Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie drożdżowego testu estrogenowego do ilościowego oznaczenia agonistów ludzkich receptorów estrogenowych ekstrahowanych z produktów do pielęgnacji osobistej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii, zaburzeń endokrynologicznych i ekofizjologii, ponieważ pozwala wykrywać i kwantyfikować estrogeny środowiskowe w wodzie, żywności oraz produktach do pielęgnacji osobistej. Głównymi zaletami tej techniki in vitro są niskie koszty, szerokie zastosowanie oraz fakt, że stanowi ona doskonałą platformę do nauczania technicznych umiejętności laboratoryjnych.

Wykrywanie estrogenów środowiskowych jest kluczowe, ponieważ mogą one zmieniać sygnalizację hormonalną, szczególnie podczas rozwoju płodu oraz w okresach przejść fizjologicznych, takich jak dojrzewanie. Najtrudniejszymi elementami tej metody są obliczenia i analiza danych, które uprościliśmy poprzez opracowanie łatwej w użyciu aplikacji. Niezbędne jest również dokładne pipetowanie.

Protokół ten rozpoczyna się od przygotowania odczynników. Należy przygotować pożywki z glukozą i galaktozą, kontrole nośnika w postaci 50% etanolu oraz standardy estradiolu, które zostaną wykorzystane pierwszego dnia analizy, a także bufor LacZ, ditiotreitol i węglan sodu na drugi dzień. Pożywki z glukozą i galaktozą należy wysterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,2 µm.

Do 23 różnych produktów do higieny osobistej (PCPs) oraz kontroli ekstrakcji można przetestować w trzech powtórzeniach na jednej płytce 96-dołkowej. Produkty PCPs obejmują mydło, krem do włosów, szampon, krem z filtrem przeciwsłonecznym, makijaż, krem do golenia oraz balsam. Na potrzeby filmu próbki zostaną przygotowane z zaledwie ośmiu produktów PCPs.

Połączyć jeden gram każdej próbki z 10 mililitrami bezwodnego etanolu w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Dodatkowo przygotować negatywną kontrolę ekstrakcji składającą się z 11 mililitrów bezwodnego etanolu w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Homogenizować zawartość każdej probówki przez 30 minut, stosując kombinację wstrząsania ręcznego i mieszania na wortexie.

Wiruj probówki stożkowe z maksymalną dopuszczalną prędkością w wirówce z koszyczkami przez 10 minut. Zlej nadsącz z każdej probówki przez sitko do komórek o rozmiarze oczek 40 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie przenieś zawartość każdej probówki 50 ml do szklanej fiolki scyntylacyjnej.

Pozostaw fiolki otwarte w wentylowanej komorze przez jeden tydzień, aby etanol całkowicie odparował. Chroń suszące się próbki przed światłem, aby uniknąć degradacji składników światłoczułych. Po wysuszeniu próbek, każdą z nich zrekonstytuuj w 1 ml 50% etanolu, a następnie wymieszaj w wortexie w celu homogenizacji.

Na dwie noce lub około 42 godziny przed przygotowaniem płyt do badania estrogenowego drożdży (YES), stosując technikę sterylną, należy przeprowadzić pasaż drożdży, dodając 0,1 mililitra każdej aktywnej kultury drożdży do 10 mililitrów sterylizowanej przez filtr pożywki glukozowej w sterylnej kolbie Erlenmeyera. Inkubować w temperaturze 30 °C, zachowując jednocześnie oryginalne kultury jako zapasy. Dwa dni później, w pierwszym dniu testu YES, stosując technikę sterylną, należy rozcieńczyć zawiesiny kultur drożdży oraz sterylizowaną przez filtr pożywkę galaktozową w sterylnym zlewce.

Potwierdź gęstość optyczną, pipetując 120 µL każdej próbki drożdży w trzech powtórzeniach wraz z trzema próbami kontrolnymi z pożywki z galaktozą do przezroczystej płytki polistyrenowej. Użyj spektrofotometru do płytek, aby zweryfikować, czy rozcieńczona kultura drożdży ma wypadkową gęstość optyczną 0,065 ± 0,005 przy długości fali 610 nm. Wyznacz wypadkową wartość OD610 drożdży poprzez odjęcie OD610 prób kontrolnych z pożywki z galaktozą.

