Name: Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj analizę superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji. Ta metoda zachowuje fizjologiczną integralność kompleksów podczas izolacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty od American Heart Association Founder's Affiliate [12GRNT12060233] oraz Strong Children's Research Center na Uniwersytecie w Rochester.

<ol><li>Lenaz, G., Genova, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organisation+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%3A+a+new+challenge+for+the+mechanism+and+control+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Exp+Med+Biol%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organisation of the mitochondrial respiratory chain: a new challenge for the mechanism and control of oxidative phosphorylation.</a> Adv Exp Med Biol. 748, 107-144 (2012).</li>
<li>Saks, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+Energetic+Units+regulate+metabolism+in+cardiac+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Intracellular Energetic Units regulate metabolism in cardiac cells.</a> J Mol Cell Cardiol. 52 (2), 419-436 (2012).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Hahn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+Complete+ATP+Synthase+Dimer+Reveals+the+Molecular+Basis+of+Inner+Mitochondrial+Membrane+Morphology%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+cell%22%5BJournal%5D)">Structure of a Complete ATP Synthase Dimer Reveals the Molecular Basis of Inner Mitochondrial Membrane Morphology.</a> Molecular cell. 63 (3), 445-456 (2016).</li>
<li>Strauss, M., Hofhaus, G., Schroder, R. R., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimer+ribbons+of+ATP+synthase+shape+the+inner+mitochondrial+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Dimer ribbons of ATP synthase shape the inner mitochondrial membrane.</a> EMBO J. 27 (7), 1154-1160 (2008).</li>
<li>Beutner, G., Eliseev, R. A., Porter, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initiation+of+electron+transport+chain+activity+in+the+embryonic+heart+coincides+with+the+activation+of+mitochondrial+complex+1+and+the+formation+of+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Initiation of electron transport chain activity in the embryonic heart coincides with the activation of mitochondrial complex 1 and the formation of supercomplexes.</a> PloS one. 9 (11), e113330(2014).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Interplay+Between+Respiratory+Supercomplexes+and+ROS+in+Aging%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The Interplay Between Respiratory Supercomplexes and ROS in Aging.</a> Antioxid Redox Signal. 23 (3), 208-238 (2015).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Kuter, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adaptation+within+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+supercomplexes+and+membrane+viscosity+during+degeneration+of+dopaminergic+neurons+in+an+animal+model+of+early+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Adaptation within mitochondrial oxidative phosphorylation supercomplexes and membrane viscosity during degeneration of dopaminergic neurons in an animal model of early Parkinson's disease.</a> Biochim Biophys Acta. 1862 (4), 741-753 (2016).</li>
<li>Wittig, I., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+resolution+clear+native+electrophoresis+for+in-gel+functional+assays+and+fluorescence+studies+of+membrane+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">High resolution clear native electrophoresis for in-gel functional assays and fluorescence studies of membrane protein complexes.</a> Mol Cell Proteomics. 6 (7), 1215-1225 (2007).</li>
<li>Fiala, G. J., Schamel, W. W., Blumenthal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+polyacrylamide+gel+electrophoresis+%28BN-PAGE%29+for+analysis+of+multiprotein+complexes+from+cellular+lysates%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Blue native polyacrylamide gel electrophoresis (BN-PAGE) for analysis of multiprotein complexes from cellular lysates.</a> J Vis Exp. (48), (2011).</li>
<li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19026783">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Molecular cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Dudkina, N. V., Eubel, H., Keegstra, W., Boekema, E. J., Braun, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+mitochondrial+supercomplex+formed+by+respiratory-chain+complexes+I+and+III%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Structure of a mitochondrial supercomplex formed by respiratory-chain complexes I and III.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 102 (9), 3225-3229 (2005).</li>
<li>Giorgio, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dimers+of+mitochondrial+ATP+synthase+form+the+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Dimers of mitochondrial ATP synthase form the permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 110 (15), 5887-5892 (2013).</li>
<li>Beutner, G., Sharma, V. K., Giovannucci, D. R., Yule, D. I., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+ryanodine+receptor+in+rat+heart+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of a ryanodine receptor in rat heart mitochondria.</a> J Biol Chem. 276 (24), 21482-21488 (2001).</li>
<li>Rehncrona, S., Mela, L., Siesjo, B. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+of+brain+mitochondrial+function+in+the+rat+after+complete+and+incomplete+cerebral+ischemia%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Recovery of brain mitochondrial function in the rat after complete and incomplete cerebral ischemia.</a> Stroke. 10 (4), 437-446 (1979).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue-native+gels+to+isolate+protein+complexes+from+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Blue-native gels to isolate protein complexes from mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 231-244 (2001).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Schafer, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Architecture+of+active+mammalian+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Architecture of active mammalian respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 281 (22), 15370-15375 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+ATP+synthase+and+respiratory+chain+in+mitochondrial+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of ATP synthase and respiratory chain in mitochondrial membranes.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (6), 672-680 (2009).</li>
<li>Davies, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macromolecular+organization+of+ATP+synthase+and+complex+I+in+whole+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Macromolecular organization of ATP synthase and complex I in whole mitochondria.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 108 (34), 14121-14126 (2011).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Antonioli, P., Bachi, A., Fasoli, E., Righetti, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+removal+of+DNA+from+proteomic+samples+prior+to+two-dimensional+map+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+A%22%5BJournal%5D)">Efficient removal of DNA from proteomic samples prior to two-dimensional map analysis.</a> J Chromatogr A. 1216 (17), 3606-3612 (2009).</li>
<li>Wittig, I., Carrozzo, R., Santorelli, F. M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+assays+in+high-resolution+clear+native+gels+to+quantify+mitochondrial+complexes+in+human+biopsies+and+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">Functional assays in high-resolution clear native gels to quantify mitochondrial complexes in human biopsies and cell lines.</a> Electrophoresis. 28 (21), 3811-3820 (2007).</li>
<li>Glancy, B., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+composition+and+function+of+red+and+white+skeletal+muscle+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Protein composition and function of red and white skeletal muscle mitochondria.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 300 (6), C1280-C1290 (2011).</li>
<li>Wittig, I., Beckhaus, T., Wumaier, Z., Karas, M., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+estimation+of+native+proteins+by+blue+native+electrophoresis%3A+principles+and+practical+hints%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Mass estimation of native proteins by blue native electrophoresis: principles and practical hints.</a> Mol Cell Proteomics. 9 (10), 2149-2161 (2010).</li>
<li>Alavian, K. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+uncoupling+channel+within+the+c-subunit+ring+of+the+F1FO+ATP+synthase+is+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Nat+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An uncoupling channel within the c-subunit ring of the F1FO ATP synthase is the mitochondrial permeability transition pore.</a> Proc Nat Acad Sci USA. 111 (29), 10580-10585 (2014).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+IV.+The+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. IV. The respiratory chain.</a> J Biol Chem. 217 (1), 429-438 (1955).</li>
<li>Zickermann, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology.+Mechanistic+insight+from+the+crystal+structure+of+mitochondrial+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural biology. Mechanistic insight from the crystal structure of mitochondrial complex I.</a> Science. 347 (6217), 44-49 (2015).</li>
<li>Zhu, J., Vinothkumar, K. R., Hirst, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+mammalian+respiratory+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of mammalian respiratory complex I.</a> Nature. 536 (7616), 354-358 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Funkcjonalny ETC jest niezbędny do generowania mitochondrialnego ATP. Kompleksy ETC są zdolne do tworzenia dwóch typów superkompleksów: respirasomy (Cx-I, -III i -IV)1 oraz syntasomy (Cx-V)2. Montaż każdego kompleksu jest wymagany dla nienaruszonego ETC, podczas gdy organizacja ETC w superkompleksy uważa się za zwiększające ogólną wydajność ETC 5,22. Sposób, w jaki te superkompleksy łączą się i demontują, nie jest d...

