Glikoinżynieria metaboliczna kwasu sjalowego z wykorzystaniem mannozaminy modyfikowanych N-acylem

Ogólnym celem tej techniki jest wygenerowanie komórek lub produktów pochodzących z komórek ze zmodyfikowaną ekspresją kwasu sjalowego. Dlatego komórki są traktowane mannosaminami modyfikowanymi N-acylem, które są metabolizowane do odpowiednich kwasów sjalowych, a następnie ulegają ekspresji na powierzchni komórki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie glikobiologii, takie jak wpływ glikokoniugatów na interakcje receptor-ligand.

Główną zaletą tej techniki jest to, że jest łatwa w aplikacji i czysto cytotoksyczna. Aby zademonstrować glikoinżynierię metaboliczną, użyjemy N-acetylmannosaminy, która jest dostępna na rynku. Ponadto zademonstrujemy syntezę i zastosowanie N-propionylu i N-butanoylmannosaminy.

Przedstawiono biologiczny wpływ glikoinżynierii metabolicznej na ekspresję kwasu polisjalowego. Najpierw rozpuść 431,2 miligrama chlorowodorku mannosaminy w 10 mililitrach trzech milimolowych roztworów mettlenku sodu w 15-mililitrowej szklanej butelce zawierającej mieszadło. Schłodzić mieszaninę na lodzie do zera stopni Celsjusza.

Mieszając, powoli dodawaj kroplami 210 mikrometrów chlorku propionylu do roztworu. Następnie inkubuj mieszającą mieszaninę w temperaturze zero stopni Celsjusza przez cztery godziny. Następnie przenieś roztwór do 50-mililitrowej plastikowej tubki i wbij cienką igłą od czterech do 8 otworów w nasadce tubki.

Szybko zamroź roztwór za pomocą ciekłego azotu. Następnie liofilizuj próbkę, aż do całkowitego wyschnięcia. Po liofilizacji wysuszony produkt rozpuścić w octanie etylu, metanolu i wodzie.

Za pomocą pipety załaduj roztwór na wcześniej przygotowaną kolumnę z żelem krzemionkowym. Po wypudowaniu 500 mililitrów rozpuszczalnika zbierz cztery frakcje mililitrowe. Przenieś wymyte frakcje do 15-mililitrowej plastikowej rurki i wbij cienką igłą od trzech do sześciu otworów w nasadce tubki.

Po zamrożeniu roztworu ciekłym azotem należy liofilizować próbkę aż do całkowitego wyschnięcia. Hodowla komórek nerwiaka zarodkowego Kelly'ego w pożywce RPMI w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Przed zastosowaniem mannosaminy należy odłączyć komórki nerwiaka zarodkowego Kelly'ego, inkubując je przez 10 minut z trypsyną i EDTA.

Po zneutralizowaniu trypsyny pożywką RPMI należy policzyć komórki za pomocą komory Neubauera. Aby zmierzyć cukrów prostych kwasu sjalowego, umieść komórki w 500 mikrolitrach pożywki na 48-dołkowej płytce do hodowli tkankowej. W celu analizy kwasów polisjalowych należy umieścić komórki w trzech mililitrach pożywki na naczyniu do hodowli komórkowych o średnicy sześciu centymetrów.

Dodać odpowiednie pochodne mannozaminy, rozpuszczone w RPMI, do świeżo posianych komórek, w końcowym stężeniu pięciu milimoli i inkubować w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla, zastępując pożywkę zawierającą mannosaminy modyfikowane N-acylem co 24 godziny. Po zabiegu zdekantować pożywkę i przemyć komórki PBS. Odłącz komórki, inkubując je przez 10 minut z trypsyną i EDTA.

Zneutralizuj trypsynę, dodając tę samą objętość pożywki do hodowli komórkowych do oderwanych komórek. Następnie przenieś odłączone komórki do 15-mililitrowych plastikowych rurek. Odwirowywać próbki przez trzy minuty w temperaturze 500 razy G. Po odrzuceniu supernatantu przemyć komórki trzykrotnie pięcioma mililitrami PBS.

