Name: Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 6 s
Description: Poznaj metodę glikoinżynierii metabolicznej modyfikującą ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórek przy użyciu pochodnych N-acetylomannozaminy. Technika ta umożliwia badanie interakcji receptor-ligand w glikobiologii.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy L. D. Nguyenowi za korektę manuskryptu i owocne dyskusje. Ponadto dziękujemy J. Dernedde i H. G. Nguyenowi za pomoc w przygotowaniu sesji zdjęciowej. Większość scen filmu została nakręcona w laboratoriach R. Taubera. Dziękujemy również Instytutowi Maxa Plancka za koloidy i interfejsy oraz za umożliwienie nam bezpłatnego dostępu do ich laboratorium spektrometrii mas. RH był wspierany przez DFG (ProMoAge).

1. Przygotowanie i odczynników
<ol>
	<li>Przygotowanie 3 mM roztworu mettlenku sodu
	<ol>
		<li>Rozpuścić 8,1 mg mettlenku sodu w 50 ml metanolu (3 mM) w szklanej butelce o pojemności 100 ml z mieszadłem. Przechowywać w temperaturze pokojowej (RT) przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu Tris-HCl
	<ol>
		<li>Połącz 8,766 g NaCl, 157 mg Tris-HCl i 146 mg EDTA w szklanej butelce o pojemności 100 ml z mieszadłem i rozpuść w 80 ml wody.</li>
		<li>Dodać wodorotlenek sodu (1 M, w wodzie) lub HCl (20%, w wodzie) do roztworu mieszającego, obserwując pH za pomocą pH-metru, i dostosować pH do 8,0.</li>
		<li>Dodaj objętość wody potrzebną do uzyskania końcowej objętości 100 ml. Przefiltrować roztwór za pomocą sterylnego systemu filtrów 0,22 μm. 
		UWAGA: 100 ml buforu Tris-HCl będzie zawierał 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl i 5 mM EDTA (pH 8,0). Roztwór można przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu aprotyniny
	<ol>
		<li>Rozpuść 10 mg aprotyniny w 1 ml wody (1,54 mM). Roztwór aprotyniny rozdzielić na 10 probówek z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml (każda po 100 μl). Przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu leupeptyny
	<ol>
		<li>Rozpuścić 10 mg leupeptyny w 2 ml wody (10 mM). Podać roztwór leupeptyny 10 x 1,5 ml plastikowych probówek. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu fluorku fenylometylosulfonylu (PMSF)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 34,8 mg PMSF w 2 ml etanolu (100 mM). Roztwór PMSF należy rozdzielić do 10 probówek z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml. Przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu dichlorowodorku 1,2-diamino-4,5-metylodioksybenzolu (DMB)
	<ol>
		<li>Połącz 15,62 mg DMB, 352 μl β-merkaptoetonu i 48 μl roztworu wodorosiarczynu sodu (39%) i dodaj 9,6 ml wody (6,9 mM DMB, 500 mM β-merkaptoetanolu i 0,19% wodorosiarczynu sodu). Roztwór DMB należy rozmieścić w 40 probówkach z tworzywa sztucznego o pojemności 1,5 ml (każda po 250 μl). Przechowywać w chronionym przed światłem w temperaturze -20 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 1 M roztworu kwasu trifluorooctowego (TFA)
	<ol>
		<li>Dodaj 770,3 μl 100% TFA do 9,23 ml wody w plastikowej tubie o pojemności 15 ml (1 M). Przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu TFA o stężeniu 120 mM
	<ol>
		<li>Dodaj 92,4 μl TFA (100%) do 9,91 ml wody (120 mM) w plastikowej tubie o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie 400 mM roztworu wodorotlenku sodu (NaOH)
	<ol>
		<li>Rozpuścić 160 mg NaOH w 10 ml wody (400 mM) w plastikowej probówce o pojemności 15 ml. Przechowywać w temperaturze 4 °C przez kilka tygodni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu do lizy Western blot
	<ol>
		<li>Rozpuścić 5,84 g NaCl, 0,1 g tris(hydroksymetylo)-aminometanu (Tris), 0,1 g CaCl2, 0,95 g MgCl2 i 1 g Triton-X100 w 100 ml wody i dostosować pH do 7,8. Przechowywać w temperaturze 4 °C. Dodać 100 μl każdego inhibitora proteazy (aprotyniny, leupeptyny i PMSF) przed użyciem buforu do lizy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu do elektroforezy w żelu poliakryloamidowym dodecylosiarczanu sodu (SDS-PAGE)
	<ol>
		<li>Rozpuść 0,3 g Tris, 1,5 g glicyny i 0,1 g SDS w 100 ml wody i dostosuj pH do 7,3. Sklep w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie buforu Western blot
	<ol>
		<li>Rozpuść 0,3 g Tris, 1,1 g glicyny w 90 ml wody i dodaj 10 ml etanolu. Sklep w RT.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie roztworu blokującego
	<ol>
