Name: Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 14 min 13 s
Description: Poznaj zoptymalizowany drożdżowy ekran estrogenowy do wykrywania ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej. Ta metoda umożliwia ilościowe oznaczanie estrogenów środowiskowych i doskonale nadaje się do nauczania technik laboratoryjnych na studiach licencjackich.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ten projekt został sfinansowany przez fundusze start-upów dla TME i AMR odpowiednio z Louisiana Tech University i Furman University. Dodatkowe finansowanie pochodziło z grantu Faculty Advancement Grant dla AMR i TME w 2015 r. z The Associated Colleges of the South, grantu Louisiana EPSCoR Pfund dla TME z National Science Foundation i Louisiana Board of Regents oraz nagrody podróżniczej dla TME z University of the South. Dziękujemy dr Davidowi Eubanksowi (Furman) za pomoc w analizach statystycznych oraz panu Christopherowi Moore'owi za "podanie nam ręki" podczas kręcenia filmu.

<ol><li>Agradi, E., Vegeto, E., Sozzi, A., Fico, G., Regondi, S., Tome, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Traditional+healthy+Mediterranean+diet%3A+estrogenic+activity+of+plants+used+as+food+and+flavoring+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Phytother+Res%22%5BJournal%5D)">Traditional healthy Mediterranean diet: estrogenic activity of plants used as food and flavoring agents.</a> Phytother Res. 20 (8), 670-675 (2006).</li>
<li>Morgan, H. E., Dillaway, D., Edwards, T. M. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/full/10.4161/endo.28490">Estrogenicity of soybeans (Glycine max) varies by plant organ and developmental stage.</a> Endocr Disruptors. 2 (1), (2014).</li>
<li>Myers, S. L., Yang, C. Z., Bittner, G. D., Witt, K. L., Tice, R. R., Baird, D. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estrogenic+and+anti-estrogenic+activity+of+off-the-shelf+hair+and+skin+care+products%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp.+Sci+Environ+Epidemiol%22%5BJournal%5D)">Estrogenic and anti-estrogenic activity of off-the-shelf hair and skin care products.</a> J Exp. Sci Environ Epidemiol. 25 (3), 271-277 (2015).</li>
<li>Wagner, M., Oehlmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endocrine+disruptors+in+bottled+mineral+water%3A+estrogenic+activity+in+the+E-Screen%5BTitle%5D)+AND+%22J+Steroid+Biochem+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Endocrine disruptors in bottled mineral water: estrogenic activity in the E-Screen.</a> J Steroid Biochem Mol Biol. 127 (1-2), 128-135 (2011).</li>
<li>Arnold, S. F., Robinson, M. K., Notides, A. C., Guillette, L. J. Jr, McLachlan, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+estrogen+screen+for+examining+the+relative+exposure+of+cells+to+natural+and+xenoestrogens%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">A yeast estrogen screen for examining the relative exposure of cells to natural and xenoestrogens.</a> Environ Health Perspect. 104 (5), 544-548 (1996).</li>
<li>Odum, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+rodent+uterotrophic+assay%3A+critical+protocol+features%2C+studies+with+nonyl+phenols%2C+and+comparison+with+a+yeast+estrogenicity+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Regul+Toxicol+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">The rodent uterotrophic assay: critical protocol features, studies with nonyl phenols, and comparison with a yeast estrogenicity assay.</a> Regul Toxicol Pharmacol. 25 (2), 176-188 (1997).</li>
<li>Mellanen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wood-derived+estrogens%3A+studies+in+vitro+with+breast+cancer+cell+lines+and+in+vivo+in+trout%5BTitle%5D)+AND+%22Toxicol+Appl+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Wood-derived estrogens: studies in vitro with breast cancer cell lines and in vivo in trout.</a> Toxicol Appl Pharmacol. 136 (2), 381-388 (1996).</li>
<li>Bergman, A., Heindel, J. J., Jobling, S., Kidd, K. A., Zoeller, R. T. State of the science of endocrine disrupting chemicals – 2012. Inter-Organisation Programme for the Sound Management of Chemicals (IOMC). , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/">http://www.who.int/ceh/publications/endocrine/en/</a> (2013).</li>
<li>Balsiger, H. A., de la Torre, R., Lee, W. Y., Cox, M. B. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/20074779">A four-hour yeast bioassay for the direct measure of estrogenic activity in wastewater without sample extraction, concentration, or sterilization.</a> Sci Total Environ. 408 (6), 1422-1429 (2010).</li>
<li>Coldham, N. G., Dave, M., Sivapathasundaram, S., McDonnell, D. P., Connor, C., Sauer, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+a+recombinant+yeast+cell+estrogen+screening+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Evaluation of a recombinant yeast cell estrogen screening assay.</a> Environ Health Perspect. 105 (7), 734-742 (1997).</li>
<li>De Boever, P., Demaré, W., Vanderperren, E., Cooreman, K., Bossier, P., Verstraete, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+a+yeast+estrogen+screen+and+its+applicability+to+study+the+release+of+estrogenic+isoflavones+from+a+soygerm+powder%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Optimization of a yeast estrogen screen and its applicability to study the release of estrogenic isoflavones from a soygerm powder.</a> Environ Health Perspect. 109 (7), 691-697 (2001).</li>
<li>Fox, J. E., Burow, M. E., McLachlan, J. A., Miller, C. A. 3d <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detecting+ligands+and+dissecting+nuclear+receptor-signaling+pathways+using+recombinant+strains+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Detecting ligands and dissecting nuclear receptor-signaling pathways using recombinant strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nat Protoc. 3 (3), 637-645 (2008).</li>
<li>Routledge, E. J., Sumpter, J. P. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/etc.5620150303/full">Estrogenic activity of surfactants and some of their degradation products assessed using a recombinant yeast screen.</a> Environ Toxicol Chem. 15 (3), 241-248 (1996).</li>
<li>Miller, C. A. 3d, Tan, X., Wilson, M., Bhattacharyya, S., Ludwig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+plasmids+expressing+human+steroid+hormone+receptors+and+a+reporter+gene+for+use+in+yeast+signaling+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Single plasmids expressing human steroid hormone receptors and a reporter gene for use in yeast signaling assays.</a> Plasmid. 63 (2), 73-78 (2010).</li>
<li>Delfosse, V., Grimaldi, M., Cavaillès, V., Balaguer, P., Bourguet, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+profiling+of+environmental+ligands+for+estrogen+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Environ+Health+Perspect%22%5BJournal%5D)">Structural and functional profiling of environmental ligands for estrogen receptors.</a> Environ Health Perspect. 122 (12), 1306-1313 (2014).</li>
<li>Environmental Working Group. Skin Deep Cosmetics Database. , Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.ewg.org/skindeep">http://www.ewg.org/skindeep</a> (2016).</li>
<li>Eustice, D. C., Feldman, P. A., Colberg-Poley, A. M., Buckery, R. M., Neubauer, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+sensitive+method+for+the+detection+of+beta-galactosidase+in+transfected+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A sensitive method for the detection of beta-galactosidase in transfected mammalian cells.</a> Biotechniques. 11 (6), (1991).</li>
<li>Buller, C., Zang, X. P., Howard, E. W., Pento, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+beta-galactosidase+tissue+levels+in+a+tumor+cell+xenograft+model%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Find+Exp+Clin+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Measurement of beta-galactosidase tissue levels in a tumor cell xenograft model.</a> Methods Find Exp Clin Pharmacol. 25 (9), 713-716 (2003).</li>
<li>Pelisek, J., Armeanu, S., Nikol, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+beta-galactosidase+activity+in+tissue+in+the+presence+of+blood%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Evaluation of beta-galactosidase activity in tissue in the presence of blood.</a> J Vasc Res. 37 (6), 585-593 (2000).</li>
<li>Gray, W. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+alcohol+tolerance+of+yeasts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Studies on the alcohol tolerance of yeasts.</a> J Bacteriol. 42 (5), 561-574 (1941).</li>
<li>Schug, T. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Designing+endocrine+disruption+out+of+the+next+generation+of+chemicals%5BTitle%5D)+AND+%22Green+Chem%22%5BJournal%5D)">Designing endocrine disruption out of the next generation of chemicals.</a> Green Chem. 15 (1), 181-198 (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

