Technika frakcjonowania optycznego do szacowania liczby komórek w szczurzym modelu terapii elektrowstrząsowej

Ogólnym celem tego stereologicznego badania z wykorzystaniem frakcjonatora optycznego jest uzyskanie informacji ilościowych, takich jak całkowita liczba komórek w określonym obszarze mózgu, przy użyciu metod opartych na bezstronnych zasadach. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu analizy ilościowej, takie jak oszacowanie całkowitej liczby komórek w kompletnej strukturze będącej przedmiotem zainteresowania. Jedną z głównych zalet tej techniki jest to, że zapewnia ona dokładne szacunki ze stałą i z góry określoną precyzją.

Demonstruje tę procedurę Esther Kjaer Needham, która jest współautorką artykułu. Zacznij od utrwalonego i zamrożonego mózgu szczura. Za pomocą skalpela oddziel prawą i lewą półkulę wzdłuż linii środkowej mózgu, a następnie wybierz losowo jedną lub drugą półkulę w pierwszym mózgu.

Następnie systematycznie przemieszczaj się między prawą i lewą półkulą. Następnie za pomocą medium montażowego zamontuj wybraną półkulę na krążku próbki z długą osią prostopadłą do dysku. Gdy półkula jest zamontowana na dysku, umieść rurkę wokół półkuli i napełnij ją Tissue-Tek, aby całkowicie pokryć półkulę.

Następnie umieść ponumerowane pojemniki wielonaczyniowe w kriostacie w celu wstępnego schłodzenia. Następnie zamontuj krążek próbki w kriostacie i przetnij cały hipokamp, zaczynając losowo na odcinki o grubości 80 mikronów w płaszczyźnie koronalnej. Podczas cięcia należy umieścić wszystkie pobrane sekcje kolejno w zimnych pojemnikach wielonaczyniowych, aby upewnić się, że sekcje są utrzymane w kolejności cięcia.

Po podziale całego hipokampa należy całkowicie pokryć skrawki krioprotektantem i utrzymywać pojemniki w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu dalszego użycia. Gdy będziesz gotowy do rozpoczęcia barwienia immunologicznego, pozwól skrawkom osiągnąć temperaturę pokojową. Następnie za pomocą pędzla przenieś co piątą sekcję z serii odcinków hipokampa do 25-dołkowych siatek barwiących umieszczonych na szalkach Petriego wypełnionych PBS.

W każdym hipokampie powinno być od ośmiu do 12 sekcji do barwienia. Przenieść siatki barwiące zawierające skrawki do pasujących szklanych naczyń zawierających PBS i umyć skrawki dwukrotnie przez 10 minut w PBS. Następnie inkubować w 3% nadtlenku wodoru przez 20 minut.

Po umyciu przenieś sekcje do trzech roztworów kwasu solnego. Następnie zneutralizować w 0,1 tetraboranu sodu w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Po trzech 10-minutowych inkubacjach i zmianie buforu do przemywania przenieść skrawki do roztworu blokującego na jedną godzinę w temperaturze pokojowej.

Następnie inkubować skrawki w mysim anty-BrdU rozcieńczonym od 1 do 100 w roztworze blokującym przez 48 godzin w temperaturze czterech stopni Celsjusza. Po inkubacji przeciwciał pierwotnych przemyć trzy razy przez 10 minut w buforze do mycia. Następnie inkubować przez 48 godzin w peroksydazie chrzanowej rozcieńczonej od 1 do 10 w buforze do mycia.

48 godzin później przenieś skrawki do PBS na 10 minut i powtórz w sumie pięć prań. Po umyciu przenieś skrawki do roztworu DAB na siedem minut. Następnie przenieś do roztworu DAB zawierającego 0,02% nadtlenku wodoru na 10 minut.

Po serii myć zamontuj sekcje w kolejności numerycznej na szkiełkach mikroskopowych. Pozostawić do wyschnięcia na około 30 minut. Następnie wysuszyć próbki na powietrzu, umieszczając je w stojaku na szkiełka.

Następnie należy ponownie nawodnić próbki przez 10 minut w naczyniu do barwienia szkiełek zawierających wodę destylowaną. Następnie przenieś szkiełka do 0,02% fioletu krezylowego i wody destylowanej na 15 minut. Po powtórzeniu barwienia fioletem krezylowym należy ponownie nawodnić skrawki za pomocą serii etanolu.

Następnie oczyść skrawki z ksylenu dwa razy przez 15 minut za każdym razem. Na koniec dodaj szybkoschnący środek montażowy i nakryj szkiełka. Po 24 godzinach szkiełka można wykorzystać do mikroskopii.

Zacznij od sprawdzenia grubości tkanki, najpierw umieszczając szkiełka na zmotoryzowanym stoliku mikroskopu, a następnie otwierając oprogramowanie stereologii. Określ obszar zainteresowania za pomocą obiektywu o małym powiększeniu, zanim zmienisz obiektyw na 100-krotny zanurzenie w olejku. Następnie wybierz określony punkt w ramce zliczania, na przykład obszar przylegający do narożnika, i zlokalizuj górną część sekcji, przesuwając się wzdłuż płaszczyzny ogniskowej, aż jakiś element sekcji pojawi się w ostrości.

Zarejestruj pozycję Z jako zero. Następnie przesuń płaszczyznę ogniskowej w dół przez tkankę, aż ostatni poziom Z tkanki będzie ostry, a następnie zaznacz tę pozycję. Lokalna grubość tkanki jest definiowana od zera do tego punktu końcowego i może być odczytana na osi Z.

Zarejestruj grubość tkanki. Grubość tkanki jest mierzona w kilku miejscach w obszarze zainteresowania. Wysokość dysektora i stref ochronnych, rozmiar ramki liczącej, długość kroku i końcowe powiększenie są określane w badaniu pilotażowym.

Teraz możesz zacząć liczyć neurony dodatnie Brd-U, zwykle przy końcowym powiększeniu od 2000 do 3000x, używając obiektywu z olejkiem 60x lub 100x z olejkiem i dużą aperturą numeryczną. Zidentyfikuj neurony BrdU-dodatnie w każdej ramce liczenia, ale nie licz tych, które dotykają czerwonej linii wykluczenia. Policz te neurony BrdU-dodatnie, które dotykają zielonej linii inkluzji i te, które mieszczą się w granicach ramki zliczającej.

Neurony Brd-U dodatnie należy liczyć tylko wtedy, gdy cecha będąca przedmiotem zainteresowania jest wyraźnie rozpoznawana na wysokości dyssektora. Pokazane tutaj częściowo widoczne neurony nie są liczone. Ten obraz pokazuje całkowitą liczbę neuronów BrdU-dodatnich w warstwie komórek ziarnistych hipokampa i strefie subziarnistej hipokampa szczura.

Poziome słupki reprezentują wartości średnie. Po stymulacji elektrowstrząsowej następuje natychmiastowy wzrost o 260% w tworzeniu nowych neuronów BrdU-dodatnich w porównaniu z grupą kontrolną leczoną. W tej puli nowo wygenerowanych neuronów występuje 40% zaniku od pierwszego dnia do trzech miesięcy, przy czym prawie 50% nowo powstałych neuronów przeżywa 12 miesięcy po leczeniu.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak oszacować całkowitą liczbę komórek w regionie mózgu za pomocą metod stereologicznych.