Name: In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 5 s
Description: Poznaj metodę różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych w komórki podobne do kardiomiocytów in vitro. Technika wykorzystuje sygnały środowiskowe i formowanie agregatów zamiast środków farmakologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy dziękują następującym pracownikom i pracownikom naukowym za ich wkład: Matthew Librach, Leila Maghen, Tanya A. Baretto, Shlomit Kenigsberg i Andrée Gauthier-Fisher. Prace te były wspierane przez The Ontario Research Fund - Research Excellence (ORF-RE, Round #7) oraz CReATe Program Inc.

Wszystkie badania z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone i zgłoszone zgodnie z wytycznymi ARRIVE48. Wszystkie badania zostały przeprowadzone za zgodą instytucjonalnej komisji bioetycznej ds. badań naukowych (numer REB 454-2011, Sunnybrook Research Institute; REB 29889, Uniwersytet w Toronto, Toronto, Kanada). Wszystkie procedury na zwierzętach zostały zatwierdzone przez Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami Uniwersyteckiej Sieci Zdrowia (Toronto, Kanada), a wszystkie zwierzęta otrzymały humanitarną opiekę zgodnie z Przewodnikiem opieki i wykorzystania zwierząt laboratoryjnych, wydanie 8 (National Institutes of Health 2011).
1. Hodowla tkankowa
<ol>
	<li>Hodowle FTM HUCPVC, termin HUCPVC (wcześniej ustalone, n ≥ 3 niezależne linie dla każdego)42 i dostępne na rynku BMSC w pożywce o minimalnej ilości niezbędnej alfa (MEM) uzupełnione 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i 1% koktajlem penicyliny/streptomycyny (P/S). Hodowla pierwotnych kardiomiocytów szczurów i kokultur kardiomiocytów MSC w zmodyfikowanym pożywce Dulbecco's Eagle Media: Mieszanka składników odżywczych F-12 (DMEM-F12) zawierająca 10% FBS i 1% P/S. 
	UWAGA: Wysterylizuj pożywkę za pomocą filtra 0,2 μm. Przygotowane roztwory pożywki należy przechowywać w temperaturze 4 °C przez okres do 3 tygodni.</li>
	<li>Utrzymuj hodowle komórkowe w nawilżonych inkubatorach (95% wilgotności względnej, 37 °C i 5% CO2 ) i pasaż przy zbieganiu 70-80%, określonym za pomocą mikroskopii z kontrastem fazowym. Stosować odpowiednie objętości pożywki do wielkości użytego naczynia do hodowli tkankowej (np. 10 ml w 10-centymetrowym naczyniu i 2 ml na dołek w 6-dołkowej płytce do hodowli tkankowej). Stosuj te warunki hodowli przez cały czas trwania protokołu.</li>
	<li>Dysocjować monowarstwy MSC do pasażu lub kohodowli MSC-kardiomiocytów za pomocą roztworu enzymu dysocjacyjnego (2 ml/dołek na płytce 6-dołkowej) i inkubować w temperaturze 37 °C przez 4 minuty.</li>
	<li>Przenieść zdysocjowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.</li>
	<li>Odessać supernatant bez przerywania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml pożywki hodowlanej odpowiedniej do liczenia przy użyciu automatycznego licznika komórek. Zasiej komórki zgodnie z opisem w poniższych sekcjach protokołu.</li>
</ol>
2. Przygotowanie pierwotnych kardiomiocytów szczurów i kokultur MSC
<ol>
	<li>Uzyskaj tkankę serca do pierwotnej izolacji kardiomiocytów.
	<ol>
		<li>Eutanazja szczeniąt szczurów (5-6 dni po porodzie) za pomocą uduszenia CO2 . Ustaw komory CO2 na 20% wymianę gazu (natężenie przepływu = 0,2 x objętość komory na minutę). Potwierdź wyjście przez brak odruchu szczypania.</li>
		<li>Usuń przedsionki z łączącymi je głównymi naczyniami krwionośnymi za pomocą wysterylizowanych narzędzi (np. kleszczy i zakrzywionych nożyczek)41. Przenieść serca do 50-mililitrowych probówek zawierających sterylny PBS z 1% P/S (PBS-P/S) na lodzie.</li>
		<li>Przeciąć komory na pół i pozwolić, aby krew wypłukała się w 10-centymetrowym naczyniu z 10 ml PBS-P/S na lodzie. Pokrój ściany komór na małe kawałki (średnica = 2-3 mm) za pomocą zakrzywionych nożyczek.</li>
		<li>Przenieś kawałki serca od 10-12 zwierząt do probówki o pojemności 50 ml za pomocą pipety serologicznej i pozwól im się uspokoić.</li>
		<li>Usuń jak najwięcej PBS-P/S bez usuwania jakichkolwiek kawałków serca. Dodać 10 ml nowego PBS-P/S.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawić tkankę serca, aby wyizolować kardiomiocyty.
	<ol>
		<li>Pozwól, aby kawałki serca opadły. Zastąp PBS-P/S 10 ml 0,15% trypsyny w PBS i wstrząsaj w temperaturze 37 °C przez 10 minut.</li>
		<li>Odrzucić supernatant. Powtórzyć trawienie opisane w kroku 2.2.1 jeszcze trzy razy, ale zdekantować supernatanty do 50-mililitrowych probówek zbiorczych zawierających 10 ml 100% FBS.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Odwirować komórki (400 x g, 5 min) i odessać supernatant. Ponownie zawiesić komórki w DMEM-F12 zawierającym 10% FBS i 1% P/S i wysiewać na 6-dołkowej płytce (1 x 105 komórek/cm2, 2 ml podłoża na studzienkę).</li>
	<li>Po upływie 1 godziny przenieść pożywkę zawierającą nieprzyłączone komórki do probówki o pojemności 50 ml i wyrzucić przyłączone komórki. Policz komórki w zawiesinie i ponownie umieść je na nowych płytkach 6-dołkowych (1 x 105 komórek/cm2, 2 ml DMEM-F12 zawierających 10% FBS i 1% P/S na studzienkę).</li>
	<li>Hamować proliferację komórek za pomocą bromodeoksyurydyny (BrdU). 
	Uwaga: BrdU jest silnym teratogenem i podejrzewa się, że działa mutagennie. Przed użyciem upewnij się, że zapewniono odpowiednie szkolenie i zapoznaj się z kartą charakterystyki.
	<ol>
		<li>Po przyczepieniu się komórek zastąp pożywkę w płytce 6-dołkowej DMEM-F12 zawierającą 10% FBS, 1% P/S (2 ml pożywki na dołek) i 5 μM BrdU. Inkubować przez 16 godzin (37 °C, 5% CO2 ).</li>
		<li>Usuń pożywkę zawierającą BrdU i zastąp DMEM-F12 zawierającą 10% FBS i 1% P/S (2 ml pożywki na studzienkę).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotuj wstępnie wybarwione MSC.
	<ol>
		<li>Gdy kultury MSC osiągną 70-80% zbieżności w 10-centymetrowych szalkach, usuń pożywkę hodowlaną i dodaj 3 ml roztworu dysocjacji komórek. Inkubować naczynie w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 5 minut.</li>
		<li>Przenieść zdysocjowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut.</li>
		<li>Odessać supernatant bez przerywania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM-F12 zawierającym 10% FBS i 1% P/S w celu zliczenia przy użyciu automatycznego licznika komórek.</li>
		<li>Rozcieńczyć komórki do stężenia 1 x 106 MSC/ml DMEM-F12 zawierającego 10% FBS i 1% P/S.</li>
		<li>Inkubować MSCs z żywym, nieprzenoszalnym barwnikiem fluorescencyjnym (5 μM, 30 min, 37 °C, 5% CO2 ) w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml przez 1 godzinę.</li>
		<li>Odwirować probówki o stężeniu 400 x g przez 5 minut. Odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w DMEM-F12 zawierającym 10% FBS i 1% P/S dla stężenia komórek 1 x10,6 MSC/ml. Powtórz to w sumie 3 razy.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przenieść MSCs na kardiomiocyty (krok 2.5.2) w stężeniu 10 x 104 komórek na dołek płytki 6-dołkowej.</li>
