Ogólnoustrojowe dostarczanie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego serotypu 9 wirusa związanego z adenowirusem w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych u gryzoni
10 sierpnia 2018
Tutaj opisujemy dostarczanie mikroRNA za pomocą rekombinowanego wirusa związanego z adenowirusem serotypu 9 w mysim modelu choroby nerwowo-mięśniowej. Pojedyncze podanie obwodowe myszom spowodowało trwałą nadekspresję miRNA w neuronach mięśniowych i ruchowych, co dało możliwość zbadania funkcji miRNA i potencjału terapeutycznego in vivo.
Ogólnym celem tej metody jest wybranie i dostarczenie mikroRNA przy użyciu rekombinowanego wektora wirusa związanego z adenowirusem. Następnie dostarcz go do mięśni szkieletowych i neuronów ruchowych myszy i aby ocenić ich skuteczność w łagodzeniu fenotypów choroby. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na ważne pytanie, czy strategia wyciszania oparta na mikroRNA może być stosowana w leczeniu schorzeń nerwowo-mięśniowych.
Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie wirusa serotypu 9 związanego z adenowirusem do dostarczania mikroRNA poprzez krążenie ogólnoustrojowe do rdzenia kręgowego i mięśni szkieletowych myszy, w celu bezpośredniego wyciszenia docelowego genu choroby. Podziel plazmid AAV-microRNA na 100 do 200 mikrolitrów podwielokrotności zawierających miano wirusa od dziesięciu do stu bilionów genomów na mililitr. Następnie załadować jedną porcję do strzykawki i przymocować igłę o rozmiarze od 27 do 30.
Teraz, używając standardowego ogranicznika myszy, zabezpiecz mysz tak, aby jej ogon był odsłonięty. Następnie oczyść ogon 70% alkoholem i umieść ciepłą podkładkę pod ogonem na około 30 sekund, aby zwiększyć rozszerzenie naczyń krwionośnych. Teraz, w dystalnej części ogona, włóż igłę do żyły ogonowej skosem do góry i pod płytkim kątem, około 15 stopni.
Następnie wstrzyknij wirusa i odczekaj kilka sekund przed usunięciem igły. Po wyjęciu igły należy zastosować umiarkowany ucisk dwoma palcami, aby zatamować krwawienie. Następnie wróć zwierzę do jego domowej klatki.
Podczas iniekcji żyły ogonowej nierzadko można zauważyć błysk krwi w piaście igły. Podczas wstrzykiwania nie powinno być oporu. Jeśli ogon zacznie blednąć i puchnąć, wyjmij igłę i spróbuj ponownie proksymalnie do poprzedniego miejsca wejścia.
W przypadku tych testów myszy powinny być starsze niż cztery tygodnie i należy pamiętać o zebraniu podstawowej miary przed leczeniem. W pomieszczeniu testowym powinno być cicho i ciemno bez zakłóceń. Przynieś myszy do pokoju co najmniej 30 minut przed przeprowadzeniem jakichkolwiek testów.
Nie należy przeszkadzać zwierzętom w tym okresie aklimatyzacji. Zacznij od testu wiszącego drutu. Podnieś mysz za ogon i umieść ją na środku siatki drucianej.
Następnie podnieś siatkę o 15 do 20 cali i powoli odwróć ekran, aby dać myszy czas na dostosowanie uchwytu. Gdy siatka zostanie całkowicie odwrócona, uruchom stoper i nagraj czas do upadku. Pozwól myszy na 60 sekund zawiesić się, jeśli upadnie wcześniej, wróć do siatki i powtórz procedurę.
Jeśli mysz zawiesi się na pełne 60 sekund, zarejestruj 60 sekund dla wyniku i wróć do klatki. Pozwól każdej myszy na trzy próby ręki 60 sekund. W przeciwnym razie uzyskaj najdłuższy czas zawieszenia.
Po eutanazji myszy należy pobrać rdzeń kręgowy, a następnie mięsień czworogłowy, mięsień szkieletowy. Aby zatrzasnąć pobrane tkanki, napełnij do połowy miskę ze stali nierdzewnej 2-metylobutanem i zanurz dolną ćwiartkę miski w ciekłym azocie. Odczekaj dwie minuty, zanim przejdziesz dalej.
Po kilku minutach przenieść próbkę do 2-metylobutanu. Gdy próbka zmieni kolor na biały, natychmiast przenieś ją do pojemnika zanurzonego w suchym lodzie. Później przechowuj próbkę w temperaturze 80 stopni Celsjusza.
W celu analizy biochemicznej i kwantyfikacji mikroRNA umieść pobraną tkankę w kriowiale i zamroź ją w ciekłym azocie. Następnie przechowuj go w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Myszom SBMA wstrzyknięto sto bilionów genomów AAV microR-298 w wieku pięciu tygodni.
