Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej
18 maja 2017
Choroby związane z wiekiem są związane z wieloma defektami składników cytoplazmy. W tym miejscu przedstawiamy protokół przygotowania pęcherzyków błony komórkowej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Technika ta może być potencjalnie wykorzystana jako środek terapii zastępczej cytoplazmy w celu poprawy lub nawet odwrócenia fenotypów związanych z wiekiem.
Ogólnym celem tej procedury jest dostarczenie nowatorskiej terapii cytoplazmozastępczej do mięśnia brzuchatego łydki myszy za pomocą pęcherzyków błony plazmatycznej lub PMV pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego myszy lub BMSC. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania dotyczące suplementacji komórek młodą cytoplazmą z innych BMSC za pomocą fuzji PMV, która może poprawić lub nawet odwrócić fenotypy związane z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że enkapsulacja cytozolu BMSC przez PMV może być natychmiast wywołana przez mechaniczne wytłaczanie.
Kiedy demonstrujesz tę metodę, ma to kluczowe znaczenie, ponieważ wytłaczanie i konstruowanie kroków jest trudne do nauczenia się poprzez testowanie do faktycznego posiadania. Aby wytworzyć PMV, najpierw posiewa się myszy BMSC w kompletnym pożywce hodowlanej DMEM w jednym dołku z sześciodołkowej płytki w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Gdy komórki osiągną 90% konfluencji, przepłucz studzienkę 0,5 mililitra PBS bez wapnia i odłącz komórki 0,5 mililitra 0,25% trypsyny-EDTA.
Po trzech minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza postukaj kilka razy w płytkę dłonią, aby ułatwić dysocjację komórek i zatrzymać trawienie za pomocą jednego mililitra pożywki hodowlanej. Przenieś komórki do pięciomililitrowej stożkowej probówki do odwirowania i ponownie zawieś osad w czterech mililitrach świeżej pożywki hodowlanej. Następnie podziel komórki między dwie studzienki nowej płytki sześciodołkowej i włóż płytkę z powrotem do inkubatora do hodowli komórkowych na 24 godziny.
Następnego dnia zbierz komórki z jednej studzienki przez trawienie trypsyny, jak właśnie pokazano. Ponowne zawieszenie osadu w 0,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej po zebraniu przez odwirowanie. Załaduj komórki do jednomililitrowej strzykawki insulinowej i podłącz strzykawkę do jednostki filtrującej.
Szybko wciśnij tłok, aby przecisnąć komórki przez filtr i wyrzuć wytłaczane medium. Następnie załaduj i dozuj 0,5 mililitra dodatkowej pożywki hodowlanej przez filtr, jak pokazano, zbierając pożywkę z drugiego wytłaczania. Wysiew 150 mikrolitrów zebranego podłoża do 35-mililitrowego naczynia ze szklanym dnem i pozwól pęcherzykom osiąść przez około 10 minut.
Następnie potwierdź obecność PMV pod mikroskopem z odwróconym kontrastem fazowym wyposażonym w kamerę CCD za pomocą 20-krotnej soczewki obiektywowej. Aby prześledzić obudowę mitochondriów i potencjał błonowy w PMV, należy wybarwić 90% zlewającą się kulturę BMSC odpowiednim barwnikiem mitochondrialnym lub sondą potencjału błony mitochondrialnej odpowiednio w świeżej pożywce hodowlanej przez 30 minut w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie przepłucz komórki trzykrotnie 0,5 mililitra PBS na pranie i zbierz komórki przez trawienie trypsyny w celu wytworzenia PMV, jak właśnie pokazano dla ich wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.
Aby prześledzić cytoplazmatyczną lokalizację białek PMV, najpierw rozcieńczyć dwa mikrogramy superskręconego plazmidowego DNA dla kasety ekspresyjnej EGFP i sześć mikrolitrów odczynnika do transfekcji kationowej w pojedynczych 0,5 mililitrowych probówkach zawierających 50 mikrolitrów wolnego DMEM w surowicy. Zwirować probówki, a następnie krótko odwirować. Następnie dodaj odczynnik do transfekcji kroplami do probówki zawierającej rozcieńczony roztwór DNA.
Mieszaninę transfekcji DNA należy intensywnie wirować przez jedną minutę, a następnie krótko wirować w 10-minutowej inkubacji w temperaturze pokojowej. Następnie nakarm 30% zlewającą się kulturę BMSC na sześciodołkowej płytce z dwoma mililitrami świeżej pożywki hodowlanej i dodaj mieszaninę DNA kroplami do komórek. 48 godzin po ich transfekcji zbierz BMSC przez trawienie trypsyny i przygotuj PMV, jak właśnie pokazano.
PMV można następnie analizować za pomocą mikroskopii konfokalnej przy użyciu 100-krotnego obiektywu olejowego. Przed wstrzyknięciem PMV oznacz kulturę BMSC barwnikiem fluorescencyjnym do śledzenia komórek barwiącym błonę w jednym mililitrze świeżej pożywki hodowlanej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut i zbierz komórki przez trawienie trypsyną. Ponownie zawiesić znakowane komórki w 0,5 mililitra świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej jednym mikrogramem polietylenoaminy i przygotować PMV, jak pokazano.