Energia mitochondrialna w postaci ATP jest nie tylko niezbędna do przetrwania komórki, ale także do regulacji śmierci komórki. Wytwarzanie ATP przez fosforylację oksydacyjną wymaga funkcjonalnego łańcucha transportu elektronów (ETC; Cx-I do IV) i mitochondrialnej syntazy ATP (Cx-V). Ostatnie badania wykazały, że te duże kompleksy białkowe są zorganizowane w superkompleksy, zwane respirasomami i syntasomami1,2. Wyzwaniem jest analiza składania, dynamiki i regulacji aktywności tych masywnych kompleksów i superkompleksów. Podczas gdy pomiary zużycia tlenu wykonane za pomocą elektrody tlenowej i testy enzymatyczne przeprowadzone za pomocą spektrofotometru mogą dostarczyć cennych informacji na temat aktywności kompleksu ETC, testy te nie mogą dostarczyć informacji na temat obecności, wielkości i składu podjednostek zaangażowanego kompleksu białkowego lub superkompleksów. Jednak rozwój niebieskiego i przezroczystego natywnego (odpowiednio BN i CN) PAGE3 stworzył potężne narzędzie do ujawniania ważnych informacji o złożonym składzie i składaniu/demontażu oraz o dynamicznej regulacji supramolekularnej organizacji tych ważnych kompleksów oddechowych w warunkach fizjologicznych i patologicznych4.
Łączenie tych kompleksów w superkompleksy wyższego rzędu wydaje się regulować strukturę i funkcję mitochondriów5. Na przykład, montaż respirasomu zwiększa efektywność transferu elektronów i generowanie siły napędowej protonów przez wewnętrzną błonę mitochondrialną5. Ponadto składanie syntasomów nie tylko zwiększa wydajność produkcji ATP i transfer ekwiwalentów energii do cytoplazmy2, ale także formuje wewnętrzną błonę mitochondriów w rurkowe cristae6,7. Badania nad składaniem nadkompleksów podczas rozwoju serca w zarodkach myszy pokazują, że wytwarzanie superkompleksów zawierających Cx-I w sercu rozpoczyna się około 13,5 dnia embrionalnego8. Inni wykazali, że ilość superkompleksów zawierających Cx-I zmniejsza się w sercu z powodu starzenia się lub urazów niedokrwiennych/reperfuzyjnych9,10 lub może odgrywać rolę w postępie chorób neurodegeneracyjnych11.
Ten protokół opisuje metody dla natywnej strony żelowej, które mogą być użyte do badania montażu i aktywności kompleksów i superkompleksów ETC. Przybliżoną masę cząsteczkową superkompleksów mitochondrialnych można ocenić, rozdzielając kompleksy białkowe w żelach poliakrylamidowych CN lub BN. CN PAGE pozwala również na wizualizację aktywności enzymatycznej wszystkich kompleksów mitochondrialnych bezpośrednio w żelu (testy w żelu; IGA)12. Praca ta wykazuje aktywność respirasomów, podkreślając zdolność Cx-I do utleniania NADH przez IGA oraz obecność syntasomów ze względu na aktywność hydrolizującą ATP Cx-V przez IGA. Istnienie wielu kompleksów i superkompleksów zawierających Cx-I i Cx-V można również wykazać poprzez przeniesienie białek na błony nitrocelulozowe i przeprowadzenie immunoblottingu. Zaletą tego podejścia jest to, że BN lub CN PAGE na ogół rozdzielają kompleksy białkowe na podstawie ich fizjologicznej wielkości i składu; Przeniesienie na membranę zachowuje ten wzór pasm. Analiza kompleksów białkowych w BN lub CN PAGE może być również wykonana za pomocą 2D-PAGE (patrz Fiala i wsp.13 dla demonstracji) lub przez wirowanie gęstości sacharozy14,15. Aby dalej analizować określone prążki, można je wyciąć z BN PAGE, a białka z tego kompleksu białkowego można oczyścić przez elektroelucję w warunkach natywnych. Natywną elektroelucję można przeprowadzić w ciągu kilku godzin, co może mieć znaczący wpływ na bierną dyfuzję (jak zastosowano w Reference 16) białek z żelu do otaczającego buforu.
Podsumowując, te metody opisują kilka podejść, które pozwalają na dalszą charakterystykę superkompleksów o wysokiej masie cząsteczkowej z błon mitochondrialnych.

