Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Ogólnym celem elektroforezy w warunkach natywnych w połączeniu z testami w żelu, immunoblottingiem oraz natywną elektroelucją jest zachowanie i analiza struktury superkompleksów mitochondrialnych. Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu, w jaki sposób kompleksy białkowe mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów łączą się w superkompleksy w zależności od wielu czynników, w tym potrzeb bioenergetycznych oraz warunków fizjologicznych i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że przy prawidłowym wykonaniu integralność fizjologiczna i funkcjonalność superkompleksów mitochondrialnych zostają zachowane podczas długotrwałego procesu izolacji.

Metodę tę można również zastosować do badania dynamiki montażu superkompleksów oraz do analizy kompleksów białkowych w błonie plazmatycznej, a także w innych błonach wewnątrzkomórkowych. Podczas przygotowań do analiz w żelu krytycznie ważne jest, aby wszystkie elementy używane do elektroforezy natywnej nie były zanieczyszczone detergentami, ponieważ przyczynią się one do rozpadu mitochondrialnych superkompleksów. Wytnij jedną lub więcej ścieżek z przejrzystego żelu natywnego i przenieś je do opisanego pojemnika.

Aby przeprowadzić test kompleksu-1, połącz 10 mililitrów buforu do testu z 25 miligramami nitro błękitu tetrazolium i 100 mikrolitrów NADH o stężeniu 10 miligramów na mililitr. Dodaj tę mieszaninę do wyciętej ścieżki żelu natywnego CN lub obszaru zainteresowania. Obserwuj powstawanie niebieskich prążków po delikatnym mieszaniu na wytrząsarce przez co najmniej trzy minuty.

Następnie utrwal żel w 10 do 20 mililitrów roztworu kwasu octowego lub przemyj go w 5 milimolarnym Tris pH 7,4, aby zatrzymać reakcję. Wykonaj zdjęcia do dokumentacji. Aby przeprowadzić analizę complex-5, wytnij żel, ścieżkę lub obszar zainteresowania z żelu blue native lub clear native.

Próbkę inkubować przez dwie godziny przy łagodnym mieszaniu w 10 do 20 mililitrów buforu do analizy z dodatkiem plus lub minus 5 µg/mL oligomycyny w temperaturze pokojowej. Po inkubacji zastąpić bufor 14 mililitrami świeżego buforu do analizy. Następnie dodać kolejno 190 µL 1 M siarczanu magnezu, 27,28 mg azotanu ołowiu, 60 mg ATP oraz 75 µL oligomycyny.

Inkubować przy delikatnym mieszaniu, obserwując powstawanie białego osadu, ponieważ prążki na żelach traktowanych oligomycyną będą stanowiły prążki niezależne od kompleksu 5. Utwierdzić żel w utrwalaczu na bazie metanolu, ponieważ roztwory kwasowe rozpuszczą osad ołowiu. Wykonać dokumentację fotograficzną wyników, a następnie przeprowadzić transfer białek i immunoblotting zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

W dniu elektroelucji umieść frytę na dnie każdej szklanej rurki, której będziesz używać. W razie potrzeby zanurz szklaną rurkę w buforze elucyjnym i dociśnij frytę od wewnątrz do dna rurki. Wsuń szklaną rurkę z frytą do modułu urządzenia Electro-Eluter.

Zwilż przelotkę buforem elucyjnym i wsuń szklaną rurkę na miejsce. Upewnij się, że górne krawędzie szklanych rurek są zrównane z przelotką. Zamknij puste przelotki za pomocą korków.

Następnie umieść wilgotną zatyczkę membranową na dnie silikonowego adaptera i napełnij adapter buforem elucyjnym. Powolnymi ruchami pipetuj bufor w adapterze w górę i w dół, aby usunąć pęcherzyki powietrza wokół membrany dializacyjnej. Wsuń napełniony buforem adapter na dno szklanej rurki.