Następnie zagęścić PMV przez odwirowanie i ponownie zawiesić osad w 100 mikrolitrach świeżej pożywki hodowlanej z delikatnym wirowaniem. Następnie załaduj komórki do jednomililitrowej strzykawki insulinowej wyposażonej w igłę o rozmiarze 30 i zdezynfekuj zewnętrzną część mięśnia brzuchatego łydki znieczulonej myszy BALB/c 75% etanolem. Następnie powoli wstrzyknij całą objętość PMV do mięśnia i pozwól zwierzęciu dojść do siebie pod lampą grzewczą.
Po 12 godzinach spryskaj mięsień 75% etanolem, otwórz skórę nożyczkami i zbierz cały mięsień brzuchaty łydki na obu końcach. Przepłucz mięsień PBS i umieść go pod mikroskopem fluorescencyjnym. Używając 20-krotnej soczewki obiektywowej, usuń niefluorescencyjne kawałki tkanki mięśniowej za pomocą ostrej żyletki i zmiel pozostałe silnie czerwone fluoryzujące kawałki na około dziewięć milimetrów sześciennych sześciennych.
Osadź każdą kostkę w medium o optymalnej temperaturze cięcia. Następnie zanurz kostki w ciekłym azocie na pięć minut. I przechowuj próbki tkanek w temperaturze minus 20 stopni Celsjusza do czasu ich analizy.
PMV generowane z BMSC, jak wykazano, wykazują głównie rozmiar w zakresie około trzech mikrometrów średnicy, badane pod mikroskopią z kontrastem fazowym przy użyciu obiektywu 20-krotnego. Transfekcja BMSC z kasetą fluorescencyjną przez 48 godzin ilustruje cytoplazmatyczne enkapsulację białka EGFP przez PMV. Co więcej, stanie z fluorescencyjnym barwnikiem mitochondrialnym ujawnia, że duża część PMV zawiera mitochondria.
Większość z nich zabarwia się dodatnio na obecność barwnika potencjału błony mitochondrialnej, co wskazuje na funkcjonalność mitochondriów. Traktowanie polietylenoaminy przed ich podaniem en vivo zapobiega agregacji PMV podczas ich zagęszczania odśrodkowego w celu usunięcia składnika komórkowego. Znakowanie barwnikiem membranowym BMSC przed wytworzeniem PMV ułatwia generowanie PMV ze śladem fluorescencji.
Rzeczywiście, wizualizacja zamrożonych odcinków mięśnia brzuchatego łydki po domięśniowym podaniu znakowanych PMV wskazuje na dostarczenie PMV do cytoplazmy komórek mięśniowych, prawdopodobnie poprzez endocytozę. Podczas próby procedury generowania PMV należy pamiętać o załadowaniu do strzykawki odpowiedniej liczby komórek, aby szybko wcisnąć tłok podczas przepłukiwania komórek przez filtr. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się terapią komórkami macierzystymi do zbadania leczenia chorób związanych z wiekiem u myszy.
Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak przygotować PMV z BMSC do dostarczania cytoplazmy do mięśnia brzuchatego łydki myszy.
Wyświetl pełny transkrypt i uzyskaj dostęp do tysięcy filmów naukowych
Przegląd
W niniejszym artykule przedstawiono protokół przygotowania pęcherzyków błony plazmatycznej (PMVs) z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSCs). Technika ta ma na celu zbadanie terapii wymiany cytoplazmy jako potencjalnej metody łagodzenia fenotypów związanych z wiekiem.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neurobiologia
- Biologia komórki
- Badania nad starzeniem
Wstęp
- Choroby związane z wiekiem często wiążą się z defektami komponentów cytoplazmatycznych.
- Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego stanowią obiecujące źródło do wymiany cytoplazmy.
- Pęcherzyki błony plazmatycznej mogą enkapsulować cytozol do zastosowań terapeutycznych.
- Zrozumienie wpływu młodej cytoplazmy na proces starzenia jest kluczowe dla opracowania terapii.
Cel badania
- W celu przeprowadzenia terapii zastępczej cytoplazmy w mięśniu brzuchatym goleni myszy.
- Aby zbadać, czy fuzja PMV z komórkami starzejącymi się może odwrócić fenotypy związane z wiekiem.
- W celu opracowania niezawodnej metody generowania PMV z BMSCs.
Zastosowane metody
- Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSCs) myszy w pełnej pożywce DMEM.
- Odrywanie komórek za pomocą trypsyny-EDTA po osiągnięciu konfluencji.
- Ekstruzja mechaniczna w celu wytworzenia PMV enkapsulujących cytozol BMSCs.
- Testowanie skuteczności PMV w łagodzeniu efektów związanych z wiekiem.