<table><tbody><tr><td>Komora do mini-żelu Protean II</td><td>Biorad</td><td>1658004</td><td>Kompletny zestaw do nalewania i uruchamiania elektroforezy mini-żelowej</td></tr><tr><td>Protean XL maxi-gel</td><td>Biorad</td><td>1653189</td><td>Kompletny zestaw do nalewania i uruchamiania elektroforezy maxi-gel</td></tr><tr><td>Maszyna do gradientów, Hoefer SG15</td><td>VWR</td><td>95044-704</td><td>Wylewanie gradientów mini-żelu</td></tr><tr><td>Maszyna do gradientów, maxi-gel</td><td>VWR</td><td>GM-100</td><td>Nalewanie maxi-żelu gradienty</td></tr><tr><td>Zestaw transferowy</td><td>Biorad</td><td>1703930</td><td>Kompletny zestaw do mokrego transferu białek na błony</td></tr><tr><td>Elektroeluter model 422</td><td>Biorad</td><td>1652976</td><td>Elektroelucja białek ze stron natywnych lub SDS</td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>Biorad</td><td>1653308</td><td>Płytki krótkie</td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>Biorad</td><td>1653312</td><td>Płytki dystansowe</td></tr><tr><td>Płytki</td> <td>szklaneBiorad</td><td>1651823</td><td>Płyty wewnętrzne</td></tr><tr><td>Płytki szklane</td><td>Biorad</td><td>1651824</td><td>Płyty zewnętrzne</td></tr><tr><td>Zasilacz</td><td>Biorad</td><td>1645070</td><td>Zasilacz odpowiedni do elektroforezy natywnej</td></tr><tr><td>ECL-Western&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32209</td><td>Podłoże chemolumniscense</td></tr><tr><td>SuperSignal-West Dura</td><td>Thermo Scientific</td><td>34075</td><td>Ulepszone podłoże chemolumniscencyjne</td></tr><tr><td>Film/film autoradiograficzny</td><td>GE Opieka zdrowotna</td><td>28906845</td><td>Dokumentacja Western blot</td></tr><tr><td>Procesor filmowy CP1000</td><td>Agfa</td><td>NC0872640</td><td></td></tr><tr><td>Canon Power Shot 640&nbsp;</td><td>Canon</td><td>PL</td><td>Robienie zdjęć w celu udokumentowania żeli, membran i plam.</td></tr><tr><td>Osłona przeciwsłoneczna Canon Power Shot 640&nbsp;</td>Aparat ekranujący <td>Canon</td><td></td><td>do zdjęć robionych na stole podświetlanym</td></tr><tr><td>Akrylamid/bisakryloamid</td><td>Biorad</td><td>1610148</td><td>40% wstępnie zmieszany roztwór</td></tr><tr><td>Glicyna</td><td>Sigma</td><td>G7403</td><td></td></tr><tr><td>SDS (dodecylosiarczan sodu)</td><td>Invitrogen</td><td>15525-017</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma</td><td>T1503</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Deoksychelat sodu</td><td>Sigma</td><td>D66750</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E5134</td><td></td></tr><tr><td>Sacharoza</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Sigma</td><td>I15513</td><td>Bufor</td></tr><tr><td>Lauryl Maltoside</td><td>Sigma</td><td>D4641</td><td>Detergent</td></tr><tr><td>Coomassie G250</td><td>Biorad</td><td>161-0406</td><td></td></tr><tr><td>Kwas aminoheksanowy</td><td>Sigma</td><td>O7260</td><td></td></tr><tr><td>Rodzimy&nbsp; zestaw do masy cząsteczkowej</td><td>GE Opieka zdrowotna&nbsp;</td><td>17-0445-01</td><td>Zestaw do kalibracji wysokocząsteczkowej do elektroforezy natywnej.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue tetrazolium</td><td>Sigma</td><td>N6639</td><td></td></tr><tr><td>Tris HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>ATP&nbsp; &nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</strong</td></tr><tr><td>>Azotan ołowiu(II) (Pb(NO3)2):</td><td>Sigma</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>Oligomycyna</td><td>Sigma</td><td>O4876</td><td></td></tr><tr><td> Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>anty-ATP5A</td><td>Abcam</td><td>ab14748</td><td>przeciwciało przeciwko podjednostce syntazy ATP ATP5A</td></tr><tr><td>anty-NDUFB6</td><td>Abcam</td><td>ab110244</td><td>przeciwciało przeciwko podjednostce Cx-1 NDUFB6</td></tr><tr><td>anty-VDAC</td><td>Przeciwciało Calbiochem</td><td>529534</td><td>przeciwko przeciwciału połączonemu z VDAC</td></tr><tr><td>ECL HRP GE</td><td>Health Care</td><td>NA931V</td> przeciwciało <td>wtórne przeciwko ATP5A, NDUFB6 i VDAC</td></tr><tr><td>Odczynnik blokujący</td><td>Biorad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>chlorek sodu</td><td>Sigma</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Zestaw do barwienia srebra</td><td>Invitrogen</td><td>LC6070</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Analyzing Supercomplexes of the Mitochondrial Electron Transport Chain with Native Electrophoresis, In-gel Assays, and Electroelution

