Name: Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj analizę superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji. Ta metoda zachowuje fizjologiczną integralność kompleksów podczas izolacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez granty od American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] oraz Strong Children's Research Center na Uniwersytecie w Rochester.

<ol><li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%3A+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li>
<li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li>
<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026783">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li>
<li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li>
<li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li>
<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li>
<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Funkcjonalny ETC jest niezbędny do generowania mitochondrialnego ATP. Kompleksy ETC są zdolne do tworzenia dwóch typów superkompleksów: respirasomy (Cx-I, -III i -IV)1 oraz syntasomy (Cx-V)2. Montaż każdego kompleksu jest wymagany dla nienaruszonego ETC, podczas gdy organizacja ETC w superkompleksy uważa się za zwiększające ogólną wydajność ETC 5,22. Sposób, w jaki te superkompleksy łączą się i demontują, nie jest d...

Energia mitochondrialna w postaci ATP jest nie tylko niezbędna do przetrwania komórki, ale także do regulacji śmierci komórki. Wytwarzanie ATP przez fosforylację oksydacyjną wymaga funkcjonalnego łańcucha transportu elektronów (ETC; Cx-I do IV) i mitochondrialnej syntazy ATP (Cx-V). Ostatnie badania wykazały, że te duże kompleksy białkowe są zorganizowane w superkompleksy, zwane respirasomami i syntasomami1,2. Wyzwaniem jest analiza składania, dynamiki i regulacji aktywności tych masywnych kompleksów i superkompleksów. Podczas gdy pomiary zużycia tlenu wykonane za pomocą elektrody tlenowej i testy enzymatyczne przeprowadzone za pomocą spektrofotometru mogą dostarczyć cennych informacji na temat aktywności kompleksu ETC, testy te nie mogą dostarczyć informacji na temat obecności, wielkości i składu podjednostek zaangażowanego kompleksu białkowego lub superkompleksów. Jednak rozwój niebieskiego i przezroczystego natywnego (odpowiednio BN i CN) PAGE3 stworzył potężne narzędzie do ujawniania ważnych informacji o złożonym składzie i składaniu/demontażu oraz o dynamicznej regulacji supramolekularnej organizacji tych ważnych kompleksów oddechowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych4.
Łączenie tych kompleksów w superkompleksy wyższego rzędu wydaje się regulować strukturę i funkcję mitochondriów5. Na przykład, montaż respirasomu zwiększa efektywność transferu elektronów i generowanie siły napędowej protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną5. Ponadto składanie syntasomów nie tylko zwiększa wydajność produkcji ATP i transfer ekwiwalentów energii do cytoplazmy2, ale także formuje wewnętrzną błonę mitochondriów w rurkowe cristae6,7. Badania nad składaniem nadkompleksów podczas rozwoju serca w zarodkach myszy pokazują, że wytwarzanie superkompleksów zawierających Cx-I w sercu rozpoczyna się około 13,5 dnia embrionalnego8. Inni wykazali, że ilość superkompleksów zawierających Cx-I zmniejsza się w sercu z powodu starzenia się lub urazów niedokrwiennych/reperfuzyjnych9,10 lub może odgrywać rolę w postępie chorób neurodegeneracyjnych11.
Ten protokół opisuje metody dla natywnej strony żelowej, które mogą być użyte do badania montażu i aktywności kompleksów i superkompleksów ETC. Przybliżoną masę cząsteczkową superkompleksów mitochondrialnych można ocenić, rozdzielając kompleksy białkowe w żelach poliakrylamidowych CN lub BN. CN PAGE pozwala również na wizualizację aktywności enzymatycznej wszystkich kompleksów mitochondrialnych bezpośrednio w żelu (testy w żelu; IGA)12. Praca ta wykazuje aktywność respirasomów, podkreślając zdolność Cx-I do utleniania NADH przez IGA oraz obecność syntasomów ze względu na aktywność hydrolizującą ATP Cx-V przez IGA. Istnienie wielu kompleksów i superkompleksów zawierających Cx-I i Cx-V można również wykazać poprzez przeniesienie białek na błony nitrocelulozowe i przeprowadzenie immunoblottingu. Zaletą tego podejścia jest to, że BN lub CN PAGE na ogół rozdzielają kompleksy białkowe na podstawie ich fizjologicznej wielkości i składu; Przeniesienie na membranę zachowuje ten wzór pasm. Analiza kompleksów białkowych w BN lub CN PAGE może być również wykonana za pomocą 2D-PAGE (patrz Fiala i wsp.13 dla demonstracji) lub przez wirowanie gęstości sacharozy14,15. Aby dalej analizować określone prążki, można je wyciąć z BN PAGE, a białka z tego kompleksu białkowego można oczyścić przez elektroelucję w warunkach natywnych. Natywną elektroelucję można przeprowadzić w ciągu kilku godzin, co może mieć znaczący wpływ na bierną dyfuzję (jak zastosowano w Reference 16) białek z żelu do otaczającego buforu.
Podsumowując, te metody opisują kilka podejść, które pozwalają na dalszą charakterystykę superkompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej z błon mitochondrialnych.

