Name: Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-18T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Poznaj metodę przygotowania pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do terapii cytoplazmozastępczej. Technika ta umożliwia dostarczenie młodej cytoplazmy do komórek w celu odwrócenia fenotypów związanych ze starzeniem.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Badania te były wspierane przez Fundację Li Ka Shing, Projekt Uniwersytetu Wysokiego Szczebla w Guangdong "Zielone technologie dla przemysłu morskiego", Chińską Fundację Nauk Przyrodniczych (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant nr 30971665, 81172894, 81370925) oraz Departament Edukacji Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant nr cxzd1123).

8 do 12 tygodniowych myszy BALB/c zostały zakupione w Shanghai Experimental Animal Center (Szanghaj, Chiny) i hodowane w specyficznym, wolnym od patogenów i klimatyzowanym obiekcie dla zwierząt. Opieka nad zwierzętami i procedury eksperymentalne były zgodne z wytycznymi dotyczącymi użytkowania i opieki nad zwierzętami laboratoryjnymi ustanowionymi przez Uniwersytet Shantou.
1. Montaż aparatury
<ol>
	<li>Aby zapewnić sterylność, przed użyciem włącz światło UV okapu do hodowli tkankowej na 30 minut.</li>
	<li>Odkręć jednorazową jednostkę filtrującą 25 mm i zanurz nakrętkę i spód urządzenia w szklanym kubku o pojemności 200 ml wypełnionym 75% etanolem na 30 minut. Urządzenie wykonane jest z polipropylenu klasy medycznej.</li>
	<li>Podnieś nasadkę i spód urządzenia za pomocą kleszczy, ręcznie strząśnij pozostały etanol i pozostaw części do wyschnięcia na powietrzu przez 10 minut w masce.</li>
	<li>Zwilż membranę poliwęglanową o grubości 19 mm w PBS i ostrożnie umieść ją na matrycy nośnej dolnej części urządzenia. Folia polimerowa ma gładką, płaską powierzchnię i wytrawione pory o wielkości 3 μm.</li>
	<li>Zmontuj urządzenie, mocno dokręcając nakrętkę do spodu. Upewnij się, że membrana nie jest wysunięta ze środka.</li>
	<li>Usunąć igłę ze strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml i pobrać 1 ml PBS. Podłącz strzykawkę do jednostki filtrującej, a następnie przepchnij PBS przez jednostkę, aby zwilżyć zespół i sprawdzić, czy nie ma wycieków.</li>
</ol>
2. Wytwarzanie pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV)
<ol>
	<li>Ustal kulturę BMSC, zgodnie z raportem Nemetha i wsp.15, w pożywce DMEM zawierającej 15% FBS i 1% penicyliny/streptomycyny. Hodować komórki na 6-dołkowej płytce w wilgotnym inkubatorze zawierającym 5% CO2 w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby rozmnożyć komórki, usuń pożywkę hodowlaną i przepłucz studzienkę 0,5 ml bezwapniowego PBS.</li>
	<li>Dodać 0,5 ml 0,25% trypsyny-EDTA i inkubować komórki w temperaturze 37 °C przez 3 minuty. Postukaj płytką o dłoń kilka razy, aby ułatwić odklejanie komórek. Zatrzymaj trawienie, dodając 1 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Zebrać komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i wirować z prędkością 200 x g przez 2 minuty w wirówce stołowej. Ponownie zawiesić komórki w 4 ml pożywki hodowlanej i podzielić komórki na dwie studzienki na płytce 6-dołkowej. 
	UWAGA: Komórki zwykle osiągają konfluencję po około 24 godzinach.</li>
	<li>Aby wytworzyć PMV, należy pobrać komórki z jednego dołka (około 5 x 105 komórek) z 6-dołkowej płytki przez trawienie trypsyną i monodyspersować komórki w 0,5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Załaduj komórki do strzykawki insulinowej, przymocuj ją do jednostki filtrującej i szybko naciśnij tłok, aby przecisnąć komórki przez filtr. Wytłaczane medium należy wyrzucić, ponieważ powinno się w nim znajdować tylko kilka PMV.</li>
	<li>Załaduj dodatkowe 0,5 ml pożywki do strzykawki i szybko przepchnij ją przez filtr. Zebrano pożywkę z drugiej ekstruzji, która zawiera PMV o różnej wielkości.</li>
	<li>Załaduj 150 μl zebranego podłoża do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozwól PMV osiąść na dnie przez około 10 minut. Zbadaj PMV pod mikroskopem z odwróconą fazą kontrastu wyposażonym w kamerę CCD przy użyciu soczewki obiektywu 20X.</li>
</ol>
3. Badanie zawartości w PMV za pomocą mikroskopii konfokalnej
<ol>
	<li>Aby przeprowadzić transfekcję w BMSC, rozcieńczyć 2 μg superskręconego plazmidowego DNA i 6 μl odczynnika do transfekcji kationowej (np. PolyJet) w 50 μl DMEM bez surowicy. Wiruj, aby dobrze wymieszać i krótko odwiruj, aby zebrać cały płyn z boków rurki.</li>
	<li>Dodawać rozcieńczony roztwór (z kroku 3.1) kroplami do rozcieńczonego roztworu DNA, mocno wirować przez 1 minutę, krótko wirować i inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut.</li>
	<li>Zastąp starą pożywkę na BMSC, które zostały wysiane w ciągu około 30% zbiegu przez noc, 2 ml świeżej pożywki hodowlanej i dodawaj kroplami mieszaninę transfekcji DNA.</li>
	<li>Zastąp 2 ml świeżej pożywki po 12 godzinach transfekcji.</li>