</ol>
3. Przygotowanie zbiorczych kokultur
<ol>
	<li>Przygotować jednokomórkową zawiesinę MSCs (2 x 104 komórki/ml pożywki, pasaż # ≤ 6) w alfa-MEM uzupełnioną 10% FBS i 1% P/S (patrz krok 2.6). 
	UWAGA: Patrz sekcja 1 protokołu, aby uzyskać informacje na temat pasażowania komórek. Alternatywnie, wstępnie zabarwić MSC zgodnie z krokiem 2.6.</li>
	<li>Zainicjuj tworzenie agregatu, umieszczając 25 μl kropli zawiesiny komórek (500 komórek) na wewnętrznej powierzchni pokrywek 10-centymetrowych naczyń do hodowli tkankowych (do 50 kropli na pokrywkę). Umieścić pokrywki na ich dolnych odpowiednikach zawierających PBS-P/S. Inkubować w temperaturze 37 °C i 5% CO2, 
	UWAGA: Umieść 5-7 ml PBS-P/S w naczyniu hodowlanym poniżej wiszących kropli, aby uniknąć parowania kropli.</li>
	<li>Obserwuj tworzenie się agregatów w kroplach po 3 dniach za pomocą stereomikroskopu. Jeśli ponad 40 z 50 kropli zawiera uformowane agregaty, należy zebrać krople z pokrywek za pomocą mikropipety o pojemności 1 ml i przenieść agregaty bezpośrednio na pierwotne monowarstwy kardiomiocytów szczura (przygotowane w krokach 2.1-2.7; 10 kropli/dołek). Należy unikać intensywnego pipetowania, aby zachować integralność kruszywa.</li>
	<li>Utrzymuj zagregowane kokultury w inkubatorach przez okres do 2 tygodni, zmieniając pełną objętość pożywki (2 ml DMEM-F12 zawierającej 10% FBS i 1% P/S na studzienkę) co 72 godziny.
	<ol>
		<li>Codziennie obserwuj agregaty przyczepiające się do warstw komórek zasilających za pomocą mikroskopii jasnego pola. Rejestruj zagregowane kontrakty, gdy są obserwowane.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Przygotowanie agregatów do analizy.
	<ol>
		<li>Usuń pożywkę i dodaj 2 ml PBS na dołek 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Usunąć PBS i dodać 2 ml roztworu dysocjacyjnego do studzienki. Inkubować przez 3 minuty w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .</li>
		<li>Wirować przy 400 x g przez 5 minut, aby uzyskać osad komórkowy. Zawiesić ponownie w podłożu, jak określono dla zastosowań opisanych w kolejnych krokach (patrz kroki 4.1, 5.1 i 6.1) i przepuścić przez sitko do komórek o średnicy 70 μm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Cytometria przepływowa (FC) i sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS)
<ol>
	<li>Zawiesiny komórek inkubować (1 x 105 komórek w 200 μl PBS zawierającego 3% FBS) z pierwszorzędowymi przeciwciałami sprzężonymi z fluoroforem (FITC lub APC) (tj. CD49f, Cx43, TRA-1-85, HLA-A, HLA-G i SIRPA dla FC lub TRA-1-85 dla FACS; 1:40) w temperaturze 4 °C przez 30 minut, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Odwirować (400 x g, 5 min) i ponownie zawiesić komórki w 1 ml PBS z 3% FBS dla FC lub PBS z 0,5% FBS dla FACS. 
	UWAGA: FC MSCs został zoptymalizowany przez Hong i wsp.41.</li>
	<li>Utrzymuj komórki w temperaturze 4 °C w ciemności, aż będą gotowe do analizy przez FC (co najmniej 1 x 104 zdarzenia) lub FACS. Posortuj komórki zgodnie z opisem41. Ponownie płytkować TRA-1-85 wysoce dodatnie posortowane komórki na płytkach 6-dołkowych (1 x 104 komórki / dołek, 2 ml DMEM-F12 zawierające 10% FBS i 1% P / S) w ciągu 1 godziny 
	UWAGA: Aby zapoznać się ze strategią bramkowania antygenu powierzchniowego komórek ludzkich TRA-1-85, patrz rysunek uzupełniający.</li>
</ol>
5. Immunocytochemia (ICC) i mikroskopia
<ol>
	<li>Zawiesiny komórkowe otrzymane z kokultur (krok 3.5.2) lub FACS (sekcja 4) należy ponownie umieścić na szkiełkach komorowych (1 x 104 komórki / dołek, 2 ml DMEM-F12 zawierające 10% FBS i 1% P / S na studzienkę). Pozwól komórkom przyczepić się na noc w inkubatorze do hodowli tkankowych (patrz sekcja 1, aby zapoznać się z warunkami).</li>
	<li>Utrwal komórki za pomocą 3 ml 4% paraformaldehydu (PFA) w PBS przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Przemyć 3 razy 3 ml PBS zawierającego 1% albuminę surowicy bydlęcej (BSA; PBS-BSA) przez 5 minut na pranie. 
	Ostrzeżenie: Podczas obchodzenia się z PFA należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Przepuszczalność komórek w 3 ml PBS-BSA z 0,1% Triton X-100. Inkubować w temperaturze pokojowej przez 10 minut w przypadku antygenów wewnątrzkomórkowych (tj. alfa sarkomerycznej aktyniny (aSarc) i Cx43) lub 25 minut w przypadku antygenów wewnątrzjądrowych (tj. Mef2c i ludzkiego antygenu jądrowego (HuNu)). Umyj 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie.</li>
	<li>Zablokuj próbki przed niespecyficznymi reakcjami przeciwciał za pomocą 3 ml PBS zawierającego 5% normalnej surowicy koziej (NGS) i 1% BSA przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Umyj 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie.</li>
	<li>Inkubować komórki w pierwszorzędowych przeciwciałach (tj. Mef2c, aSarc, Cx43 i HuNu) rozcieńczonych w stosunku 1:200 w 3 ml PBS-BSA w temperaturze 4 °C przez noc.</li>
	<li>Przemyć 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie i inkubować z przeciwciałami drugorzędowymi przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Umyj 3 razy 3 ml PBS-BSA przez 5 minut na pranie.</li>
	<li>Przechowywać wybarwione próbki w 3 ml podłoża montażowego.</li>
	<li>Rejestruj obrazy za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego. Użyj obiektywu 10X (NA = 0,3) i obiektywu 20X (NA = 0,45) do obrazowania o mniejszym powiększeniu. Dla stosowanych przeciwciał drugorzędowych należy stosować kostki filtra fluorescencyjnego i długości fal dla GFP (ex = 470/22 nm, em = 525/50 nm) i RFP (ex = 531/40 nm, em = 593/40 nm) (patrz tabela materiałów i sprzętu).</li>
	<li>Określ ilościowo obrazy za pomocą oprogramowania do obrazowania (zalecane oprogramowanie znajduje się w Tabeli materiałów i sprzętu). Znormalizuj odczyty intensywności fluorescencji do wtórnych akwizycji kontrolnych.</li>
</ol>
6. Izolacja RNA i ilościowy RT-PCR
<ol>
	<li>Przygotować próbki RNA z niezróżnicowanych kultur MSC lub MSCs posortowanych z kokultur przy użyciu izolacji RNA opartej na kolumnach, zgodnie z instrukcjami producenta. Przygotować 1 x 104 do 1 x 106 komórek w 0,7 ml buforu do lizy komórek (dostarczonego z zestawem do izolacji RNA) na próbkę.</li>
	<li>Przygotuj cDNA z maksymalnie 2 μg RNA na 100 μl reakcji RT.</li>
	<li>Przeprowadzić qPCR przy użyciu 10 ng cDNA na reakcję (40 cykli, 60 °C wyżarzanie/rozszerzanie temperatury).
	<ol>
		<li>Stosować startery dla ludzkich MY6H i cTnT w stężeniu 500 nM i 1-100 ng cDNA na reakcję (patrz Tabela materiałów i sprzętu). Użyj GAPDH, ACTB i HPRT jako wewnętrznych normalizatorów sprzątania. Stosować dostępne na rynku indukowane przez człowieka pluripotencjalne kardiomiocyty pochodzące z komórek macierzystych jako kontrolę pozytywną. 
		UWAGA: Wyraź zmianę krotności ekspresji w porównaniu z niezróżnicowanymi próbkami cDNA pochodzącymi z MSC.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