<table><tbody><tr><td>Komora do mini-żelu Protean II</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>Kompletny zestaw do nalewania i uruchamiania elektroforezy mini-żelowej</td></tr><tr><td>Protean XL maxi-gel</td><td>Biorad</td><td>1653189</td><td>Kompletny zestaw do nalewania i uruchamiania elektroforezy maxi-gel</td></tr><tr><td>Maszyna do gradientów, Hoefer SG15</td><td>VWR</td><td>95044-704</td><td>Wylewanie gradientów mini-żelu</td></tr><tr><td>Maszyna do gradientów, maxi-gel</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>Nalewanie maxi-żelu gradienty</td></tr><tr><td>Zestaw transferowy</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>Kompletny zestaw do mokrego transferu białek na błony</td></tr><tr><td>Elektroeluter model 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>Elektroelucja białek ze stron natywnych lub SDS</td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>Biorad</td><td>1653308</td><td>Płytki krótkie</td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>Płytki dystansowe</td></tr><tr><td>Płytki</td> <td>szklaneBiorad</td><td>1651823</td><td>Płyty wewnętrzne</td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td>Płyty zewnętrzne</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>Zasilacz odpowiedni do elektroforezy natywnej</td></tr><tr><td>ECL-Western&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>Podłoże chemolumniscense</td></tr><tr><td>SuperSignal-West Dura</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>Ulepszone podłoże chemolumniscencyjne</td></tr><tr><td>Film/film autoradiograficzny</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>28906845</td><td>Dokumentacja Western blot</td></tr><tr><td>Procesor filmowy CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Canon</td><td>PL</td><td>Robienie zdjęć w celu udokumentowania żeli, membran i plam.</td></tr><tr><td>Osłona przeciwsłoneczna Canon Power Shot 640&nbsp;</td>Aparat ekranujący <td>Canon</td><td></td><td>do zdjęć robionych na stole podświetlanym</td></tr><tr><td>Akrylamid/bisakryloamid</td><td>Biorad</td><td>1610148</td><td>40% wstępnie zmieszany roztwór</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Deoksychelat sodu</td><td>Sigma</td><td>D66750</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I15513</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Lauryl Maltoside</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Kwas aminoheksanowy</td><td>Sigma</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>Rodzimy&nbsp; zestaw do masy cząsteczkowej</td><td>GE Opieka zdrowotna&nbsp;</td><td>17-0445-01</td><td>Zestaw do kalibracji wysokocząsteczkowej do elektroforezy natywnej.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Azotan ołowiu(II) (Pb(NO3)2):</td><td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td> Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>anty-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>przeciwciało przeciwko podjednostce syntazy ATP ATP5A</td></tr><tr><td>anty-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>przeciwciało przeciwko podjednostce Cx-1 NDUFB6</td></tr><tr><td>anty-VDAC</td><td>Przeciwciało Calbiochem</td><td>529534</td><td>przeciwko przeciwciału połączonemu z VDAC</td></tr><tr><td>ECL HRP GE</td><td>Health Care</td><td>NA931V</td> przeciwciało <td>wtórne przeciwko ATP5A, NDUFB6 i VDAC</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebra</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC) przekształca energię pochodzącą z rozkładu różnych paliw w bioenergetyczną walutę komórki, ATP. ETC składa się z 5 masywnych kompleksów białkowych, które również łączą się w superkompleksy zwane respirasomami (C-I, C-III i C-IV) i syntasomami (C-V), które zwiększają wydajność transportu elektronów i produkcji ATP. Od ponad 50 lat stosuje się różne metody pomiaru funkcji ETC, ale protokoły te nie dostarczają informacji na temat składania poszczególnych kompleksów i superkompleksów. Protokół ten opisuje technikę natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), metody, która została zmodyfikowana ponad 20 lat temu w celu zbadania złożonej struktury ETC. Natywna elektroforeza pozwala na rozdzielenie kompleksów ETC na ich aktywne formy, a kompleksy te można następnie badać za pomocą immunoblottingu, testów w żelu (IGA) i oczyszczania przez elektroelucję. Łącząc wyniki natywnego żelu PAGE z wynikami innych testów mitochondrialnych, możliwe jest uzyskanie pełniejszego obrazu aktywności ETC, jej dynamicznego składania i demontażu oraz tego, jak reguluje to strukturę i funkcję mitochondriów. W niniejszej pracy omówione zostaną również ograniczenia tych technik. Podsumowując, przedstawiona poniżej technika natywnego PAGE, a następnie immunoblottingu, IGA i elektroelucji, jest potężnym sposobem badania funkcjonalności i składu mitochondrialnych superkompleksów ETC.