	<li>Aby śledzić białka zlokalizowane cytoplazmatycznie, należy transfekować komórki plazmidem zawierającym kasetę ekspresji EGFP (pEGFP-N1), jak opisano powyżej. Zebrać komórki przez trawienie trypsyny 48 godzin po transfekcji w celu wytworzenia PMV, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Aby prześledzić mitochondria, należy wybarwić komórki barwnikiem mitochondrialnym (1 μM, MitoTracker) w świeżej pożywce hodowlanej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Aby wykryć potencjał błonowy mitochondriów, należy wybarwić komórki barwnikiem cyjaninowym JC-1 (jodek 5,5',6,6'-tetrachloro-1,1',3,3'-tetraetylobenzimi-dazolylokarbocyjaniny) (10 μg/ml) w świeżej pożywce hodowlanej przez 30 minut w temperaturze 37 °C.
	<ol>
		<li>Umyj komórki trzykrotnie 0,5 ml PBS, a następnie zbierz komórki przez trawienie trypsyny w celu wytworzenia PMV, jak opisano powyżej.</li>
		<li>Załaduj 150 μl zebranego podłoża do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozwól PMV osiąść na dnie przez około 10 minut. Zbadaj PMV pod mikroskopem konfokalnym za pomocą soczewki obiektywu olejowego 100X.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aby wykryć EGFP lub barwnik mitochondrialny, włącz laser 488 nm i zbierz sygnał o długości fali 505-530 nm. Aby wykryć JC-1, włącz lasery 488 nm i 543 nm i zbieraj sygnały o długości fali 505-530 nm i 560-615 nm. Ustaw wartość otworka na około 1,4.</li>
</ol>
4. Przygotowanie skoncentrowanych PMV przez wirowanie
<ol>
	<li>Zbierz komórki przez trawienie trypsyny i wygeneruj PMV, jak opisano powyżej, w 0,5 ml pożywki hodowlanej.</li>
	<li>Wirować PMV przy 1 200 x g w wirówce stołowej przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Ostrożnie odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 100 μl pożywki hodowlanej, delikatnie obracając.</li>
	<li>Załaduj 50 μl PMV do naczynia ze szklanym dnem o średnicy 35 mm i pozwól im osiąść w temperaturze pokojowej przez około 10 minut. Zbadaj PMV pod mikroskopem konfokalnym za pomocą soczewki obiektywu olejowego 40X.</li>
	<li>Dodać serię rozcieńczonego roztworu polietyleniniminy (PEI) do kultury BMSC na 1 godzinę i sprawdzić, czy nie ma oznak cytotoksyczności. 
	UWAGA: W tym przypadku wybrano PEI na poziomie 2 μg/ml, ponieważ nie wykryto żadnych oznak toksyczności w BMSC.</li>
	<li>Zbierz komórki przez trawienie trypsyny i dodaj PEI w ilości 2 μg/ml przez 1 godzinę, aby naładować błonę komórkową jako środek zapobiegający agregacji. Wygenerować PMV, jak opisano powyżej, w 0,5 ml pożywki hodowlanej. Skoncentruj PMV i zbadaj je pod mikroskopem konfokalnym, jak opisano powyżej.</li>
</ol>
5. Wstrzyknięcie PMV do mięśnia brzuchatego łydki
<ol>
	<li>Aby zabarwić membranę, dodaj barwnik CM-DiI (chloromethyl dialkilo-indocarbocyanine) (10 μM) w 1 ml świeżej pożywki hodowlanej do BMSC na 30 minut.</li>
	<li>Zbierz komórki (około 5 x 105) przez trawienie trypsyny i ponownie zawieś je w 0,5 ml pożywki hodowlanej. Dodaj PEI (2 μg/ml) na 1 godzinę. Wytworzyć i zagęścić PMV w 100 μl pożywki hodowlanej, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Znieczulij mysz BALB/c, wstrzykując barbital sodu (10 mg/kg) po 12 godzinach postu.</li>
	<li>Oczyść zewnętrzną część mięśnia brzuchatego łydki 75% etanolem. Powoli wstrzyknąć PMV (100 μl) do mięśnia brzuchatego łydki za pomocą strzykawki insulinowej 30 G.</li>
	<li>Po podaniu znieczulenia umieść mokrą gazę na oczach na czas eksperymentu i ogrzej mysz żarówką, aż się obudzi. Umieść mysz samą w indywidualnej klatce wentylacyjnej.</li>
	<li>Aby zebrać mięsień brzuchaty łydki 12 godzin po operacji, zabij mysz przez zwichnięcie szyjki macicy.</li>
	<li>Posyp mięsień brzuchaty łydki 75% etanolem, otwórz skórę nożyczkami i wytnij cały mięsień brzuchaty łydki na obu końcach.</li>
	<li>Przepłucz mięsień PBS i zbadaj go pod mikroskopem fluorescencyjnym za pomocą soczewki obiektywowej 20X.</li>
	<li>Przytnij mięsień ostrą żyletką, aby usunąć części bez fluorescencji. Części o silnej czerwonej fluorescencji pokroić w około 9 mm3 kostkę.</li>
	<li>Zanurz każdą kostkę w podłożu o optymalnej temperaturze cięcia (OCT), zanurz ją w ciekłym azocie na 5 minut i przechowuj w zamrażarce o temperaturze -20 °C do czasu użycia.</li>
	<li>Pokrój zamrożone kawałki na kawałki o grubości 20 μm za pomocą kriostatu i przyklej każdą sekcję do szkiełka podstawowego. Przepłukać sekcję raz za pomocą PBS.</li>
	<li>Narysuj okrąg wokół sekcji za pomocą pisaka do barwienia i dodaj 100 μl DAPI (1 μg/ml). Odessać roztwór DAPI po 10 minutach inkubacji w temperaturze pokojowej w ciemności i przemyć trzykrotnie PBS.</li>
	<li>Upuść olej montażowy na próbkę, przykryj ją szkiełkiem i uszczelnij szkiełko lakierem do paznokci. Zbadaj przekrój pod mikroskopem konfokalnym za pomocą soczewki obiektywu olejowego 100X.</li>
	<li>Aby wykryć CM-DiI, włącz laser 543 nm i zbierz sygnał o długości fali 560-615 nm. Aby wykryć DAPI, włącz laser 405 nm i zbierz sygnał o długości fali 420-480 nm. Ustaw wartość otworka na około 1,4.</li>
</ol>

