Name: Jonoforeza w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem w celu ilościowego określenia frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 45 s
Description: Poznaj metodę jonoforezy w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem do ilościowego określania frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu żywego. Technika ta umożliwia badanie dynamicznych zmian fizycznych parametrów ECS.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Praca była wspierana przez NIH NINDS grant R01 NS047557.

<ol><li>Sykova, E., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+in+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Diffusion in brain extracellular space.</a> Physiol Rev. 88 (4), 1277-1340 (2008).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="https://www.researchgate.net/publication/230904011_Diffusion_and_related_transport_mechanisms_in_brain_tissue">Diffusion and related transport mechanisms in brain tissue.</a> Rep Prog Phys. 64 (7), 815-884 (2001).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion-selective+microelectrodes+and+diffusion+measurements+as+tools+to+explore+the+brain+cell+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Ion-selective microelectrodes and diffusion measurements as tools to explore the brain cell microenvironment.</a> J Neurosci Methods. 48 (3), 199-213 (1993).</li>
<li>Nicholson, C., Phillips, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+diffusion+modified+by+tortuosity+and+volume+fraction+in+the+extracellular+microenvironment+of+the+rat+cerebellum%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ion diffusion modified by tortuosity and volume fraction in the extracellular microenvironment of the rat cerebellum.</a> J Physiol. 321, 225-257 (1981).</li>
<li>Nicholson, C., Sykova, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+space+structure+revealed+by+diffusion+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Extracellular space structure revealed by diffusion analysis.</a> Trends Neurosci. 21 (5), 207-215 (1998).</li>
<li>Xie, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sleep+drives+metabolite+clearance+from+the+adult+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Sleep drives metabolite clearance from the adult brain.</a> Science. 342 (6156), 373-377 (2013).</li>
<li>Hrabetova, S., Nicholson, C. Biophysical properties of brain extracellular space explored with ion-selective microelectrodes, integrative optical imaging and related techniques. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/?term=Biophysical+properties+of+brain+extracellular+space+explored+with+ion-selective+microelectrodes%2C+integrative+optical+imaging+and+related+techniques">Electrochemical Methods for Neuroscience Neuroscience</a>. Michael, A. C., Borland, L. M. , CRC press. 167-204 (2007).</li>
<li>Rice, M. E., Okada, Y. C., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anisotropic+and+heterogeneous+diffusion+in+the+turtle+cerebellum%3A+implications+for+volume+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Anisotropic and heterogeneous diffusion in the turtle cerebellum: implications for volume transmission.</a> J Neurophysiol. 70 (5), 2035-2044 (1993).</li>
<li>Vargova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+parameters+of+the+extracellular+space+in+human+gliomas%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Diffusion parameters of the extracellular space in human gliomas.</a> Glia. 42 (1), 77-88 (2003).</li>
<li>Haack, N., Durry, S., Kafitz, K. W., Chesler, M., Rose, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Double-barreled+and+concentric+microelectrodes+for+measurement+of+extracellular+ion+signals+in+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Double-barreled and concentric microelectrodes for measurement of extracellular ion signals in brain tissue.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>Xiao, F., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enlarged+extracellular+space+of+aquaporin-4-deficient+mice+does+not+enhance+diffusion+of+Alexa+Fluor+488+or+dextran+polymers%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Enlarged extracellular space of aquaporin-4-deficient mice does not enhance diffusion of Alexa Fluor 488 or dextran polymers.</a> Neuroscience. 161 (1), 39-45 (2009).</li>
<li>Sherpa, A. D., Pvan de Nes,, Xiao, F., Weedon, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gliotoxin-induced+swelling+of+astrocytes+hinders+diffusion+in+brain+extracellular+space+via+formation+of+dead-space+microdomains%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Gliotoxin-induced swelling of astrocytes hinders diffusion in brain extracellular space via formation of dead-space microdomains.</a> Glia. 62 (7), 1053-1065 (2014).</li>
<li>Kume-Kick, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Independence+of+extracellular+tortuosity+and+volume+fraction+during+osmotic+challenge+in+rat+neocortex%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Independence of extracellular tortuosity and volume fraction during osmotic challenge in rat neocortex.</a> J Physiol. 542 (Pt 2), 515-527 (2002).</li>
<li>Saghyan, A., Lewis, D. P., Hrabe, J., Hrabetova, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extracellular+diffusion+in+laminar+brain+structures+exemplified+by+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Extracellular diffusion in laminar brain structures exemplified by hippocampus.</a> J Neurosci Methods. 205 (1), 110-118 (2012).</li>
<li>Fedirko, N., Svichar, N., Chesler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fabrication+and+use+of+high-speed%2C+concentric+H%2B-+and+Ca2%2B-selective+microelectrodes+suitable+for+in+vitro+extracellular+recording%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophys%22%5BJournal%5D)">Fabrication and use of high-speed, concentric H+- and Ca2+-selective microelectrodes suitable for in vitro extracellular recording.</a> J Neurophys. 96 (2), 919-924 (2006).</li>
<li>Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+from+an+injected+volume+of+a+substance+in+brain+tissue+with+arbitrary+volume+fraction+and+tortuosity%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Diffusion from an injected volume of a substance in brain tissue with arbitrary volume fraction and tortuosity.</a> Brain Res. 333 (2), 325-329 (1985).</li>
<li>Nicholson, C., Tao, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hindered+diffusion+of+high+molecular+weight+compounds+in+brain+extracellular+microenvironment+measured+with+integrative+optical+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Hindered diffusion of high molecular weight compounds in brain extracellular microenvironment measured with integrative optical imaging.</a> Biophys J. 65 (6), 2277-2290 (1993).</li>
<li>Thorne, R. G., Nicholson, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+diffusion+analysis+with+quantum+dots+and+dextrans+predicts+the+width+of+brain+extracellular+space%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">In vivo diffusion analysis with quantum dots and dextrans predicts the width of brain extracellular space.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (14), 5567-5572 (2006).</li>
<li>Wolak, D. J., Thorne, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffusion+of+macromolecules+in+the+brain%3A+implications+for+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pharm%22%5BJournal%5D)">Diffusion of macromolecules in the brain: implications for drug delivery.</a> Mol Pharm. 10 (5), 1492-1504 (2013).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

<img alt="Rysunek 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig10.jpg" /> 
Rysunek 10: Nieidealne dane obrazujące typowe problemy techniczne. (a) Schematy typowych problemów technicznych z mikroelektrodami do jontoforezy: Porównanie prawidłowego uwalniania TMA z działającej mikroelektrody jontoforetycznej z trzema źródłami wykazującymi problemy techniczne. [Duże powiększenie, a1] Prąd w idealnym źródle jontoforetycznym jest przenoszony w równym stopniu przez uwalnianie T...

