In vitro Różnicowanie ludzkich mezenchymalnych komórek macierzystych w funkcjonalne komórki podobne do kardiomiocytów

Ogólnym celem tej procedury eksperymentalnej jest indukcja i obserwacja kardiomiogennej indukcji mezenchymalnych komórek macierzystych. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie mezenchymalnych komórek macierzystych, takie jak, jakie środki zaradcze mogą być wywołane przez sygnały środowiskowe w celu wytworzenia funkcjonalnych kardiomiocytów. Główną zaletą tej techniki jest to, że zamiast środków farmakologicznych lub materiału genetycznego stosuje się w niej tworzenie agregatów i warstw sercowych płodu.

Implikacje tej techniki rozciągają się na terapię chorób sercowo-naczyniowych, ponieważ rozwija ona kardiomiogenny potencjał mezenchymalnych komórek macierzystych. Tę procedurę zademonstrują mi pani Farwah Iqbal, doktorantka naszego laboratorium, Max Librach i Nadav Gasner, oboje stażyści naszego laboratorium. Po wyizolowaniu części szczeniąt szczura zgodnie z protokołem tekstowym, przetnij komory na pół i przenieś je do 10-centymetrowego naczynia z 10 mililitrami PBS i prążkowanymi na lodzie, aby krew mogła się wypłukać.

Następnie za pomocą zakrzywionych nożyczek pokrój ściany komór na małe kawałki o średnicy od dwóch do trzech milimetrów. Za pomocą pipety serologicznej przenieś kawałki serca od 10 do 12 zwierząt do 50-mililitrowej probówki i pozwól im się uspokoić. Usuń jak najwięcej PBS P/S, nie usuwając żadnych kawałków serca.

Następnie dodaj 10 milimetrów świeżego PBS P/S. Aby wyizolować kardiomiocyty, po ustabilizowaniu się kawałków serca, użyj 0,15% trypsyny w PBS, aby zastąpić PBS P / S i inkubuj tkankę w temperaturze 37 stopni Celsjusza z potrząsaniem przez 10 minut. Odrzucić supernatant.

Następnie powtórz trawienie trypsyny jeszcze trzy razy, z wyjątkiem dekanterowania supernatantów do 50-mililitrowych probówek zbiorczych zawierających 10 mililitrów 100% FBS. Następnie odwirować probówki komórek i odessać supernatant. Następnie użyj DMEM-F12 z 10% FBS i 1% P/S, aby ponownie zawiesić komórki i umieścić je na płytce z sześcioma dołkami.

Po przyczepieniu się komórek zastąp pożywkę dwoma mililitrami świeżej pożywki. Aby przygotować wstępnie wybarwione MSC, usuń pożywkę z kultur MSC, które osiągnęły 70% do 80% konfluencji w 10-centymetrowych szalkach i dodaj trzy mililitry roztworu dysocjacji komórek. Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez pięć minut.

Przenieś zdysocjowane komórki do 15-mililitrowej probówki i wiruj przy 400 x G przez pięć minut. Odessać supernatant bez naruszania osadu komórkowego i ponownie zawiesić komórki. Następnie użyj automatycznego licznika komórek, aby policzyć komórki.

Rozcieńczyć komórki do stężenia 1 x 10 do szóstych MSCs na mililitr, w DMEM-F12 zawierającym 10% FBS i 1% P/S. Następnie do komórek w 1,5-mililitrowych probówkach wirówkowych dodaj żywy, nieprzenoszalny barwnik fluorescencyjny i inkubuj MSCs przez pół godziny. Po odwirowaniu probówek o stężeniu 400 x G przez pięć minut, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w stężeniu 1 x 10 do szóstych MSCs na mililitr.

Następnie przenieś MSCs na kardiomiocyty w stężeniu 10 x 10 do czwartej komórki na dołek sześciodołkowej płytki. Aby uzyskać kokultury agregatowe, należy przygotować zawiesinę pojedynczych komórek MSCs w alfa MEM, uzupełnioną 10% FBS i 1% P/S. Zainicjuj tworzenie agregatu, umieszczając 25 mikrolitrowych kropli zawiesiny komórkowej na wewnętrznej powierzchni pokrywek 10-centymetrowych naczyń do hodowli tkankowych.