<ol><li>Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfer+with+fusogenic+liposomes+containing+vesicular+stomatitis+virus+G+glycoprotein%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein.</a> J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).</li>
<li>Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solid+lipid+nanoparticles+as+efficient+drug+and+gene+delivery+systems%3A+recent+breakthroughs%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Pharm+Bull%22%5BJournal%5D)">Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs.</a> Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).</li>
<li>Torchilin, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multifunctional%2C+stimuli-sensitive+nanoparticulate+systems+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery.</a> Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).</li>
<li>Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+replacement+therapy+in+reproductive+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).</li>
<li>López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.cell.com/abstract/S0092-8674(13)00645-4">The hallmarks of aging.</a> Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).</li>
<li>Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipid+droplet-associated+proteins+in+atherosclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Med+Rep%22%5BJournal%5D)">Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis.</a> Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).</li>
<li>Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Islet+amyloid+and+type+2+diabetes+mellitus%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus.</a> N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).</li>
<li>Jagust, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+amyloid-%CE%B2+harmful+to+the+brain%3F+Insights+from+human+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies.</a> Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).</li>
<li>Naidoo, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+endoplasmic+reticulum+stress+response+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The endoplasmic reticulum stress response and aging.</a> Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).</li>
<li>Cuervo, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autophagy+and+aging%3A+keeping+that+old+broom+working%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Autophagy and aging: keeping that old broom working.</a> Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).</li>
<li>Bratic, A., Larsson, N. G. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23454757">The role of mitochondria in aging.</a> J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).</li>
<li>Lin, H. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+VSV-G+produces+fusogenic+plasma+membrane+vesicles+capable+of+efficient+transfer+of+bioactive+macromolecules+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Microdevices%22%5BJournal%5D)">Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria.</a> Biomed Microdevices. 18 (3), 41(2016).</li>
<li>Riekstina, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+stem+cell+marker+expression+pattern+in+human+mesenchymal+stem+cells+derived+from+bone+marrow%2C+adipose+tissue%2C+heart+and+dermis%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Rev%22%5BJournal%5D)">Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis.</a> Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).</li>
<li>Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+HLA+profiling+and+immunomodulatory+effects+of+human+adult+bone+marrow-+and+adipose-derived+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells.</a> Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).</li>
<li>Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+practical+guide+to+culturing+mouse+and+human+bone+marrow+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells.</a> Curr Protoc Immunol. 102, Unit 22F.12 (2013).</li>
<li>Shahabipour, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Nanoparticulate+tools+for+RNA+interference+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery.</a> J Cell Physiol. , [Epub ahead of print (2017).</li>
<li>Lamichhane, T. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+for+extracellular+vesicles+in+tissue+engineering+and+regenerative+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+B%22%5BJournal%5D)">Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine.</a> Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).</li>
<li>Baumgart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-scale+fluid%2Ffluid+phase+separation+of+proteins+and+lipids+in+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles.</a> Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).</li>
<li>Sezgin, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+membrane+structure+and+protein+behavior+using+giant+plasma+membrane+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles.</a> Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).</li>
<li>Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasma+membranes+are+poised+for+activation+of+raft+phase+coalescence+at+physiological+temperature%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature.</a> Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).</li>
<li>Pandey, A. P., Sawant, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyethylenimine%3A+A+versatile%2C+multifunctional+non-viral+vector+for+nucleic+acid+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Cytoplazmatyczna terapia zastępcza zaproponowana w tym manuskrypcie ma wyjątkowe zalety w porównaniu z innymi opisanymi podejściami, takimi jak terapia genowa, molekularna i komórkowa. PMV generowane przez BMSC zawierają w sobie nie tylko produkty genów macierzystych, ale także nienaruszone organelle komórkowe, które są niezbędne do przeciwdziałania fenotypom starzenia się związanym ze starzeniem się. Kiedy młoda cytoplazma jest dostarczana do komórek starczych, nieprawidłowo działające mechanizmy mogą uzyskać krótką ulg...