Przestrzeń zewnątrzkomórkowa (ECS) to sieć połączonych ze sobą kanałów znajdujących się na zewnątrz wszystkich komórek mózgu, zawierająca zarówno płyn śródmiąższowy, jak i macierz zewnątrzkomórkową (Rycina 1a oraz Rycina 1b). Dystrybucja wielu substancji niezbędnych do funkcjonowania komórek mózgu, w tym składników odżywczych, hormonów i neurotransmiterów, odbywa się poprzez dyfuzję w obrębie ECS. Zmiany parametrów fizycznych tej przestrzeni, w tym objętości, geometrii i macierzy zewnątrzkomórkowej, mogą drastycznie wpływać na dyfuzję przez ECS oraz lokalne stężenia jonów otaczających komórki mózgu, co ma głęboki wpływ na funkcjonowanie tych komórek1,2.
Iontoforeza w czasie rzeczywistym (RTI) jest wykorzystywana do określania dwóch charakterystyk strukturalnych regionu mózgu: frakcji objętościowej oraz krętości3,4,5. Frakcja objętościowa (α) to proporcja objętości tkanki zajmowanej przez ECS (VECS) w stosunku do całkowitej objętości tkanki (Vtissue) w reprezentatywnej objętości elementarnej;
<img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq1.jpg" />
Krętość (λ) to względna przeszkoda, jaką napotyka substancja dyfundując przez region mózgu w porównaniu do ośrodka pozbawionego przeszkód;
<img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq2.jpg" />
gdzie D* (cm2 s-1) to efektywny współczynnik dyfuzji substancji w mózgu, a D (cm2s-1) to współczynnik dyfuzji swobodnej substancji w medium swobodnym, takim jak rozcieńczony żel agarozowy.
Obecnie najczęściej stosowaną substancją sondą w metodzie RTI jest mały kation tetrametylammonium (TMA). TMA ma masę cząsteczkową 74 g/mol, całkowicie dysocjuje w roztworze i posiada jeden ładunek dodatni. Badania RTI z wykorzystaniem tego jonu wykazały, że α <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 0.2 oraz λ <img alt="Równanie" src="/files/ftp_upload/55755/55755eq3.jpg" /> 1.61,2. Oznacza to, że ECS stanowi w przybliżeniu 20% całkowitej objętości mózgu, a dyfuzja małej, obojętnej cząsteczki zachodzi w ECS około 2,5 raza wolniej niż w ośrodku bez przeszkód3. Jednakże zarówno α, jak i λ zmieniają się w zależności od wieku mózgu, regionu i stanu, a także w warunkach patologicznych1. Zmiany tych parametrów wiązano z rozwojem mózgu, starzeniem się, snem, epilepsją oraz wieloma innymi podstawowymi procesami i chorobami mózgu1,6. Choć inne techniki pozwalają mierzyć α i λ, RTI umożliwia pomiar obu tych wartości w lokalnych obszarach żywej tkanki w czasie rzeczywistym. Z tego powodu RTI stało się niezastąpionym narzędziem do badania zmian α i λ podczas ostrych i odwracalnych czynników stresowych.
Teoria wspierająca RTI została pierwotnie zwalidowana przez Nicholsona i Phillipsa, a technika ta jest szeroko stosowana od tamtego czasu4,7. Eksperymenty z wykorzystaniem RTI rozpoczynają się od uwolnienia impulsu TMA z mikroelektrody źródłowej poprzez jontoforezę do rozcieńczonego żelu agarozowego. Po wyrzuceniu jony swobodnie dyfundują z punktowego źródła, wybierając jedną z potencjalnie nieskończonej liczby losowych ścieżek (Rysunek 1d). Zmieniające się stężenie jonów jest mierzone w czasie za pomocą mikroelektrody selektywnej jonowo (ISM) umieszczonej w odległości około 100 µm (Rysunek 1c). Zmiany stężenia TMA są nanoszone na wykres i dopasowywane do krzywej, co pozwala na obliczenie zarówno D, jak i liczby transportowej mikroelektrody jontoforetycznej (parametry omówione w Protokole). Mając te wartości, procedurę powtarza się w interesującym badacza obszarze mózgu w celu uzyskania D* oraz obliczenia α i λ. Sterowanie mikroelektrodą jontoforetyczną, zbieranie danych, sporządzanie wykresów i dopasowywanie krzywej stężenia TMA oraz obliczanie parametrów eksperymentalnych są zazwyczaj wykonywane przez programy Wanda i Walter, które zostały zaprojektowane specjalnie w tym celu (oprogramowanie i instrukcje są dostępne bezpłatnie od autorów na żądanie).
Sekcja Protokół niniejszego przeglądu opisuje podstawowe procedury niezbędne do zaprojektowania i przeprowadzenia RTI w skrawkach mózgu gryzoni. Technikę tę stosowano również w modelach niegryzoniowych, w tym w skrawkach mózgu ludzkiego oraz w preparatach mózgu in vivo1,4,6,8,9. Sekcja Wyniki Reprezentatywne prezentuje zarówno wyniki idealne, jak i nieidealne, aby zwrócić uwagę na niuanse w interpretacji danych. Na koniec sekcja Dyskusja krótko omawia techniki rozwiązywania problemów, ograniczenia RTI, alternatywne techniki stosowane do badania ECS oraz przyszłe zastosowania RTI.
<img alt="Rycina 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55755/55755fig1.jpg" /> 
Rycina 1: Schematy dyfuzji przez ECS. (a) Schemat ECS: Przedstawia rozmiar i rozmieszczenie ECS w typowym przekroju mózgu. Kolor żółty oznacza ECS pomiędzy szarymi wypustkami komórek mózgu. Objętość ECS stanowi około 20% całkowitej objętości tkanki (t.j. ułamek objętościowy = 0,2) w warunkach fizjologicznych. (b) Powiększony schemat ECS: Wyróżnia parametry fizyczne przyczyniające się do krętości, w tym geometrię komórek mózgu (szare) i macierz zewnątrzkomórkową (przedstawioną jako sieć wielobarwnych glikozaminoglikanów i proteoglikanów). (c) Trójwymiarowy schemat dyfuzji z punktowego źródła: Przedstawia wypadkowy ruch cząsteczek obojętnych ze źródła iontoforetycznego do ISM. Z pominięciem barier dyfuzyjnych i wychwytu komórkowego cząsteczki dyfundują na zewnątrz we wszystkich kierunkach, tworząc sferyczny front stężeń. ISM określa lokalne stężenie cząsteczek obojętnych uwolnionych ze źródła iontoforetycznego. (d) Symulacja komputerowa dyfuzji w ECS mózgu: [Po lewej] Konfiguracja symulacji Monte Carlo; zielone sfery reprezentują wypustki komórek mózgu, a czerwony krzyżyk reprezentuje źródło punktowe. Ta konfiguracja modeluje tkankę mózgową przedstawioną na Rycini 1a. [Środkowe obrazy] 3 i 6 cząsteczek wykonujących ruchy losowe podczas dyfuzji przez przestrzeń zewnątrzkomórkową mózgu, ukazane w 2 wymiarach. [Po prawej] Błądzenia losowe wielu cząsteczek uwolnionych ze źródła punktowego. Wypadkowy ruch wszystkich cząsteczek ze źródła punktowego jest skierowany na zewnątrz, jak przedstawiono na Rycini 1c. Skumulowane błądzenia losowe obrysowują przestrzenie między komórkami (t.j. ECS; dalsze wyjaśnienia w referencji5). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55755/55755fig1large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić większą wersję tej ryciny.</a>