		<li>Rozpuść 1 g mleka beztłuszczowego w 25 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Zawsze przygotowuj świeże.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Synteza ManNProp i pokrewnych mannozaminy modyfikowanych N-acylem 
<ol>
	<li>Rozpuścić 431,2 mg chlorowodorku mannozaminy w 10 ml 3 ml roztworu mettlenku sodu w szklanej butelce o pojemności 50 ml z mieszadłem.</li>
	<li>Schłodzić mieszaninę na lodzie do temperatury 0 °C. Do roztworu mieszającego powoli dodawać kroplami 210 μl chlorku propionylu (2,4 mmol) lub 248 μl chlorku butanoylu (2,4 mmol) w celu syntezy odpowiednio ManNProp lub ManNBut. Mieszaninę mieszającą inkubować w temperaturze 0 °C przez 4 godziny.</li>
	<li>Przenieść roztwór do plastikowej probówki o pojemności 50 ml. Wbij 4-8 otworów w pokrywkę plastikowej rurki cienką igłą. Szybko zamrozić roztwór za pomocą ciekłego azotu, a następnie liofilizować (liofilizować go) przez 48 godzin lub do całkowitego wyschnięcia.</li>
	<li>Zmieszaj 350 g żelu krzemionkowego 60 z 750 ml octanu etylu/metanolu/wody (15:2:1) (jest to zawiesina). Napełnić szklaną kolumnę (o średnicy 35 mm i długości 70 cm) zawiesiną żelu krzemionkowego 60 i przed użyciem umyć przygotowaną kolumnę dodatkowym 100 ml octanu etylu/metanolu/wody (15:2:1).</li>
	<li>Rozpuścić wysuszone produkty z etapu 2.3 (5 g suchego produktu) w 10 ml octanu etylu/metanolu/wody (15:2:1) i załadować je pipetą do kolumny z żelem krzemionkowym. Zebrać 4 ml frakcji po 500 ml (dla ManNProp). UWAGA: ManNBut wymywa się z kolumny około po 700 ml.</li>
	<li>Uwolnione frakcje przenieść do plastikowych probówek o pojemności 15 ml. Wbij 3-6 otworów w pokrywkę plastikowej rurki cienką igłą. Szybko zamrozić roztwór za pomocą ciekłego azotu, a następnie liofilizować go aż do całkowitego wyschnięcia. 
	UWAGA: Produkty liofilizowane mogą być przechowywane przez kilka miesięcy w RT.</li>
	<li>Sprawdzić czystość produktów za pomocą spektrometrii mas (patrz sekcja 9). 
	UWAGA: Alternatywnie, czystość można również zweryfikować za pomocą 1-godzinnegomagnetycznego rezonansu jądrowego (NMR).</li>
</ol>
3. Hodowla komórkowa
<ol>
	<li>Hodowla komórek nerwiaka zarodkowego Kelly'ego w pożywce Roswell Park Memorial Institute (RPMI) zawierającej 10% płodowej surowicy bydlęcej, 100 U penicyliny, 100 mg streptomycyny, 2 mM L-glutaminy zawierającej 5 mM ManNAc, 5 mM ManNProp lub 5 mM ManNBut, w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Komórki hodowane w pożywce bez ManNAc lub jego analogów są używane jako kontrola.</li>
	<li>Przed zastosowaniem mannozaminy należy odłączyć komórki nerwiaka zarodkowego Kelly'ego, inkubując je przez 10 minut z trypsyną/EDTA (0,25%, 0,02% w PBS) i policzyć za pomocą komory Neubauera lub licznika komórek. Zasiej komórki pod zdefiniowanymi liczbami w oparciu o rozmiar talerza/naczynia.
	<ol>
		<li>Aby zmierzyć cukrów prostych kwasu sjalowego, wysiewaj 1 x 105 komórek w pożywce o objętości 500 μl na 48-dołkową płytkę do hodowli tkankowej. Do analizy kwasów polisjalowych wysiewa się 1 x 106 komórek w 3 ml pożywki na szalce do hodowli komórkowej o średnicy 6 cm. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wymieniaj podłoże co 24 godziny 
		UWAGA: Efekt MGE nasila się wraz z całkowitym czasem leczenia. Aby uzyskać wysoką wydajność metaboliczną, traktuj komórki przez 5-7 dni.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po zabiegu zdekantować podłoże. Umyj talerze/naczynia za pomocą PBS. Odłącz komórki, inkubując je przez 10 minut z trypsyną/EDTA (0,25%, 0,02%, w PBS). Zneutralizuj trypsynę, dodając tę samą objętość pożywki do hodowli komórkowych do oderwanych komórek. Przenieś oderwane komórki do plastikowych probówek o pojemności 15 ml. Odwirować próbki przez 3 minuty przy 500 x g i odrzucić supernatant.
	<ol>
		<li>Dodać 5 ml PBS i odwirować komórki (patrz krok 3.3). Powtórz procedurę prania jeszcze dwa razy. 
		UWAGA: Przemyte osady komórkowe bez supernatantu można przechowywać w temperaturze -20 °C przez kilka dni. Jeśli ekspresja kwasu polisjalowego ma zostać wyjaśniona, przejdź do punktu 10.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Liza komórek do analizy HPLC
<ol>
	<li>Przygotowanie buforu do lizy HPLC
	<ol>
		<li>Połącz 5 ml buforu Tris-HCl, 5 μl roztworu aprotyniny, 20 μl roztworu leupeptyny i 50 μl roztworu PMSF. 