Ogromna ilość wysiłku została włożona w opracowanie metod terapii zastępowania genów, enzymów i komórek. Zaowocowało to wielkimi przełomami, a nawet zastosowaniami klinicznymi1,2,3. Ostatnio kontrowersyjna terapia zastępcza mitochondriów oparta na technologii transferu jądra została zastosowana do zapłodnienia in vitro u kobiet w podeszłym wieku lub z letalną mutacją mitochondrialnego DNA4. Wady występujące w chorobach związanych z wiekiem, w tym miażdżycy, cukrzycy typu 2, chorobie Alzheimera i nowotworach, są zwykle wieloaspektowe. Udokumentowano, że gromadzenie się kropelek lipidów; odkładanie się białka amyloidowego; zatrzymywanie niesfałdowanych białek w retikulum endoplazmatycznym; a wadliwy proteasom, autofagosom i mitochondria przyczyniają się do rozwoju lub zaostrzenia tych chorób5,6,7,8,9,10,11. Obecnie nie ma dostępnego mechanizmu mającego na celu bezpośrednie zaradzenie nieprawidłowemu działaniu cytozolu i organelli, które powoduje starzenie się i starzenie fenotypów.
Wcześniej informowaliśmy o wytwarzaniu pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV) poprzez mechaniczne wytłaczanie komórek ssaków12. Z wyjątkiem jądra, w PMV znaleziono składniki błony lub cytozolu, w tym białka i RNA, a także organelle, takie jak mitochondria. Zasadniczo PMV można uznać za miniaturową komórkę wyłuszczoną. Co ważniejsze, fuzja PMV z komórkami Rho0 z niedoborem mitochondriów przywróciła aktywność mitotyczną w normalnych warunkach hodowli. Jest to pierwszy raport dotyczący ustalenia potencjalnie skutecznego podejścia do cytoplazmowej terapii zastępczej.
Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) są multipotencjalnymi komórkami progenitorowymi, które są rutynowo generowane ze szpiku kostnego i łatwo się namnażają w hodowli. Markery embrionalnych komórek macierzystych Oct4, Nanog i SOX2 zostały wykryte na niskich poziomach w MSCs13. Aktywność telomerazy jest również mierzalna. Ponadto brak cząsteczek kostymulujących i cząsteczek ludzkiego antygenu leukocytarnego (HLA) klasy II, a także niska ekspresja HLA klasy I na MSCs, sprawiają, że są to idealne komórki do allogenicznego lub "gotowego" zastosowania zarówno w medycynie regeneracyjnej, jak i immunomodulacji14.
Tutaj opisujemy, jak przygotować PMV z mysich BMSC poprzez ekstruzję przez membranę poliwęglanową z porami 3-μm, określić istnienie mitochondriów i zbadać utrzymanie potencjału błonowego w PMV za pomocą mikroskopii konfokalnej, przygotować skoncentrowane, ale nie zagregowane PMV przez wirowanie, i przeprowadzić in-vivo iniekcję PMV do mięśnia brzuchatego łydki myszy.