Główne wyniki
- Pomyślna generacja PMV z hodowlanych BMSC.
- Wykazany potencjał PMV w dostarczaniu młodego cytoplazmy do starzejących się komórek.
- Wstępne wyniki sugerują, że terapia PMV może odwracać fenotypy związane z wiekiem.
- Ustanowienie metodologii dla przyszłych badań nad terapią wymiany cytoplazmy.
Wnioski
- PMV stanowią nowatorskie podejście do terapii wymiany cytoplazmy.
- Technika ta może przynieść przełom w leczeniu chorób związanych z wiekiem.
- Konieczne są dalsze badania w celu potwierdzenia potencjału terapeutycznego PMV.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla przemysłu
Terapia zastępowania cytoplazmy z wykorzystaniem pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV) pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) oferuje mechanistyczne podejście do przeciwdziałania dysfunkcjom komórkowym związanym z wiekiem poprzez dostarczanie młodych komponentów cytoplazmatycznych. Strategia ta wspiera walidację celów w badaniach nad starzeniem, umożliwiając funkcjonalną ocenę odmłodzenia cytozolu w systemach istotnych dla danej choroby. Metoda ta stanowi model przedkliniczny do oceny zastępowania cytoplazmy jako potencjalnej interwencji w fenotypach związanych z wiekiem.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne odkrywanie i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie wpływu składników cytozolu na fenotypy starzenia się poprzez kontrolowane dostarczanie młodej cytoplazmy.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system oceny funkcjonalnej regeneracji aktywności mitochondrialnej i zdolności mitotycznych.
Przesiewy i opracowywanie testów
- Wartość naukowa: Pozwala na generowanie zestandaryzowanych PMV o mierzalnej wielkości i enkapsulacji mitochondriów, zapewniając spójność materiałów wejściowych do analiz.
- Wartość operacyjna: Umożliwia skalowalną produkcję preparatów pęcherzyków poprzez ekstruzję i wirowanie na potrzeby dalszych etapów procesów przesiewowych.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Demonstruje dostarczanie do cytoplazmy tkanki mięśniowej, zapewniając ciągłość od etapu odkrycia do walidacji in vivo.
- Wartość operacyjna: Ustanawia metodę przygotowania PMV umożliwiającą śledzenie z wykorzystaniem barwników błonowych do badań biodystrybucji i pobierania.
Integracja potoku i przepływu pracy
Metoda przygotowania PMV integruje się z wczesnymi etapami procesów odkrywania leków, dostarczając standaryzowane źródło pęcherzyków do badań nad zastępowaniem cytoplazmy, co stanowi pomost między walidacją celu a oceną przedkliniczną.
- Biologia odkrywcza: Ułatwia testowanie hipotez dotyczących odmładzania cytozolu poprzez umożliwienie kontrolowanej fuzji młodej cytoplazmy z komórkami starymi lub chorymi.
- Przesiewy: Dostarcza jednorodnych preparatów PMV odpowiednich do analizy wysokoprzepustowej (high-content analysis) w zakresie poboru pęcherzyków, dostarczania ładunku i funkcjonalnego ratunku.
- Analityka: Umożliwia ilościową ocenę potencjału błony mitochondrialnej oraz enkapsulacji białek cytoplazmatycznych za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
- Badania translacyjne: Wspiera ciągłość przedkliniczną poprzez wykazanie dostarczania znakowanych PMV do cytoplazmy mięśni in vivo.
- Wykorzystanie w skali przedsiębiorstwa: Definiuje reużywalną platformę produkcji pęcherzyków, którą można zastosować w wielu źródłach komórek macierzystych i modelach chorób.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorstwowy
- Wartość naukowa: Zwiększa pewność prognostyczną w walidacji celu poprzez izolację zmiennych cytoplazmatycznych w fenotypach starzenia.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalność dzięki standaryzacji parametrów ekstruzji i protokołów stężenia pęcherzyków.
- Wartość strategiczna: Wspiera podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go), dostarczając wglądu w mechanizm wystarczalności cytoplazmatycznej dla ratowania fenotypu.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii celowanych w cytoplazmę z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o walidację funkcjonalną w układach istotnych dla danej choroby.
Uwagi dotyczące wdrożenia
- Wymaga doświadczenia w hodowli pierwotnych komórek macierzystych, technikach aseptycznych oraz mikroskopii fluorescencyjnej.
- Zależne od dostępu do sprzętu do ekstruzji o określonej wielkości porów oraz możliwości wirowania w celu przetwarzania pęcherzyków.
- Wymaga standaryzacji konfluencji komórek, czasu trypsynizacji oraz warunków pożywki w poszczególnych partiach produkcyjnych.
- Wiąże się z koniecznością dostosowania metody do różnych typów komórek oraz strategii ładowania ładunku poza BMSCs i EGFP.
- Ograniczone przez heterogeniczność rozmiarów pęcherzyków i potencjalną agregację podczas koncentracji, co jest łagodzone poprzez traktowanie polietylenopoliaminą.