		UWAGA: 5 ml buforu do lizy HPLC będzie zawierało 150 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 5 mM EDTA, 1,54 μM aprotyniny, 40 μM leupeptyny i 1 mM PMSF (pH 8,0). Ten bufor powinien być zawsze przygotowywany świeży przed lizą komórek.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Ponownie zawiesić zebrane granulki komórek (krok 3.3) każdy w 500 μl lodowatego buforu do lizy HPLC i ultra-sonicyzować próbki za pomocą igły procesora ultradźwiękowego trzy razy przez okres 30 s przy średnio-wysokich amplitudach. Próbki należy schłodzić na lodzie przez co najmniej 1 minutę pomiędzy cyklami.</li>
</ol>
5. Separacja frakcji membranowej
<ol>
	<li>Odwirować próbki zlizowanych komórek przez 2 godziny w temperaturze 20 000 x g i w temperaturze 4 °C. Oddzielić supernatant (około 480 μl), reprezentujący białka cytozolowe, w plastikowych probówkach o pojemności 1,5 ml. Oznaczyć stężenie białka w tych frakcjach, stosując np. test Bradforda lub test kwasu bicinchoninowego (BCA). 
	UWAGA: Stężenie białka (około 1 mg/ml) frakcji cytozolowych można później odnieść do zmierzonych ilości szanowanych gatunków kwasu sjalowego. Osad reprezentuje frakcję membrany, która jest używana w kroku 6.1.</li>
</ol>
6. Hydroliza kwasowa
UWAGA: Oligo- i polisacharydy w błonach komórkowych są hydrolizowane do monosacharydów. Co więcej, możliwe modyfikacje O w cukrów prostych są również hydrolizowane. Jest to konieczne do ilościowej analizy HPLC, ponieważ przytłaczająca większość kwasów sjalowych we frakcjach błonowych jest naturalnie włączona do glikokoniugatów i może zawierać modyfikacje O-acetylu lub O-laktolilu.
<ol>
	<li>Dodać 150 μl 1 M roztworu TFA do oddzielonych frakcji membranowych (osad z sekcji 5). Inkubować próbki przez 4 godziny w temperaturze 80 °C z wytrząsaniem przy 200-600 obr./min.</li>
	<li>Odwirowywać próbki przez około 30 minut przy 20 000 x g i temperaturze 21 °C przy użyciu probówek filtracyjnych o pojemności 0,5 ml z membranami wykluczającymi 3 kDa, aż objętość górnej fazy będzie mniejsza niż 20 μl. 
	UWAGA: Ten krok jest ważny, aby pozbyć się zanieczyszczeń o wyższej masie cząsteczkowej.</li>
	<li>Przenieść dolną fazę zawierającą mniejsze cząsteczki, w tym kwas sjalowy, do plastikowych probówek o pojemności 2 ml. Wbij 2-4 otwory w nasadkach plastikowych rurek cienką igłą. Szybkie zamrożenie próbek za pomocą ciekłego azotu, a następnie liofilizacja przez noc. 
	UWAGA: Wysuszone próbki można przechowywać przez kilka dni w temperaturze pokojowej. Wymień nakrętkę bez otworów, aby zapewnić dłuższe przechowywanie.</li>
</ol>
7. Etykietowanie fluorescencyjne
<ol>
	<li>Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 10 μl 120 mM roztworze TFA i dodać 50 μl roztworu DMB. Przenieś próbki do ciemnych probówek o pojemności 1,5 ml, aby chronić je przed światłem ultrafioletowym.</li>
	<li>W przypadku wzorców rozpuść 1 μl Neu5Ac (60 ng/ml w wodzie) lub 1 μl Neu5Gc (60 ng/ml w wodzie) w 10 μl 120 mM roztworze TFA w ciemnych probówkach o pojemności 1,5 ml. Dodać 50 μl roztworu DMB.</li>
	<li>Próbki błony komórkowej i wzorce należy inkubować przez 1,5 godziny w temperaturze 56 °C, chroniąc przed światłem. Po inkubacji dodać 4 μl 400 mM roztworu NaOH do każdej próbki, aby zatrzymać reakcję znakowania.</li>
</ol>
8. Analiza HPLC
UWAGA: Znakowane próbki są analizowane w systemie HPLC wyposażonym w kolumnę C18 RP (110 A, wielkość cząstek 3 μm, 4,6 x 150 mm), detektor fluorescencji i kolektor frakcji. Stosowane rozpuszczalniki to metanol, acetonitryl i woda. Upewnij się, że odgazowałeś wszystkie rozpuszczalniki przed pomiarami, jeśli system HPLC nie ma wewnętrznego odgazowywacza.
<ol>
	<li>Ustaw temperaturę kolumny na 40 °C i skonfiguruj detektor fluorescencji odpowiednio na 373 nm dla wzbudzenia i 448 nm dla emisji. Wstrzyknąć próbkę o objętości 10 μl i rozdzielić sondy na 50 minut przy natężeniu przepływu 0,5 ml/min z metanolem/acetonitrylem/wodą (6:8:86) jako eluentem. Do analizy spektrometrii mas zbierz interesujące nas piki. 
	UWAGA: Oczekuje się, że Neu5Gc wypłynie po 6-8 minutach, Neu5Ac po 9 - 12 minutach, Neu5Prop po 17 - 23 minutach, a Neu5But po 38 - 44 minutach. Frakcjonowane próbki można przechowywać przez kilka godzin w temperaturze 4 °C, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Po zmierzeniu każdej próbki przemyć kolumnę przez 7,5 minuty przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min (objętość ≈ 1,5 kolumny) metanolem/acetonitrylem/wodą (6:25:69) i ponownie wyrównać układ przez 7,5 minuty przy natężeniu przepływu 1,0 ml/min z metanolem/acetonitrylem/wodą (6:8:86).</li>