<table><tbody><tr><td>Przetwornik A/D i D/A</td><td>National Instruments Corporation</td><td>NI USB-6221 DAQ</td><td>NI USB-6221 jest nadal sprzedawany przez NI jako urządzenie "Legacy". Zalecają używanie DAQ NI USB-6341 X Series do nowych instalacji, jednak nie testowaliśmy nowszych jednostek. Opisujemy użycie NI USB-6221 z MATLAB i Windows 7 (32-bitowym). Alternatywa: znacznie starszy konwerter A/D PCI-MIO-16E-4 (używany tylko w systemie Windows XP lub starszym systemie operacyjnym) z panelem złączy BNC BNC-2090 i SH68-68-EP. Jak wspomniano w Podręczniku Wanda, dostępny jest eksperymentalny program MATLAB do korzystania z plików binarnych Axon.</td></tr><tr><td>agaroza</td><td>Lonza</td><td>NuSieve GTG Agaroza #50081</td><td>do przygotowania rozcieńczonego żelu agarozowego do pomiarów RTI</td></tr><tr><td>wzmacniacz do ISM</td><td>Dagan</td><td>Model IX2-700 Podwójny wewnątrzkomórkowy przedwzmacniacz</td><td>jonowy i wzmacniacz napięcia odniesienia z głowicami N=0,1 (dla lufy referencyjnej) i N=0,001 (dla lufy jonowej)</td></tr><tr><td>Miscroscope związków biologicznych (z obiektywem 4x i 10x)</td><td></td><td></td><td>do rozdrabniania końcówek mikroelektrod i kontroli mikroelektrod; różni dostawcy, np. Rurki</td></tr><tr><td>ze szkła kapilarnego borokrzemianowego Theta</td> AmScope <td>Aparat Harvarda</td><td>Warner Instruments model TG200-4; Zamówienie #64-0811</td><td>Rurki szklane dwulufowe do mikroelektrod jonoselektywnych i mikroelektrod jonoforetycznych; Średnica zewnętrzna 2,0 mm, średnica wewnętrzna 1,4 mm, przegroda 0,2 mm, długość 10 cm</td></tr><tr><td>szczotka</td><td>Winsor & Newton</td><td>University Series 233, okrągła</td><td>szczotka z uchwytem shoft rozmiar 0, dostępna w</td></tr><tr><td>Amazon Bunsen Burner</td><td>Kamera Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>do wizualizacji mikropipet</td><td>Olympus</td><td>OLY-150</td><td>wymaga monitora, filtr podczerwieni na iluminatorze podstopnia jest opcjonalnym</td></tr><tr><td>rejestratorem</td><td></td><td></td> <td>wykresówdo ciągłego rejestrowania napięć na mikroelektrodzie jonoselektywnej podczas kalibracji w wzorcach tetrametyloamonu oraz podczas eksperymentu RTI; np. Kipp & Zarejestrowano wykres podwójnej kanelu Zonen typu BD112, dostępny odnowiony</td></tr><tr><td>chlorotrimetylosilan, puriss., > 99%</td><td>Katalog Sigma-Aldrich</td><td># 92360</td><td>do silanizacji; UWAGA: łatwopalny, ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna), skóra, uszkodzenie oczu, gwałtownie reaguje z wodą, pełny opis patrz Sigma-Aldrich Safety Information</td></tr><tr><td>Oprogramowanie komercyjne</td><td>The MathWorks</td><td>MATLAB, Zestaw narzędzi do pozyskiwania</td><td>i analizy danych za pomocą programów Wanda i Walter. Pamiętaj, że dostępna jest licencja akademicka.</td></tr><tr><td>okulary ochronne</td><td>Mikroskop złożony Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ze stałym stopniem</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td>może używać innych mikroskopów złożonych ze stałymi stopniami</td></tr><tr><td>kleszczy</td><td>Fine Science Tools</td><td>#11251-10</td><td>do rozdrabniania kapilary szklanej; Dumond #5, najlepiej używany i już niepotrzebny do precyzyjnej pracy</td></tr><tr><td>dygestorium</td><td></td><td></td><td>do silanizacji i napełniania końcówki beczki jonoselektywnej ciekłym wymieniaczem jonowym; różne zasilacze, np. Captair z filtrem asygnalizacyjnym sprzedawany przez Erlab</td></tr><tr><td>szklany szkiełko mikroskopowe</td><td>Fisher</td><td>#12-550A</td><td>do rozdrabniania końcówek mikroelektrod</td></tr><tr><td>grzałka/mieszadło</td><td>Fisher</td><td>Corning PC-420D</td><td>do przygotowania rozcieńczonego żelu agarozowego i roztworów mieszających</td></tr><tr><td>jednostka jonoforetyczna</td><td>Dagan</td><td>ION-100 i PS-100</td><td>ION-100 to jednokanałowa jednostka jonoforezy zgodna z +/- 130 V; PS-100 to zewnętrzny zasilacz; alternatywy: np. Axoprobe-1A wyprodukowany przez Axon Instruments (obecnie Molecular Devices), wycofany z produkcji, sprawdź dostępność odnowionych jednostek (eBay i inne witryny)</td></tr><tr><td>ciekły wymieniacz jonowy (LIX) do tetrametyloamonu</td> Wymieniacz jonowy <td>potasu World Precision Instruments</td><td>IE190</td><td>Uwaga: jest to odpowiednik oryginalnego wymiennika potasu Corning 477317 opartego na tetrafenlyboranie - nie mylić z neutralnym nośnikowym wymiennikiem potasu pochodzi z laboartory Dr. Simon, ETH, Zurych, która nie wykrywa tetrametyloamonu i jest sprzedawana przez firmę Fluka. Możesz również samodzielnie wykonać płynny wymieniacz jonowy dla tetrametyloamonu: 3% wagowo tetrakis potasu = boran (p-chlorofenylu) rozpuszczony w 2,3-dimetylonitrobenzenie. Kupuj chemikalia od firmy Fluka (obecnie część Sigma). Patrz Oehme i Simon (1976) Anal. Chim. Dzieje Apostolskie 86,21-25; UWAGA: Właściwości toksykologiczne tego ciekłego wymieniacza jonowego nie zostały w pełni określone. Spożycie lub kontakt z ciałem ludzkim może być szkodliwy. Zachowaj należytą ostrożność! Ciekłe wymieniacze jonowe należy przechowywać w chłodnym miejscu, z dala od bezpośredniego światła słonecznego.