Minimalnie inwazyjne osadzanie mięśni (MIME) - nowatorska technika eksperymentalna ułatwiająca miogenezę za pośrednictwem komórek dawcy

Ogólnym celem tej techniki jest wszczepienie niewielkiego segmentu tkanki mięśniowej dawcy do mięśnia biorcy, aby pobudzić miodogenezę zapośredniczoną przez komórki dawcy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie regeneracyjnej biologii mięśni, takie jak to, czy tkanka mięśniowa pobrana po śmierci może promować miodogenezę zapośredniczoną przez komórki dawcy w mięśniu biorcy. Główną zaletą tej techniki jest to, że jest ona małoinwazyjna.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię nieśmiertelnych dystrofii mięśniowych, ponieważ połączenie implantacji mięśniowej, ćwiczeń i immunoterapii może pozwolić na odnowienie potencjału regeneracyjnego niektórych dotkniętych chorobą mięśni. Jako fizjoterapeuta i inżynier biomedyczny uważam, że małoinwazyjny charakter procedury MIME jest kluczowy, ponieważ dostarcza ona źródła komórek miogennych wraz z naturalnym rusztowaniem tkankowym, nie zakłócając nadmiernie struktury i funkcji mięśni gospodarza. Procedurę zademonstruje pani Morium Begam, asystentka badawcza w moim laboratorium.

Na początek poddać eutanazji myszy dawców szczepu C57 black six w wieku od 12 do 16 tygodni, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Za pomocą nożyczek chirurgicznych rozciąć skórę na przedniej powierzchni kończyny tylnej. Po zlokalizowaniu mięśnia TA (mięśnia piszczelowego przedniego), usunąć go, aby odsłonić mięsień EDL (mięsień prostownik długi palców) znajdujący się za mięśniem TA.

Wsuń końcówkę pęsety za mięsień i delikatnie pociągnij, aby sprawdzić, czy palce u nogi prostują się, co potwierdzi, że jest to m. EDL. Po zidentyfikowaniu mięśnia EDL użyj odcinków jedwabnej nici 4-0 o długości około 10 cm, aby zawiązać szwy prowadzące na ścięgnach dystalnych i proksymalnych. Zawiąż dwa podwójne węzły na szwach ścięgien proksymalnych i dystalnych mięśnia.

Przetnij dystalny ścięgno mięśnia prostownika palców długich (EDL) i odchyl mięsień. Następnie przetnij ścięgno proksymalne, aby uwolnić mięsień. Umieść pobrane mięśnie EDL w szalce Petriego wypełnionej roztworem Ringera dla myszy.

Zznieczuj samca myszy gospodarza NSG-GFP w wieku od ośmiu do dziesięciu tygodni, zgodnie z protokołem tekstowym. Nałóż wazelinę na oczy, aby zapobiec ich wysuszeniu. W celu przygotowania skóry nałóż krem do depilacji na przednią część lewej tylnej nogi i pozostaw go na dwie minuty.

Używając chusteczek nasączonych PBS, usuń krem depilacyjny wraz z sierścią. Aby oczyścić skórę, stosuj naprzemiennie szorowanie trzema chusteczkami z roztworem powidon-jodu i 70% etanolem. Aby stworzyć kanał dla igły w mięśniu TA gospodarza, wprowadź igłę chirurgiczną przez środek mięśnia, wzdłuż jego długiej osi.

Należy wprowadzić igłę w kierunku głowowo-ogonowym, wzdłuż mięśnia TA i przez środek jego brzuszca. Po wprowadzeniu igły, przełożyć nici prowadzące z jednego końca tkanki dawcy przez światło igły chirurgicznej w kierunku ogonowo-głowowym. Wycofać igłę z mięśnia biorcy w kierunku ogonowo-głowowym, aby przeprowadzić tkankę dawcy przez kanał po igle.

Właściwie umieść tkankę mięśnia EDL dawcy wewnątrz mięśnia TA biorcy, wykorzystując szwy prowadzące na końcach guzowym i głowowym mięśnia dawcy. Po osadzeniu tkanki dawcy przetnij szwy prowadzące i dokonaj ewentualnych korekt za pomocą pęsety z cienkimi końcówkami. Na koniec zamknij rany po igłach w tkance mięśniowej, zamykając wcięcie rany pęsetą i nakładając weterynaryjny klej tkankowy za pomocą końcówki igły chirurgicznej o rozmiarze 27 G.