Mitochondrialny łańcuch transportu elektronów (ETC) przekształca energię pochodzącą z rozkładu różnych paliw w bioenergetyczną walutę komórki, ATP. ETC składa się z 5 masywnych kompleksów białkowych, które również łączą się w superkompleksy zwane respirasomami (C-I, C-III i C-IV) i syntasomami (C-V), które zwiększają wydajność transportu elektronów i produkcji ATP. Od ponad 50 lat stosuje się różne metody pomiaru funkcji ETC, ale protokoły te nie dostarczają informacji na temat składania poszczególnych kompleksów i superkompleksów. Protokół ten opisuje technikę natywnej elektroforezy w żelu poliakrylamidowym (PAGE), metody, która została zmodyfikowana ponad 20 lat temu w celu zbadania złożonej struktury ETC. Natywna elektroforeza pozwala na rozdzielenie kompleksów ETC na ich aktywne formy, a kompleksy te można następnie badać za pomocą immunoblottingu, testów w żelu (IGA) i oczyszczania przez elektroelucję. Łącząc wyniki natywnego żelu PAGE z wynikami innych testów mitochondrialnych, możliwe jest uzyskanie pełniejszego obrazu aktywności ETC, jej dynamicznego składania i demontażu oraz tego, jak reguluje to strukturę i funkcję mitochondriów. W niniejszej pracy omówione zostaną również ograniczenia tych technik. Podsumowując, przedstawiona poniżej technika natywnego PAGE, a następnie immunoblottingu, IGA i elektroelucji, jest potężnym sposobem badania funkcjonalności i składu mitochondrialnych superkompleksów ETC.