YES to tania metoda stosowana do wykrywania ligandów estrogenowych w próbkach środowiskowych, takich jak woda, żywność, tkanki roślinne lub produkty higieny osobistej. Przedstawione tutaj dane porównują 2 receptory estrogenowe (ERα i ERβ), 2 substraty (ONPG i CPRG) oraz 2 osie czasu (protokół 2 d bez chłodzenia i protokół siedmiodniowy z chłodzeniem) do pomiaru estrogenności w produktach higieny osobistej za pomocą testu YES. 7-dniowy protokół chłodniczy wykorzystujący CPRG i drożdże wyrażające ERα i/lub ERβ najlepiej określa ilościowo EEQ, a jednocześnie jest zgodny z ograniczeniami czasowymi narzuconymi przez kursy laboratoryjne na studiach licencjackich, które odbywają się tylko raz w tygodniu przez kilka godzin. W rzeczywistości, w porównaniu z testem 2 d bez chłodzenia, siedmiodniowy test z chłodzeniem wiązał się ze zmniejszoną wariancją między powtórzeniami płytek. Ponadto część liniowa krzywej standardowej została nieznacznie rozszerzona dla danych zebranych za pomocą testu chłodzonego. Liniowa część krzywej wzorcowej określa zakres wykrywania testu i jest jedyną częścią krzywej wzorcowej, którą można wykorzystać do interpolacji EEQ próbki.
We wszystkich badanych próbkach, z wyjątkiem jednej, EEQ mierzone za pomocą CPRG były niższe niż te oznaczone ilościowo za pomocą ONPG. Dzięki wyższemu współczynnikowi ekstynkcji i niższemu Km i Vmax, CPRG jest dziesięć razy bardziej czuły niż ONPG17. W związku z tym CPRG może być stosowany w niższych stężeniach i może być stosowany do wykrywania mniejszych ilości β-galaktozydazy. Z tych powodów CPRG jest generalnie preferowany w stosunku do ONPG18,19. Jednak większa czułość substratu nie wyjaśnia niższych wartości EEQ wykrytych za pomocą CPRG. Wyższe wartości EEQ wykryte za pomocą ONPG mogą być spowodowane interferencją matrycy z testem, jak zauważyli inni autorzy 2,18. Żółte pigmenty z ekstraktów produktów higieny osobistej mogą zawyżać wartości EEQ wykrywane za pomocą ONPG. Inni obeszli ten problem, włączając kontrolę pigmentu do swojego projektu eksperymentalnego2, podejście, które podwaja liczbę płytek w eksperymencie. Gdy interferencja matrycy może być problematyczna, CPRG może być preferowanym substratem do testu YES, chociaż jest droższy i wymaga dłuższego czasu inkubacji niż ONPG. Co więcej, zmiana koloru wywołana rozszczepieniem substratu przez β-galaktozydazę jest bardziej dramatyczna w przypadku CPRG, co ułatwia uczniom wizualizację wyników.
Miller i in. (2010), którzy zaprojektowali drożdże użyte w tym protokole, zauważyli, że drożdże wykazujące ekspresję ERβ były 30 razy bardziej wrażliwe na 17β-estradiol niż drożdże eksprymujące ERα, co potwierdzają nasze dane14. Poza potencjalnymi niuansami w budowie plazmidu, Miller i in. (2010) nie mogli wyjaśnić tej różnicy w czułości14. Jedną z różnic między tymi dwoma konstruktami plazmidu jest to, że ekspresja ERα jest regulowana przez galaktozę, podczas gdy ekspresja ERβ jest regulowana przez glukozę lub galaktozę. Drożdże użyte w teście YES są hodowane w pożywkach z glukozą i podaje się im galaktozę tylko wtedy, gdy są rozcieńczone na początku testu. W związku z tym drożdże wykazujące ekspresję ERβ mogą gromadzić większą liczbę kopii białek receptorowych przed rozpoczęciem testu, nadając w ten sposób większą wrażliwość ligandom estrogenowym.
Niższa czułość drożdży wykazujących ekspresję ERα może wyjaśniać wyższe wskaźniki niewykrywania estrogenności w próbkach mierzonych za pomocą ERα w porównaniu z ERβ. Aby zwiększyć prawdopodobieństwo, że EEQ próbki zostaną wykryte, użytkownicy mogą zastosować różne rozpuszczalniki i metody ekstrakcji lub dodać większe objętości próbki do drożdży. Jeżeli stosuje się większe objętości próbek, stężenia wzorców E2 powinny być dostosowane w taki sposób, aby ta sama objętość wzorców i próbek mogła być użyta w badaniu. Jednym z ograniczeń związanych z dodawaniem większej ilości próbki jest to, że drożdże tolerują tylko 6 - 10% etanolu, z lepszą tolerancją w temperaturach inkubacji 30 w porównaniu z 35 °C20. W celu kontroli wpływu etanolu na drożdże, badacze powinni dodać trzy studzienki "tylko drożdże" do układu płytki i potwierdzić, że OD610 tych studzienek "tylko drożdże" jest porównywalne z OD610 studzienek kontrolnych nośnika bezpośrednio po dodaniu buforu LacZ. Alternatywnie, próbki rozpuszczone w etanolu można dodać do suchych płytek mikrodołkowych, a etanol odparować przed dodaniem drożdży. Dimetylosulfotlenek (DMSO) jest również stosowany jako rozpuszczalnik próbki w testach YES, ale końcowe stężenie robocze DMSO z drożdżami powinno być ograniczone do 1%12.
Test YES jest potężnym narzędziem przesiewowym do wykrywania estrogenowości w próbkach środowiskowych. W szczególności YES wykrywa ligandy, które wiążą jądrowe receptory estrogenowe, które oddziałują z elementami odpowiedzi estrogenowej w celu bezpośredniej ekspresji genów14. Jednak TAK ma również istotne ograniczenia. TAK nie wykrywa EE, które działają poprzez mechanizmy niejądrowe, takie jak błonowe receptory estrogenowe lub mechanizmy obejmujące dodatkowe elementy, takie jak czynniki transkrypcyjne białka aktywującego 1 (AP-1). Co więcej, ponieważ drożdże nie mają takiej samej zdolności metabolicznej jak komórki ssaków, TAK nie mogą wykryć ligandów, które wymagają aktywacji metabolicznej, aby być estrogennymi.
Ponadto test YES nie może łatwo rozróżnić ligandów estrogenowych i antyestrogenowych w złożonych próbkach. Zamiast tego mierzy estrogenność netto , która jest sumą efektu ligandów estrogenowych i antyestrogenowych. Aby określić ilościowo stężenie antagonistów ER lub ocenić aktywność hamującą mieszanin, test można zmodyfikować poprzez inkubację drożdży zarówno ze standardowym agonistą (17β-estradiolem), jak i zakresem stężeń próbki testowej12. Proces ten określa, czy antagoniści w próbkach mogą zmniejszać aktywność reporterową indukowaną przez agonistów i stanowi przydatne badanie przesiewowe do identyfikacji obecności antagonistów ER w próbkach.
Przedstawiony tutaj protokół może uwzględniać różne typy próbek, chociaż niektóre próbki mogą wymagać modyfikacji etapów ekstrakcji i przygotowania próbki. Na przykład EEQ różniły się znacznie w zależności od replikacji niektórych produktów higieny osobistej. Bardziej zróżnicowane próbki zawierały kropelki oleju lub w inny sposób nie były całkowicie jednorodne, co wskazuje, że pomocny byłby bardziej lipofilowy rozpuszczalnik, taki jak eter dietylowy. Alternatywnie, oleje i wosk w produktach higieny osobistej można wykluczyć, ekstrahując próbki z 50% etanolem zamiast 100% etanolu. Ekstrakcja 50% etanolem wychwyci również więcej rozpuszczalnych w wodzie ligandów estrogenowych (np. Niektóre pigmenty). Jednak 50% etanolu odparowuje wolniej niż 100% etanolu, a tym samym może wydłużyć czas ekstrakcji. Ponadto niektóre próbki (takie jak mydła) były cytotoksyczne dla drożdży, co skutkowało zmniejszonymi pomiarami gęstości komórek (OD610). Fox i in. (2008) sugerują, że takie próbki należy rozcieńczyć i ponownie przetestować, jeśli różnice w gęstości komórek przekraczają 30% w porównaniu z dołkami kontrolnymi nośników12.
Jeżeli test TAK jest stosowany do celów badań analitycznych, można przebadać krzywe rozcieńczania puli próbek w celu prewencyjnego określenia odpowiednich objętości ekstraktu, który ma zostać dodany do drożdży w kroku 4.5. Alternatywnie, ekstrakty mogą być jednocześnie testowane w wielu objętościach (np. 5 μl i 20 μl ekstraktu dodanego do drożdży w kroku 4.5) lub rozcieńczeniach, które obejmują rzędy wielkości (np. 0,2 μl, 2 μl i 20 μl). "Odpowiednie" objętości ekstraktu to te, które identyfikują estrogenność poprzez dopasowanie wartości LacZ wzdłuż liniowej części krzywej wzorcowej. Optymalizacja zapobiega problemom spowodowanym dodaniem zbyt dużej lub zbyt małej próbki do drożdży, takim jak cytotoksyczność, wyniki fałszywie ujemne lub estrogenność przekraczająca krzywą standardową. Jak wspomniano powyżej, objętość próbek i wzorce E2 powinny być dostosowane, gdy stosuje się różne ilości liganda, tak aby drożdże były wystawione na działanie stałej objętości i stężenia etanolu lub innego nośnika na płytce.
Pomimo możliwości uzyskania wyników fałszywie ujemnych, test YES został zidentyfikowany jako narzędzie testowe poziomu 3 dla substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego przez Schug i in. (2013), którzy opracowali kompleksowy wielopoziomowy protokół zaburzeń endokrynologicznych (TiPED)21. W przypadku edukacji licencjackiej test jest cenny w nauczaniu pojęć związanych z zaburzeniami endokrynologicznymi, hodowlą komórek, wiązaniem receptorów, aktywnością enzymów, inżynierią genetyczną, statystyką i projektowaniem eksperymentalnym. Studenci, którzy korzystają z testu, ćwiczą również podstawowe i szeroko stosowane umiejętności laboratoryjne, takie jak seryjne rozcieńczanie roztworów wzorcowych; pobieranie próbek; tworzenie rozwiązań; konstruowanie i interpolowanie krzywych standardowych; obliczanie stężeń; tworzenie rozwiązań; demonstrowanie sterylnej techniki; hodowla komórek; identyfikowanie zmiennych i kontroli; gromadzenie, organizowanie i analizowanie danych; konstruowanie i interpretacja wykresów; oraz przy użyciu powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak mikropipety i spektrofotometry.