</td></tr><tr><td>uchwyt mikroelektrody</td><td>WPI</td><td>M3301EH</td><td>do przechowywania jonoselektywnego prefabrykatu mikroelektrody do silanizacji i wypełnienia końcówki jonoselektywnej beczki ciekłym wymieniaczem jonowym; WPI sprzedaje dwie wersje tego uchwytu, bezbarwną M3301EH i czarną M3301EH. Z naszego doświadczenia wynika, że przezroczysty M3301EH wydaje się być mocniejszy niż M3301EH.</td></tr><tr><td>mikromanipulator</td><td>Narishige</td><td>MM-3</td><td>do pozycjonowania prefabrykatu mikroelektrod jonoselektywnych podczas silanizacji i napełniania końcówki cylindra jonoselektywnego ciekłym wymieniaczem jonowym; może być zastąpiony dowolnym mikromanipulatorem trójosiowym w dobrym stanie technicznym</td></tr><tr><td>ściągacz do mikropipet</td><td>Sutter Instruments</td><td>Model P-97</td><td>do ciągnięcia szklanych rurek dwulufowych; inne ściągacze mogą być używane, o ile mogą pomieścić dwulufowy termometr z mikrosondą z dwulufowymi rurkami</td></tr> szklanymi <tr><td></td><td>Physiotemp</td><td>Model BAT-12R</td><td>cienka sonda tego termometru jest umieszczona w pobliżu</td></tr><tr><td>igły do rejestracji</td><td></td><td>Strzykawki i igły BD # 305122 (rozmiar 25)</td> <td>do silanizacji; Igły BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 cala (0,5 mm x 16 mm)</td></tr><tr><td>obiektyw 5X suchy</td><td>Olympus</td><td>MPlan N</td><td></td></tr><tr><td>obiektyw 10X zanurzenie w wodzie</td><td>Olympus</td><td>UMPlan FL N</td><td>10X obiektyw do zanurzenia w wodzie, apertura numeryczna 0,3, odległość robocza 3,3 mm</td></tr><tr><td>plastikowe pojemniki (z pokrywkami)</td><td>Fisher</td><td>#14-375-148</td><td>do przechowywania roztworów wzorcowych tetrametyloamonu i mikroelektrod</td></tr><tr><td>platforma i stolik translacyjny x-y do mikroskopu stałostolikowego</td><td>EXFO</td><td>Gibraltar Platforma Burleigh</td><td>mieści komorę krocząt, mikromanipulatory i akcesoria, stolik translacyjny x-y porusza mikroskopem bez uszczerbku dla stabilności zapisu</td></tr><tr><td>porowaty minicup</td><td></td><td></td><td>do pomiarów RTI w rozcieńczonym żelu agarozowym; domowy</td></tr><tr><td>klej wielokrotnego użytku</td><td>Bostik</td><td>Blu-Tack</td><td>do mocowania mikroelektrod do naczynia przechowawczego i do innych zastosowań; różni dostawcy, dostępni w Amazon</td></tr><tr><td>mikromanipulator robotyczny z precyzyjnym pozycjonowaniem x,y,z</td><td>Sutter Instruments</td><td>MP-285</td><td>dwa mirkomanipulatory są potrzebne do oddzielnego przechowywania mikroelektrody jonoselektywnej i mikroelektrody jonoforetycznej. Możliwe jest również przyklejanie mikropipet w układzie rozstawionym (patrz tekst).</td></tr><tr><td>jednostka kondycjonowania sygnału z filtrem dolnoprzepustowym</td><td>Axon Instruments</td><td>CyberAmp 320 lub 380</td><td>nie jest już dostępny u producenta, ale może być dostępny w serwisie E-Bay; alternatywy: np. Filtr/wzmacniacz FLA-01 firmy Cygnus Technology. Jest to instrument jednokanałowy z minimalnym odcięciem przy 10 Hz przy użyciu wielobiegunowego filtra Bessela, ale firma może być skłonna do zmodyfikowania go w celu uzyskania niższej częstotliwości odcięcia (2 Hz), jeśli zajdzie taka potrzeba.</td></tr><tr><td>srebrny drut</td><td>A-M Systems</td><td>#7830</td><td>średnica 0,015", goła (bez powłoki)</td></tr> <tr><td>komora na plastry</td><td>Aparat Harvarda</td><td>Warner Model RC-27L</td><td>to jest komora zanurzeniowa; nie używaj</td></tr> mikroskopu stereoskopowego <tr><td></td><td></td><td></td> z komorą warstwową interfejsu <td>do silanizacji i napełniania końcówki jonoselektywnej beczki ciekłym wymieniaczem jonowym; zamontowany poziomo;</td></tr><tr><td>strzykawka różnych dostawców, 10 ml</td><td></td><td>Strzykawki i igły BD #309604</td><td>do zasypywania mikroelektrod i do silanizacji; Filtr strzykawkowy BD Luer-Lok z końcówką</td></tr><tr><td>0,22 i mikro; m pore</td><td>Whatman</td><td>#6780-1302</td><td>do filtrowania roztworów zasypki; dostępne od igły</td></tr><tr><td>strzykawkowej Fisher, rozmiar 28, 97 mm</td><td>World Precision Instruments</td><td>MicroFil MF28G-5</td><td>do zasypywania mikroelektrod</td></tr><tr><td>Rurki teflonowe (=PTFE)</td><td>Dostawa komponentów</td><td>STT-28 Ścianka świetlna rurki PTFE (rozmiar 28)</td><td>do silanizacji beczki jonoselektywnej; pasuje do igieł BD PrecisionGlide 25 G x 5/8 cala. Uwaga: Teflon jest niezbędny, rurki PVC stopiłyby się pod wpływem gorącego wosku.</td></tr><tr><td>system kontroli temperatury</td><td>Harvard Apparatus</td><td>Warner Models TC-344B i SH-27A</td><td>TC-344B to podwójny automatyczny regulator temperatury, SH-27A to grzałka liniowa; sterownik i grzałka współpracują z komorami warstwowymi Warnera chlorek</td></tr><tr><td>tetrametyloamonu (TMA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-3411</td><td>5 M roztwór; UWAGA: ostra toksyczność (doustna, skórna, inhalacyjna), rakotwórczość, niebezpieczna dla środowiska wodnego, pełny opis znajduje się w Sigma-Aldrich Informacja o bezpieczeństwie</td></tr><tr><td>mikrotom</td><td>Leica</td><td>VT1000S</td><td>do cięcia plastrów mózgu</td></tr><tr><td>ksylenów</td><td>Fisher</td><td>X5-1</td><td>do silanizacji; UWAGA: łatwopalny, ostra toksyczność (doustna, skórna, wziewna), skóra, uszkodzenie oczu, rakotwórczość patrz Fisher Safety Information w celu uzyskania pełnego opisu</td></tr></tbody></table>