	<li>Do analizy ilościowej należy obliczyć obszar pod krzywą pików kwasu sjalowego będącego przedmiotem zainteresowania, korzystając z oprogramowania operacyjnego odpowiedniego systemu HPLC22. 
	UWAGA: Uzyskane dane można odnieść do wzorca Neu5Ac lub Neu5Gc oraz do zmierzonych stężeń białek we frakcjach cytozolowych (patrz punkt 5.1).</li>
</ol>
9. Analiza spektrometrii mas cukrów prostych kwasu sjalowego
UWAGA: Interesujące piki retencji HPLC mogą być dalej analizowane za pomocą chromatografii cieczowej (LC) spektrometrii mas z elektrorozpylaniem i jonizacją (ESI-MS), w celu weryfikacji nienaturalnych gatunków kwasu sjalowego.
<ol>
	<li>W celu analizy spektrometrii mas wstrzyknij 20 μl pobranej próbki do systemu LC/selektywnego detektora masy (MSD) z 79,9% metanolem, 20% alkoholem izopropylowym i 0,1% kwasem mrówkowym jako eluentem, natężeniem przepływu 0,5 ml/min, napięciem kapilarnym 4 kV i temperaturą kapilarną 350 °C22,23.</li>
	<li>W oprogramowaniu oceniającym odpowiedniego systemu LC/MSD wybrać interesujący nas pik na chromatogramie jonów całkowitych. Umożliwia wyświetlenie widma masowego rozwiązanego piku. Wyświetlanie dodatniego stosunku masy do ładunku w zakresie od 300 do 700, 
	UWAGA: Znakowanie DMB kwasów sjalowych prowadzi do wzrostu masy cząsteczkowej o 116,2 g/mol. Formy kwasu sjalowego znakowane DMB mają następujące masy cząsteczkowe: DMB-Neu5Ac = 424,2 g/mol, DMB-Neu5Gc = 441,8 g/mol, DMB-Neu5Prop = 436,2 g/mol, DMB-Neu5But = 453,2 g/mol. Częstymi adduktami są acetonitryl, sód lub alkohol izopropylowy.</li>
</ol>
10. Analiza Western Blot kwasu polisjalowego w komórkach nerwiaka zarodkowego Kelly'ego
<ol>
	<li>Przygotowanie lizatów komórkowych
	<ol>
		<li>Dodaj 1 ml buforu do lizy Western blot do granulek komórek z kroku 3.3 i wiruj. Inkubować przez 30 minut na lodzie. Wir co 5 minut. Odwirowywać próbki przez 1,5 godziny w temperaturze 20 000 x g w temperaturze 4 °C. Zebrać supernatant zawierający białka z komórek poddanych lizie.</li>
		<li>Określić stężenie białka we frakcjach białkowych, np. test Bradforda lub test BCA. Rozcieńczyć próbki do stężenia białka 1,5 μg/μl w buforze do lizy.</li>
		<li>Przygotuj próbki do SDS-PAGE, dodając 10 μl buforu próbki Laemmli do 90 μl frakcji białkowej (1,5 μg/μL) i gotuj próbkę przez 5 min24.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immunoblotting (Immunoblotting)
	<ol>
		<li>Stosować 8% żele akrylowe SDS z kieszeniami 20 - 30 μl i grubością 0,75 lub 1 mm. Uruchom żel pod ciśnieniem 25 mA przez 2 godziny przy RT.</li>
		<li>Ostrożnie zdejmij szklaną osłonę z żelu. Wytnij i wyrzuć górną część żelu zawierającą kieszenie ładunkowe. Żel umieszczamy na membranie nitrocelulozowej (0,2 μm), uprzednio nasączonej buforem Western blot. Przenieść białka do nitrocelulozy zgodnie z zaleceniami systemu (np. 250 mA przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C).</li>
		<li>Usunąć membranę nitrocelulozową z systemu bibuły. Zabarwić plamę czerwienią Panceau, aby uwidocznić białka. Przenieść membranę nitrocelulozową do plastikowej komory i dodać 10 ml roztworu blokującego. Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C.</li>
		<li>Zdekantować roztwór blokujący i dodać przeciwciało monoklonalne anty-polySia 735 (1 μg/ml) do PBS. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej lub przez noc w temperaturze 4 °C. Po inkubacji przemyć membranę co najmniej trzy razy przez 5 minut PBS.</li>
		<li>Dodać poliklonalne przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG (1 μg/ml) sprzężone z peroksydazą chrzanową (HRP) lub znacznikiem fluorescencyjnym w PBS. Inkubować błonę przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Po inkubacji przemyć membranę co najmniej trzy razy przez 5 minut PBS.</li>
		<li>Przenieść membranę na płytkę odpowiedniego imagera. Wykryj sygnał zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Jeżeli chemicznie syntetyzowane pochodne ManNAc, ManNProp i ManNBut są analizowane za pomocą spektrometrii mas, należy zidentyfikować tylko prawidłowy pik masy dla obu próbek. W związku z tym można przyjąć, że produkty mają czystość powyżej 99%. Niewielkie ilości Neu5Gc, który normalnie nie występuje w komórkach ludzkich29, są wykrywane we frakcjach błonowych komórek poddanych lizie. Najprawdopodobniej dzieje się to poprzez szlak ratunkowy, który rekrutuje Neu5Gc z płodowych koniugatów sialoglykok...