Ekran estrogenowy drożdży (YES) jest szeroko stosowany do ilościowego oznaczania ligandów, które naśladują estradiol (E2 lub 17β-estradiol) w różnych matrycach, w tym w wodzie, tkankach roślinnych, produktach konsumenckich i żywności1,2,3,4. Zbiorczo takie ligandy są określane jako "estrogeny środowiskowe (EE)". YES został pierwotnie opracowany jako tania alternatywa in vitro dla testów in vivo, takich jak test uterotroficzny gryzoni5,6 i test karmienia pstrąga tęczowego7. Celem tych testów jest ustalenie, czy produkt zawiera substancje chemiczne, które stymulują lub blokują mechanizmy zależne od estrogenów. Wykrywanie EE ma kluczowe znaczenie, ponieważ mogą one zakłócać normalną endogenną sygnalizację estrogenową, szczególnie podczas rozwoju płodu. Ta ingerencja zagraża zdrowiu, zwiększając ryzyko otyłości, bezpłodności, raka i utraty funkcji poznawczych8.
Pomimo znaczenia EE i innych EDC dla zdrowia publicznego, zaburzenia endokrynologiczne nie są często uwzględniane w programach studiów licencjackich. Niedobór ten wynika częściowo z braku zajęć, które ilustrują związane z tym zasady, a jednocześnie są dostępne dla studentów studiów licencjackich. Ponadto istnieje kilka odmian protokołu YES9,10,11,12,13, a ta różnorodność sprawia, że optymalizacja testów jest czasochłonna dla koordynatorów laboratoriów, którzy nie są specjalnie przeszkoleni w zakresie odpowiednich technik. Wreszcie, testy TAK są zwykle wykonywane przez 1 długi dzień lub 2 kolejne dni z inkubacją O/N. Termin ten nie jest zgodny z formatem stacjonarnych kursów laboratoryjnych, które zazwyczaj odbywają się raz w tygodniu przez kilka godzin.
W odpowiedzi na te potrzeby, ten manuskrypt informuje o zoptymalizowanym 96-dołkowym protokole YES, który obejmuje metody ekstrakcji etanolowej dla produktów higieny osobistej (PCP)3 oraz 6-dniowy etap chłodzenia, aby dostosować się do cotygodniowych spotkań laboratoryjnych. Etanol absolutny jest wszechstronnym rozpuszczalnikiem organicznym, który może rozpuszczać różne polarne i niepolarne substancje rozpuszczone. Co więcej, nadaje się na studia licencjackie, ponieważ jest łatwo dostępny, stosunkowo nietoksyczny, niedrogi i miesza się z wodą; Łatwo odparowuje również bez specjalnego sprzętu. Jednak etanol nie jest idealny do ekstrakcji silnie hydrofobowych substancji zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego lub wielu olejów i wosków, przy czym te dwa ostatnie są powszechnymi składnikami PCP. Niska wydajność ekstrakcji zwiększa ryzyko wyników fałszywie ujemnych. Mając na uwadze to ograniczenie, badacze powinni wybrać procedury ekstrakcji (np. ekstrakcja etanolowa lub ekstrakcja do fazy stałej), które uwzględniają charakterystykę próbki i spełniają cele badania (badania w porównaniu z instrukcjami licencjackimi).
Tak opiera się na rekombinowanych Saccharomyces cerevisiae, pierwotnie stworzonych przez dr Charlesa Millera z Tulane University. Zobacz Miller i wsp. (2010) dla kompletnej mapy zmodyfikowanego plazmidu14. Drożdże przekształcone za pomocą tych plazmidów konstytutywnie wyrażają ludzkie jądrowe ERα lub ERβ (zwane również odpowiednio ESR1 i ESR2), gdy są hodowane w pożywkach zawierających galaktozę (dla ERα) lub glukozę lub galaktozę (dla ERβ). Jeśli estrogenowe substancje chemiczne są obecne w pożywce, wiążą się z receptorami, tworząc kompleksy ligand-receptor, które aktywują ekspresję β-galaktozydazy (lacZ) na poziomie proporcjonalnym do stężenia estrogenowych substancji chemicznych. Komórki drożdży są następnie poddawane lizie w celu uwolnienia nagromadzonej β-galaktozydazy. Bufor do lizy zawiera ONPG lub CPRG, które są rozszczepiane przez β-galaktozydazę w celu uzyskania odpowiednio żółtych lub czerwonych produktów. Produkty kolorymetryczne można określić ilościowo, mierząc absorbancję za pomocą spektrofotometru z płytką mikrodołkową. Stopień zmiany koloru jest proporcjonalny do stężenia ligandów estrogenowych, na które narażone były drożdże.
Wybór substratu (CPRG lub ONPG) zależy od potencjału absorbancji tła wynikającej z badanych próbek. Na przykład ekstrakty roślinne często dodają żółty odcień do pożywki, która sztucznie zawyża miary estrogenności, jeśli ONPG (określany ilościowo przy 405 nm) jest używany jako substrat dla β-galaktozydazy. W przypadku ekstraktów roślinnych CPRG (oznaczany ilościowo przy 574 nm) może być bardziej odpowiednim substratem kolorymetrycznym. CPRG jest droższa niż ONPG, ale stosuje się ją w jednej dziesiątej molowości. W artykule przedstawiono estrogenność ekstraktów PCP oznaczoną ilościowo zarówno przy użyciu ONPG, jak i CPRG.
Kwantyfikacja estrogenności próbek środowiskowych przy użyciu zarówno ERα, jak i ERβ jest bardziej wszechstronnym podejściem niż użycie tylko jednego z tych receptorów. U zwierząt receptory te wykazują zróżnicowane rozmieszczenie w tkankach, działania regulacyjne i powinowactwo do ligandów estrogenowych i antyestrogenowych15. Na przykład fitoestrogeny pochodzenia roślinnego zazwyczaj wiążą ERβ silniej2, podczas gdy syntetyczne substancje chemiczne mogą preferować ERα lub ERβ lub mogą równie dobrze wiązać oba receptory15. W związku z tym, wiązanie się z jednym receptorem estrogenowym niekoniecznie przewiduje wiązanie się z drugim.
Chociaż EE znajdują się w wielu produktach konsumenckich (np. pestycydach, detergentach, klejach, smarach, tworzywach sztucznych, żywności i farmaceutykach), a także w roślinach, przedstawione dane zostały uzyskane przy użyciu wybranych PCP. PCP są atrakcyjne, łatwo dostępne, przyjazne dla budżetu i istotne dla środowiska dla studentów studiów licencjackich. Studenci mogą zostać zaproszeni do przyniesienia swoich ulubionych PCP z domu w celu przetestowania w laboratorium. Mogą również przeszukiwać bazę danych Skin Deep opracowaną przez Environmental Working Group16 w celu wygenerowania opartych na hipotezach porównań PCP o wysokich i niskich wynikach toksyczności. W ten sposób studenci mogą jednocześnie rozwijać zaawansowane umiejętności laboratoryjne; angażować się w samodzielne uczenie się oparte na dociekaniu; i badać pojawiające się problemy w naukach o środowisku i zdrowiu.