Po odwirowaniu ponownie zawieś zebrane granulki komórek w 500 mikrolitrach lodowatego buforu do lizy HPLC. Próbki należy poddać działaniu ultradźwięków za pomocą igły procesora ultradźwiękowego trzy razy przez okres 30 sekund przy średnio-wysokich amplitudach, schładzając próbki na lodzie przez co najmniej jedną minutę pomiędzy cyklami. Po odwirowaniu zlizowanych próbek komórek należy oddzielić supernatant od frakcji błonowych w 1,5-mililitrowych probówkach z tworzywa sztucznego.

W przypadku hydrolizy kwasowej dodać 150 mikrolitrów jednego molowego roztworu TFA do oddzielonych frakcji membranowych. Inkubować próbki przez cztery godziny w temperaturze 80 stopni Celsjusza, wstrząsając przy 200 do 600 obr./min. Następnie przetransportuj próbki do 0,5 mililitrowych probówek filtracyjnych z trzema membranami wykluczającymi kilodaltony.

Odwirowywać próbki przez około 30 minut w temperaturze 20 000 razy G i 21 stopni Celsjusza, aż objętość górnej fazy będzie mniejsza niż 20 mikrolitrów. Następnie wyrzuć wkładki i cienkiej igły wbij od dwóch do czterech otworów w nakrętkach probówek zawierających ultrafiltrat. Po zamrożeniu próbek ciekłym azotem należy je liofilizować przez noc.

Ponownie zawiesić wysuszone próbki w 10 mikrolitrach 120-milimolowego roztworu TFA i dodać 50 mikrolitrów roztworu DMB. Przenieś próbki do ciemnych probówek o pojemności 1,5 mililitra, aby chronić je przed światłem ultrafioletowym. Inkubuj próbki błony komórkowej i wzorce przez 1,5 godziny w temperaturze 56 stopni Celsjusza.

Po inkubacji dodać cztery mikrolitry 400-milimolowego roztworu wodorotlenku sodu do każdej próbki, aby zatrzymać reakcję znakowania. W przypadku analizy HPLC ustaw temperaturę kolumny na 40 stopni Celsjusza i skonfiguruj detektor fluorescencji odpowiednio na 373 nanometry dla wzbudzenia i 448 nanometrów dla pominięcia. Wstrzyknąć 10 mikrolitrów objętości próbki i oddzielić sondy na 15 minut przy natężeniu przepływu 0,5 mililitra na minutę z metanolem, acetonitrylem i wodą jako eluantem.

W celu analizy spektrometrii mas wstrzyknąć 20 mikrolitrów każdej pobranej próbki HPLC do systemu selektywnego detektora masy LC. W oprogramowaniu ewaluacyjnym systemu selektywnego detektora masy LC wybrać interesujący nas pik w chromatogramie jonów całkowitych. Wyświetla widmo masowe rozdzielczego piku i dodatni stosunek masy do ładunku w zakresie od 300 do 700.

Dodaj jeden mililitr buforu do lizy western blot do wcześniej przygotowanych granulek komórek glikoinżynieryjnych i wiruj. Próbki należy inkubować przez 30 minut na lodzie, wirując co pięć minut. Następnie odwiruj próbki przez 1,5 godziny w temperaturze 20 000 razy G i czterech stopniach Celsjusza.

Następnie zbierz supernatant zawierający białka z lizowanych komórek do 1,5 mililitrowych probówek. Przygotuj próbki na stronę SDS, dodając 10 mikrolitrów buforu do próbek Laemmli do 90 mikrolitrów każdej frakcji białkowej. Gotować próbki przez pięć minut.

Po załadowaniu próbek do 8% żelu akryloamidowego SDS, uruchom żel przy natężeniu 25 miliamperów przez dwie godziny w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu ostrożnie zdejmij szklaną osłonę z żelu i wytnij górną część żelu zawierającą kieszenie ładunkowe. Następnie umieść żel na membranie 0,2 mikronitrocelulozy, uprzednio nasączonej buforem western blot.