Do wizualizacji superkompleksów mitochondrialnych wykorzystano świeżo wyizolowane mitochondria myszy17,18. Superkompleksy mitochondrialne są wrażliwe na wielokrotne cykle zamrażania i rozmrażania, co prowadzi do ich dezintegracji, choć dla niektórych badaczy może być to dopuszczalne. Jeśli przechowywanie w zamrażarce jest konieczne, w celu zapewnienia najlepszych wyników próbki nie powinny przechodzić więcej niż jednego cyklu zamr...

Ten protokół opisuje separację funkcjonalnych mitochondrialnych kompleksów łańcucha transportu elektronów (Cx) I-V i ich superkompleksów za pomocą natywnej elektroforezy w celu ujawnienia informacji o ich budowie i strukturze. Natywny żel można poddać immunoblottingowi, testom w żelu i oczyszczaniu za pomocą elektroelucji w celu dalszego scharakteryzowania poszczególnych kompleksów.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

The mitochondrial electron transport chain (ETC) transduces the energy derived from the breakdown of various fuels into the bioenergetic currency of the ...

Ogólnym celem elektroforezy w warunkach natywnych w połączeniu z testami w żelu, immunoblottingiem oraz natywną elektroelucją jest zachowanie i analiza struktury superkompleksów mitochondrialnych. Metoda ta może pomóc w wyjaśnieniu, w jaki sposób kompleksy białkowe mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów łączą się w superkompleksy w zależności od wielu czynników, w tym potrzeb bioenergetycznych oraz warunków fizjologicznych i patologicznych. Główną zaletą tej techniki jest to, że przy prawidłowym wykonaniu integralność fizjologiczna i funkcjonalność superkompleksów mitochondrialnych zostają zachowane podczas długotrwałego procesu izolacji.Metodę tę można również zastosować do badania dynamiki montażu superkompleksów oraz do analizy kompleksów białkowych w błonie plazmatycznej, a także w innych błonach wewnątrzkomórkowych. Podczas przygotowań do analiz w żelu krytycznie ważne jest, aby wszystkie elementy używane do elektroforezy natywnej nie były zanieczyszczone detergentami, ponieważ przyczynią się one do rozpadu mitochondrialnych superkompleksów. Wytnij jedną lub więcej ścieżek z przejrzystego żelu natywnego i przenieś je do opisanego pojemnika.Aby przeprowadzić test komp

analyzing-supercomplexes-mitochondrial-electron-transport-chain-with

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

W tym filmie pokażemy, w jaki sposób można analizować kompleksy łańcucha oddechowego mitochondriów ludzkich embrionalnych komórek macierzystych przy użyciu testów aktywności w żelu.