Dr Clifford L. Librach jest współposiadaczem patentu: Metody izolacji i wykorzystania komórek pochodzących z tkanki pępowinowej pierwszego trymestru, przyznanego w Kanadzie i Australii.

Różnicowanie komórek macierzystych serca jest rozwijane od ponad 2 dekad, przy czym do generowania komórek podobnych do kardiomiocytów ze źródeł MSC stosuje się kilka różnych strategii. Wiele z tych strategii jest jednak nieskutecznych, a stosowane warunki często nie są reprezentatywne dla środowiska, z którym przeszczepiane komórki stykają się in vivo.
W przeciwieństwie do istniejących metod, przedstawiony tutaj protokół wykorzystuje kombinację pierwotnych warstw zasilających serce i...

Zastoinowa niewydolność serca (CHF) nadal jest główną przyczyną zachorowalności i śmiertelności na całym świecie. Niewydolność serca często występuje w wyniku masywnej utraty kardiomiocytów i rozwoju bezkomórkowej tkanki bliznowatej jako patologiczny wynik zawału mięśnia sercowego (MI)1. Podczas gdy serce jest częściowo samoodnawiającym się narządem, rezydentna pula komórek macierzystych i progenitorowych odpowiedzialnych za regenerację tkanek znacznie zmniejsza się pod względem liczebności i funkcji u starszych pacjentów, często stając się niewystarczająca do optymalnego powrotu do zdrowia po urazie. W związku z tym istnieje duże zainteresowanie opracowywaniem eksperymentalnych metod leczenia, które polegają na przeszczepianiu zdrowych komórek dawcy do uszkodzonego mięśnia sercowego. Konieczne jest, aby komórki dawcy nie tylko odbudowały strukturę tkanki, ale także osiągnęły funkcjonalne odzyskanie dotkniętego mięśnia sercowego.
Rodzime serce wykorzystuje komórki macierzyste pochodzące z tkanki serca i endogennego szpiku kostnego do naprawy po urazie2,3,4. Komórki regeneracyjne – zarówno pochodzące od gospodarza, jak i dawcy – muszą mieć zdolność do uzyskania odpowiedniego fenotypu i funkcji w mikrośrodowisku przebudowywanego mięśnia sercowego, a także zdolność do skutecznego i bezpiecznego zastępowania utraconych komórek. Metody różnicowania in vitro są szeroko stosowane w celu osiągnięcia wysokiej wydajności produkcji kardiomiocytów opartej na komórkach macierzystych5,6. Profil ekspresji markerów linii serca służy do zdefiniowania procesu różnicowania komórek macierzystych w kierunku linii serca7. Wczesne markery różnicowania, takie jak NKX2.5, czynnik wzmacniający miocyty 2C (Mef2c) i GATA48,9, mogą wskazywać na inicjację procesu kardiomiogennego. Dojrzałe markery kardiomiocytów powszechnie stosowane do oceny skuteczności różnicowania to α białka regulatorowego sygnału (SIRPA)10, troponina sercowa T (cTnT)11, miozyna sercowa o ciężkim łańcuchu (MYH6)8,12,13 i connexin 43 (Cx43)14,15,16. Metody wykorzystujące embrionalne komórki macierzyste (ESC) i pluripotencjalne komórki macierzyste (PSC) zostały dokładnie zoptymalizowane i omówione pod kątem szczegółów czynników indukcyjnych, gradientów tlenu i składników odżywczych oraz dokładnego czasu działania5,6,7,17,18. Niemniej jednak technologie oparte na ESC i PSC nadal wiążą się z wieloma problemami etycznymi i bezpieczeństwa, a także z nieoptymalnymi cechami elektrofizjologicznymi i immunologicznymi19,20. Gospodarze, którym przeszczepiono te komórki, często doświadczają odrzucenia immunologicznego i wymagają trwałej immunosupresji. Wynika to głównie z niedopasowania cząsteczek głównego kompleksu zgodności tkankowej (MHC) u gospodarza i dawcy oraz z wynikającej z tego odpowiedzi limfocytów T21. Podczas gdy indywidualne dopasowanie MHC klasy I jest możliwym rozwiązaniem, bardziej dostępna praktyka kliniczna wymagałaby źródła komórek, które jest powszechnie immunouprzywilejowane, aby przezwyciężyć problem odrzucenia.
Jako alternatywne źródło komórek do zastosowań klinicznych, MSC, a w szczególności BMSC, były badane pod kątem wykorzystania w regeneracji tkanek od czasu ich początkowego opisu w 1995 roku22. Uważa się, że MSCs są rezydentnymi komórkami regeneracyjnymi, które można znaleźć w prawie każdej unaczynionej tkance23. Po wyizolowaniu od pożądanego źródła, MSCs mogą być łatwo namnażane w hodowli, mają dużą pojemność parakrynną i często posiadają właściwości immunouprzywilejowane lub immunomodulujące24,25. Ich bezpieczeństwo i skuteczność zostały już wykazane w kilku badaniach przedklinicznych, w szczególności dotyczących regeneracji serca3,26.
Wiele strategii różnicowania MSC wykorzystuje środki farmakologiczne, takie jak 5-azacytydyna22 i DMSO27, oraz czynniki wzrostu lub morfogenne, takie jak BMPs5,7,28,29 lub angiotensyna II30, ze zmienną wydajnością. Strategie te nie opierają się jednak na przeszkodach, które naiwna komórka regeneracyjna może napotkać po naprowadzeniu lub dostarczeniu do miejsca uszkodzenia in vivo. Bardziej fizjologicznie istotne strategie, choć trudniejsze do zdefiniowania i manipulowania, opierają się na założeniu, że różnicowanie MSC może być indukowane przez sygnały z samego mikrośrodowiska tkankowego. Wcześniejsze badania wykazały, że narażenie na lizaty komórek serca 31 lub komorowy mięsień sercowy32,33, lub bezpośredni kontakt z pierwotnymi kardiomiocytami in vitro15,34, może zwiększyć ekspresję markerów sercowych w MSCs. Inni wykazali spontaniczną kardiomiogenezę po leczeniu urazów serca za pomocą MSCs35,36,37,38, chociaż częściowo, fuzja BMSC i kardiomiocytów39,40 wygenerował powstający mięsień sercowy. Zgodnie z naszą wiedzą, nie zgłoszono jeszcze funkcjonalnych, spontanicznie kurczących się kardiomiocytów z ludzkich MSC (hMSC) z jakiegokolwiek źródła tkankowego.
Obecny konsensus jest taki, że wszystkie MSCs powstają z komórek okołonaczyniowych23. Młode MSCs o właściwościach perycytów można wyizolować z obszaru okołonaczyniowego tkanki pępowiny człowieka41,42,43. W porównaniu z BMSC, HUCPVC mają zwiększony potencjał różnicowania i kilka innych zalet regeneracyjnych, zarówno in vitro41,44, jak i in vivo45,46,47. Warto zauważyć, że źródłem jest interfejs matka-płód, HUCPVC mają znacznie niższą immunogenność w porównaniu z dorosłymi źródłami MSC. Nasze badania koncentrują się na charakterystyce i przedklinicznych zastosowaniach HUCPVC FTM, najmłodszego badanego źródła MSC, które, jak wykazaliśmy wcześniej, mają zwiększoną proliferację i wyższą zdolność różnicowania wieloliniowego, w tym w linii kardiomiogennej<klasa sup="xref">41.
Tutaj prezentujemy protokół, który łączy tworzenie agregatów i główne warstwy zasilające komórki serca jako siły indukcyjne, aby osiągnąć pełne kardiomiogenne różnicowanie MSC. Agregaty zapewniają środowisko 3D, które lepiej modeluje warunki in vivo w porównaniu do kultur przylegających do 2D. Wykorzystanie warstw zasilających serce zapewnia środowisko, które jest reprezentatywne dla ostatecznego miejsca przeszczepu dla MSC. Wykazaliśmy, że młodsze źródła MSC wyizolowane z pępowiny przed lub po urodzeniu mają większą zdolność do tworzenia agregatów i osiągania fenotypu serca w porównaniu z dorosłymi BMSC, przy jednoczesnym zachowaniu ich przywilejów immunologicznych. Oprócz gwałtownego wzrostu genów markerowych linii serca i indukowanej ekspresji białek wewnątrzkomórkowych (tj. cTnT i MYH6) i powierzchniowych komórek (tj. SIRPA i Cx43) specyficznych dla kardiomiocytów, pokazujemy, że potencjał różnicowania HUCPVC FTM można wykorzystać tą metodą i że mogą one powodować spontanicznie kurczące się komórki podobne do kardiomiocytów.