Następnie usuń wszystkie pęcherzyki powietrza, które pojawiły się na fricie wewnątrz szklanej rurki. Napełnij każdą szklaną rurkę buforem elucyjnym. Umieść wycięte prążki z BN-PAGE w szklanych rurkach.

Podziel duże fragmenty na mniejsze części. Upewnij się, że wysokość wypełnienia w szklanej rurce wynosi około jednego centymetra. Następnie umieść cały moduł w zbiorniku.

Do zbiornika należy dodać około 600 mililitrów zimnego buforu elucyjnego. Należy upewnić się, że silikonowe nakładki adapterów są zanurzone w buforze. Przed rozpoczęciem elucji białek przez cztery godziny przy napięciu 350 voltów w pomieszczeniu chłodniczym, na dnie zbiornika należy umieścić mieszadło magnetyczne.

Po zakończeniu elucji wyjmij moduł Electro-Eluter ze zbiornika z buforem i umieść go w zlewie lub misce. Jeśli użyto korka, usuń go, aby opróżnić górną komorę buforową. Usuń bufor z każdej szklanej rurki i go zutylizuj.

Należy upewnić się, że adapter silikonowy pozostaje na swoim miejscu, a ciecz pod fritem nie jest zaburzona ani wstrząśnięta. Następnie ostrożnie należy usunąć adapter silikonowy wraz z nakładką membranową z dna szklanej rurki. Zawartość nakładki silikonowej należy przenieść pipetą do mikroprobówki.

Kolejnymi 200 µL buforu elucyjnego przepłucz silikonową zatyczkę i dodaj go do mikroprobówki. Powtórz ten proces dla wszystkich probówek szklanych. Przechowuj wielorazowe zatyczki z membraną w buforze elucyjnym zawierającym 0,5 mg/mL azotku sodu w warunkach chłodniczych.

Superkompleksy z mitochondriów serca są tutaj wizualizowane za pomocą analiz in-gel. Ścieżki żelu clear native są wykorzystywane do analiz in-gel dla kompleksu-1 oraz kompleksu-5. Swoistość sygnału można ocenić, stosując inhibitory, takie jak oligomycyna w przypadku syntazy ATP.

Analizy w żelu dostarczają informacji o wielkości kompleksu białkowego z aktywnością kompleksu-1 lub kompleksu-5, ale nie o jego składzie. Nieodbarwiający żel natywny (BN-PAGE) wykazuje prążki kompleksów białkowych, które można wyciąć w celu elektroelucji. Po elektroelucji eluat jest wykorzystywany do dalszych analiz, takich jak testy aktywności w żelu, barwienie srebrem eluowanych białek przy użyciu elektroforezy natywnej lub denaturującej oraz Western blotting.

Po opanowaniu techniki, przy prawidłowym wykonaniu, procedurę można przeprowadzić w ciągu trzech dni. Te trzy dni obejmują izolację mitochondriów, nocną elektroforezę Blue Native w formacie maxi oraz immunoblotting. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak izolować i identyfikować superkompleksy mitochondrialne z wykorzystaniem elektroforezy natywnej, testów w żelu oraz elektroelucji.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że superkompleksy mitochondrialne są nietrwałe. Należy ograniczyć do minimum liczbę cykli zamrażania i rozmrażania próbek. Elektroforezę natywną oraz elektroelucję należy przeprowadzać na lodzie lub w pomieszczeniu chłodniczym.

Znaczenie tych technik wykracza poza określenie składu fizycznego każdego superkompleksu. Ponieważ superkompleksy są utrwalane w ich natywnej formie, możliwe jest przeprowadzenie testów funkcjonalnych. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie biologii mitochondriów do ponownej oceny zrozumienia aktywności mitochondrialnego transportu elektronów oraz jej konsekwencji dla pacjentów z chorobami mitochondrialnymi.

Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak HPLC, spektrometria mas, mikroskopia elektronowa lub patch clamping, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące składu molekularnego, struktury lub właściwości elektrofizjologicznych wyizolowanych kompleksów białkowych.