Umieść pokrywki na ich dolnych odpowiednikach zawierających PBS P/S. Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla. Pod mikroskopem stereoskopowym obserwuj tworzenie się agregatów w kroplach po trzech dniach.

Jeśli ponad 80% kropli zawierało uformowane agregaty, użyj mikropipety o pojemności jednego mililitra, aby zebrać krople z pokrywek i przenieść agregaty bezpośrednio na pierwotne monowarstwy kardiomiocytów szczura. Inkubuj zagregowane kokultury przez okres do dwóch tygodni. Zmiana pełnej objętości podłoża co 72 godziny.

Na co dzień używaj mikroskopii jasnego pola, aby obserwować agregaty przyczepiające się do warstw komórek płodu. Rejestruj zagregowane kontrakty, gdy są obserwowane. Aktywne agregaty kurczą się w sposób zsynchronizowany, sugerujemy przewodnictwo między nimi w całej warstwie płodu, która nie ma aktywności fizycznej.

Odessać pożywkę i dodać dwa mililitry PBS na dołek z sześciodołkowej płytki. Następnie usuń PBS i dodaj dwa mililitry roztworu dysocjacyjnego do studzienki. Inkubuj naczynia w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% dwutlenku węgla przez trzy minuty.

Jak pokazano tutaj, HMSC trzech różnych typów wykazywały podobną liczebność i wygląd w bezpośrednich kokulturach. Dwa do trzech dni po przeniesieniu wiszących kropli na komórki serca w zagregowanych kokulturach, FTM i term huck PBC pojawiły się w większych agregatach w porównaniu z tymi obserwowanymi z BMSC. W tym eksperymencie analiza cytometrii przepływowej ekspresji CD49F w niezróżnicowanych MSC wykazała, że 96% PBC huck FTM, określanych jako 89% huck PBC i 53% BMSC, było dodatnich dla CD49F na powierzchni komórki.

Cytometria przepływowa na TRA zdobyła 85 komórek, wykazała regulację w górę markera związanego z kardiomiocytami, SIRPA w PBC FTM huck i term huck PBC, ale nie w BMSC z bezpośrednich kokultur kardiomiocytów. Jak widać tutaj, regulacja w górę cx43 była znacznie wyższa w PBC huck FTM w porównaniu z termicznymi PBC huck lub BMSC w bezpośrednich kokulturach. Analiza mikroskopii fluorescencyjnej wykazała, że rozróżnianie FTM i term huck PBC, oba regulowane w górę cx43.

Z PBC term huck w wyższej części niż FTM. Jednak mikroskopia fluorescencyjna wykazała, że w błonie komórkowej komórek FTM huck PBC zaobserwowano cx43 dodatnie punkty, które były głównie cytoplazmatyczne w komórkach terminowych. Wreszcie, jak widać tutaj, przeprowadzono mikroskopię fluorescencyjną w dużym powiększeniu na posortowanych komórkach ludzkich, po kokulturze i potwierdzono wysoką obfitość cx43 w błonie plazmatycznej.

Po opanowaniu, kluczowe kroki tej procedury można wykonać w ciągu jednej godziny, jeśli zostaną wykonane prawidłowo. Podczas próby wykonania tej procedury ważne jest zachowanie środków ostrożności w zakresie aseptyki. Pierwotne tkanki zwierzęce, które mogą powodować zanieczyszczenie, jeśli nie są odpowiednio traktowane.

Po tej procedurze można przeprowadzić inne metody, takie jak dalsza hodowla kurczących się kruszyw, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak długowieczność tych struktur. Po opracowaniu, technika ta umożliwia naukowcom zajmującym się MSC zbadanie potencjału różnicowania młodszych źródeł mezenchymalnych komórek macierzystych, takich jak dodatkowe tkanki embrionalne. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo dobrze zrozumieć, w jaki sposób przygotować agregaty MSC i połączyć je z bezpośrednimi pierwotnymi warstwami tkanek płodu, w sposób, który zapewnia odpowiednią indukcję różnicowania kardiomiogennego.

Nie zapominaj, że praca z BRDU może być bardzo niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze podejmować środki ostrożności, takie jak właściwe obchodzenie się z odpadami cytotoksycznymi.