<table><tbody><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex Mixer (do jednej lub wielu rur)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-215-365</td><td>Wystarczy dowolny mikser.</td></tr><tr><td>Wirówka kubełkowa</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>75-063-839</td><td>Każda wirówka kubełkowa wystarczy, jeśli jest w stanie odwirować stożkowe probówki z prędkością 4000 obr./min.</td></tr><tr><td>Palnik Bunsena</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>17-012-823</td><td>Wystarczy dowolny palnik Bunsena lub zamiast niego można użyć palnika alkoholowego (Fisher Scientific 04-245-1).</td></tr><tr><td>Inkubator</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>50125590H</td><td>Każdy inkubator jest wystarczający, jeśli jest w stanie utrzymać temperaturę 30 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Czytnik mikropłytek</td><td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>EPOCH2</td><td>Czytnik płytek innej marki wystarczy, jeśli może mierzyć absorbancję przy długościach fal 405, 574 i 610 nm.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie czytnika mikropłytek i imagera Gen5</td> Wymagane oprogramowanie <td>BioTek (www.biotek.com)</td><td>GEN5</td><td>zależy od marki i modelu czytnika płytek; Oprogramowanie GEN5 jest przeznaczone do użytku z czytnikiem płytek BioTek.</td></tr><tr><td>Lodówka</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05LREEFSA</td><td>Każda lodówka wystarczy, jeśli jest w stanie utrzymać temperaturę 4 stopni Celsjusza.</td></tr><tr><td>Pipetor lub PipetAid kompatybilny z pipetami serologicznymi 1 - 10 ml</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-681-15E</td><td>Wszelkie pipety będą wystarczające, jeśli są kompatybilne z pipetami serologicznymi o pojemności 1 i 10 ml.</td></tr><tr><td>Mikropipet P10</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144562G</td><td>Każdy mikropipet wystarczy, jeśli jest w stanie dozować 5 &mikrolitrów.</td></tr><tr><td>Mikropipeta P200</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F144565G</td><td>Każdy mikropipet wystarczy, jeśli jest w stanie dozować do 200 &mikrolitrów.</td></tr><tr><td>Pipetor wielokanałowy P300</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FBE1200300</td><td>Każdy pipet wielokanałowy jest wystarczający, jeśli jest w stanie dozować 50 - 205 &mikrolitrów.</td></tr><tr><td>Pipetor powtarzalny</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164001G</td><td>Musi być w stanie dostarczyć 100 - 320 &mikro; l; Ten pipetor jest opcjonalny, ponieważ zamiast niego można użyć pipetora wielokanałowego.</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Supplies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterylne probówki stożkowe 15 ml z nakrętkami</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>05-539-801</td><td></td></tr><tr><td>Szklane fiolki scyntylacyjne</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>03-337-4</td><td></td></tr><tr><td>Polistyren 96-dołkowy, płaskie płytki z pokrywką (niesterylne)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12565501</td><td></td></tr><tr><td>Polipropylen 96-dołkowy, mikropłytki płaskodenne bez pokrywy&nbsp;</td><td>Cole-Parmer (www.coleparmer.com)</td><td>EW-01728-81</td><td></td></tr><tr><td>Zlewki szklane 100 ml</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-539H</td><td>Wystarczą dowolne szklane zlewki, jeśli można je sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>Szklane kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB500250</td><td>Wystarczą dowolne szklane kolby Erlenmeyera, jeśli można je sterylizować w autoklawie.</td></tr><tr><td>Sterylna, klejąca, porowata folia&nbsp;</td><td>VWR (www.vwr.com)</td><td>60941-086</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze metalowe</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>12-000-157</td><td>Wystarczą dowolne kleszcze metalowe.</td></tr><tr><td>Zbiornik odczynnika</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>07-200-127</td><td></td></tr><tr><td>Jednostki filtracyjne (0,2 i mikro; m)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>09-761-52</td><td></td></tr><tr><td>Butelka ze spryskiwaczem (na etanol)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>02-897-10</td><td>Wystarczą dowolne laboratoryjne butelki do spryskiwania.</td></tr><tr><td>Autoklawowalne butelki do przechowywania</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>06-414-1D</td><td>Wystarczą dowolne szklane butelki do przechowywania w autoklawie.</td></tr><tr><td>10 ml szklane pipety serologiczne (sterylne)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27F</td><td>Wystarczą dowolne szklane pipety serologiczne.</td></tr><tr><td>1 ml szklane pipety serologiczne (sterylne)</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>13-678-27C</td><td>Wystarczą dowolne szklane pipety serologiczne.</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipetorów P10</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-3810</td><td>Wszelkie końcówki wystarczą, jeśli są kompatybilne z powyższym mikropipetorem.</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipetorów P200</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-8810</td><td>Wszelkie końcówki wystarczą, jeśli są kompatybilne z powyższym mikropipetorem.</td></tr><tr><td>Końcówki do mikropipet P300</td><td>USA Scientific (www.usascientific.com)</td><td>1120-9810</td><td>Wszelkie końcówki wystarczą, jeśli są kompatybilne z powyższym mikropipetorem.</td></tr><tr><td>Końcówki strzykawkowe do pipetora powtarzalnego</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>F164150G</td><td>Wymagane tylko w przypadku użycia pipetora powtarzalnego.</td></tr><tr><td>Sterylne szalki Petriego</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>FB0875712</td><td>Wystarczą dowolne sterylne szalki Petriego.</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Fisher Scientific (www.fishersci.com)</td><td>S37440</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Drożdże&nbsp; Szczepy </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Saccharomyces cerevisiae które nie mają produktu genu TRP1 (np. , W303a)</td><td>American Type Culture Company (ATCC) (www.ATCC.org)</td>Drożdże rekombinowane <td>MYA-151</td><td>są również dostępne na życzenie autorów.</td></tr><tr><td>Receptor/plazmid reporterowy dla ER&alfa;</td><td>Addgene (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERalpha-5Z (Plazmid #23061)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Receptor/plazmid reporterowy dla ER i beta;</td><td>Addgene (www.addgene.org)</td><td>pRR-ERbeta-5Z (Plazmid #23062)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Chemicals</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Difco agar</td><td>BD (www.bd.com)</td><td>214530</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>D0632</td><td>UWAGA:&nbsp; Ditiotreitol działa drażniąco na skórę i oczy.&nbsp; Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, dygestoria, maskę przeciwpyłową), aby uniknąć kontaktu ze skórą i oczami, wdychania i połknięcia.</td></tr><tr><td>Orto-nitrofenylo-&beta;-D-galaktopiranozyd</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>Chlorofenol czerwony-&beta;-D-galaktopyranozyd</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>10884308001</td><td></td></tr><tr><td>Drożdżowa zasada azotowa</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>Y0626</td><td></td></tr><tr><td>Sigma</td><td>glukozy (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Galaktoza</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>G5388</td><td></td></tr><tr><td>Siarczan adeniny</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>A9126</td><td></td></tr><tr><td>Uracyl</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>U0750</td><td></td></tr><tr><td>Leucyna</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>L8000</td><td></td></tr><tr><td>Histydyna</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>H8000</td><td></td></tr><tr><td>17 &beta;-Estradiol& nbsp;</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; MP Biomedycyna&nbsp;</td><td>E8875-250 mg&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 0219456401 - 1 mg</td><td>UWAGA:&nbsp; Estradiol jest podejrzewany o działanie rakotwórcze i toksyczne działanie na rozrodczość. Jest szkodliwy w przypadku wdychania, połknięcia lub wchłaniania przez skórę. Estradiol może szkodzić dzieciom i płodom karmionym piersią. Estradiol jest bardzo toksyczny dla organizmów wodnych. Stosować odpowiednie środki ochrony osobistej (rękawice, dygestorio, maska przeciwpyłowa) i unikać narażenia w czasie ciąży i laktacji. Estradiol powinien być utylizowany jako odpad niebezpieczny i nie powinien być uwalniany do środowiska.</td></tr><tr><td>100% etanol</td><td>Pharmco-Aaper (www.pharmcoaaper.com)</td><td>111000200</td><td></td></tr><tr><td>Sodu fosforan jednozasadowy jednowodny</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodu fosforan dwuzasadowy (bezwodny)</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S0876</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek</td> <td>potasuSigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>Sarkosyl (sól sodowa N-lauroilosarkozyny)</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>L5125</td><td></td></tr><tr><td>Węglan sodu</td><td>Sigma (www.sigmaaldrich.com)</td><td>S7795</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company</td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze </td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel arkusz kalkulacyjny</td><td>Microsoft&nbsp;</td><td></td><td>Excel to wygodne oprogramowanie do obsługi arkuszy kalkulacyjnych do zarządzania danymi wyjściowymi i generowania plików .csv do analizy R.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie Java (wymagane dla aplikacji z Załącznika 1)&nbsp;</td><td>Oracle Corporation</td><td></td><td>Aby obliczyć wartości LacZ za pomocą aplikacji wymienionej w Załączniku 1, należy najpierw pobrać bezpłatne oprogramowanie Java (https://www.java.com/en/download/), a następnie otworzyć aplikację LacZ w Załączniku 1. Wyniki LacZ utworzone przez aplikację można skopiować, naciskając "control (ctrl) + c" na klawiaturach PC lub "command + c" na klawiaturach Mac.</td></tr><tr><td>Oprogramowanie statystyczne JMP w wersji 13.0.0</td><td>SAS Institute</td><td></td><td>Załącznik 2 zawiera wskazówki dotyczące korzystania z JMP w celu dopasowania danych LacZ do czteroparametrowej krzywej regresji logistycznej. Krzywa służy do interpolacji ekwiwalentów estradiolu (EEQ) próbki testowej w stosunku do krzywej wzorca estradiolu.</td></tr><tr><td>R oprogramowanie do obliczeń statystycznych i grafiki</td><td>R Foundation</td><td></td><td>Bezpłatne oprogramowanie R można pobrać ze strony https://www.r-project.org/.&nbsp; Wskazówki i kod dotyczący stosowania R w celu dopasowania danych LacZ do czteroparametrowej krzywej regresji logistycznej podano w dodatku 2.</td></tr></tbody></table>

wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

Detecting Estrogenic Ligands in Personal Care Products using a Yeast Estrogen Screen Optimized for the Undergraduate Teaching Laboratory

Ekran estrogenowy drożdży (YES) jest używany do wykrywania ligandów estrogenowych w próbkach środowiskowych i jest szeroko stosowany w badaniach zaburzeń endokrynologicznych. Ligandy estrogenowe obejmują zarówno naturalne, jak i sztuczne "estrogeny środowiskowe" (EE) znajdujące się w wielu towarach konsumpcyjnych, w tym produktach higieny osobistej (PCP), tworzywach sztucznych, pestycydach i żywności. EE zakłócają sygnalizację hormonalną u ludzi i innych zwierząt, potencjalnie zmniejszając płodność i zwiększając ryzyko choroby. Pomimo znaczenia EE i innych substancji chemicznych zaburzających funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) dla zdrowia publicznego, zaburzenia endokrynologiczne nie są zazwyczaj uwzględniane w programach studiów licencjackich. Niedociągnięcie to wynika częściowo z braku odpowiednich działań laboratoryjnych, które ilustrują stosowane zasady, a jednocześnie są dostępne dla studentów studiów licencjackich. W tym artykule przedstawiono zoptymalizowane TAK do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej, które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje jeden z dwóch substratów kolorymetrycznych (orto-nitrofenylo-β-D-galaktopyranozyd (ONPG) lub chlorofenol czerwony-β-D-galaktopyranozyd (CPRG)), które są rozszczepiane przez β-galaktozydazę, 6-dniowy etap inkubacji w chłodzeniu w celu ułatwienia stosowania na studiach laboratoryjnych, zautomatyzowaną aplikację do obliczeń LacZ oraz kod R do powiązanej 4-parametrowej analizy regresji logistycznej. Protokół został zaprojektowany, aby umożliwić studentom studiów licencjackich opracowywanie i przeprowadzanie eksperymentów, w których badają wybrane przez siebie produkty pod kątem naśladownictwa estrogenu. W trakcie tego procesu dowiadują się o zaburzeniach endokrynologicznych, hodowli komórek, wiązaniu receptorów, aktywności enzymów, inżynierii genetycznej, statystyce i projektowaniu eksperymentalnym. Równolegle ćwiczą również podstawowe i szeroko stosowane umiejętności laboratoryjne, takie jak: obliczanie stężeń; tworzenie rozwiązań; demonstrowanie sterylnej techniki; wzorce seryjnego rozcieńczania; konstruowanie i interpolowanie krzywych standardowych; identyfikowanie zmiennych i kontroli; gromadzenie, organizowanie i analizowanie danych; konstruowanie i interpretacja wykresów; oraz przy użyciu powszechnie używanego sprzętu laboratoryjnego, takiego jak mikropipety i spektrofotometry. W ten sposób wdrożenie tego testu zachęca uczniów do angażowania się w uczenie się oparte na dociekaniu podczas odkrywania pojawiających się problemów w naukach o środowisku i zdrowiu.

Ten artykuł przedstawia zoptymalizowany ekran estrogenów drożdżowych do ilościowego oznaczania ligandów w produktach higieny osobistej (PCP), które wiążą receptory estrogenowe alfa (ERα) i/lub beta (ERβ). Metoda obejmuje dwie opcje substratów kolorymetrycznych, sześciodniową inkubację w chłodzie do wykorzystania na studiach licencjackich oraz narzędzia statystyczne do analizy danych.

Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

The Yeast Estrogen Screen (YES) is used to detect estrogenic ligands in environmental samples and has been broadly applied in studies of endocrine ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest wykorzystanie drożdżowego testu estrogenowego do ilościowego oznaczenia agonistów ludzkich receptorów estrogenowych ekstrahowanych z produktów do pielęgnacji osobistej. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie toksykologii, zaburzeń endokrynologicznych i ekofizjologii, ponieważ pozwala wykrywać i kwantyfikować estrogeny środowiskowe w wodzie, żywności oraz produktach do pielęgnacji osobistej. Głównymi zaletami tej techniki in vitro są niskie koszty, szerokie zastosowanie oraz fakt, że stanowi ona doskonałą platformę do nauczania technicznych umiejętności laboratoryjnych.Wykrywanie estrogenów środowiskowych jest kluczowe, ponieważ mogą one zmieniać sygnalizację hormonalną, szczególnie podczas rozwoju płodu oraz w okresach przejść fizjologicznych, takich jak dojrzewanie. Najtrudniejszymi elementami tej metody są obliczenia i analiza danych, które uprościliśmy poprzez opracowanie łatwej w użyciu aplikacji. Niezbędne jest również dokładne pipetowanie.Protokół ten rozpoczyna się od przygotowania odczynników. Należy przygotować pożywki z glukozą i galaktozą, kontrole nośnika w postaci 50% etanolu oraz standardy estradiolu, które zostaną wykorzystane pierwszego dnia analizy, a także bufor LacZ, ditiotreitol i węglan sodu na drugi dzień. Pożywki z glukozą i galaktozą należy wysterylizować poprzez filtrację przez filtr 0,2 µm.Do 23 różnych produktów do higieny osobistej (PCPs) oraz kontroli ekstrakcji można przetestować w trzech powtórzeniach na jednej płytce 96-dołkowej. Produkty PCPs obejmują mydło, krem do włosów, szampon, krem z filtrem przeciwsłonecznym, makijaż, krem do golenia oraz balsam. Na potrzeby filmu próbki zostaną przygotowane z zaledwie ośmiu produktów PCPs.Połączyć jeden gram każdej próbki z 10 mililitrami bezwodnego etanolu w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Dodatkowo przygotować negatywną kontrolę ekstrakcji składającą się z 11 mililitrów bezwodnego etanolu w probówce stożkowej o pojemności 15 mililitrów. Homogenizować zawartość każdej probówki przez 30 minut, stosując kombinację wstrząsania ręcznego i mieszania na wortexie.Wiruj probówki stożkowe z maksymalną dopuszczalną prędkością w wirówce z koszyczkami przez 10 minut. Zlej nadsącz z każdej probówki przez sitko do komórek o rozmiarze oczek 40 µm do probówki stożkowej o pojemności 50 ml. Następnie przenieś zawartość każdej probówki 50 ml do szklanej fiolki scyntylacyjnej.Pozostaw fiolki otwarte w wentylowanej komorze przez jeden tydzień, aby etanol całkowicie odparował. Chroń suszące się próbki przed światłem, aby uniknąć degradacji składników światłoczułych. Po wysuszeniu próbek, każdą z nich zrekonstytuuj w 1 ml 50% etanolu, a następnie wymieszaj w wortexie w celu homogenizacji.Na dwie noce lub około 42 godziny przed przygotowaniem płyt do badania estrogenowego drożdży (YES), stosując technikę sterylną, należy przeprowadzić pasaż drożdży, dodając 0,1 mililitra każdej aktywnej kultury drożdży do 10 mililitrów sterylizowanej przez filtr pożywki glukozowej w sterylnej kolbie Erlenmeyera. Inkubować w temperaturze 30 °C, zachowując jednocześnie oryginalne kultury jako zapasy. Dwa dni później, w pierwszym dniu testu YES, stosując technikę sterylną, należy rozcieńczyć zawiesiny kultur drożdży oraz sterylizowaną przez filtr pożywkę galaktozową w sterylnym zlewce.Potwierdź gęstość optyczną, pipetując 120 µL każdej próbki drożdży w trzech powtórzeniach wraz z trzema próbami kontrolnymi z pożywki z galaktozą do przezroczystej płytki polistyrenowej. Użyj spektrofotometru do płytek, aby zweryfikować, czy rozcieńczona kultura drożdży ma wypadkową gęstość optyczną 0,065 ± 0,005 przy długości fali 610 nm. Wyznacz wypadkową wartość OD610 drożdży poprzez odjęcie OD610 prób kontrolnych z pożywki z galaktozą.Używając pipety wielokanałowej (automatycznej) ze sterylnym końcowym tłokiem strzykawki, należy nanieść rozcieńczoną zawiesinę drożdży do studzienek sterylnej polipropylenowej mikropłytki 96-dołkowej zgodnie z poniższym schematem płyty. Podczas pipetowania należy utrzymywać zawiesinę drożdży w ruchu, stale obracając zlewką lub mieszając roztwór pipetą. Na koniec, do studzienek od H10 do H12, zaznaczonych na zielono w schemacie płyty, należy dodać 120 µL filtrowanego sterylnego pożywki z galaktozą, która posłuży jako kontrola pożywki w celu uwzględnienia absorbancji pochodzącej z samej pożywki.Przygotuj oddzielne płytki dla każdej kombinacji szczepu drożdży i podłoża kolorymetrycznego, które zostaną poddane badaniu. Następnie, w każdej płytce sporządź krzywą wzorcową poprzez rozcieńczenia seryjne zgodnie z układem płytki. Używając pipety jednokanałowej z jałowymi końcówkami, dodaj 5 µL standardu estradiolu do studni A1, A2 i A3. Użyj pipety wielokanałowej, aby wymieszać zawartość studni poprzez pipetowanie, a następnie przenieś 205 µL z studni A1–A3 do studni B1–B3. Powtarzaj przenoszenie 205 µL aż do rzędu G. Po zakończeniu rozcieńczeń seryjnych odlej 205 µL ze studni G1–G3. Na koniec tego etapu wszystkie studnie ze standardami powinny zawierać 120 µL.Do każdej studni kontroli nośnika zawierającej zawiesinę drożdży – studni H1, H2 i H3, zaznaczonych na niebiesko w układzie płytki – dodaj 5 µL 50% etanolu. W kolejnym kroku do studni zawierających zawiesinę drożdży, zaznaczonych na fioletowo w układzie płytki, dodaj próbki lub negatywne kontrole ekstrakcji w trzech powtórzeniach po 5 µL każda. Zanotuj, które próbki lub kontrole ekstrakcji zostały umieszczone w poszczególnych studniach.Aby śledzić, które dołki zawierają próbki, a które nie, należy rozpocząć pracę