Badanie aktywności kompleksów mitochondrialnych w ludzkich embrionalnych komórkach macierzystych

W tym filmie demonstrujemy technikę elektroforetyczną, zwaną niebieską natywną STRONĄ, do analizy mitochondrialnych kompleksów białkowych układu oddechowego w ich natywnie złożonym i funkcjonalnie aktywnym stanie. Anionowy niebieski barwnik Coomassie powoduje, że kompleksy białkowe stają się naładowane ujemnie, co umożliwia separację na podstawie wielkości i struktury.

Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym niebieskim: technika separacji bez denaturacji do analizy nienaruszonych kompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Ten protokół demonstruje analizę mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych za pomocą elektroforezy w natywnym żelu poliakrylamidowym niebieskim. W tym miejscu opisano metodę zastosowaną do hodowanych komórek ludzkich.

Analiza mitochondrialnych kompleksów łańcuchów oddechowych w hodowanych komórkach ludzkich przy użyciu elektroforezy w żelu Blue Native Polyacrylamide i immunoblottingu

Tutaj prezentujemy protokół ekstrakcji, dystrybucji i identyfikacji superkompleksów mitochondrialnych, który minimalizuje narażenie na detergenty i Coomassie Blue. Protokół ten zapewnia optymalną równowagę między rozdzielczością a zachowaniem aktywności enzymów, jednocześnie minimalizując ryzyko utraty labilnych interakcji białko-białko.

Hybrydowa elektroforeza przezroczysta/niebieska natywna do separacji i analizy superkompleksów mitochondrialnych łańcuchów oddechowych

Genom mitochondrialny drożdży piekarskich koduje osiem polipeptydów. Celem obecnego protokołu jest oznaczenie ich wszystkich, a następnie wizualizacja ich jako oddzielnych pasm.

Znakowanie i wizualizacja produktów ekspresji genomu mitochondrialnego w drożdżach piekarskich Saccharomyces cerevisiae

Przygotowanie wzbogaconych o mitochondria próbek z wcześniej zamrożonych zarchiwizowanych tkanek stałych pozwoliło badaczom na przeprowadzenie zarówno funkcjonalnych, jak i analitycznych ocen mitochondriów w różnych eksperymentalnych modalnościach. Badanie to pokazuje, jak przygotować preparaty wzbogacone w mitochondria z zamrożonej tkanki serca i przeprowadzić ocenę analityczną mitochondriów.

Pomiar mitochondrialnych kompleksów przenoszenia elektronów w wcześniej zamrożonej tkance serca od potomstwa lochy: model do oceny zmian bioenergetyki mitochondrialnej wywołanych wysiłkiem fizycznym

Ten protokół opisuje technikę analizy superkompleksów oddechowych, gdy dostępne są tylko małe ilości próbek.

Izolacja mitochondriów do analizy superkompleksów mitochondrialnych z próbek małych tkanek i kultur komórkowych

Ten artykuł opisuje metodę oceny interakcji i zespołów integralnych białek błonowych in vitro z różnymi czynnikami partnerskimi w środowisku lipidowo-proksymalnym.

Wykorzystanie liposomów rusztowania do odtworzenia interakcji lipidowo-proksymalnych białko-białko in vitro

Biblioteki wyświetlania bakterii w biopanowaniu to sprawdzona technika odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego, solidna alternatywa dla przeciwciał. Półautomatyczna metoda sortowania usprawniła biopanoramowanie w celu zmniejszenia występowania wyników fałszywie dodatnich. Poniżej ilustrujemy proces myślowy i techniki stosowane w ocenie kandydatów i minimalizacji dalszej analizy.

Półautomatyczne biopanowanie bakteryjnych bibliotek wyświetlających w celu odkrywania odczynników powinowactwa peptydowego i analizy otrzymanych izolatów

Celem tego protokołu jest spektrofotometryczne monitorowanie transportu elektronów przez błonę transplazmatyczną za pomocą zewnątrzkomórkowych akceptorów elektronów i analiza oddziaływań enzymatycznych, które mogą wystąpić z tymi zewnątrzkomórkowymi akceptorami elektronów.

Pomiar transportu elektronów w błonie transplazmatycznej przez miorurki C2C12

Poznaj analizę superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji. Ta metoda zachowuje fizjologiczną integralność kompleksów podczas izolacji.

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji (Wideo) | JoVE Journal

Analiza superkompleksów mitochondrialnego łańcucha transportu elektronów za pomocą natywnej elektroforezy, testów w żelu i elektroelucji

Przeglądaj więcej filmów