<table><tbody><tr><td>Membrany IsoporeTM</td><td>Milipore</td><td>TSTP04700</td><td>3 mm porów</td></tr><tr><td>Jednorazowa jednostka filtrująca</td><td>Xinya, Szanghaj, Chiny</td><td>25 mm</td><td>Polipropylen</td></tr><tr><td>medyczny Strzykawka insulinowa</td><td>BD</td><td>328446</td><td>1 ml</td></tr><tr><td>pN1-EGFP</td><td>Clontech</td><td>&nbsp; 6085-1</td><td></td></tr><tr><td>Sondy molekularne</td><td>MitoTracker</td><td>M7514</td><td>Zielony FM, 1 &mu; M</td></tr><tr><td>JC-1</td><td>Beyotime, Haimen, Chiny</td><td>C2006</td><td>10 mg/mL</td></tr><tr><td>CM-DiI</td><td>Beyotime, Haimen, Chiny</td><td>C1036</td><td>10 mM</td></tr><tr><td>PEI</td><td>Sigma</td><td>P3143</td><td>Mn = 75 000 Mikroskop</td></tr><tr><td>fluorescencyjny</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TE 2000</td><td>Z kamerą CCD</td></tr><tr><td>Mikroskop Confocol</td><td>Carl Zeiss</td><td>LSM 510 Meta</td><td></td></tr><tr><td>PolyJet</td><td>SigaGen</td><td>SL100688</td><td>Do transfekcji komórek</td></tr></tbody></table>

przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej

Preparation of Plasma Membrane Vesicles from Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells for Potential Cytoplasm Replacement Therapy

Wcześniej informowaliśmy o wytwarzaniu pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV) poprzez mechaniczne wytłaczanie komórek ssaków. Fuzja PMV z mitochondrialnymi komórkami Rho0 z niedoborem mitochondriów przywróciła aktywność mitotyczną w normalnych warunkach hodowli. Miażdżyca, cukrzyca typu 2, choroba Alzheimera i rak to choroby związane z wiekiem, które, jak doniesiono, są związane z wieloma mechanicznymi i funkcjonalnymi defektami cytozolu i organelli różnych typów komórek. Mezenchymalne komórki macierzyste szpiku kostnego (BMSC) reprezentują unikalną populację komórek ze szpiku kostnego, które posiadają zdolności do samoodnawiania się przy zachowaniu swojej multipotencji. Suplementacja komórek starzenia młodą cytoplazmą z autologicznych BMSC poprzez fuzję PMV stanowi obiecujące podejście do poprawy lub nawet odwrócenia fenotypów związanych z wiekiem. Protokół ten opisuje, w jaki sposób przygotować PMV z BMSC poprzez wytłaczanie przez membranę poliwęglanową z porami 3 μm, określić istnienie mitochondriów i zbadać utrzymanie potencjału błonowego w PMV za pomocą mikroskopu konfokalnego, zagęścić PMV przez odwirowanie i przeprowadzić wstrzyknięcie in vivo PMV do mięśnia brzuchatego łydki myszy.

Kluczem do pomyślnego przygotowania PMV jest przede wszystkim prawidłowy montaż jednostki filtrującej (Rycina 1), który można sprawdzić, przepychając 1 mL PBS przez membranę. W przypadku wystąpienia przecieku należy ponownie złożyć jednostkę filtrującą i powtórzyć test. Należy jednak pamiętać, że szczelność można sprawdzić wiarygodnie jedynie podczas przepychania komórek przez membranę. Jeśli pod zwykłym mikroskopem przy użyciu obiektywu 10X wykryto tylko kilka PMV lub je...

Choroby związane z wiekiem są związane z wieloma defektami składników cytoplazmy. W tym miejscu przedstawiamy protokół przygotowania pęcherzyków błony komórkowej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego. Technika ta może być potencjalnie wykorzystana jako środek terapii zastępczej cytoplazmy w celu poprawy lub nawet odwrócenia fenotypów związanych z wiekiem.

Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej

We have previously reported on the generation of plasma membrane vesicles (PMVs) through the mechanical extrusion of mammalian cells. The fusion of PMVs ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest zastosowanie nowatorskiej terapii zastępowania cytoplazmy w mięśniu brzuchatym łydek myszy przy użyciu pęcherzyków błony plazmatycznej (PMV) pochodzących z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) myszy. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na pytania dotyczące tego, czy suplementacja komórek młodą cytoplazmą z innych BMSC poprzez fuzję PMV może łagodzić, a nawet odwracać fenotypy związane z wiekiem. Główną zaletą tej techniki jest to, że enkapsulacja cytozolu BMSC w PMV może zostać natychmiast wywołana poprzez ekstruzję mechaniczną.Podczas prezentacji tej metody kluczowe jest rzetelne zaprezentowanie etapów ekstruzji i konstruowania, ponieważ są one trudne do opanowania bez praktycznego doświadczenia. Aby wytworzyć PMV, najpierw należy hodować mysie BMSCs w pełnej pożywce DMEM w jednej studzience płytki 6-dołkowej w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5% CO2. Po osiągnięciu przez komórki 90% konfluencji, należy przepłukać studzienkę 0,5 ml PBS bez wapnia i odczepić komórki za pomocą 0,5 ml 0,25% trypsyny-EDTA.Po trzech minutach w temperaturze 37°C należy kilkakrotnie uderzyć dłonią w płytkę, aby ułatwić dysocjację komórek, a następnie zatrzymać proces trawienia, dodając 1 ml pożywki hodowlanej. Komórki przenieść do probówki stożkowej o pojemności 5 ml w celu odwirowania, a otrzymany osad resuspendować w 4 ml świeżej pożywki hodowlanej. Następnie podzielić komórki pomiędzy dwa dołki nowej płytki 6-dołkowej i umieścić płytkę z powrotem w inkubatorze do hodowli komórkowych na 24 godziny.Następnego dnia zebrać komórki z jednej studzienki poprzez trawienie trypsyną, zgodnie z wcześniejszą instrukcją. Po odwirowaniu zawiesić osad w 0,5 milliliters świeżej pożywki hodowlanej. Przenieść komórki do strzykawki insulinowej o pojemności one milliliter i przyłączyć strzykawkę do jednostki filtrującej.Szybko naciśnij tłok, aby przepchnąć komórki przez filtr, a następnie odrzuć wypchnięte medium. Następnie naciągnij i wydispensuj 0,5 mililitra dodatkowego medium hodowlanego przez filtr, tak jak pokazano przed chwilą, zbierając medium z drugiego wypchnięcia. Przenieś 150 mikrolitrów zebranego medium do szklanego naczynia z dnem o pojemności 35 mililitrów i pozwól pęcherzykom osiąść przez około 10 minut.Następnie potwierdź obecność PMV pod odwróconym mikroskopem fazowo-kontrastowym wyposażonym w kamerę CCD, używając obiektywu o powiększeniu 20x. Aby prześledzić obrys mitochondriów oraz potencjał błonowy w PMV, zabarw 90% konfluencję kultury BMSC odpowiednim barwnikiem mitochondrialnym lub sondą potencjału błony mitochondrialnej odpowiednio w świeżej pożywce hodowlanej przez 30 minut w temperaturze 37 °C. Następnie wypłucz komórki trzykrotnie, używając 0,5 ml PBS na każde płukanie, a następnie zbierz komórki poprzez trawienie trypsyną w celu generowania PMV, tak jak wykazano wcześniej dla ich wizualizacji za pomocą mikroskopii konfokalnej.Aby prześledzić lokalizację cytoplazmatyczną białek PMV, należy najpierw rozcieńczyć dwie mikrogramy superzwiniętego plazmidowego DNA dla kasety ekspresyjnej EGFP oraz sześć mikrolitrów kationowego odczynnika do transfekcji w oddzielnych probówkach o pojemności 0,5 mililitra zawierających 50 mikrolitrów DMEM bez surowicy. Probówki należy wymieszać w vorteksie, a następnie poddać krótkiej wirówce. Następnie odczynnik do transfekcji należy dodawać kroplami do probówki zawierającej rozcieńczony roztwór DNA.Mieszaninę do transfekcji DNA należy intensywnie wymieszać na wortexie przez jedną minutę, a następnie krótko odwirować i inkubować przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie kulturę BMSC o 30% konfluencji w płytce sześciodołkowej należy zasilić dwoma mililitrami świeżej pożywki i dodać mieszaninę DNA do komórek kroplami. 