<table><tbody><tr><td>0,25% Trypsyna / EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td>Do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Alpha-MEM</td><td>Gibco</td><td>12571071</td><td>Do pożywek hodowlanych HUCPVC i BMSC.</td></tr><tr><td>Przeciwciało anty-ludzkie/mysie CD49f sprzężone z PE</td><td>Biolegend</td><td>313612</td><td>Marker integrynowy dla</td></tr><tr><td>FC Sprzężone z APC ludzkie przeciwciało Cx43 / GJA1</td><td>R& D Systems</td><td>FAB7737A</td><td>marker Connexin 43 dla</td></tr><tr><td>przeciwciała HLA-A2 sprzężonego z FC FITC</td><td>Genway Biotech Inc.</td><td>GWB-66FBD2</td><td>Marker immunogenności dla</td></tr><tr><td>przeciwciała anty-HLA-HLA-G [MEM-G/9] sprzężonego z FITC</td><td>ABCAM</td><td>AB7904</td><td>Marker immunogenności dla</td></tr><tr><td>mysiego przeciwciała antyludzkiego SIRPA/CD172a skoniugowanego z FC FITC</td>, <td>AbD Serotec/Bio-Rad</td><td>MCA2518F</td><td>Marker sercowy dla</td></tr><tr><td>ludzkiego przeciwciała TRA-1-1-85/CD147 sprzężonego z FC APC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195A</td><td>Marker komórek ludzkich dla</td></tr><tr><td>ludzkiego przeciwciała TRA-1-85 / CD147 sprzężonego z FC i FACS FITC</td><td>R& D Systems</td><td>FAB3195F</td><td>Marker komórek ludzkich dla przeciwciała</td></tr><tr><td>antykoneksynowego 43 / GJA1</td> FC i FACS <td>Abcam</td><td>ab11370</td><td>Cx43. Dla</td></tr> przeciwciała <tr><td>wtórnego ICC Goat anty-króliczego IgG (H + L) wchłoniętego krzyżowo, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21428</td><td>Dla przeciwciała ICC</td></tr><tr><td>Anty-sarkomerycznej alfa aktyniny [EA-53]</td><td>Abcam</td><td>ab9465</td><td>aSARC. Dla</td></tr> przeciwciała <tr><td>wtórnego ICC Goat anty-mysiego łańcucha ciężkiego IgM wchłoniętego krzyżowo, Alexa Fluor 555</td><td>Life Technologies</td><td>A-21426</td> Dla przeciwciała <td>królika ICC</td></tr><tr><td>Mef2C (D80C1) XP</td><td>New England BioLabs Ltd.</td><td>5030S</td><td>Dla</td></tr><tr><td>przeciwciała wtórnego ICC Donkey anty-króliczego IgG (H + L), Alexa Fluor 488</td><td>Life Technologies</td><td>A-21206</td><td>Dla przeciwciała ICC</td></tr><tr><td>Anti-nuclei (HuNu) (klon 235-1)</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB1281</td><td>Dla ICC</td></tr><tr><td>MZ9.5 Stereomikroskop</td><td>Leica</td><td></td><td>Do agregacji obrazowania.</td></tr><tr><td>1,5 ml mikroprobówki wirówkowe</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td>Do barwienia MSCs barwnikiem fluorescencyjnym.</td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów o otwartym kodzie źródłowym.</td></tr><tr><td>Aria II&nbsp;</td><td></td><td>Placówka BD</td><td>UHN SickKids FC. Do sortowania komórek.</td></tr><tr><td>Szpik kostny, mezechomalne komórki zrębowe</td>, <td>Lonza</td><td>PT-2501</td>, <td>BMSCs,</td></tr><tr><td>albumina surowicy bydlęcej</td>, <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7030-100G</td><td>, BSA. Aby przygotować roztwory dla ICC</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>EMD Millipore</td><td>MAB3424</td><td>Uwaga: BrdU jest silnym teratogenem i podejrzewa się działanie mutagenne. Przed użyciem upewnij się, że jesteś odpowiednio przeszkolony i zapoznaj się z kartą charakterystyki.</td></tr><tr><td>Obiekt Canto II</td><td>BD</td><td></td><td>UHN SickKids FC. Do cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>cDNA EcoDry Premix</td><td>Clontech/Takara</td><td>639570</td><td>Do przygotowania cDNA do qPCR</td></tr><tr><td>CellTracker Green CMFDA Dye</td><td>Life Technologies</td><td>C7025</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne cytoplazmy komórkowej</td></tr><tr><td>Countess automatyczny licznik komórek</td><td>Invitrogen Inc.</td><td>C10227</td><td>Do zliczania komórek</td></tr><tr><td>DMEM-F12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D6421</td><td>Do pierwotnej pożywki hodowli kardiomiocytów szczurów.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami</td><td>Gibco</td><td>firmy Dulbecco 10010023</td><td>D-PBS, bez Ca2+, Mg2+</td></tr><tr><td>EVOS</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>Własny mikroskop fluorescencyjny</td></tr><tr><td>FACSCalibur</td><td>BD</td><td></td><td>In-house. Do cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca (Hyclon)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH3039603</td><td>FBS. Składnik pożywki do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Sondy IDT Prime Time qPCR</td><td>Zintegrowane technologie danych</td><td>FAM fluorofor</td><td>http://www.idtdna.com/pages/products/gene-expression/primetime-qpcr-assays-and-primers</td></tr><tr><td>Lab Vision Wodne medium montażowe PermaFluor</td><td>ThermoScientific</td><td>TA-030-FM</td><td>Do przechowywania komórek, które mają zostać poddane ICC</td></tr><tr><td>LSR II&nbsp;</td><td></td><td>Placówka BD</td><td>UHN SickKids FC. Do cytometrii przepływowej.