z nowym pudełkiem końcówek i używać końcówek z tych samych pozycji w pudełku, które odpowiadają położeniu odpowiednich dołków na płytce. Zawartość dołków z próbkami, kontrolą ekstrakcji oraz kontrolą nośnika należy wymieszać poprzez pipetowanie. Objętość w tych dołkach należy dostosować do 120 microliters, usuwając z każdego z nich 205 microliters.Każdą płytkę należy szczelnie zamknąć sterylną, przepuszczalną folią adhezyjną, opisać i inkubować w temperaturze 30 °C przez 17 godzin. Po 17-godzinnej inkubacji należy wyjąć płytki z inkubatora. Jeśli płytki nie mogą zostać przetworzone natychmiast, należy owinąć je folią spożywczą i przechowywać w lodówce w temperaturze 4 °C przez sześć dni.Po przygotowaniu płytek do procesu, należy je rozpakować. Za pomocą pipety wielokanałowej wymieszać zawartość każdego rzędu wgłębień, a następnie przenieść 50 µL zawiesiny drożdży z każdego wgłębienia do odpowiadającego mu wgłębienia w przejrzystej polistyrenowej mikropłytce 96-dołkowej. Oznaczyć nową płytkę.Aby uniknąć zanieczyszczenia krzyżowego studzienek, należy używać nowych końcówek do pipety dla każdej studzienki, przy czym końcówki nie muszą być sterylne. W dygestorium dodać 20 µL 1 M DTT do 20 mL rozmrożonego, w temperaturze pokojowej buforu LacZ, aby uzyskać końcowe stężenie 1 mM DTT. Dokładnie wymieszać bufor LacZ.Używając pipety wielokanałowej, dodaj 200 µL buforu LacZ zawierającego DTT oraz ONPG lub CPRG do wszystkich dołków polistyrenowej płytki, a następnie natychmiast zmierz i zapisz gęstość optyczną wszystkich dołków przy 610 nm za pomocą czytnika płytek. Powtórz czynność w razie potrzeby dla kolejnych płytek. Przykryj płytki pokrywkami i inkubuj w temperaturze 30 °C przez wskazany czas.Po zakończeniu inkubacji wyjmij płytki z inkubatora. Za pomocą pipety wielokrotnej dodaj 100 µL węglanu sodu do każdej studzienki w celu zatrzymania reakcji beta-galaktozydazy. Za pomocą spektrofotometru do płytek zmierz i zapisz gęstość optyczną wszystkich studzienek przy 405 nm dla ONPG lub 574 nm dla CPRG.Obliczenia wartości LacZ można przeprowadzić za pomocą zautomatyzowanej aplikacji, która wymaga zainstalowanego środowiska Java. Aby rozpocząć, otwórz zautomatyzowaną aplikację LacZ opisaną w dodatku pierwszym. Wklej odczyty gęstości optycznej przy 405 nanometrach dla ONPG lub 574 nanometrach dla CPRG dla wszystkich studzienek, stosując układ płytki identyczny z tym przedstawionym na rysunku pierwszym.Wprowadź czas inkubacji w godzinach, aby test wytworzył barwę, a następnie kliknij Next. Wklej odczyty gęstości optycznej przy 610 nanometrach dla wszystkich studzienek. Kliknij Submit, aby wyświetlić wyniki LacZ.Wyniki LacZ można skopiować za pomocą poleceń klawiatury i wkleić do arkusza kalkulacyjnego lub innych plików w razie potrzeby. Rozpocznij analizę, otwierając internetową aplikację do analizy danych testu YES. Prześlij plik danych CSV sformatowany zgodnie z opisem na pierwszej karcie.Zdigitalizuj krzywą standardową estradiolu w drugiej zakładce i oszacuj parametry regresji. Przejrzyj wyniki modelu regresji w trzeciej zakładce, a następnie znajdź interpolowane wartości osi x odpowiadające wartościom LacZ próbek w czwartej zakładce. Kliknij piątą zakładkę, aby zobaczyć wartości ekwiwalentów estrogenowych lub EEQ próbek.Na koniec należy znormalizować wartości EEQ do pierwotnej masy próbki, zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Przedstawione są przykłady krzywych wzorcowych po 17-godzinnej inkubacji drożdży z 17 beta-estradiolami. Z powodów omówionych w manuskrypcie, CPRG jest często lepszym wyborem substratu niż ONPG.Zgodnie z wcześniejszymi obserwacjami, testy z wykorzystaniem drożdży wykazujących ekspresję ER Beta były o ponad rząd wielkości bardziej czułe niż testy z drożdżami wykazującymi ekspresję ER Alpha. W konsekwencji aktywność estrogenna była częściej wykrywana w drożdżach wykazujących ekspresję ER Beta. Dodatkowym celem badania było przetestowanie czasów inkubacji, które byłyby zgodne z harmonogramem studiów laboratoryjnych na poziomie licencjackim.Wprowadzenie sześciodniowego okresu przechowywania w chłodni po 17-godzinnej inkubacji sprawiło, że krzywe wzorcowe z płyt chłodzonych były porównywalne z krzywymi z płyt niechłodzonych. Błędy standardowe parametrów szacowanych za pomocą czteroparametrowych modeli regresji logistycznej były we wszystkich przypadkach mniejsze dla płyt chłodzonych niż dla płyt niechłodzonych. Zatem chłodzenie płyt przez sześć dni zmniejsza błąd i poprawia dokładność szacunków EEQ.Po opanowaniu, technikę tę można przeprowadzić w dwóch sesjach trwających od trzech do czterech godzin każda. Podczas wykonywania procedury należy pamiętać o stosowaniu technik sterylnych we wszystkich krokach poprzedzających 17-godzinny okres inkubacji, o starannym i dokładnym pipetowaniu oraz o przestrzeganiu układu płytki przedstawionego na rysunku 1. Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak testy in-vivo na zwierzętach, aby zbadać dodatkowe mechanizmy działania estrogennego oraz efekty w całym organizmie.Po opracowaniu test drożdżowy na estrogeny (yeast estrogen screen) został uznany za niskokosztową metodę pomiaru ligandów estrogenowych w próbkach środowiskowych, takich jak żywność, tkanki roślinne i produkty do higieny osobistej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przeprowadzać proste ekstrakcje produktów do higieny osobistej, hodować drożdże, przygotowywać standardowe krzywe rozcieńczeń, przeprowadzać test YES na płytce 96-dołkowej oraz wykonywać powiązane obliczenia. Należy pamiętać, że praca z estradiolami może być niezwykle niebezpieczna, dlatego podczas wykonywania tej procedury należy zawsze stosować środki ostrożności, takie jak noszenie rękawiczek i innego osobistego sprzętu ochronnego, a także zapewnić odpowiednią utylizację odpadów.