Myszy SBMA są nosicielami transgenu ludzkiego receptora androgenowego z nieprawidłowo rozszerzonym traktem poliglutaminy. Po dziesięciu tygodniach zwykle pojawiają się u nich objawy choroby nerwowo-mięśniowej. Odcinek lędźwiowy, rdzeń kręgowy i mięsień czworogłowy uda pobrano w kilku punktach czasowych po leczeniu w celu analizy.
Ilościowy RT-PCR wykazał, że ekspresja mikro-R298 osiągnęła szczyt w mięśniach szkieletowych po ośmiu tygodniach, a ekspresja osiągnęła szczyt w rdzeniu kręgowym po 12 tygodniach. Dziesięć tygodni po wstrzyknięciu GFP wykryto w obu tkankach. A ekspresja GFP współzlokalizowana z markerem neuronu ruchowego acetylotransferazą choliny.
W eksperymencie kontrolnym myszom losowo wstrzyknięto wirusa lub nośnik w wieku siedmiu tygodni, a następnie zważono i oznaczono behawioralnie co tydzień, do 40 tygodnia życia. Dziesięć tygodni po wstrzyknięciu leczone myszy zaczęły przybierać na wadze i zaczęły wykazywać poprawę sprawności motorycznej. Ilościowy PCR w czasie rzeczywistym wykazał, że leczenie obniża poziom transkryptu AR w dotkniętych tkankach.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak dostarczyć mikroRNA za pomocą rekombinowanego wektora wirusa związanego z Adeno poprzez wstrzyknięcie próżnego ogona. I jak wykonywać testy behawioralne, które mogą pomóc w ocenie skuteczności dostarczonego mikroRNA w łagodzeniu atrofii i osłabienia kończyn dolnych u myszy. Implikacje tej techniki rozciągają się na podejścia terapii genowej, ponieważ bezpieczna i skuteczna terapia genowa wymaga docelowego transferu terapeutycznego transgenu specyficznego dla tkanek.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zdaliśmy sobie sprawę, że choroba spowodowana toksycznym wzmocnieniem mechanizmów funkcjonalnych, takich jak SBMA, skorzysta na nadekspresji naturalnie występujących mikroRNA, które są ukierunkowane na naprawę transkryptu choroby w trzech liczbach pierwotnych.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia metodę dostarczania mikroRNA (miRNA) przy użyciu wektora rekombinowanego wirusa towarzyszącego adenowirusom (rAAV) w celu ukierunkowania na mięśnie szkieletowe i motoneurony w modelu mysim zaniku mięśni rdzeniowych i opuszkowych (SBMA). Podejście to ma na celu ocenę skuteczności wyciszania genów za pośrednictwem miRNA w łagodzeniu fenotypów chorób nerwowo-mięśniowych, co ma istotne znaczenie dla terapii genowej w zaburzeniach typu toksycznego wzmocnienia funkcji.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Terapia genowa
- Badania nad chorobami nerwowo-mięśniowymi
- Neuronauka molekularna
Wprowadzenie
- Interferencja RNA poprzez endogenne ścieżki miRNA reguluje ekspresję genów potranskrypcyjnie.
- Regulacja genów za pośrednictwem miRNA jest obiecującą strategią terapeutyczną w przypadku schorzeń neurologicznych spowodowanych toksycznymi mutacjami typu gain-of-function.
- Efektywne dostarczanie terapeutycznych miRNA do tkanek docelowych pozostaje istotnym wyzwaniem.
- SBMA jest chorobą nerwowo-mięśniową spowodowaną ekspansją poliglutaminy w genie receptora androgenowego (AR).
Cel badania
- Aby sprawdzić, czy nadekspresja nowo zidentyfikowanego miRNA celującego w AR (miR-298) może złagodzić fenotypy choroby u myszy z SBMA.
- Aby ocenić wydajność systematycznego dostarczania miR-298 przy użyciu wektorów rAAV9.
- Aby ocenić wpływ miR-298 na poziomy transkrypcji AR oraz funkcję nerwowo-mięśniową.
Zastosowane metody
- Przygotowanie wektorów rAAV9 kodujących miR-298, podzielonych na porcje do iniekcji.
- Podanie systemowe poprzez wstrzyknięcie do ogonowej żyły u myszy z SBMA przy użyciu igły o rozmiarze 27–30 G.
- Ocena behawioralna z wykorzystaniem testu zawieszenia na drucie w celu oceny funkcji motorycznych.
- Pobieranie tkanek (rdzeń kręgowy i mięsień czworogłowy uda) do analizy biochemicznej i ilościowego oznaczenia miRNA za pomocą ilościowej RT-PCR.
- Immunofluorescencja w celu wykrycia ekspresji GFP i ko-lokalizacji z markerami neuronów ruchowych.
Główne wyniki
- Iniekcja rAAV9-miR-298 do żyły ogonowej doprowadziła do trwałej i rozległej nadekspresji miR-298 w mięśniach szkieletowych i neuronach ruchowych.
- Ekspresja miR-298 osiągnęła szczyt w mięśniach szkieletowych w 8. tygodniu, a w rdzeniu kręgowym w 12. tygodniu po iniekcji.
