D)">Induction of mesenchymal progenitor cells with chondrogenic property from mouse-induced pluripotent stem cells.</a> Cell Reprogram. 12 (3), 249-261 (2010).</li>
<li>Su, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+generation+of+integration-free+ips+cells+from+human+adult+peripheral+blood+using+BCL-XL+together+with+Yamanaka+factors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Efficient generation of integration-free ips cells from human adult peripheral blood using BCL-XL together with Yamanaka factors.</a> PLoS One. 8 (5), e64496(2013).</li>
<li>Carey, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+factor+stoichiometry+influences+the+epigenetic+state+and+biological+properties+of+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming factor stoichiometry influences the epigenetic state and biological properties of induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 9 (6), 588-598 (2011).</li>
<li>Okita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+efficient+nonviral+method+to+generate+integration-free+human-induced+pluripotent+stem+cells+from+cord+blood+and+peripheral+blood+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">An efficient nonviral method to generate integration-free human-induced pluripotent stem cells from cord blood and peripheral blood cells.</a> Stem Cells. 31 (3), 458-466 (2013).</li>
<li>Staerk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reprogramming+of+human+peripheral+blood+cells+to+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Reprogramming of human peripheral blood cells to induced pluripotent stem cells.</a> Cell Stem Cell. 7 (1), 20-24 (2010).</li>
<li>Qu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+pluripotent+stem+cells+in+chondrocyte+co-culture%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human pluripotent stem cells in chondrocyte co-culture.</a> Int J Biochem Cell Biol. 45 (8), 1802-1812 (2013).</li>
<li>Guzzo, R. M., Gibson, J., Xu, R. H., Lee, F. Y., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+differentiation+of+human+iPSC-derived+mesenchymal+stem+cells+to+chondroprogenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Efficient differentiation of human iPSC-derived mesenchymal stem cells to chondroprogenitor cells.</a> J Cell Biochem. 114 (2), 480-490 (2013).</li>
<li>Koyama, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+induced+pluripotent+stem+cells+differentiated+into+chondrogenic+lineage+via+generation+of+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">Human induced pluripotent stem cells differentiated into chondrogenic lineage via generation of mesenchymal progenitor cells.</a> Stem Cells Dev. 22 (1), 102-113 (2013).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+insulin-transferrin-selenium+in+auricular+chondrocyte+proliferation+and+engineered+cartilage+formation+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Role of insulin-transferrin-selenium in auricular chondrocyte proliferation and engineered cartilage formation in vitro.</a> Int J Mol Sci. 15 (1), 1525-1537 (2014).</li>
<li>Guzzo, R. M., Scanlon, V., Sanjay, A., Xu, R. H., Drissi, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+human+cell+type-specific+iPS+cells+with+enhanced+chondrogenic+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Establishment of human cell type-specific iPS cells with enhanced chondrogenic potential.</a> Stem Cell Rev. 10 (6), 820-829 (2014).</li>
<li>Goepfert, C., Slobodianski, A., Schilling, A. F., Adamietz, P., Portner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cartilage+engineering+from+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Biochem+Eng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Cartilage engineering from mesenchymal stem cells.</a> Adv Biochem Eng Biotechnol. 123, 163-200 (2010).</li>
<li>Ingber, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+engineering+and+developmental+biology%3A+going+biomimetic%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Tissue engineering and developmental biology: going biomimetic.</a> Tissue Eng. 12 (12), 3265-3283 (2006).</li>
<li>Yoshida, Y., Yamanaka, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+stem+cell+advances%3A+induced+pluripotent+stem+cells+for+disease+modeling+and+stem+cell-based+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Recent stem cell advances: induced pluripotent stem cells for disease modeling and stem cell-based regeneration.</a> Circulation. 122 (1), 80-87 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W tym miejscu udostępniamy protokół generowania chondrocytów z PBC za pośrednictwem iPSC. Ponieważ PBC są bardziej powszechne i szeroko stosowane w dziedzinie klinicznej, są one przedstawiane jako potencjalna alternatywa dla przeprogramowania. W tym badaniu wektory episomalne (EV) wykorzystano do przeprogramowania PBC na iPSC, zgodnie z metodą ustaloną przez Zhanga i wsp.11. To podejście bez integracji nie obejmuje integracji genotoksyczności związanej z wirusem, która, jak się uważa, ma ...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55722/differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human">Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells</a>.
The corresponding author was updated from:
Yueying Li 
yueyinglee2010@hotmail.com 
Key Laboratory of Genomic and Precision Medicine, Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences
The corresponding author is now listed as:
Tie Liu 
waterkins@163.com 
Department of Orthopedics, Beijing Chao-Yang Hospital, Capital Medical University

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/55722/differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human">Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells</a>.