</td></tr><tr><td>MoFlo Astrios</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td>UHN SickKids FC Facility. Do sortowania komórek.</td></tr><tr><td>Normalna surowica kozia</td><td>Technologia sygnalizacji komórkowej</td><td>5425S</td><td>NGS. Stosowany w roztworze blokującym do ICC</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Chamber Coverglass, 8-dołkowy</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>155409</td><td>Do przygotowania próbek do ICC</td></tr><tr><td>OmniPur Triton X-100 Surfaktant</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-OP</td><td>Jako składnik roztworu przepuszczalnego podczas przygotowywania komórek do</td></tr><tr><td>ICC Paraformaldehyd, 16% roztwór, EM Grade</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15710</td><td>Do mocowania komórek do ICC.</td></tr><tr><td>Penicylina/streptomycyna</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td>Składnik pożywki do hodowli komórkowych.</td></tr><tr><td>Startery</td><td>Sigma</td><td>Niestandardowe standardowe oligonukleotydy DNA, odsolone, 0,2 &mu; mol</td><td>CTnT_F: GGC AGC GGA AGA GGA TGC TGA A; CTnT_R: GAG GCA CCA AGT TGG GCA TGA ACG A; MYH6 F: GCA AAG TAC TGG ATG ACA CGC T; MYH6 R: GTC ATT GCT GAA ACC GAG AAT G</td></tr><tr><td>Quorum Spinning Disk Confocal</td><td>Zeiss</td><td></td><td>SickKids Imaging Facility</td></tr><tr><td>ReproCardio Kardiomiocyty pochodzące z komórek hiPS</td><td>ReproCell</td><td>RCD001N</td><td>Kontrola pozytywna dla qPCR</td></tr><tr><td>RNeasy mini kit</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td>Do izolacji RNA do qPCR</td></tr><tr><td>Rotor-Gene SYBR Green PCR Kit</td><td>Qiagen</td><td>204074</td><td>Do qPCR z mieszanką główną</td></tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>A1049101</td><td>Do MSC, pożywka do kohodowli monocytów.</td></tr><tr><td>Testy starterowe TaqMan qPCR</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4444556</td><td>Dla qPCR</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Barwienie komórek pod kątem żywotności i liczenia</td></tr><tr><td>Trypsyna</td><td>Gibco</td><td>272500108</td><td>Do dysocjacji komórek</td></tr><tr><td>Moc</td><td>Perkin-Elmer</td><td>Volocity 6.3</td><td>Oprogramowanie do obrazowania</td></tr><tr><td>0,2 i mu; m filtr porowy</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>566-0020</td><td>Do sterylizacji pożywek do hodowli</td></tr><tr><td>tkankowych HERAcell 150i Inkubator CO2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>51026410</td><td>Do inkubacji komórek</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>PBS. 1X, Bez chlorku wapnia i chlorku magnezu</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Almedic</td><td>7727- A10-704</td><td>Do podawania serca szczura. Można użyć dowolnych podobnych kleszczy.</td></tr><tr><td>Nożyczki</td><td>Fine Science Tools</td><td>14059-11</td><td>Do mielenia serca szczura. Zalecane zakrzywione nożyczki.</td></tr><tr><td>Probówka 50 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352070</td><td>Do pobierania podczas pobierania kardiomiocytów i ogólnych procedur hodowli tkanek</td></tr><tr><td>Probówka 15 ml</td><td>BD Falcon</td><td>352096</td><td>Do ogólnych procedur hodowli tkanek</td></tr><tr><td>Płytki 6-dołkowe</td><td>Thermo Scientific Nunc</td><td>CA73520-906</td><td>Do hodowli tkankowych</td></tr><tr><td>10 cm Naczynia do hodowli tkankowych</td><td>Corning</td><td>25382-428</td><td>Do formowania agregatów</td></tr><tr><td>Mikroskop Axiovert 40C</td><td>Zeiss</td><td></td><td>Do obrazowania w jasnym polu przez naszą hodowlę tkankową i resztę protokołu</td></tr><tr><td>70 &mu; m Sitko</td><td>komórkowe Fisherbrand</td><td>22363548</td><td>Aby zapewnić zawiesinę pojedynczej komórki przed cytometrią przepływową lub sortowaniem</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>EMD Millipore</td><td>9410-1L</td><td>Stosowany w roztworze przepuszczalnym dla ICC</td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H1399</td><td>Bejca stosowanego podczas wizualizacji lokalizacji Cx43</td></tr></tbody></table>