jonoforeza w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem w celu ilościowego określenia frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

Ta recenzja opisuje podstawowe pojęcia i protokół do wykonywania metody jonoforezy w czasie rzeczywistym (RTI), złotego standardu do badania i ilościowego określania przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ECS) żywego mózgu. ECS otacza wszystkie komórki mózgowe i zawiera zarówno płyn śródmiąższowy, jak i macierz zewnątrzkomórkową. Transport wielu substancji niezbędnych do aktywności mózgu, w tym neuroprzekaźników, hormonów i składników odżywczych, odbywa się poprzez dyfuzję przez ECS. Zmiany w objętości i geometrii tej przestrzeni zachodzą podczas normalnych procesów mózgowych, takich jak sen, i stanów patologicznych, takich jak niedokrwienie. Jednak struktura i regulacja ECS w mózgu, szczególnie w stanach chorobowych, pozostaje w dużej mierze niezbadana. Metoda RTI mierzy dwa parametry fizyczne żywego mózgu: ułamek objętościowy i krętość. Ułamek objętościowy to proporcja objętości tkanki zajmowanej przez ECS. Skrętność jest miarą względnej przeszkody, jaką napotyka substancja podczas dyfuzji przez obszar mózgu, w porównaniu z ośrodkiem bez przeszkód. W RTI obojętna cząsteczka jest pulsowana z mikroelektrody źródłowej do ECS mózgu. Ponieważ cząsteczki dyfundują z dala od tego źródła, zmieniające się stężenie jonu jest mierzone w czasie za pomocą jonoselektywnej mikroelektrody umieszczonej w odległości około 100 μm. Na podstawie wynikowej krzywej dyfuzji można obliczyć zarówno ułamek objętościowy, jak i krętość. Technika ta została wykorzystana w wycinkach mózgu wielu gatunków (w tym ludzi) oraz in vivo do badania ostrych i przewlekłych zmian ECS. W przeciwieństwie do innych metod, RTI może być używany do badania zarówno odwracalnych, jak i nieodwracalnych zmian w ECS mózgu w czasie rzeczywistym.