Erratum: Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

Tkanka chrzęstna ma bardzo słabą zdolność do samonaprawy i regeneracji. W celu przywrócenia funkcji chrząstki i stawów stosuje się różne interwencje chirurgiczne i zabiegi biologiczne, z niezadowalającymi wynikami. Niedawny rozwój technologii komórek macierzystych może zmienić całe pole naprawy chrząstki1. Różne komórki macierzyste były badane jako komórki nasienne, ale ludzkie indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (hiPSC) wydają się być najbardziej obiecującym wyborem, ponieważ mogą dostarczyć wiele typów komórek specyficznych dla pacjenta, nie powodując reakcji odrzucenia2. Co więcej, mogą przezwyciężyć ograniczoną proliferacyjną naturę dorosłych komórek i utrzymać ich zdolności do samoodnawiania się i pluripotencjalne. Co więcej, celowanie genowe może być wykorzystane do zmiany genotypu w celu uzyskania określonych typów chondrocytów.
Fibroblasty były szeroko stosowane do generowania iPSC, ponieważ ich potencjał przeprogramowania również został dobrze zbadany. Jednak nadal istnieją pewne ograniczenia, które należy pokonać, takie jak bolesna biopsja od pacjentów i potrzeba ekspansji fibroblastów in vitro, co może skutkować mutacjami genów3. Ostatnio stwierdzono, że PBC są korzystne do przeprogramowania4; Co więcej, były one powszechnie wykorzystywane i obficie przechowywane. Możliwe, że mogą one przekierować uwagę badania ze skóry. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, istnieje niewiele doniesień na temat przeprogramowania PBC, a następnie różnicowania w chondrocyty.
W obecnym badaniu wykorzystujemy PBC jako alternatywne źródło, przeprogramowując je na iPSC, a następnie różnicując iPSC do linii chondrogenicznej poprzez system hodowli granulek, aby naśladować tworzenie chondrocytów.

<table><tbody><tr><td>Knockout DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>10829018</td><td>Pożywka bazowa stosowana do hodowli hiPSC i pożywki do tworzenia EB</td></tr><tr><td>Wymiana surowicy nokautującej (KSR)</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>Bardziej zdefiniowany, wolny od FBS suplement diety stosowany do hodowli hiPSC i pożywki do tworzenia EB</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (FBS)</td><td>Hyclon</td><td>sh30070.03</td><td>Stosowany do hodowli hiPSC i pożywki do tworzenia EB, oferuje doskonałą wartość dla komórek kultura</td></tr><tr><td>Aminokwasy endogenne</td><td>Chemicon</td><td>TMS-001-C</td><td>Stosowany jako suplement wzrostu we wszystkich pożywkach do hodowli komórkowych, w celu zwiększenia wzrostu i żywotności komórek</td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Invitrogen</td><td>TMS-002-C</td><td>Aminokwas niezbędny do hodowli komórkowej</td></tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)</td><td>Peprotech</td><td>100-18B</td><td>Cytokina stosowana do podtrzymania pluripotencji i samoodnawiania hiPSC</td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Invitrogen</td><td>17105041</td><td>Używany do dysocjacji hiPSC dla subkultury</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>C11960</td><td>Pożywka podstawowa używana do pożywki hodowlanej MSC</td></tr><tr><td>0,1% żelatyny</td><td>Milipore</td><td>ES-006-B</td><td>Używany do przyłączania komórek do szalek</td></tr><tr><td>0,25% trypsyna/EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200072</td><td>Używany do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190250</td><td>Zbilansowany roztwór soli stosowany do przemywania komórek lub odczynnika do przygotowania</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu</td><td>invitrogen</td><td>21985023</td><td>Stosowany jako suplement wzrostu we wszystkich pożywkach do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>ITS</td><td>invitrogen</td><td>41400045</td><td>Insulina, Transferyna, Roztwór selenu.Służy do różnicowania chondrogennego.</td></tr><tr><td>Kwas askorbinowy</td><td>Sigma</td><td>4403</td><td>Znany jako witamina C. Pomaga w aktywnym wzroście i ma właściwości przeciwutleniające.</td></tr><tr><td>Pirogronian sodu</td><td>Gibco</td><td>11360070</td><td>Dodawany do pożywki do hodowli komórkowych jako źródło energii oprócz glukozy.</td></tr><tr><td>Transformujący czynnik wzrostu-beta 1</td><td>Peprotech</td><td>AF-100-21C</td><td>Cytokina, która reguluje proliferację, wzrost i różnicowanie chondrogenne komórek.</td></tr><tr><td>Królicze przeciwciała poliklonalne przeciwko Collagen II</td><td>Abcam</td><td>ab34712</td><td>To przeciwciało reaguje z kolagenami typu II, które są specyficzne dla tkanek chrzęstnych.</td></tr><tr><td>Mysie przeciwciała monoklonalne przeciwko Collagen X</td><td>Abcam</td><td>ab49945</td><td>To przeciwciało reaguje z kolagenem typu X, który jest produktem hipertroficznych chondrotocytów.</td></tr><tr><td>Permount</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-100</td><td>Do montażu i długotrwałego przechowywania szkiełek</td></tr><tr><td>Toluidyna niebieska</td><td>Sigma</td><td>89640</td><td>Służy do wykrywania proteoglikanów.</td></tr><tr><td>Błękit alcyjski</td><td>Amresco</td><td>#0298</td><td>Służy do wykrywania glukozaminoglikanów.</td></tr><tr><td>Papaina</td><td>Sigma</td><td>P4762-25MG</td><td>Służy do trawienia granulek chondrogennych.</td></tr><tr><td>Błękit dimetylometylenowy</td><td>Sigma</td><td>341088-1G</td><td>Służy do ilościowego oznaczania glikozaminoglyanów</td></tr><tr><td>Sól sodowa siarczanu chondroityny z chrząstki rekina</td><td>Sigma</td><td>C4384-250MG</td><td>Służy do rysowania standardowej krzywej do pomiaru zawartości sGAG.</td></tr><tr><td>Zestaw do oznaczania zawartości DNA Qubit dsDNA HS</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851 (100)</td><td>Służy do oznaczania zawartości DNA</td></tr><tr><td>TRIzol</td><td>Invitrogen</td><td>15596018</td><td>Służy do izolacji RNA z komórek</td></tr><tr><td>System odwrotnej transkryptazy</td><td>Promega</td><td>A3500</td><td>Służy do konwersji RNA do cDNA</td></tr><tr><td>SYBR FAST qPCR kit Master Mix</td><td>Kapa</td><td>KK4601</td><td>Używany do PCR w czasie rzeczywistym</td></tr></tbody></table>

różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

W tym badaniu użyliśmy komórek krwi obwodowej (PBC) jako komórek nasiennych do produkcji chondrocytów za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) w sposób wolny od integracji. Po utworzeniu ciała zarodkowego (EB) i ekspansji komórek fibroblastycznych, iPSC są indukowane do różnicowania chondrogennego przez 21 dni w warunkach wolnych od surowicy i ksenoizolacji. Po indukcji chondrocytów fenotypy komórek są oceniane za pomocą analiz morfologicznych, immunohistochemicznych i biochemicznych, a także ilościowego badania PCR w czasie rzeczywistym markerów różnicowania chondrogennego. Granulki chondrogenne wykazują dodatnie zabarwienie błękitem alcyjnym i błękitem toluidynowym. Immunohistochemia barwienia kolagenem II i X jest również pozytywna. Zawartość siarczanowanych glikozaminoglikanu (sGAG) i chondrogenne markery różnicowania COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9 i AGGRECAN są znacznie podwyższone w granulkach chondrogennych w porównaniu z hiPSC i komórkami fibroblastycznymi. Wyniki te sugerują, że PBC mogą być wykorzystywane jako komórki nasienne do generowania iPSC do naprawy chrząstki, co jest specyficzne dla pacjenta i opłacalne.

Różnicowanie chondrogenne hiPSC:
Do różnicowania hiPSC w kierunku linii mezenchymalnej wykorzystano pożywkę do tworzenia ciał embroidalnych (EB) oraz podstawową pożywkę hodowlaną. Zastosowano wieloetapową metodę hodowli (Rysunek 1). W pierwszym etapie hiPSC poddano spontanicznemu różnicowaniu poprzez tworzenie EB przez 10 dni (D10; Rysunek 2A). W drugim etapie komórki wyra...