detecting-estrogenic-ligands-personal-care-products-using-yeast

Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Ten film opisuje test reporterowy oparty na komórkach w celu określenia aktywności estrogenowej związków pochodzenia roślinnego. Związek o aktywności podobnej do estrogenu naśladuje jego wiązanie z receptorami estrogenowymi i napędza transkrypcję genów enzymu reporterowego. Enzym reporterowy generuje bioluminescencję w reakcji, co wskazuje na aktywność estrogenową związku.

Test aktywności reporterowej receptora estrogenowego w celu zbadania aktywności estrogenowej fitoestrogenów

Związki zaburzające funkcjonowanie układu hormonalnego (EDC) stanowią poważne zagrożenie dla środowiska wodnego. Miejskie oczyszczalnie ścieków w znacznym stopniu przyczyniają się do estrogenowej siły działania wód powierzchniowych. Przedstawiona w artykule metodologia pozwala na ocenę skuteczności i przydatności procesów oczyszczania ścieków w odniesieniu do usuwania EDC.

Wykorzystanie zestawu metod chemicznych i ekotoksykologicznych do oceny skuteczności procesów oczyszczania ścieków w celu usunięcia siły działania estrogenów

Protokół badania przesiewowego pod kątem aktywności endokrynologicznej w organicznych ekstraktach próbek wody, w tym ścieków oczyszczonych i wód powierzchniowych (odbierających), został dostosowany przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych in vitro transaktywacji z zatrzymaniem ("zamrożenie i rozmrożenie").

Badania przesiewowe pod kątem aktywności hormonalnej w wodzie przy użyciu dostępnych na rynku testów biologicznych transaktywacji in vitro

Przedstawiamy metodę analizy aktywności dimeryzacji domeny 4-hydroksy-tamoksyfenu zależnej od receptora estrogenowego alfa ligandu za pomocą testu dwuhybrydowego u ssaków.

Wykrywanie aktywności dimeryzacji receptora estrogenowego alfa wiążącej ligand za pomocą testu dwuhybrydowego ssaków

Zoptymalizowaliśmy dostępny na rynku test reporterowy receptora estrogenowego β do badania pokarmów dla naczelnych u ludzi i innych zwierząt pod kątem aktywności estrogenowej. Potwierdziliśmy ten test, pokazując, że znana estrogenna soja z ludzkiej żywności rejestruje się na wysokim poziomie, podczas gdy inne pokarmy nie wykazują żadnej aktywności.

Badania przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego

Ten protokół opisuje zoptymalizowaną metodę enzymatycznego testu immunopochłaniania (ELISA) do wykrywania i ilościowego oznaczania 17β-estradiolu i testosteronu w ludzkiej cieczy łzowej pobranej za pomocą mikrokapillark. Takie podejście umożliwia minimalnie inwazyjne pomiary stężenia hormonów w łzach.

Wykrywanie hormonów płciowych w błonie łzowej człowieka za pomocą enzymatycznych testów immunopochłaniających

Próbki o mikroobjętości są kwantyfikowane za pomocą systemu spektrofotometrycznego, który wykorzystuje naturalne napięcie powierzchniowe do utrzymania próbek bez użycia kuwet lub kapilar. Zakres dynamiczny stężeń białek oraz szybkość ich pomiaru są znacznie zwiększone dzięki zastosowaniu tej metody.

Oznaczanie stężenia białek w mikroobjętościach z wykorzystaniem spektrofotometru NanoDrop 2000c

W niniejszym opracowaniu opisujemy badanie przesiewowe nadekspresji plazmidowej w Saccharomyces cerevisiae, z wykorzystaniem ułożonej w matrycy biblioteki plazmidów oraz wysokoprzepustowego protokołu transformacji drożdży z użyciem robota do obsługi cieczy.

Wysokoprzepustowy screening nadekspresji plazmidowej w drożdżach

Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody optymalizacji detekcji immunofluorescencyjnej receptora estrogenowego α (ERα) w skrawkach tętnic oponowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego.

Obrazowanie receptorów estrogenowych $\alpha$ w tętniczkach oplątwowych szczura przy użyciu cyfrowego mikroskopu immunofluorescencyjnego

Niniejszy protokół opisuje regularną konserwację i pielęgnację w celu utrzymania optymalnych warunków chowu danio pręgowanych. Film przedstawia procedurę konserwacji systemu, bieżącego utrzymania, karmienia, rozrodu oraz hodowli larw danio pręgowanych.

Regularna pielęgnacja i konserwacja laboratorium rybek danio (Danio rerio): wprowadzenie

Poznaj zoptymalizowany drożdżowy ekran estrogenowy do wykrywania ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej. Ta metoda umożliwia ilościowe oznaczanie estrogenów środowiskowych i doskonale nadaje się do nauczania technik laboratoryjnych na studiach licencjackich.

Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego (Wideo) | JoVE Journal

Wykrywanie ligandów estrogenowych w produktach higieny osobistej za pomocą drożdżowego ekranu estrogenowego zoptymalizowanego pod kątem laboratorium nauczania licencjackiego

Przeglądaj więcej filmów