Po MIME wstrzyknij od 50 do 60 µL 1,2% chlorku baru do mięśnia TA gospodarza w trzech miejscach wzdłuż długości mięśnia: w proksymalnej, środkowej i dystalnej jednej trzeciej brzuszca mięśnia. Po wstrzyknięciu oczyść nogę myszy gospodarza etanolem i zabezpiecz skórę, nakładając cienką warstwę wazeliny. Umieść mysz w pojedynczej klatce rekonwalescencyjnej bez ściółki.

Pod połową klatki należy umieścić izotermiczny żelowy podkład grzewczy, aby zapewnić wsparcie termiczne myszy gospodarza, umożliwiając jej jednocześnie przeniesienie się na nieogrzewaną połowę. Po pełnym powrocie do sprawności mysz należy przenieść do pierwotnej klatki. Za pomocą nożyczek chirurgicznych należy rozciąć skórę na przedniej powierzchni nogi.

Po zlokalizowaniu mięśnia TA należy przeciąć jego ścięgno dystalne i odsunąć mięsień. Następnie należy przeciąć ścięgno proksymalne, aby uwolnić mięsień TA. Należy pobrać oba mięśnie TA: lewy (poddany działaniu czynnika) oraz prawy (kontrolny).

Zważ pobrane mięśnie, kładąc je na papierze wagowym i wadze analitycznej. W celu krioprotekcji zanurz mięśnie na krótko w oleju mineralnym, a następnie usuń nadmiar oleju za pomocą chłonnej włókniny. Aby gwałtownie zamrozić mięśnie, umieść je na folii aluminiowej i szybko zanurz w naczyniu typu dual flask wypełnionym ciekłym azotem.

Przenieś zamrożone próbki do opisanych fiolek kriogenicznych. Precyzyjne osadzenie tkanki dawcy w mięśniu biorcy jest kluczowe dla sukcesu metody MIME. Po trzech dniach mięsień EDL dawcy pozostaje wszczepiony w mięsień TA biorcy, a na mięśniu biorcy wciąż widoczne są ślady po igle.

Dodatkowo, przekroje poprzeczne mięśni dawcy nie wykazują zielonej fluorescencji, podczas gdy przekroje poprzeczne mięśni biorcy taką wykazują. W przekrojach poprzecznych wszczepionych mięśni widoczna jest wyraźna granica między GFP-dodatnimi włóknami mięśniowymi biorcy a GFP-ujemnymi włóknami mięśniowymi dawcy.

14 dni po zabiegu wszystkie włókna mięśniowe oraz mięśnie nieleczone są pozytywne pod kątem GFP. Nie dotyczy to jednak leczonych mięśni gospodarza. Wykazano, że wiele z tych włókien negatywnych pod kątem GFP jest żywotnych, co potwierdzono czerwonym znakowaniem desminy.

Dowodzi to, że MIME prowadzi do miogenezy pochodzącej z komórek dawcy. W mięśniu TA obecne są chimeryczne włókna mięśniowe. Zostały one wykryte dzięki niskiej lub umiarkowanej fluorescencji, która prawdopodobnie wynika z fuzji miogennych komórek gospodarza i dawcy.

Ich obecność w obrębie całej średnicy mięśnia biorcy sugeruje, że donorowe komórki miogenne mogą migrować wewnątrz mięśnia na odległość kilkuset mikronów. Po opanowaniu tej techniki, jej wykonanie zajmuje od 15 do 20 minut, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia procedury. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat wykorzystania techniki MIME do wszczepienia fragmentu mięśnia donorowego do mięśnia biorcy w celu ułatwienia miogenezy pośredniczonej przez komórki donorowe.

Technika MIME otwiera przed nami możliwość zbadania, czy pośmiertny mięsień ludzki może promować miogenezę zapośredniczoną przez komórki dawcy u myszy biorcy. Pomaga ona również ocenić, czy neuromięśniowa stymulacja elektryczna jest w stanie zwiększyć miogenezę zapośredniczoną przez komórki dawcy. Metodę tę można zastosować również w innych układach, takich jak generowanie modeli zwierzęcych chorób ludzkich poprzez wszczepianie biopsji mięśnia ludzkiego zwierzętom biorcom, a także do testowania, czy mimetyki tkanki mięśniowej zawierające komórki miogenne mogą promować miogenezę.