Przedstawiamy protokół generowania linii chondrogennej z ludzkiej krwi obwodowej (PB) za pomocą indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) przy użyciu metody bez integracji, która obejmuje tworzenie ciała zarodkowego (EB), ekspansję komórek fibroblastycznych i indukcję chondrogeneczną.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest generowanie komórek linii chondrogennej z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej, czyli komórek IPS. Metoda ta może pomóc w uzyskaniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracji chrząstki dotyczące wykorzystania pochodzących od pacjenta komórek krwi obwodowej jako komórek źródłowych do generowania komórek IPS w celu naprawy chrząstki. Głównymi zaletami tej techniki są łatwa reprodukowalność oraz fakt, że różnicowanie chondrocytów zachodzi w warunkach wolnych od surowicy i składników pochodzenia ksenogenicznego.Zacznij od wysiania ludzkich komórek iPS w 4 ml pożywki do ludzkich iPSC na 60 mm szalkę do hodowli tkanek zawierającą monowarstwę napromieniowanych mysich embrionalnych fibroblastów jako komórek karmicielskich. Hoduj komórki w temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO₂. Gdy komórki macierzyste osiągną 80 do 90% konfluencji, zdysocjuj je za pomocą roztworu Dispase w celu subkultury.Po dwóch do trzech pasażach, używając szklanej igły wyciąganej nad ogniem, podziel kolonię niezróżnicowanych iPSC o konfluencji od 80 do 90% na mniejsze fragmenty, a następnie przenieś nie więcej n

differentiating-chondrocytes-from-peripheral-blood-derived-human

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

Stres mechaniczny może indukować chondrogenne różnicowanie komórek macierzystych, dostarczając potencjalnego podejścia terapeutycznego do naprawy uszkodzonej chrząstki. Przedstawiamy protokół indukowania chondrogennego różnicowania komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ASC) za pomocą grawitacji odśrodkowej (CG). Indukowana przez CG regulacja w górę SOX9 powoduje rozwój fenotypów chondrogennych.

Indukcja różnicowania chondrogennego komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej przez grawitację odśrodkową

Tutaj prezentujemy protokoły hodowli ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC), używane do różnicowania hPSC na hematopoetyczne komórki progenitorowe CD34+. Metoda ta wykorzystuje specyficzną dla etapu manipulację kanoniczną sygnalizacją WNT w celu określenia komórek wyłącznie do ostatecznego lub pierwotnego programu krwiotwórczego.

Ukierunkowane różnicowanie pierwotnych i ostatecznych progenitorów hematopoetycznych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Tutaj proponujemy protokół chondrogenicznego różnicowania od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej.

Tworzenie chondrogennych osadów z pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi pępowinowej

Proponujemy protokół, który pokazuje, jak różnicować indukowane pluripotencjalne keratynocyty i fibroblasty pochodzące z komórek macierzystych oraz generować organoid skóry 3D, używając tych keratynocytów i fibroblastów. Protokół ten zawiera dodatkowy krok generowania humanizowanego modelu myszy. Przedstawiona tutaj technika usprawni badania dermatologiczne.

Generowanie organoidu 3D skóry z pluripotencjalnych komórek macierzystych indukowanych krwią pępowinową

Prezentowany tutaj jest prosty protokół do bezpośredniego różnicowania hemogennych komórek śródbłonka od ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w ciągu około 1 tygodnia.

Ukierunkowane różnicowanie hemogennych komórek śródbłonka z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół opisuje i porównuje dwie reprezentatywne metody różnicowania hiPSC na mezenchymalne komórki zrębu (MSC). Metoda jednowarstwowa charakteryzuje się niższym kosztem, prostszą obsługą i łatwiejszym różnicowaniem osteogennym. Metoda ciał zarodkowych (EBs) charakteryzuje się mniejszym zużyciem czasu.

Porównanie dwóch reprezentatywnych metod różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych w mezenchymalne komórki zrębu

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ten protokół szczegółowo opisuje izolację chondrocytów, chondroprogenitorów pochodzących z testu adhezji fibronektyny (FAA-CPs) i migrujących chondroprogenitorów (MCP) z ludzkiej chrząstki stawowej. Obejmuje trawienie enzymatyczne, adhezję fibronektyny i testy oparte na migracji w celu wyizolowania i scharakteryzowania tych komórek.

Izolacja chondrocytów i chondroprogenitorów za pomocą adhezji fibronektyny i testu migracyjnego

To badanie opisuje metodę wytwarzania sferoid chondrocytarnych poprzez agregację komórek w sferoidy w warunkach niskiej adhezji przy użyciu grawitacji, a następnie hodowlę powstałych sferoid w mini-bioreaktorach.

Generowanie sferoid z różnych chondrocytów przy użyciu warunków niskiej przyczepności w warunkach grawitacyjnych i domowych mini-bioreaktorów

Poznaj protokół różnicowania chondrocytów z iPSC pochodzących z krwi obwodowej w warunkach wolnych od surowicy i ksenogenicznych. Ta metoda oferuje odtwarzalne, ekonomiczne podejście do pacjentospecyficznej regeneracji chrząstki.

Różnicowanie chondrocytów od pluripotencjalnych komórek macierzystych pochodzących z krwi obwodowej pochodzących od człowieka

Przeglądaj więcej filmów