in vitro różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

In Vitro Differentiation of Human Mesenchymal Stem Cells into Functional Cardiomyocyte-like Cells

Zawał mięśnia sercowego i następująca po nim kaskada niedokrwienna powodują rozległą utratę kardiomiocytów, prowadząc do zastoinowej niewydolności serca, głównej przyczyny śmiertelności na całym świecie. Mezenchymalne komórki macierzyste (MSC) są obiecującą opcją dla terapii komórkowych, która może zastąpić obecne, inwazyjne techniki. MSCs mogą różnicować się w linie mezenchymalne, w tym typy komórek serca, ale nie osiągnięto jeszcze pełnego różnicowania w funkcjonalne komórki. Dotychczasowe metody różnicowania opierały się na środkach farmakologicznych lub czynnikach wzrostu. Jednak bardziej fizjologicznie istotne strategie mogą również umożliwić MSCs przejście transformacji kardiomiogennej. W tym artykule przedstawiono metodę różnicowania z wykorzystaniem agregatów MSC na warstwach zasilających kardiomiocyty w celu wytworzenia kurczących się komórek przypominających kardiomiocyty.
Wykazano, że Wykazano, że ludzkie komórki okołonaczyniowe pępowiny (HUCPVC) mają większy potencjał różnicowania niż powszechnie badane typy MSC, takie jak MSC szpiku kostnego (BMSC). Jako ontogenetycznie młodsze źródło, zbadaliśmy potencjał kardiomiogenny HUCPVC w pierwszym trymestrze ciąży (FTM) w porównaniu ze starszymi źródłami. HUCPVC FTM są nowym, bogatym źródłem MSC, które zachowują swoje właściwości immunouprzywilejowane w macicy podczas hodowli in vitro. Korzystając z tego protokołu różnicowania, FTM i term HUCPVC osiągnęły znacznie zwiększone różnicowanie kardiomiogenne w porównaniu z BMSC, na co wskazuje zwiększona ekspresja markerów kardiomiocytów (tj. czynnika wzmacniającego miocyty 2C, troponiny sercowej T, miozyny serca łańcucha ciężkiego, białka regulatorowego sygnału α i koneksyny 43). Utrzymywały również znacznie niższą immunogenność, o czym świadczy ich niższa ekspresja HLA-A i wyższa ekspresja HLA-G. Stosując różnicowanie oparte na agregatach, HUCPVC FTM wykazały zwiększony potencjał tworzenia agregatów i wygenerowały kurczące się klastry komórek w ciągu 1 tygodnia od kohodowli na warstwach zasilających serce, stając się pierwszym typem MSC, który tego dokonał. 
Nasze wyniki pokazują, że ta strategia różnicowania może skutecznie wykorzystać kardiomiogenny potencjał młodych MSC, takich jak FTM HUCPVC, i sugeruje, że predyferencjacja in vitro może być potencjalną strategią zwiększenia ich skuteczności regeneracyjnej in vivo.

HUCPVCs wykazują wyższy potencjał tworzenia agregatów i poziomy ekspresji CD49f w porównaniu do BMSCs:
Aby indukowć różnicowanie hMSC (tj. FTM HUCPVCs, term HUCPVCs oraz BMSCs), zawiesiny pojedynczych niezróżnicowanych komórek MSC lub krople wiszące zawierające MSC (Table 1) przeniesiono na monowarstwy pierwotnych kardiomiocytów szczura w celu utworzenia odpowiednio bezpośrednich współh...

Tutaj prezentujemy metodę efektywnego wykorzystania potencjału różnicowania serca młodych źródeł ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w celu generowania funkcjonalnych, kurczących się, kardiomiocytów komórek in vitro.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Myocardial infarction and the subsequent ischemic cascade result in the extensive loss of cardiomyocytes, leading to congestive heart failure, the leading ...