Skuteczność techniki RTI została zademonstrowana w eksperymencie zaprojektowanym w celu pomiaru zmian w α i podczas wyzwania hipoozmotycznego (Rycina 8 i Rycina 9). Wcześniejsze badania wykazały, że obniżenie osmolarności ECS poprzez przemywanie hipotonicznym ACSF spowoduje zmniejszenie się α oraz wzrost λ13.
W tym eksp...

Ten protokół opisuje jonoforezę w czasie rzeczywistym, metodę, która mierzy parametry fizyczne przestrzeni zewnątrzkomórkowej (ECS) żywych mózgów. Dyfuzja obojętnej cząsteczki uwolnionej do ECS służy do obliczenia ułamka objętościowego ECS i krętości. Idealnie nadaje się do badania ostrych, odwracalnych zmian w ECS mózgu.

Jonoforeza w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem w celu ilościowego określenia frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Ogólnym celem tej procedury jest ilościowe określenie ułamka objętościowego i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej w tkance mózgowej. Metoda ta odpowiada na kluczowe pytania dotyczące związku między przestrzenią zewnątrzkomórkową a fizjologią i chorobą. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala na scharakteryzowanie w czasie rzeczywistym dwóch ważnych parametrów przestrzeni zewnątrzkomórkowej.Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, będą miały trudności, ponieważ mikroelektroda jonoforetyczna wykazuje tendencję do zmiany swoich właściwości podczas eksperymentów i często wymaga rozwiązywania problemów podczas eksperymentów. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ do uzyskania pomyślnego nagrania wymagana jest precyzyjna manipulacja mikroelektrodą jonoselektywną, elektrodą jonoforetyczną w wielu etapach. Aby rozpocząć tę procedurę, przepuść ACSF zawierający tetrametyloamon lub TMA przez komorę zanurzeniową z prędkością dwóch mililitrów na minutę.Ustaw regulator temperatury na żądaną temperaturę i napełnij ACSF bąbelkami 95% tlenu i 5% dwutlenku węgla na czas trwania eksperymentu. Następnie zamontuj elektrodę uziemiającą na uchwycie i zanurz jej końcówkę w ACSF biegnącym przez komorę zanurzeniową. Następnie napełnij porowaty kubek przygotowanym wcześniej 0,3% agarozą zawierającą TMA i umieść go w komorze zanurzeniowej.Teraz przymocuj mikroelektrodę jonoforetyczną do uchwytu pipety jednego mikromanipulatora. Podłącz przewód mikroelektrody jonoforezy do stopnia głowicy jednostki jonoforezy. Następnie przymocuj skalibrowany ISM do drugiego mikromanipulatora i podłącz ISM do jego stopni głównych.Następnie włącz komputer, na którym znajdują się programy Wanda i Walter. W graficznym interfejsie użytkownika Wanda kliknij przycisk Kalibruj. Następnie w polu Calibration (Kalibracja) wpisz napięcia zmierzone podczas kalibracji ISM i kliknij przycisk Fit Data (Dopasuj dane).Następnie kliknij przycisk Akceptuj w polu Kalibruj, aby automatycznie przenieść wygenerowane nachylenie i kolizję do głównego graficznego interfejsu użytkownika. Po lewej stronie graficznego interfejsu użytkownika upewnij się, że wszystkie parametry eksperymentalne są ustawione w odpowiednich wpisach. Następnie umieść sondę temperatury w kubku agarowym.Zapisz zmierzoną temperaturę we wpisie Temperatura w skrzynce elektrod pomiarowych w graficznym interfejsie użytkownika. Następnie opuść mikroelektrody na głębokość co najmniej 1 000 mikrometrów w głąb agarozy i wyśrodkuj je w kubku. Wizualizuj je pod mikroskopem za pomocą obiektywu 10X.Na dwukanałowym amplifier ręcznie przesuń złącze kanału ISM na wyjście odejmowania napięcia, aby włączyć odejmowanie między kanałami odniesienia i ISM. Wyśrodkuj końcówki na sobie we wszystkich trzech osiach kierunkowych. Następnie wyzeruj względne położenie obu mikroelektrod na skrzynkach sterowniczych mikromanipulatora i upewnij się, że mikroelektrody są dokładnie i precyzyjnie wyśrodkowane.Następnie odsuń ISM o 120 mikrometrów od mikroelektrody jonoforezy w jednej osi. Następnie rozpocznij nagrywanie, klikając Zdobądź w GUI i pozwól programowi uruchomić się w celu pełnego nagrania. W tej procedurze otwórz program Walter na komputerze.W menu Zero Records From kliknij przycisk Wanda Voltoro, aby odczytać rekordy wygenerowane przez Wandę. W następnym wyskakującym oknie wybierz jeden lub więcej rekordów do odczytania i kliknij Otwórz. W menu Excel One Write kliknij pozycję Arkusz 1.3 i postępuj zgodnie z instrukcjami, aż rekordy zostaną automatycznie przedstawione na wykresie.Aby rozpocząć procedurę dopasowania, w menu Dwie opcje kliknij przycisk wyboru nagrywania. Następnie w wyskakującym oknie na rysunku drugim użyj myszy, aby przesunąć krzyżyk nad pierwszym rekordem, który ma zostać przetworzony, i naciśnij dowolny przycisk myszy, aby wybrać rekord. Następnie kliknij krzywą dopasowania w menu i użyj co najmniej 20 iteracji dopasowania, aby uzyskać dokładne dopasowanie danych.Następnie wybierz wszystko, aby dopasować wszystkie punkty danych, a następnie wybierz pozycję kontynuuj. Program dopasuje się do wyświetlanej krzywej. Następnie wybierz opcję zapisania wyniku w odpowiednim programie arkusza kalkulacyjnego, klikając Excel w menu siedmiu wyników.Nazwij plik programu Excel. Zanotuj i zapisz wygenerowane dane, które zostaną wykorzystane