Używając pipety wielokanałowej (automatycznej) ze sterylnym końcowym tłokiem strzykawki, należy nanieść rozcieńczoną zawiesinę drożdży do studzienek sterylnej polipropylenowej mikropłytki 96-dołkowej zgodnie z poniższym schematem płyty. Podczas pipetowania należy utrzymywać zawiesinę drożdży w ruchu, stale obracając zlewką lub mieszając roztwór pipetą. Na koniec, do studzienek od H10 do H12, zaznaczonych na zielono w schemacie płyty, należy dodać 120 µL filtrowanego sterylnego pożywki z galaktozą, która posłuży jako kontrola pożywki w celu uwzględnienia absorbancji pochodzącej z samej pożywki.

Przygotuj oddzielne płytki dla każdej kombinacji szczepu drożdży i podłoża kolorymetrycznego, które zostaną poddane badaniu. Następnie, w każdej płytce sporządź krzywą wzorcową poprzez rozcieńczenia seryjne zgodnie z układem płytki. Używając pipety jednokanałowej z jałowymi końcówkami, dodaj 5 µL standardu estradiolu do studni A1, A2 i A3. Użyj pipety wielokanałowej, aby wymieszać zawartość studni poprzez pipetowanie, a następnie przenieś 205 µL z studni A1–A3 do studni B1–B3. Powtarzaj przenoszenie 205 µL aż do rzędu G. Po zakończeniu rozcieńczeń seryjnych odlej 205 µL ze studni G1–G3. Na koniec tego etapu wszystkie studnie ze standardami powinny zawierać 120 µL.

Do każdej studni kontroli nośnika zawierającej zawiesinę drożdży – studni H1, H2 i H3, zaznaczonych na niebiesko w układzie płytki – dodaj 5 µL 50% etanolu. W kolejnym kroku do studni zawierających zawiesinę drożdży, zaznaczonych na fioletowo w układzie płytki, dodaj próbki lub negatywne kontrole ekstrakcji w trzech powtórzeniach po 5 µL każda. Zanotuj, które próbki lub kontrole ekstrakcji zostały umieszczone w poszczególnych studniach.

Aby śledzić, które dołki zawierają próbki, a które nie, należy rozpocząć pracę z nowym pudełkiem końcówek i używać końcówek z tych samych pozycji w pudełku, które odpowiadają położeniu odpowiednich dołków na płytce. Zawartość dołków z próbkami, kontrolą ekstrakcji oraz kontrolą nośnika należy wymieszać poprzez pipetowanie. Objętość w tych dołkach należy dostosować do 120 microliters, usuwając z każdego z nich 205 microliters.

Każdą płytkę należy szczelnie zamknąć sterylną, przepuszczalną folią adhezyjną, opisać i inkubować w temperaturze 30 °C przez 17 godzin. Po 17-godzinnej inkubacji należy wyjąć płytki z inkubatora. Jeśli płytki nie mogą zostać przetworzone natychmiast, należy owinąć je folią spożywczą i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez sześć dni.

Po przygotowaniu płytek do procesu, należy je rozpakować. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszać zawartość każdego rzędu wgłębień, a następnie przenieść 50 µL zawiesiny drożdży z każdego wgłębienia do odpowiadającego mu wgłębienia w przejrzystej polistyrenowej mikropłytce 96-dołkowej. Oznaczyć nową płytkę.

Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego studzienek, należy używać nowych końcówek do pipety dla każdej studzienki, przy czym końcówki nie muszą być sterylne. W dygestorium dodać 20 µL 1 M DTT do 20 mL rozmrożonego, w temperaturze pokojowej buforu LacZ, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM DTT. Dokładnie wymieszać bufor LacZ.

Używając pipety wielokanałowej, dodaj 200 µL buforu LacZ zawierającego DTT oraz ONPG lub CPRG do wszystkich dołków polistyrenowej płytki, a następnie natychmiast zmierz i zapisz gęstość optyczną wszystkich dołków przy 610 nm za pomocą czytnika płytek. Powtórz czynność w razie potrzeby dla kolejnych płytek. Przykryj płytki pokrywkami i inkubuj w temperaturze 30 °C przez wskazany czas.