Kwas sjalowy jest monosacharydem, który zazwyczaj można znaleźć na nieredukujących końcach glikokoniugatów, takich jak N- i O-glikany lub glikolipidy. Spośród wszystkich cukrów prostych kwas sjalowy ma pewne unikalne właściwości chemiczne. Ma szkielet 9 atomów C, grupę karboksylową w pozycji C-1, która jest deprotonowana, a tym samym naładowana ujemnie w warunkach fizjologicznych, oraz funkcję aminową w pozycji C-5. Chociaż do tej pory scharakteryzowano ponad 50 naturalnie występujących wariantów kwasu sjalowego1, dominującą formą kwasu sjalowego występującą u ludzi jest kwas N-acetyloneuraminowy (Neu5Ac). Inne ssaki również wyrażają większe ilości kwasu N-glikolylneuraminowego (Neu5Gc)2,3.
Ze względu na swoją eksponowaną pozycję w glikokoniugatach, kwas sjalowy bierze udział w wielu interakcjach receptor-ligand, np. zależne od hemaglutyniny wiązanie wirusa grypy z komórkami gospodarza4. Epitopem kwasu sjalowego pełniącym ważne funkcje biologiczne, zwłaszcza podczas embriogenezy i w układzie nerwowym, jest kwas polisjalowy. Kwas polisjalowy jest polimerem zawierającym do 200 połączonych kwasów sjalowych alfa 2,8. Głównym nośnikiem białkowym kwasu polisjalowego jest cząsteczka adhezyjna komórek nerwowych (NCAM). Ekspresja kwasu polisjalowego moduluje właściwości adhezyjne NCAM, ponieważ ekspresja kwasu polisjalowego zmniejsza adhezję i zwiększa plastyczność układu nerwowego5.
Zmiany w ekspresji kwasu (poli)sjalowego ostatecznie wpłyną na wiele różnych interakcji biologicznych. Można to wykorzystać do badania znanych procesów zależnych od kwasu sjalowego na poziomie molekularnym, do odkrycia nowych interakcji glikokoniugatów lub zbadania możliwych podejść terapeutycznych. Dostępne są różne metody, za pomocą których można modulować ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórki, na przykład leczenie glikozydazami specyficznymi dla kwasu sjalowego (sialidazy), hamowanie enzymów biorących udział w biosyntezie kwasu sjalowego6,7,8, lub obniżenie lub zmiana ekspresji kluczowego enzymu biosyntezy kwasu sjalowego9.
Inną wszechstronną metodą modulowania ekspresji kwasu sjalowego jest MGE (znana również jako metaboliczna inżynieria oligosacharydowa, MOE). W tym przypadku komórki, tkanki, a nawet zwierzęta są traktowane nienaturalnymi pochodnymi ManNAc, które zawierają modyfikacje C2-amino. Będąc cząsteczkami prekursorowymi kwasu sjalowego, po wychwycie komórkowym, te analogi ManNAc są jednokierunkowo metabolizowane do nienaturalnych kwasów sjalowych i mogą ulegać ekspresji na sjalowych glikokoniugatach. Komórki potraktowane pochodnymi ManNAc przenoszącymi alifatyczne modyfikacje C2, takie jak ManNProp lub ManNBut, zawierają kwas N-propionyloneuraminowy (Neu5Prop) lub kwas N-butanoylneuraminowy (Neu5But) w swoich glikokoniugatach10,11. Wykorzystując grupy funkcyjne wprowadzone do pozycji C2 ManNAc, występujące nienaturalne kwasy sjalowe mogą być sprzężone, np. poprzez ligację Staudingera lub cykloaddycję azydku alkinu, z barwnikami fluorescencyjnymi i w ten sposób uwidocznione na powierzchni komórki12.
Ekspresja tych nienaturalnych kwasów sjalowych ma intrygujący wpływ na wiele procesów biologicznych, w tym infekcje patogenami, adhezję i migrację komórek nowotworowych, ogólną adhezję komórek, a także unaczynienie i różnicowanie (dla przeglądu patrz: Wratil et al.13). Co ciekawe, MGE z mannosaminami modyfikowanymi N-acylem może być również używany do zakłócania ekspresji kwasu polisjalowego. Kwas polisjalowy jest wytwarzany przez dwie różne polisjalotransferazy (ST8SiaII i ST8SiaIV). Wykazano, że polisjalilotransferaza ST8SiaII jest hamowana przez nienaturalne prekursory kwasu sjalowego, takie jak ManNProp lub ManNBut14,15. Ponadto wykazano w ludzkich komórkach nerwiaka zarodkowego, że zastosowanie ManNProp lub ManNBut również zmniejsza sialilację w całości15.
MGE z mannosaminami modyfikowanymi N-acylem to łatwa do zastosowania metoda, która została z powodzeniem zastosowana, nie tylko w hodowlach komórkowych ssaków i bakterii, ale także u całych zwierząt różnych gatunków, takich jak Caenorhabditis elegans16, danio pręgowany17, lub myszy18,19,20,21. Zwłaszcza pochodne ManNAc zawierające modyfikacje alifatyczne, w tym ManNProp i ManNBut, są pomijalnie cytotoksyczne, nawet w stężeniach milimolowych w pożywce do hodowli komórkowych lub osoczu krwi. Ponadto są stosunkowo łatwe do syntezy.
Tutaj podajemy szczegóły dotyczące stosowania MGE z mannosaminami modyfikowanymi N-acetylem. Po pierwsze, wyjaśniono syntezę chemiczną dwóch najczęściej stosowanych pochodnych ManNAc w tej dziedzinie, ManNProp i ManNBut. Następnie pokazujemy, jak MGE można zastosować w eksperymencie in vivo. Jako przykład, linia komórkowa nerwiaka zarodkowego Kelly została wybrana, aby wykazać zmniejszoną ekspresję epitopu polisjalowego przez Western blot po leczeniu pochodnymi ManNAc. Nienaturalne kwasy sjalowe na powierzchni komórki oznaczono ilościowo za pomocą HPLC i poddano dalszej analizie za pomocą spektrometrii mas.