do określenia funkcjonalności mikroelektrody jonoforetycznej. Jeśli mikroelektroda jonoforezy zostanie uznana za odpowiednią do eksperymentu, zapisz średnią liczbę transportu ze wszystkich prób w polu końcowym TransportNum w graficznym interfejsie użytkownika Wanda.W tej procedurze umieść wycinek mózgu o grubości 400 mikrometrów w komorze rejestracyjnej, upewniając się, że jest całkowicie zanurzony w przepływającym ACSF. Następnie przesuń zarówno mikroelektrodę jonoforezy, jak i ISM powyżej pola zainteresowania na wycinku mózgu. Zanurz obie elektrody w przepływającym ACSF, ale powyżej plasterka.Następnie należy zrównoważyć napięcie zarówno dla kanału odniesienia, jak i kanału wykrywającego jony do zera miliwoltów. Poczekaj, aż napięcie w obu kanałach się ustabilizuje. Na rejestratorze wykresów zaznacz napięcie zmierzone na kanale wykrywania jonów ISM.Następnie umieść mikroelektrody ISM i mikroelektrody jonoforetyczne w odległości 200 mikrometrów w plastrze i 120 mikrometrów od siebie. Oblicz różnicę napięcia między sygnałami TMA mierzonymi w przepływowym ACSF i w mózgu i wprowadź tę wartość do pola Baseline Volt Millivolt w skrzynce elektrod pomiarowych GUI Wanda. Po lewej stronie graficznego interfejsu użytkownika upewnij się, że wszystkie parametry eksperymentalne zostały poprawnie wprowadzone.Rozpocznij nagrywanie, klikając przycisk Pobierz i zezwól na pełne nagranie. Po wyjęciu obu mikroelektrod z wycinka, użyj rejestratora wykresów, aby określić wszelkie zmiany między napięciem mierzonym teraz a jego pomiarem sprzed dnia. Aby przeanalizować nagrania z mózgu, powtórz procedury analizy danych agarozy za pomocą programu Walter.Zapisz dane w programie arkusza kalkulacyjnego, klikając polecenie Excel w menu Walter. Następnie zapisz ułamek objętościowy ECS mózgu, krętość ECS mózgu i klirens niespecyficzny. Aby sprawdzić numer transportowy, wykonaj nowe nagrania w agarozie i powtórz procedury w programie Waltera w celu uzyskania numeru transportowego.Sprawdź arkusz kalkulacyjny i sprawdź, czy numer transportu zmienił się o więcej niż 10% w stosunku do numeru transportu uzyskanego przed pomiarami mózgu. Jeśli tak, to dane uzyskane za pomocą mikroelektrody jonoforetycznej nie są wiarygodne. Liczba transportowa zmierzona na tym etapie musi być ściśle zgodna z liczbą uzyskaną przed pomiarami mózgu, w przeciwnym razie ułamek objętościowy nie może być uznany za dokładny.Użyj nowo uzyskanych danych kalibracji ISM jako danych wejściowych w polu Wanda Calibrate i sprawdź, czy wartość nachylenia różni się o mniej niż 10% od poprzedniej kalibracji. Pokazano tutaj reprezentatywne dane z pojedynczego badania uzyskanego w agarze wykazującym krzywą stężenia TMA. A to jest dopasowana krzywa uzyskana z przetwarzania danych w Walterze.Nakładanie się danych w dopasowanej krzywej pokazuje, że dopasowanie krzywej wykonane przez Waltera dokładnie modeluje dyfuzję w tym badaniu. Oto tabela pomiarów agaru przed eksperymentami w mózgu. Oto podsumowanie pomiarów wykonanych w wycinku mózgu myszy w warunkach kontrolnych i eksperymentalnych.Alfa zmniejszała się podczas wyzwania hipoosmolarnego, podczas gdy krętość rosła zgodnie z oczekiwaniami. Alpha przekroczyła wartości kontrolne w warunkach odzysku. A oto tabela pomiarów agry po eksperymentach w mózgu.Średnie liczby transportu przed i po eksperymencie mieściły się w granicach 10%, co wskazuje, że wartości zarejestrowane w mózgu były wiarygodne. Po opanowaniu tej procedury można ją wykonać w ciągu 14 godzin w ciągu dwóch dni. Pierwszego dnia SISM są wytwarzane i kalibrowane.Drugiego dnia ISM są ponownie kalibrowane i przeprowadzana jest jonoforeza w czasie rzeczywistym. Próbując wykonać tę procedurę, ważne jest, aby najpierw precyzyjnie określić odstępy między elektrodami. Po drugie, ważne jest, aby zaakceptować eksperyment tylko wtedy, gdy liczba transportowa mikroelektrody jonoforetycznej pozostaje stabilna przez cały czas trwania eksperymentu.Po tej procedurze, która charakteryzuje dyfuzję małych kationów w przestrzeni zewnątrzkomórkowej, możesz przejść do wykonywania innych technik, takich jak metoda integracyjnego obrazowania optycznego, która pozwala odpowiedzieć na pytanie, jak duże mikrocząsteczki poruszają się w przestrzeni zewnątrzkomórkowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wykonać metodę jonoforezy w czasie rzeczywistym, aby określić ilościowo objętość przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu i krętość w żywym mózgu w zdrowiu i chorobie. Dziękuję za oglądanie i życzę powodzenia w eksperymentach.

real-time-iontophoresis-with-tetramethylammonium-to-quantify-volume

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Film demonstruje wywołaną dynamikę stężenia jonów potasu podczas stymulacji elektrycznej wycinków mózgu myszy koronalnych hipokampów. Bipolarną elektrodę stymulującą umieszcza się w warstwie promieniowej regionu CA3 w hipokampie, a elektrodę selektywną jonów potasu umieszcza się w promieniu promieniowym warstwy CA1. Stymulacja elektryczna powoduje potencjał czynnościowy, w wyniku czego uwalniane są jony potasu. Wreszcie, brak wywołanej odpowiedzi jonów potasu w obecności cząsteczki hamującej...