Po zakończeniu inkubacji wyjmij płytki z inkubatora. Za pomocą pipety wielokrotnej dodaj 100 µL węglanu sodu do każdej studzienki w celu zatrzymania reakcji beta-galaktozydazy. Za pomocą spektrofotometru do płytek zmierz i zapisz gęstość optyczną wszystkich studzienek przy 405 nm dla ONPG lub 574 nm dla CPRG.

Obliczenia wartości LacZ można przeprowadzić za pomocą zautomatyzowanej aplikacji, która wymaga zainstalowanego środowiska Java. Aby rozpocząć, otwórz zautomatyzowaną aplikację LacZ opisaną w dodatku pierwszym. Wklej odczyty gęstości optycznej przy 405 nanometrach dla ONPG lub 574 nanometrach dla CPRG dla wszystkich studzienek, stosując układ płytki identyczny z tym przedstawionym na rysunku pierwszym.

Wprowadź czas inkubacji w godzinach, aby test wytworzył barwę, a następnie kliknij Next. Wklej odczyty gęstości optycznej przy 610 nanometrach dla wszystkich studzienek. Kliknij Submit, aby wyświetlić wyniki LacZ.

Wyniki LacZ można skopiować za pomocą poleceń klawiatury i wkleić do arkusza kalkulacyjnego lub innych plików w razie potrzeby. Rozpocznij analizę, otwierając internetową aplikację do analizy danych testu YES. Prześlij plik danych CSV sformatowany zgodnie z opisem na pierwszej karcie.

Zdigitalizuj krzywą standardową estradiolu w drugiej zakładce i oszacuj parametry regresji. Przejrzyj wyniki modelu regresji w trzeciej zakładce, a następnie znajdź interpolowane wartości osi x odpowiadające wartościom LacZ próbek w czwartej zakładce. Kliknij piątą zakładkę, aby zobaczyć wartości ekwiwalentów estrogenowych lub EEQ próbek.

Na koniec należy znormalizować wartości EEQ do pierwotnej masy próbki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawione są przykłady krzywych wzorcowych po 17-godzinnej inkubacji drożdży z 17 beta-estradiolami. Z powodów omówionych w manuskrypcie, CPRG jest często lepszym wyborem substratu niż ONPG.

Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, testy z wykorzystaniem drożdży wykazujących ekspresję ER Beta były o ponad rząd wielkości bardziej czułe niż testy z drożdżami wykazującymi ekspresję ER Alpha. W konsekwencji aktywność estrogenna była częściej wykrywana w drożdżach wykazujących ekspresję ER Beta. Dodatkowym celem badania było przetestowanie czasów inkubacji, które byłyby zgodne z harmonogramem studiów laboratoryjnych na poziomie licencjackim.

Wprowadzenie sześciodniowego okresu przechowywania w chłodni po 17-godzinnej inkubacji sprawiło, że krzywe wzorcowe z płyt chłodzonych były porównywalne z krzywymi z płyt niechłodzonych. Błędy standardowe parametrów szacowanych za pomocą czteroparametrowych modeli regresji logistycznej były we wszystkich przypadkach mniejsze dla płyt chłodzonych niż dla płyt niechłodzonych. Zatem chłodzenie płyt przez sześć dni zmniejsza błąd i poprawia dokładność szacunków EEQ.

Po opanowaniu, technikę tę można przeprowadzić w dwóch sesjach trwających od trzech do czterech godzin każda. Podczas wykonywania procedury należy pamiętać o stosowaniu technik sterylnych we wszystkich krokach poprzedzających 17-godzinny okres inkubacji, o starannym i dokładnym pipetowaniu oraz o przestrzeganiu układu płytki przedstawionego na rysunku 1. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy in-vivo na zwierzętach, aby zbadać dodatkowe mechanizmy działania estrogennego oraz efekty w całym organizmie.

Po opracowaniu test drożdżowy na estrogeny (yeast estrogen screen) został uznany za niskokosztową metodę pomiaru ligandów estrogenowych w próbkach środowiskowych, takich jak żywność, tkanki roślinne i produkty do higieny osobistej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzać proste ekstrakcje produktów do higieny osobistej, hodować drożdże, przygotowywać standardowe krzywe rozcieńczeń, przeprowadzać test YES na płytce 96-dołkowej oraz wykonywać powiązane obliczenia. Należy pamiętać, że praca z estradiolami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i innego osobistego sprzętu ochronnego, a także zapewnić odpowiednią utylizację odpadów.