<table><tbody><tr><td>Komórki</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>92110411</td><td></td></tr><tr><td>RPMI podłoże</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>75 ml kolby do hodowli tkankowych</td><td>Greiner</td><td>690175</td><td></td></tr><tr><td>48-dołkowe Corning</td><td></td><td>3548</td><td></td></tr><tr><td>FCS</td><td>PAA</td><td>A15-102</td><td></td></tr><tr><td>Pióro/Paciorkowiec</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>15400-054</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Roth</td><td>X986.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Serva</td><td>37190.03</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Roth</td><td>2326.2</td><td></td></tr><tr><td>Sprzęt SDS-PAGE (zbiorniki, szkło itp., maszyna</td><td>VWR</td><td>SDS Gel/Blot</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Roth</td><td>3019.1</td><td></td></tr><tr><td>Drabinka białkowa</td><td>Fisher Scientific</td><td>267620</td><td></td></tr><tr><td>Nitroceluloza</td><td>GE Healthcare</td><td>10600002</td><td></td></tr><tr><td>Pęczek czerwony</td><td>Roth</td><td>5938.2</td><td></td></tr><tr><td>Mleko w proszku</td><td>Roth</td><td>T145.3</td><td></td></tr><tr><td>ECL</td><td>Millipore</td><td>WBLUF 0500</td><td></td></tr><tr><td>0,5 ml Filtr odśrodkowy z membraną 3 kDa</td><td>Merck-Millipore</td><td>UFC500324</td><td></td></tr><tr><td>probówki wirówkowe 15 ml</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430791-500EA</td><td></td></tr><tr><td>2-merkaptoetanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250-10ML</td><td></td></tr><tr><td>2-Propanol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34965-1L</td><td>HPLC gradient klasy</td></tr><tr><td>4,5-metylenodioksy-1,2-fenylenodiaminy dichlorowodorek</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D4784-50MG</td><td></td></tr><tr><td>48 dołk, płaska płytka do hodowli tkankowej</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS3548-100EA</td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki wirówkowe</td><td>Sigma-Aldrich (Corning)</td><td>CLS430829-500EA</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitryl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34967-1L</td><td>HPLC gradientowa</td></tr><tr><td>aprotynina z płuc bydlęcych</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1153-10MG</td><td>liofilizowany proszek, 3-8 TIU/mg stały</td></tr><tr><td>chlorek butyrylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>109614-250G</td><td></td></tr><tr><td>C18 Kolumna RP</td><td>Phenomenex</td><td>00F-4435-E0</td><td>110 &Aring;, 3 &mikro; Wielkość cząstek M, 4,6 x 150 mm</td></tr><tr><td>Chlorowodorek D-mannozaminy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4670-1G</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Buforowany fosforanem roztwór soli</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>Kwas etylenodiaminotetraoctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884-100G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas mrówkowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>56302-50ML-GL</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór</td> <td>kwasu solnegoSigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>36,5-38,0%, w wodzie</td></tr><tr><td>Leupeptin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L2884-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Carl-Roth</td><td>T169.2</td><td>HPLC klasa gradientu</td></tr><tr><td>N-acetylo-D-mannozamina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8176-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-acetyloneuraminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0812-25MG</td><td></td></tr><tr><td>Kwas N-glikolyloneuraminowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9793-10MG</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek fenylometanosulfonylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7626-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek propionylu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P51559-500G</td><td></td></tr><tr><td>Probówki Safe-Lock, 1,5 mL, bursztynowe (ochrona przed światłem)</td><td>Probówki Eppendorf</td><td>30120191</td><td></td></tr><tr><td>Safe-Lock, 1,5 mL, bezbarwne</td><td>Eppendorf</td><td>30120086</td><td></td></tr><tr><td>Sodium roztwór wodorosiarczynu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>13438-1L-R-D</td><td>40%, w wodzie</td></tr><tr><td>Chlorek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746398-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>795429-500G-D</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>roztwór Sigma-Aldrich</td><td>319511-500ML</td><td>1,0 M, w wodzie</td></tr><tr><td>Mettlenek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>164992-5G</td><td></td></tr><tr><td>Kwas trifluorooctowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6508-100ML-D Chlorowodorek</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941-100G</td><td></td></tr><tr><td>Trypsyna 0,25 %/EDTA 0,02 % w PBS</td><td>PAN Biotech</td><td>P10-019100</td><td></td></tr><tr><td>Woda</td><td>Carl-Roth</td><td>T905.1</td><td>Klasa gradientu HPLC</td></tr><tr><td>Żel krzemionkowy 60</td><td>Carl-Roth</td><td>9779.1</td><td></td></tr><tr><td>HPLC</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>System ESI-MSD</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych n-acylem