48 godzin po transfekcji BMSC należy zebrać poprzez trawienie trypsyną i przygotować PMV zgodnie z wcześniejszą instrukcją.PMV można następnie analizować za pomocą mikroskopii konfokalnej, używając obiektywu olejowego 100x. Przed wstrzyknięciem PMV, należy oznakować hodowlę BMSC fluorescencyjnym barwnikiem do śledzenia komórek, barwiącym błony, w 1 ml świeżej pożywki hodowlanej w temperaturze 37 °C przez 30 minut, a następnie zebrać komórki poprzez trawienie trypsyną. Oznakowane komórki należy resuspender w 0,5 ml świeżej pożywki hodowlanej uzupełnionej o 1 µg polietyleniaminy i przygotować PMV zgodnie z przedstawioną procedurą.Następnie skoncentruj PMV poprzez wirowanie i resuspenduj osad w 100 µL świeżej pożywki hodowlanej, delikatnie mieszając w sposób wirowy. Dalej, przenieś komórki do strzykawki insulinowej o pojemności 1 ml wyposażonej w igłę G30 i zdezynfekuj powierzchnię mięśnia brzuchatego znieczawionej myszy BALB/c za pomocą 75% etanolu. Następnie powoli wstrzyknij całą objętość PMV do mięśnia i pozwól zwierzęciu dojść do siebie pod lampą grzewczą.Po 12 godzinach spryskać mięsień 75% ethanolem, rozciąć skórę nożyczkami i pobrać cały mięsień brzuchaty poprzez odcięcie obu jego końców. Przepłukać mięsień w PBS i umieścić go pod mikroskopem fluorescencyjnym. Przy użyciu obiektywu 20x usunąć niefluorescencyjne fragmenty tkanki mięśniowej za pomocą ostrej żyletki, a pozostałe, silnie czerwono fluorescencyjne części posiekać na kostki o wielkości około 9 mm³.Każdy sześcian należy zatopić w optymalnym medium do mrożenia (OCT). Następnie sześciany należy zanurzyć w ciekłym azocie na pięć minut. Próbki tkankowe należy przechowywać w temperaturze -20 °C do momentu analizy.Wykazano, że PMV generowane z BMSC wykazują przede wszystkim rozmiar w zakresie około trzech mikrometrów średnicy, co stwierdzono w badaniu pod mikroskopem fazokontrastowym z użyciem obiektywu 20x. Transfekcja BMSC fluorescencyjną kasetą ekspresyjną przez 48 godzin obrazuje cytoplazmatyczną enkapsulację białka EGFP przez PMV. Ponadto barwienie fluorescencyjnym barwnikiem mitochondrialnym ujawnia, że duża frakcja PMV zawiera mitochondria.Większość z nich wykazuje pozytywne barwienie barwnikiem potencjału błony mitochondrialnej, co wskazuje na funkcjonalność mitochondriów. Obróbka polietylenopoliaminą przed podaniem in vivo zapobiega agregacji PMV podczas ich koncentracji przez wirowanie w celu usunięcia składników komórkowych. Barwienie błonowe BMSC przed generowaniem PMV ułatwia tworzenie PMV możliwych do śledzenia za pomocą fluorescencji.Rzeczywiście, wizualizacja mrożonych przekrojów mięśnia brzuchatego po domięśniowym podaniu znakowanych PMV wskazuje na dostarczenie PMV do cytoplazmy komórek mięśniowych, prawdopodobnie poprzez endocytozę. Podczas próby przeprowadzenia procedury generowania PMV ważne jest, aby napełnić strzykawkę odpowiednią liczbą komórek, by móc szybko nacisnąć tłok podczas przepłukiwania komórek przez filtr. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom w dziedzinie terapii komórkami macierzystymi do badania leczenia chorób związanych z wiekiem u myszy.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat przygotowania PMV z BMSC w celu dostarczenia cytoplazmy do mięśnia brzuchatego myszy.

