Techniki laboratoryjne stosowane do utrzymania i różnicowania biotypów izolatów klinicznych i środowiskowych Vibrio cholerae

Ogólnym celem tej techniki jest dostarczenie zbioru protokołów, które są proste do przeprowadzenia i mogą pomóc każdemu badaczowi scharakteryzować dany kliniczny lub środowiskowy izolat Vibrio cholerae. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie bakteriologii, takie jak specyficzne cechy genotypowe i fenotypowe każdego izolatu Vibrio cholerae, zwłaszcza te o znaczeniu klinicznym. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona każdemu badaczowi na wykorzystanie tego zbioru testów do wiarygodnego scharakteryzowania i rozróżnienia klinicznych lub środowiskowych izolatów Vibrio cholerae.

Razem testy te zapewniają systematyczne podejście, które można stosować jako alternatywę lub jako dodatek do kosztownych, pracochłonnych eksperymentów i charakterystyki klinicznych i środowiskowych izolatów Vibrio cholerae. Chociaż metoda ta może dostarczyć informacji na temat charakterystyki biotypów Vibrio cholerae, może być również zastosowana do scharakteryzowania biochemicznych i metabolicznych zdolności innych bakterii jelitowych. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności z zarządzaniem czasem, ponieważ czasy inkubacji niezbędne do zapewnienia optymalnych wyników różnią się w zależności od testów biochemicznych.

Wizualne demonstracje protokołów wykrywania i dźgania mają kluczowe znaczenie, ponieważ rozpryskiwanie może często prowadzić do zanieczyszczenia krzyżowego i wymagane są maksymalne odstępy, aby zapobiec łączeniu się kultur. Rozpocznij protokół od granulowania 1,8 ml płynnej kultury przez noc przez dwie minuty przez odwirowanie przy co najmniej 8 600 xG w sterylnej probówce do mikrowirówek o pojemności 2 ml. Po odwirowaniu usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy w 900 mcl świeżego bulionu Luria-Bertani lub LB przez pipetowanie.

Następnie dodaj 900 mcl sterylnego glicerolu o proporcji 60% objętości do objętości do kultury i wymieszaj przez wirowanie. Przenieść mieszaninę do sterylnej probówki kriogenicznej o pojemności 2 ml i przechowywać kulturę podstawową w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Aby użyć wywaru, ze sterylną pętlą zaszczepiającą, usuń niewielką ilość zamrożonego wywaru i rozprowadź bakterie, aby uzyskać pojedyncze kolonie na płytkach agarowych LB.

Po użyciu natychmiast przywróć zamrożony wywar do 80 stopni Celsjusza, aby zapobiec całkowitemu rozmrożeniu kultur. Inkubuj płytki pokrywką do dołu przez 12-16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Zaopatrz się w wcześniej przygotowaną płytę.

Zaszczepić 4 ml płynnego bulionu LB w sterylnej probówce hodowlanej o pojemności 10 ml z pojedynczą kolonią, dotykając powierzchni pojedynczej kolonii wysterylizowaną pętlą i przenosząc kolonię do płynnego bulionu. Następnie inkubuj kulturę z napowietrzaniem w inkubatorze z wytrząsarką przy 225 obr./min przez 12-16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Przygotuj kulturę przez noc w płynnym bulionie LB.

Następnego dnia osadzaj kulturę i myj komórki, ponownie zawieszając osad komórkowy w 1,8 ml 1x soli fizjologicznej buforowanej fosforanem lub PBS. Powtórz procedurę prania trzy razy. Po trzecim płukaniu należy ponownie zawiesić końcówkę w 1,8 ml 1x PBS.

Następnie za pomocą końcówki pipety narysuj 1 mcl umytej kultury na odpowiednim podłożu. Umyj osad komórkowy otrzymany z hodowli przez noc. Zaszczepić płytki agarowe o ruchliwości, wkładając zaszczepiaczkę do przemytej płynnej kultury i wbijając pionowo w podłoże.

Upewnij się, że dźgnięcie zaszczepiające nie wygina się podczas dźgania agaru. Pomiędzy każdą inokulacją wysterylizuj dźgnięcie drutem za pomocą palnika Bunsena. Inkubować płytki pokrywką do góry przez 14-24 godziny w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po 14 godzinach uważnie monitoruj płytki ruchliwe, aby zapobiec przerostowi kultur. Zaszczepić 4 ml bulionu Voges-Proskauer lub MR-VP z czerwieni metylowej, pipetując 10 ml wcześniej przygotowanej kultury przez noc do 4 ml bulionu MR-VP w sterylnej probówce hodowlanej i inkubować z napowietrzaniem w inkubatorze z wytrząsarką przy 225 obr./min przez 12-16 godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnie dodać 150 mcl 5% wagowych na objętość alfa-naftolu i 50 mcl 40% wagowych wodorotlenku potasu do 1 ml porcji nocnej hodowli MR-VP w sterylnych probówkach hodowlanych.

Następnie krótko przekręć rurki w wiry. Pozostaw probówki w temperaturze pokojowej na maksymalnie cztery godziny, aż nastąpi zmiana koloru. Szczepy referencyjne biotypu i reprezentatywne warianty El Tor zostały włączone do podstawowych badań genetycznych PCR i testów fenotypowych w celu rozróżnienia tła biotypowego izolatów klinicznych i środowiskowych V.Cholerae.

Klasyczny O395 typu dzikiego zademonstrował klasyczne sekwencje ctxB i tcpA. I odwrotnie, dzikie szczepy El Tor N16961 i C6706 wykazały sekwencje El Tor ctxB i tcpA. MQ1795 i BAA-2163 zawierają klasyczną podjednostkę biotypu ctxB porównywalną z 0395.

Jednak oba warianty El Tor zawierały tcpA wskazujące na tło biotypu El Tor. Podczas uprawy na płytkach agarowych LB uzupełnionych polimyksyną B, klasyczny szczep biotypu dzikiego 0395 wykazywał wrażliwość na polimyksynę B, podczas gdy szczep biotypu dzikiego El Tor wykazywał odporność. Reprezentatywne szczepy wariantu El Tor wykazywały podobną oporność na antybiotyk.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak rozróżniać biotypy Vibrio cholerae za pomocą systemu identyfikacji wielu testów opisanego w tym manuskrypcie. Nie zapominaj, że praca z patogenami BSL-2 może być niezwykle niebezpieczna, a właściwe obchodzenie się i usuwanie wszystkich materiałów i odpadów musi być egzekwowane zgodnie z przepisami instytucjonalnymi, lokalnymi, stanowymi i federalnymi. Oprócz protokołów wymienionych w tym manuskrypcie, dalszą charakterystykę izolatów Vibrio cholerae można uzyskać poprzez badanie innych właściwości fenotypowych, takich jak tworzenie biofilmu i autoaglutynacja.