Pomiar dynamiki wywołanego stężenia jonów potasu w koronalnych wycinkach hipokampa

Ten film pokazuje, jak scharakteryzować przestrzeń zewnątrzkomórkową w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych do pomiaru i porównywania sygnałów elektrycznych. Proces ten pomaga określić objętość, frakcję przestrzeni i stopień skręcenia.

Charakterystyka przestrzeni zewnątrzkomórkowej w wycinku mózgu za pomocą mikroelektrod jonoselektywnych i jonoforetycznych

Źródło: Moye, S. L., et.al.  Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą żółtej jonoforezy Lucyfera. J. Vis. Exp. (2019).  Ten film demonstruje zastosowanie jonoforezy barwnika fluorescencyjnego do badania morfologii astrocytów w utrwalonych wycinkach mózgu. Szczegółowo opisuje przekłuwanie somy astrocytów elektrodą w celu dostarczenia anionowego, hydrofilowego barwnika do cytoplazmy pod prądem o niskim napięciu, umożliwiając barwnikowi dyfuzję i znakowanie somy i gałęzi. Mikroskopia...

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy barwnika fluorescencyjnego w nieruchomym wycinku mózgu myszy

W tym artykule przedstawiamy szybką mikrojonoforezę neuroprzekaźników jako technikę badania integracji sygnałów postsynaptycznych z dużą precyzją przestrzenną i czasową.

Szybka mikrojonoforeza glutaminianu i GABA: przydatne narzędzie do badania integracji synaptycznej

Demonstrujemy wykonanie, kalibrację i właściwości dwóch typów mikroelektrod selektywnych jonowo (dwulufowych i koncentrycznych) do pomiaru stężeń jonów w tkance mózgowej. Są one następnie wykorzystywane w przygotowaniu plastra hipokampa myszy, aby pokazać, że aktywność pobudzająca zmienia zarówno zewnątrzkomórkowe stężenie potasu, jak i sodu.

Dwulufowe i koncentryczne mikroelektrody do pomiaru zewnątrzkomórkowych sygnałów jonowych w tkance mózgowej

Prezentujemy metody budowy elektrod do jednoczesnego rejestrowania zewnątrzkomórkowej aktywności neuronalnej i uwalniania wielu substancji neuroaktywnych w pobliżu miejsc rejestracji u obudzonych myszy. Technika ta pozwala na szczegółową analizę przypuszczalnych lokalnych wejść synaptycznych do neuronu będącego przedmiotem zainteresowania.

Zewnątrzkomórkowy zapis aktywności neuronalnej w połączeniu z mikrojonoforowym zastosowaniem substancji neuroaktywnych u obudzonych myszy

Tutaj opisujemy metodę mikrodializy in vivo do analizy uwalniania asparaginianu i glutaminianu w brzusznym hipokampie u szczurów z padaczką i bez padaczki, w połączeniu z zapisami EEG. Zewnątrzkomórkowe stężenia asparaginianu i glutaminianu mogą być skorelowane z różnymi fazami choroby.

Mikrodializa aminokwasów pobudzających podczas zapisów EEG u swobodnie poruszających się szczurów

Ten artykuł opisuje prostą metodę przygotowania mózgów małych zwierząt do obrazowania mikro-CT, w którym zmiany chorobowe mogą być określane ilościowo, a elektrody lokalizowane z dużą precyzją w kontekście całego mózgu.

Metoda oparta na mikrotomografii komputerowej do charakteryzowania zmian chorobowych i lokalizacji elektrod w mózgach małych zwierząt

Astrocyty to morfologicznie złożone komórki, czego przykładem są ich liczne procesy i krzaczaste terytoria. Aby przeanalizować ich skomplikowaną morfologię, przedstawiamy niezawodny protokół wykonywania wewnątrzkomórkowej żółtej jonoforezy Lucyfera w lekko utrwalonej tkance.

Wizualizacja morfologii astrocytów za pomocą jonoforezy Lucyfera Yellow

Ten protokół opisuje procedury chirurgiczne i techniczne, które umożliwiają w czasie rzeczywistym wielofotonowe obrazowanie fluorescencyjne mózgu gryzonia podczas skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzykowych w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg.

Mikroskopia wielofotonowa w czasie rzeczywistym w celu wizualizacji skoncentrowanych ultradźwięków i zabiegów mikropęcherzyków w celu zwiększenia przepuszczalności bariery krew-mózg

Opisujemy protokół oceny krzywych dawka-odpowiedź dla stymulacji pozaczaszkowej pod względem pomiarów pola elektrycznego mózgu i odpowiedniego biomarkera przepływu krwi w mózgu. Ponieważ protokół ten obejmuje inwazyjne umieszczenie elektrod w mózgu, potrzebne jest znieczulenie ogólne, w którym preferowane jest spontaniczne oddychanie, a nie kontrolowane oddychanie.

Umieszczenie zewnątrzczaszkowych elektrod stymulujących i pomiar przepływu krwi w mózgu i wewnątrzczaszkowych pól elektrycznych u znieczulonych myszy

Poznaj metodę jonoforezy w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem do ilościowego określania frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu żywego. Technika ta umożliwia badanie dynamicznych zmian fizycznych parametrów ECS.

Jonoforeza w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem w celu ilościowego określenia frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu (Wideo) | JoVE Journal

Jonoforeza w czasie rzeczywistym z tetrametyloamonem w celu ilościowego określenia frakcji objętościowej i krętości przestrzeni zewnątrzkomórkowej mózgu

Przeglądaj więcej filmów