Do wizualizacji superkompleksów mitochondrialnych wykorzystano świeżo wyizolowane mitochondria myszy17,18. Superkompleksy mitochondrialne są wrażliwe na powtarzające się cykle zamrażania i rozmrażania, co prowadzi do ich dezintegracji, choć dla niektórych badaczy może być to dopuszczalne. Jeśli przechowywanie w zamrażarce jest konieczne, w celu zapewnienia najlepszych wyników próbki nie powinny zostać poddane więcej niż jednemu cy...

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Ogólnym celem elektroforezy w warunkach natywnych w połączeniu z testami w żelu, immunoblottingiem oraz natywną elektroelucją jest zachowanie i analiza struktury superkompleksów mitochondrialnych. Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu, w jaki sposób kompleksy białkowe mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów łączą się w superkompleksy w zależności od wielu czynników, w tym potrzeb bioenergetycznych oraz warunków fizjologicznych i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że przy prawidłowym wykonaniu integralność fizjologiczna i funkcjonalność superkompleksów mitochondrialnych zostają zachowane podczas długotrwałego procesu izolacji.Metodę tę można również zastosować do badania dynamiki montażu superkompleksów oraz do analizy kompleksów białkowych w błonie plazmatycznej, a także w innych błonach wewnątrzkomórkowych. Podczas przygotowań do analiz w żelu krytycznie ważne jest, aby wszystkie elementy używane do elektroforezy natywnej nie były zanieczyszczone detergentami, ponieważ przyczynią się one do rozpadu mitochondrialnych superkompleksów. Wytnij jedną lub więcej ścieżek z przejrzystego żelu natywnego i przenieś je do opisanego pojemnika.Aby przeprowadzić test kompleksu-1, połącz 10 mililitrów buforu do testu z 25 miligramami nitro błękitu tetrazolium i 100 mikrolitrów NADH o stężeniu 10 miligramów na mililitr. Dodaj tę mieszaninę do wyciętej ścieżki żelu natywnego CN lub obszaru zainteresowania. Obserwuj powstawanie niebieskich prążków po delikatnym mieszaniu na wytrząsarce przez co najmniej trzy minuty.Następnie utrwal żel w 10 do 20 mililitrów roztworu kwasu octowego lub przemyj go w 5 milimolarnym Tris pH 7,4, aby zatrzymać reakcję. Wykonaj zdjęcia do dokumentacji. Aby przeprowadzić analizę complex-5, wytnij żel, ścieżkę lub obszar zainteresowania z żelu blue native lub clear native.Próbkę inkubować przez dwie godziny przy łagodnym mieszaniu w 10 do 20 mililitrów buforu do analizy z dodatkiem plus lub minus 5 µg/mL oligomycyny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zastąpić bufor 14 mililitrami świeżego buforu do analizy. Następnie dodać kolejno 190 µL 1 M siarczanu magnezu, 27,28 mg azotanu ołowiu, 60 mg ATP oraz 75 µL oligomycyny.Inkubować przy delikatnym mieszaniu, obserwując powstawanie białego osadu, ponieważ prążki na żelach traktowanych oligomycyną będą stanowiły prążki niezależne od kompleksu 5. Utwierdzić żel w utrwalaczu na bazie metanolu, ponieważ roztwory kwasowe rozpuszczą osad ołowiu. Wykonać dokumentację fotograficzną wyników, a następnie przeprowadzić transfer białek i immunoblotting zgodnie z opisem w protokole tekstowym.W dniu elektroelucji umieść frytę na dnie każdej szklanej rurki, której będziesz używać. W razie potrzeby zanurz szklaną rurkę w buforze elucyjnym i dociśnij frytę od wewnątrz do dna rurki. Wsuń szklaną rurkę z frytą do modułu urządzenia Electro-Eluter.Zwilż przelotkę buforem elucyjnym i wsuń szklaną rurkę na miejsce. Upewnij się, że górne krawędzie szklanych rurek są zrównane z przelotką. Zamknij puste przelotki za pomocą korków.Następnie umieść wilgotną zatyczkę membranową na dnie silikonowego adaptera i napełnij adapter buforem elucyjnym. Powolnymi ruchami pipetuj bufor w adapterze w górę i w dół, aby usunąć pęcherzyki powietrza wokół membrany dializacyjnej. Wsuń napełniony buforem adapter na dno szklanej rurki.Następnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, które pojawiły się na fricie wewnątrz szklanej rurki. Napełnij każdą szklaną rurkę buforem elucyjnym. Umieść wycięte prążki z BN-PAGE w szklanych rurkach.Podziel duże fragmenty na mniejsze części. Upewnij się, że wysokość wypełnienia w szklanej rurce wynosi około jednego centymetra. Następnie umieść