Ogólnym celem niniejszej procedury eksperymentalnej jest wywołanie i obserwacja indukcji kardiomiogennej mezenchymalnych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania w dziedzinie mezenchymalnych komórek macierzystych, takie jak to, jakie bodźce środowiskowe mogą indukować generowanie funkcjonalnych kardiomiocytów. Główną zaletą tej techniki jest zastosowanie formowania agregatów i płatowych warstw serca płodu zamiast czynników farmakologicznych lub materiału genetycznego.Znaczenie tej techniki rozciąga się na terapię chorób układu sercowo-naczyniowego, ponieważ rozwija ona wiedzę na temat potencjału kardiomiogennego mezenchymalnych komórek macierzystych. Procedurę tę zademonstrują Miss Farwah Iqbal, doktorantka w naszym laboratorium, oraz Max Librach i Nadav Gasner, obaj stażyści w naszym laboratorium. Po wyizolowaniu części szczurzęt zgodnie z protokołem tekstowym, należy przekroić komory serca na pół i przenieść je do naczynia o średnicy 10 cm zawierającego 10 ml PBS i umieścić na lodzie, aby wypłukać krew.Następnie, używając zakrzywionych nożyczek, potnij ściany komór na małe kawałki o średnicy od dwóch do trzech milimetrów. Za pomocą pipety serologicznej przenieś kawałki serca od 10 do 12 zwierząt do probówki o pojemności 50 mililitrów i pozostaw je do osadzenia. Odessij jak największą ilość PBS P/S, uważając, aby nie usunąć żadnych fragmentów serca.Następnie dodaj 10 ml świeżego PBS P/S. Aby wyizolować kardiomiocyty, po osadzeniu się fragmentów serca, zastąp PBS P/S roztworem 0,15% trypsyny w PBS i inkubuj tkankę w temperaturze 37 °C z wytrząsaniem przez 10 minut. Odlej nadsącz.Następnie powtórz trawienie trypsyną jeszcze trzy razy, z wyjątkiem tego, że nadlodówki należy przelać do probówek zbiorczych o pojemności 50 ml zawierających 10 ml 100%FBS. Następnie odwiruj probówki z komórkami i odessać nadlodówkę. Potem użyj DMEM-F12 z 10%FBS i 1%P/S, aby resuspenderć komórki i wysiać je na płytkę sześciodołkową.Po przytwierdzeniu komórek należy wymienić medium na 2 ml świeżego medium. Aby przygotować uprzednio barwione MSC, należy usunąć medium z kultur MSC, które osiągnęły 70% do 80% konfluencji w naczyniach 10 cm, a następnie dodać 3 ml roztworu do dysocjacji komórek. Naczynia należy inkubować w temperaturze 37 °C i przy 5% CO2 przez pięć minut.Przenieś zdysocjowane komórki do probówki o pojemności 15 ml i wiruj przy 400 x G przez pięć minut. Odessij supernatant, nie naruszając osadu komórkowego, i resuspenduj komórki. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki.Rozcień komórki do stężenia 1 x 10⁶ MSCs na mililitr w pożywce DMEM-F12 zawierającej 10% FBS i 1% P/S. Następnie do komórek w probówkach odwirujących o pojemności 1,5 mililitra dodaj żywy, nietransferowalny barwnik fluorescencyjny i inkubuj MSCs przez pół godziny. Po odwirowaniu probówek przy 400 x G przez pięć minut odessaj supernatant i resuspenduj osad do stężenia 1 x 10⁶ MSCs na mililitr.Następnie przenieś MSC na kardiomiocyty w stężeniu 10 x 10⁴ komórek na studnię płytki sześciodołkowej. Aby utworzyć ko-kultury w formie agregatów, przygotuj zawiesinę pojedynczych komórek MSC w alpha MEM, uzupełnionym o 10% FBS i 1% P/S. Inicjuj tworzenie agregatów, umieszczając krople 25 µL zawiesiny komórkowej na wewnętrznej powierzchni pokrywek 10 cm naczyń hodowlanych.Nałóż pokrywki na odpowiadające im podstawki zawierające PBS P/S. Inkubuj szalki w temperaturze 37 °C i w atmosferze 5% CO2. Po trzech dniach za pomocą stereomikroskopu zaobserwuj tworzenie się agregatów w kroplach.Jeśli ponad 80% kropli zawierało utworzone agregaty, należy użyć mikropipety o objętości jednego mililitra, aby zebrać krople z pokrywek i przenieść agregaty bezpośrednio na monowarstwy pierwotnych kardiomiocytów szczura. Ko-kultury agregatów należy inkubować do dwóch tygodni, wymieniając pełną objętość medium co 72 godziny.W codziennym trybie pracy należy stosować mikroskopię w polu jasnym w celu obserwacji agregatów przyczepiających się do warstw komórek płodowych. Należy rejestrować kurczące się agregaty w momencie ich zaobserwowania. Aktywne agregaty kurczą się w sposób zsynchronizowany, co sugeruje istnienie przewodnictwa między nimi poprzez warstwę płodową, która nie wykazuje aktywności fizycznej.Odssać pożywkę i dodać dwa mililitry PBS do każdego dołka płytki 6-dołkowej. Następnie usunąć PBS i dodać dwa mililitry roztworu dysocjującego do każdego dołka. Inkubować płytki w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez trzy minuty.Jak pokazano tutaj, HMSCs trzech różnych typów wykazały podobną liczebność i wygląd w bezpośrednich kokulturach. Od dwóch do trzech dni po przeniesieniu kropel wiszących na komórki serca w kokulturach agregatów, FTMs i term huck PBCs pojawiły się w większych agregatach w porównaniu do tych zaobserwowanych w przypadku BMSCs. W tym eksperymencie analiza cytometryczna przepływowa ekspresji CD49F w nieróżnicowanych MSCs wykazała, że 96% FTM huck PBCs, 89% huck PBCs oraz 53% BMSCs były dodatnie pod kątem powierzchniowego markera CD49F.Cytometria przepływowa na 85 komórkach TRA won wykazała upregulację markera związanego z kardiomiocytami, SIRPA w FTM huck PBCs i term huck PBCs, ale nie w BMSCs z bezpośrednich kokultur kardiomiocytów. Jak widać tutaj, upregulacja cx43 była znacznie wyższa w FTM huck PBCs w porównaniu do term huck PBCs lub BMSCs w bezpośrednich kokulturach. Analiza mikroskopowa z użyciem fluorescencji ujawniła, że zarówno różnicujące się FTM, jak i term huck PBCs wykazały upregulację cx43.W komórkach term huck PBCs odnotowano wyższą proporcję niż w FTMs. Jednakże mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że punktowe sygnały cx43-dodatnie obserwowano w błonie komórkowej FTM huck PBCs, podczas gdy w komórkach term były one rozmieszczone głównie w cytoplazmie. Na koniec, jak widać tutaj, przeprowadzono mikroskopię fluorescencyjną przy dużym powiększeniu w posortowanych komórkach ludzkich po współhodowli, co potwierdziło wysoką zawartość cx43 w błonie plazmatycznej.Po opanowaniu metody, kluczowe etapy tej procedury można wykonywać w ciągu jednej godziny każdy, pod warunkiem ich prawidłowego przeprowadzenia. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest zachowanie środków ostrożności aseptycznych. Wykorzystywane pierwotne tkanki zwierzęce mogą wprowadzić zanieczyszczenia, jeśli nie będą odpowiednio traktowane.Po zastosowaniu tej procedury można przeprowadzić inne metody, takie jak dalsza hodowla kurczących się agregatów, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące trwałości tych struktur. Po dopracowaniu technika ta umożliwia badaczom zajmującym się MSCs badanie potencjału różnicowania młodszych źródeł mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak tkanki pozazarodkowe. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze rozumieć, jak przygotować agregaty MSC i połączyć je z bezpośrednimi pierwotnymi warstwami tkanek płodowych w sposób zapewniający odpowiednią indukcję różnicowania kardiomiogenicznego.Należy pamiętać, że praca z BRDU może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności, takich jak prawidłowe obchodzenie się z odpadami cytotoksycznymi.