preparation-plasma-membrane-vesicles-from-bone-marrow-mesenchymal

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano eksperymentalną technikę leczenia ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika. Implantacja allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w ubytki chrzęstno-kostne stanowi obiecujący kierunek rozwoju w dziedzinie inżynierii tkankowej. Przygotowanie skrzepów fibrynowo-komórkowych in vitro oferuje zestandaryzowaną metodę implantacji.

Leczenie ubytków chrzęstno-kostnych w stawie kolanowym królika poprzez implantację allogenicznych mezenchymalnych komórek macierzystych w skrzepach fibrynowych

Ten film demonstruje metodę generowania pęcherzyków błony plazmatycznej z komórek macierzystych szpiku kostnego poprzez szybkie przepuszczanie ich przez filtr membranowy. Te PMV wykazują potencjał w terapii zastępczej cytoplazmy.

Generowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z komórek macierzystych szpiku kostnego

Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) mają potencjał różnicowania w kierunku linii osteoblastycznej, gdy są stymulowane przez rozpuszczalne czynniki lub określone biomateriały. W niniejszej pracy przedstawiono nowatorską opcję dostarczania MSCs z ludzkiej błony owodniowej (AM-hMSC), która wykorzystuje macierz kostną bydła Nukbone (NKB) jako rusztowanie.

Izolacja ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych i ich hodowla na porowatej macierzy kostnej

Mezenchymalne komórki macierzyste są zwykle pozyskiwane ze szpiku kostnego i wymagają hodowli ekspansywnej. Gdy próbki krzepną przed przetworzeniem, można zastosować protokół z użyciem (enzymatycznej) urokinazy leku trombolitycznego w celu degradacji skrzepu. W ten sposób komórki są uwalniane i dostępne do hodowli ekspansyjnej. Protokół ten stanowi szybką i niedrogą alternatywę dla ponownego próbkowania.

Enzymatyczna metoda ratowania mezenchymalnych komórek macierzystych z zakrzepłych próbek szpiku kostnego

Tutaj opisujemy zoptymalizowany, wysoce powtarzalny protokół izolacji mezodermalnych komórek progenitorowych (MPC) od ludzkiego szpiku kostnego (hBM). MPC scharakteryzowano za pomocą cytometrii przepływowej i ekspresji gniazdyny. Wykazali oni zdolność do tworzenia wykładniczo rosnących kultur komórkowych podobnych do MSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich potencjału angiogennego.

Izolowanie mezangiogennych komórek progenitorowych (MPC) z ludzkiego szpiku kostnego

Hodowla ludzkich mezenchymalnych komórek zrębowych (hMSC) za pomocą autologicznej surowicy, zmniejsza ryzyko odrzucenia przez materiał ksenogeniczny i inne negatywne skutki. Pozwala również na odzyskanie podzbioru mezodermalnych komórek progenitorowych, które mogą dostarczać świeże hMSC. Osadzenie hMSC w autologicznym skrzepie fibrynowym umożliwia łatwą obsługę i skuteczną implantację chirurgiczną.

Mezenchymalna hodowla komórek zrębowych i dostarczanie w warunkach autologicznych: inteligentne podejście do zastosowań ortopedycznych

Obecny protokół opisuje wirowanie różnicowe w celu izolowania i charakteryzowania reprezentatywnych EV (egzosomów i mikropęcherzyków) z hodowanych ludzkich MSC. W tym artykule wyjaśniono również dalsze zastosowania tych pojazdów elektrycznych.

Izolacja, charakterystyka i zastosowanie terapeutyczne pęcherzyków zewnątrzkomórkowych z hodowanych ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych

Niniejszy protokół opisuje opłacalną metodę oczyszczania, namnażania i charakteryzowania wysoce jednorodnych mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego (BMSC) od myszy. Takie podejście ułatwia pozyskiwanie dużych ilości BMSC o wysokim potencjale proliferacji i różnicowania, wspierając modele mysie i posuwając naprzód badania przedkliniczne.

Oczyszczanie, ekspansja i fenotypowanie oparte na cytometrii przepływowej mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego pochodzenia mysiego

Ten protokół ma na celu przedstawienie metody produkcji i oczyszczania biomimetyków pochodzących od mezenchymalnych komórek macierzystych (MSC) dla terapii genowej. Nanowezykul jest ograniczony MSC-pochodnymi dwuwarstwowami lipidowymi i zawiera rekombinowane AAV przenoszące gen interesujący się w świetle. Ta nanowezykul oferuje ulepszony wektor dla in vivo dostarczania genów.

Opracowanie nanowezykuł otoczonych błoną komórek macierzystych mezenchymalnych w celu zwiększenia wydajności dostarczania genów

Tutaj opisujemy metody preparowania tkanek płodowych i matczynych z ludzkiego łożyska, a następnie izolacji i ekspansji mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych (MSC) z tych tkanek.

Izolacja i ekspansja mezenchymalnych komórek macierzystych/zrębowych pochodzących z ludzkiej tkanki łożyska

Poznaj metodę przygotowania pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do terapii cytoplazmozastępczej. Technika ta umożliwia dostarczenie młodej cytoplazmy do komórek w celu odwrócenia fenotypów związanych ze starzeniem.

Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej (Wideo) | JoVE Journal

Przygotowanie pęcherzyków błony plazmatycznej z mezenchymalnych komórek macierzystych szpiku kostnego do potencjalnej terapii cytoplazmozastępczej

Przeglądaj więcej filmów