cały moduł w zbiorniku.Do zbiornika należy dodać około 600 mililitrów zimnego buforu elucyjnego. Należy upewnić się, że silikonowe nakładki adapterów są zanurzone w buforze. Przed rozpoczęciem elucji białek przez cztery godziny przy napięciu 350 voltów w pomieszczeniu chłodniczym, na dnie zbiornika należy umieścić mieszadło magnetyczne.Po zakończeniu elucji wyjmij moduł Electro-Eluter ze zbiornika z buforem i umieść go w zlewie lub misce. Jeśli użyto korka, usuń go, aby opróżnić górną komorę buforową. Usuń bufor z każdej szklanej rurki i go zutylizuj.Należy upewnić się, że adapter silikonowy pozostaje na swoim miejscu, a ciecz pod fritem nie jest zaburzona ani wstrząśnięta. Następnie ostrożnie należy usunąć adapter silikonowy wraz z nakładką membranową z dna szklanej rurki. Zawartość nakładki silikonowej należy przenieść pipetą do mikroprobówki.Kolejnymi 200 µL buforu elucyjnego przepłucz silikonową zatyczkę i dodaj go do mikroprobówki. Powtórz ten proces dla wszystkich probówek szklanych. Przechowuj wielorazowe zatyczki z membraną w buforze elucyjnym zawierającym 0,5 mg/mL azotku sodu w warunkach chłodniczych.Superkompleksy z mitochondriów serca są tutaj wizualizowane za pomocą analiz in-gel. Ścieżki żelu clear native są wykorzystywane do analiz in-gel dla kompleksu-1 oraz kompleksu-5. Swoistość sygnału można ocenić, stosując inhibitory, takie jak oligomycyna w przypadku syntazy ATP.Analizy w żelu dostarczają informacji o wielkości kompleksu białkowego z aktywnością kompleksu-1 lub kompleksu-5, ale nie o jego składzie. Nieodbarwiający żel natywny (BN-PAGE) wykazuje prążki kompleksów białkowych, które można wyciąć w celu elektroelucji. Po elektroelucji eluat jest wykorzystywany do dalszych analiz, takich jak testy aktywności w żelu, barwienie srebrem eluowanych białek przy użyciu elektroforezy natywnej lub denaturującej oraz Western blotting.Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można przeprowadzić w ciągu trzech dni. Te trzy dni obejmują izolację mitochondriów, nocną elektroforezę Blue Native w formacie maxi oraz immunoblotting. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować i identyfikować superkompleksy mitochondrialne z wykorzystaniem elektroforezy natywnej, testów w żelu oraz elektroelucji.Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że superkompleksy mitochondrialne są nietrwałe. Należy ograniczyć do minimum liczbę cykli zamrażania i rozmrażania próbek. Elektroforezę natywną oraz elektroelucję należy przeprowadzać na lodzie lub w pomieszczeniu chłodniczym.Znaczenie tych technik wykracza poza określenie składu fizycznego każdego superkompleksu. Ponieważ superkompleksy są utrwalane w ich natywnej formie, możliwe jest przeprowadzenie testów funkcjonalnych. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii mitochondriów do ponownej oceny zrozumienia aktywności mitochondrialnego transportu elektronów oraz jej konsekwencji dla pacjentów z chorobami mitochondrialnymi.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak HPLC, spektrometria mas, mikroskopia elektronowa lub patch clamping, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące składu molekularnego, struktury lub właściwości elektrofizjologicznych wyizolowanych kompleksów białkowych.

analyzing-supercomplexes-mitochondrial-electron-transport-chain-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

W tym filmie demonstrujemy technikę elektroforetyczną, zwaną niebieską natywną STRONĄ, do analizy mitochondrialnych kompleksów białkowych układu oddechowego w ich natywnie złożonym i funkcjonalnie aktywnym stanie. Anionowy niebieski barwnik Coomassie powoduje, że kompleksy białkowe stają się naładowane ujemnie, co umożliwia separację na podstawie wielkości i struktury.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym niebieskim: technika separacji bez denaturacji do analizy nienaruszonych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Poznaj analizę superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji. Ta metoda zachowuje fizjologiczną integralność kompleksów podczas izolacji.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji (Wideo) | JoVE Journal

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Przeglądaj więcej filmów