in-vitro-differentiation-human-mesenchymal-stem-cells-into-functional

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

W niniejszym filmie zaprezentowano sposób przeprowadzania różnicowania in vitro embrionalnych komórek macierzystych myszy w ciała zarodkowe z wykorzystaniem metody wiszących kropli.

Różnicowanie in vitro mysich embrionalnych komórek macierzystych (mES) z wykorzystaniem metody wiszącej kropli

Opracowaliśmy protokół indukcji kardioblastów bezpośrednio z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych utrzymywanych w ściśle określonych warunkach z użyciem małych cząsteczek, co umożliwia pozyskanie dużej ilości ludzkich progenitorów serca oraz funkcjonalnych kardiomiocytów do regeneracji układu sercowo-naczyniowego.

Efektywne otrzymywanie prekursorów kardiologicznych i kardiomiocytów ludzkich z pluripotencjalnych ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem indukcji małocząsteczkowej

Pluripotencjalne komórki macierzyste, zarówno embrionalne, jak i indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPS), stanowią cenne źródło ludzkich zróżnicowanych komórek, w tym kardiomiocytów. Tutaj skupimy się na indukcji komórek iPS w sercu, pokazując, jak wykorzystać je do uzyskania funkcjonalnych ludzkich kardiomiocytów za pomocą protokołu opartego na ciałach embrionalnych.

Generowanie ludzkich kardiomiocytów: protokół różnicowania od indukowanych przez człowieka pluripotencjalnych komórek macierzystych bez karmienia

Artykuł opisuje szczegółową metodologię skutecznego różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych w kardiomiocyty poprzez selektywne modulowanie szlaku Wnt, a następnie analizę markerów referencyjnych za pomocą cytometrii przepływowej w celu oceny jednorodności i tożsamości populacji.

Wysoka skuteczność różnicowania ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych do kardiomiocytów i charakterystyka za pomocą cytometrii przepływowej

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Tutaj opisujemy solidny protokół do pozyskiwania ludzkich kardiomiocytów, który łączy modulowane małymi cząsteczkami różnicowanie serca i oczyszczanie kardiomiocytów za pośrednictwem deprywacji glukozy, umożliwiając produkcję oczyszczonych kardiomiocytów dla celów modelowania chorób sercowo-naczyniowych i badań przesiewowych leków.

Otrzymywanie wysoce oczyszczonych kardiomiocytów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu różnicowania modulowanego małymi cząsteczkami i późniejszego głodu glukozy

Ten manuskrypt opisuje tworzenie zdefiniowanych tkanek serca za pomocą ekspresji markerów powierzchniowych i sortowania komórek. Zdefiniowane tkanki mogą być następnie wykorzystane w bioreaktorze wielotkankowym do zbadania mechanizmów terapii komórkami serca w celu zapewnienia funkcjonalnego, a jednocześnie kontrolowanego systemu modelowego ludzkiego serca.

Budowa zdefiniowanych tkanek serca zaprojektowanych przez człowieka w celu zbadania mechanizmów terapii komórkami serca

Generowanie kardiomiocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych in vitro umożliwia dostęp do dużych ilości tkanki serca in vitro dla nauk podstawowych i zastosowań klinicznych.  Protokół ten wykorzystuje czynnik przedsionkowy Grem2 zarówno do zwiększenia liczby uzyskanych kardiomiocytów, jak i do wytworzenia kardiomiocytów o fenotypie przedsionkowym.

Różnicowanie kardiomiocytów przedsionkowych od pluripotencjalnych komórek macierzystych za pomocą antagonisty BMP Grem2

Elektrofizjologiczna charakterystyka kardiomiocytów pochodzących z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CMs) jest kluczowa dla modelowania chorób serca i określania odpowiedzi na leki. Protokół ten dostarcza informacji niezbędnych do dysocjacji i płytki hPSC-CM na matrycach wieloelektrodowych, pomiaru ich potencjału pola oraz metody analizy odstępów QT i RR.

Analiza elektrofizjologiczna ludzkich kardiomiocytów pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych (hPSC-CM) przy użyciu macierzy wieloelektrodowych (MEA)

Tutaj opisujemy i sprawdzamy metodę konsekwentnego generowania silnych ludzkich pluripotencjalnych kardiomiocytów pochodzących z komórek macierzystych i charakteryzujemy ich funkcję. Techniki te mogą pomóc w opracowaniu mechanistycznego wglądu w szlaki sygnałowe, zapewnić platformę do badań przesiewowych leków na dużą skalę i niezawodnie modelować choroby serca.

Wytwarzanie podobnych do komór kardiomiocytów pochodzących z HiPSC i wysokiej jakości preparatów komórkowych do charakterystyki obchodzenia się z wapniem

Tutaj prezentujemy protokół do solidnego generowania i rozbudowy ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta.

Wytwarzanie i ekspansja ludzkich kardiomiocytów z komórek jednojądrzastych krwi obwodowej pacjenta

Poznaj metodę różnicowania mezenchymalnych komórek macierzystych w komórki podobne do kardiomiocytów in vitro. Technika wykorzystuje sygnały środowiskowe i formowanie agregatów zamiast środków farmakologicznych.

In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Przeglądaj więcej filmów