- Reporter GFP potwierdził skuteczną transdukcję oraz kolokalizację z markerami neuronów ruchowych.
- Myszom SBMA poddane leczeniu zaobserwowano poprawę przyrostu masy ciała oraz sprawności motorycznej w porównaniu z grupą kontrolną.
- Ilościwa RT-PCR wykazała obniżenie poziomów transkrypcyjnych AR w dotkniętych tkankach po zastosowaniu leczenia.
Wnioski
- Systemiczna dostawa miR-298 za pomocą rAAV9 jest skuteczna w celowaniu w mięśnie szkieletowe i motoneurony u myszy z modelem SBMA.
- Nadekspresja miR-298 łagodzi fenotypy nerwowo-mięśniowe i obniża poziomy patogennych transkryptów AR.
- Podejście to wykazuje potencjał strategii wyciszania genów opartych na miRNA w leczeniu chorób nerwowo-mięśniowych wywołanych toksycznymi mutacjami typu gain-of-function.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Systemiczne dostarczanie miRNA przy użyciu wektorów rAAV9 umożliwia ukierunkowane wyciszanie genów w tkankach nerwowo-mięśniowych, rozwiązując kluczowy problem w terapeutycznej interferencji RNA w przypadku schorzeń z toksycznym nabyciem funkcji. Podejście to zwiększa pewność prognostyczną w zakresie angażowania celu i pomiaru wyników funkcjonalnych, co bezpośrednio wpływa na decyzje w fazie wczesnego odkrywania oraz w procesach translacyjnych. Zdolność tej metody do osiągania trwałej, tkankowo specyficznej modulacji genów chorobowych sprawia, że stanowi ona platformę wielokrotnego użytku dla innowacji w terapii genowej w ramach portfolio chorób nerwowo-mięśniowych.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Umożliwia bezpośrednią analizę funkcji genu związanego z chorobą poprzez wyciszanie za pośrednictwem miRNA in vivo.
- Wspiera ograniczanie ryzyka biologicznego poprzez wykazanie oddziaływania na cel w odpowiednich tkankach.
- Zwiększa pewność predykcyjną podczas testowania hipotez terapeutycznych w zaburzeniach nerwowo-mięśniowych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Przygotowuje zwalidowane modele zwierzęce do dalszych analiz behawioralnych i molekularnych.
- Standaryzuje podawanie i kwantyfikację czynników wyciszających geny w obrębie kohort.
- Umożliwia powtarzalny pomiar funkcji motorycznych oraz redukcji transkrypcji jako wyników ilościowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Jest zgodne z modelami istotnymi dla przebiegu choroby w celu opracowania biomarkerów translacyjnych.
- Zapewnia ciągłość od odkryć mechanistycznych do oceny skuteczności przedklinicznej.
- Wspiera postępy skorygowane o ryzyko poprzez powiązanie punktów końcowych molekularnych i funkcjonalnych.
Integracja potoku i przepływu pracy
Ta metoda systematycznego dostarczania miRNA łączy wczesną fazę odkrywania, walidację celu oraz ocenę skuteczności przedklinicznej w modelach chorób nerwowo-mięśniowych.
- Biologia odkrywcza: Prezentuje testowanie hipotez in vivo oraz wyjaśnianie szlaków sygnałowych dla celów z toksyczną funkcją uzyskaną.
- Przesiew: Ustanawia gotowość i powtarzalność testów dla punktów końcowych behawioralnych i molekularnych.
- Analityka: Zapewnia ilościowe odczyty RT-PCR i behawioralne do porównań między różnymi warunkami.
- Badania translacyjne: Łączy skuteczność wyciszania genów z poprawą funkcjonalną w układach istotnych dla danej jednostki chorobowej.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Oferuje skalowalną platformę do oceny dodatkowych kandydatów miRNA lub celów chorobowych.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną i redukuje niejednoznaczność mechanistyczną w strategiach terapii genowej.
- Wartość operacyjna: Zapewnia standaryzowaną, skalowalną i powtarzalną modulację genów in vivo.
- Wartość strategiczna: Umożliwia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) oraz zwiększa efektywność kapitałową poprzez powiązanie wyników molekularnych z fenotypowymi.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację kandydatów do terapii genowej w wskazaniach neuromięśniowych z uwzględnieniem poziomu ryzyka.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza specjalistyczna w zakresie przygotowania wektorów wirusowych oraz technik dostarczania in vivo.
- Niezbędny jest dostęp do infrastruktury służącej do ilościowych analiz molekularnych i testów behawioralnych.
- Konieczna jest standaryzacja protokołów wstrzykiwania, pobierania tkanek i analizy pomiędzy zespołami.
- Możliwe może być dostosowanie procedury do różnych sekwencji miRNA lub modeli chorobowych.
- Ograniczenia praktyczne obejmują dawkowanie wektora, specyficzność tkankową oraz monitorowanie długoterminowej ekspresji.