Metabolic Glycoengineering of Sialic Acid Using N-acyl-modified Mannosamines

Kwas sjalowy (Sia) jest bardzo ważnym składnikiem glikokoniugatów, takich jak N- i O-glikany czy glikolipidy. Ze względu na swoje położenie na nieredukujących końcach oligo- i polisacharydów, a także swoje unikalne właściwości chemiczne, kwas sjalowy bierze udział w wielu różnych interakcjach receptor-ligand. Modyfikując ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórki, w konsekwencji wpłynie to na interakcje zależne od kwasu sjalowego. Może to być pomocne w badaniu interakcji zależnych od kwasu sjalowego i może potencjalnie wpływać na niektóre choroby w korzystny sposób. Poprzez glikoinżynierię metaboliczną (MGE) można modulować ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórki. W tym przypadku komórki, tkanki, a nawet całe zwierzęta są traktowane zmodyfikowanymi C2 pochodnymi N-acetylmannosaminy (ManNAc). Te aminokwasy cukry działają jako cząsteczki prekursorowe kwasu sjalowego i dlatego są metabolizowane do odpowiednich gatunków kwasu sjalowego i wyrażane na glikokoniugatach. Zastosowanie tej metody daje intrygujące efekty w różnych procesach biologicznych. Na przykład może drastycznie zmniejszyć ekspresję kwasu polisjalowego (polySia) w leczonych komórkach neuronalnych, a tym samym wpływać na wzrost i różnicowanie neuronów. Tutaj pokazujemy syntezę chemiczną dwóch najczęstszych pochodnych N-acylomannozaminy modyfikowanej C2, N-propionylomannozaminy (ManNProp) oraz N-butanoylmannosaminy (ManNBut), a ponadto pokazujemy, jak te nienaturalne aminocukry można zastosować w eksperymentach z hodowlą komórkową. Ekspresja zmodyfikowanych gatunków kwasu sjalowego jest oznaczana ilościowo za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) i dalej analizowana za pomocą spektrometrii mas. Wpływ na ekspresję kwasu polisjalowego jest wyjaśniany za pomocą Western blot przy użyciu dostępnego na rynku przeciwciała przeciwko kwasowi polisjalowemu.

Chromatogramy HPLC standardów Neu5Ac i Neu5Gc znakowanych fluorescencyjnie przedstawiono na Rysunku 2. Stosując opisaną tutaj metodę, znakowany DMB Neu5Gc eluuje zazwyczaj w czasie od 7 do 9 min, a DMB-Neu5Ac w czasie od 10 do 12 min. Na chromatogramie zazwyczaj pojawia się kilka mniejszych pików między 2. a 6. minutą. Piki te odpowiadają niezreagowanemu DMB oraz produktom pośrednim reakcji25.
<p class="jove_content" fo:keep-togeth...

Kwas sjalowy to typowa jednostka monosacharydowa występująca w glikokoniugatach. Bierze udział w wielu interakcjach molekularnych i komórkowych. W artykule przedstawiono metodę modyfikacji ekspresji kwasu sjalowego na powierzchni komórki za pomocą glikoinżynierii metabolicznej z pochodnymi N-acetylmannosaminy.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Sialic acid (Sia) is a highly important constituent of glycoconjugates, such as N- and O-glycans or glycolipids. Due to its position at the non-reducing ...

Ogólnym celem tej techniki jest generowanie komórek lub produktów pochodzenia komórkowego z modyfikowaną ekspresją kwasu sialowego. W tym celu komórki poddaje się działaniu N-acylo-modyfikowanych mannozamin, które są metabolizowane do odpowiadających im kwasów sialowych, a następnie eksponowane na powierzchni komórek. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny glikobiologii, takie jak wpływ glikokoniugatów na oddziaływania receptor-ligand.Główną zaletą tej techniki jest łatwość zastosowania oraz jej czysto cytotoksyczny charakter. Aby zademonstrować metaboliczną glikoinżynierię, wykorzystamy dostępną komercyjnie N-acetylmannosaminę. Ponadto zaprezentujemy syntezę i zastosowanie N-propionylomannosaminy oraz N-butanoylomannosaminy.Przedstawiono biologiczne efekty metabolicznej glikoinżynierii w odniesieniu do ekspresji kwasu polisjalowego. Najpierw rozpuścić 431,2 mg Mannosamine hydrochloride w 10 ml 3 mM roztworu Sodium methoxide w 15 ml szklanej butelce z mieszadłem magnetycznym. Schłodzić mieszaninę na lodzie do 0 °C.Podczas mieszania powoli dodawać kroplami 210 µm propionyl chloride do roztworu. Następnie inkubować mieszaninę pod stałym mieszaniem w tempera

metabolic-glycoengineering-sialic-acid-using-n-acyl-modified

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Aby kompleksowo zbadać różnorodność glikanów sprzężonych z O, nowa procedura redukcyjnej eliminacji β w żelu, połączona z permetylacją i metodą szybkiego podziału fazy, jest stosowana do analizy glikanów sprzężonych z O, bezpośrednio uwalnianych z glikoprotein rozdzielonych przez SDS-PAGE i podatnych na późniejszą analizę glikomiczną za pomocą spektrometrii mas.