Przenieś białka do nitrocelulozy zgodnie z zaleceniami systemu. Po usunięciu błony nitrocelulozowej z systemu bibuły, należy zabarwić plamę czerwienią Pangleau, aby uwidocznić białka, a tym samym kontrolować jakość transferu. Następnie przenieś membranę nitrocelulozową do plastikowej komory i dodaj 10 mililitrów roztworu blokującego.

Po inkubacji membrany nitrocelulozowej zdekantować roztwór blokujący i dodać przeciwciało monoklonalnego kwasu antypolisjalowego 735 do PBS. Po inkubacji przemyć membranę co najmniej trzy razy przez pięć minut PBS. Teraz dodaj poliklonalne przeciwciało drugorzędowe anty-mysie IgG sprzężone z peroksydazą chrzanową do błony nitrocelulozowej.

Po inkubacji i umyciu membrany należy przenieść ją na płytkę odpowiedniego imagera. Następnie wykryj sygnał zgodnie z instrukcjami producenta. Kwas N-glikolyl-neuraminowy znakowany DMB eluuje od siedmiu do dziewięciu minut.

A kwas N-acetyloneuraminowy znakowany DMB eluuje między 10 a 12 minut. Kilka mniejszych pików zaobserwowanych na chromatogramie reprezentuje nieprzereagowany DMB i produkty pośrednie reakcji. Chromatogramy HPLC lizatów komórkowych wykazują kilka niezdefiniowanych pików, które reprezentują zanieczyszczenia wewnętrzne i produkty uboczne DMB z reakcji z innymi alfa ketokwasami obecnymi w lizatach komórkowych.

Leczenie N-acetylomannosaminą często prowadzi do wyczerpania kwasu N-glikolyloneuraminowego na powierzchni komórki. W chromatogramach zlizowanych komórek poddanych działaniu kwasu N-propionylu neuraminowego lub kwasu N-butanoylu neuraminowego obserwuje się piki wskazujące na pojawienie się odpowiednich nienaturalnych kwasów sjalowych. Reakcja DMB z gatunkami kwasu sjalowego prowadzi do wzrostu masy cząsteczkowej o 116,2 daltonu w porównaniu z gatunkami kwasu sjalowego, które nie są znakowane tym barwnikiem.

Oprócz potencjonowanych form jonów obserwuje się również addukty sodu. DMB-Neu5Gc eluuje wkrótce po nieprzereagowanym lub częściowo przereagowanym gatunku DMB, co wyjaśnia pojawienie się niezdefiniowanych pików w widmie masowym DMB-Neu5Gc. Leczenie komórek nerwiaka zarodkowego Kelly'ego N-propionylomannozaminą lub N-butanoylmannozaminą prowadzi do zmniejszonej ekspresji kwasu polisjanowego na powierzchni komórki.

Z drugiej strony leczenie N-acetylomannozaminą prowadzi do zwiększonej ekspresji kwasu polisjatynowego. Dzięki zastosowaniu tej techniki w ciągu kilku dni można wygenerować komórki o całkowitej sjalizacji. Tak glikoinżynieryjne komórki mogą być wykorzystane w dalszych eksperymentach.

Na przykład w celu zbadania interakcji receptor-ligand lub, jak pokazano tutaj, w celu zahamowania ekspresji kwasu polisjanowego. Przedstawiona tutaj procedura inżynierii metabolicznej jest zoptymalizowana pod kątem eksperymentów z kwasem sjalowym. Jednak ta sama procedura może być również stosowana w doświadczeniach na zwierzętach.

Mamy nadzieję, że przedstawiony przez nas protokół i ta produkcja wideo pomogą autorom wprowadzić glikoinżynierię metaboliczną do laboratoriów w celu analizy funkcji, a także biologicznej roli kwasu sjalowego i receptorów kwasu sjalowego w układach biologicznych. Chemicy organiczni mogą syntetyzować modyfikowane N-acylem mannosaminy o bardziej złożonych strukturach i używać ich zgodnie z sugestią zawartą w naszym protokole. Zgodnie z naszym protokołem, wszystkie próbki powinny być analizowane natychmiast po znakowaniu fluorescencyjnym.

W związku z tym nie powinno być opóźnień między analizatorami HPLC i ACMS.