Ulepszona redukcyjna eliminacja β w żelu dla kompleksowych O-sprzężonych i sulfoglikomów za pomocą spektrometrii mas

Modułowe podejście do syntezy N-glikanów do dołączania do szkiełka pokrytego tlenkiem glinu (ACG) jako mikromatrycy glikanowej zostało opracowane i zademonstrowano jego zastosowanie do profilowania przeciwciała neutralizującego wirusa HIV.

Chemoenzymatyczna synteza N-glikanów do tworzenia macierzy i profilowania przeciwciał HIV

Opisujemy opartą na HPLC metodę oznaczania kwasu N-acetyloneuraminowego i kwasu N-glikolilenuraminowego w wątrobie i mleku myszy.

Oznaczanie kwasów sjalowych w próbkach wątroby i mleka myszy typu dzikiego i myszy z nokautem CMAH.

Analizy biochemiczne i strukturalne glikozylowanych białek wymagają stosunkowo dużej ilości jednorodnych próbek. W tym miejscu przedstawiamy skuteczną metodę chemiczną specyficznej dla miejsca glikozylacji rekombinowanych białek oczyszczonych z bakterii poprzez celowanie w reaktywne tiole Cys.

Ukierunkowanie tioli cysteinowych na glikozylację białek rekombinowanych in vitro specyficzną dla miejsca

Tutaj prezentujemy protokoły syntezy nukleozydów disacharydowych metodą regioselektywnej O-glikozylacji rybonukleozydów poprzez tymczasową ochronę ich ugrupowań 2',3'-diolu za pomocą cyklicznego estru boronowego. Metoda ta ma zastosowanie do kilku niezabezpieczonych nukleozydów, takich jak adenozyna, guanozyna, cytydyna, urydyna, 5-metylurydyna i 5-fluorourydyna, aby uzyskać odpowiednie nukleozydy disacharydowe.

Regioselektywna O-glikozylacja nukleozydów poprzez tymczasową ochronę 2',3'-diolem przez ester boronowy do syntezy nukleozydów disacharydowych

Wzór glikozylacji przeciwciała determinuje jego skuteczność kliniczną, dlatego przemysłowe i akademickie wysiłki zmierzające do kontroli glikozylacji trwają. Ponieważ typowe kampanie glikoinżynieryjne są czasochłonne i pracochłonne, przydatne byłoby opracowanie szybkiego protokołu do scharakteryzowania wpływu genów glikozylacji za pomocą przejściowego wyciszania.

Szybka glikoinżynieria przeciwciał w komórkach jajnika chomika chińskiego

Przedstawiono unikalny, kompleksowy protokół generowania de-sialylowanych ludzkich komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów (mo-DCs) z izolowanych komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMCs) za pomocą leczenia sialidazą. Ponadto opisano metody oceny charakterystyki fenotypowej i funkcjonalnej mo-DC oraz oceny, w jaki sposób leczenie sialidazą poprawia poziom dojrzewania mo-DC.

Generowanie komórek dendrytycznych pochodzących z monocytów o różnych fenotypach sjalowanych

Tutaj proponujemy prosty protokół łączący metaboliczną inżynierię oligosacharydów, chemię kliknięć i mikroskopię ekspansji, który umożliwia bioobrazowanie wewnątrzkomórkowych sjalowanych N-glikoprotein z lepszą rozdzielczością przy użyciu rutynowego sprzętu mikroskopowego.

Wizualizacja sialilacji wewnątrzkomórkowej za pomocą chemii kliknięć i mikroskopii ekspansyjnej

Opisano nowatorskie podejście umożliwiające analizę wysokiej rozdzielczości interakcji komórek nowotworowych z egzogennym kwasem hialuronowym (HA). Powierzchnie wzorowane są wytwarzane poprzez połączenie chemii karbodiimidowej i mikrodruku kontaktowego.

Powierzchnie z mikrowzorami do badania oddziaływań kwasu hialuronowego z komórkami nowotworowymi

Przedstawiono opis kalibracji zintegrowanych czujników biologicznych (FIBS) Förster Resonance Energy Transfer do profilowania metabolicznego in situ. FIBS może być używany do pomiaru wewnątrzkomórkowych poziomów metabolitów w sposób nieinwazyjny, pomagając w rozwoju modeli metabolicznych i wysokoprzepustowych badaniach przesiewowych warunków bioprocesowych.

Nieinwazyjne profilowanie metaboliczne z wykorzystaniem FIBS

Poznaj metodę glikoinżynierii metabolicznej modyfikującą ekspresję kwasu sjalowego na powierzchni komórek przy użyciu pochodnych N-acetylomannozaminy. Technika ta umożliwia badanie interakcji receptor-ligand w glikobiologii.

Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Przeglądaj więcej filmów