Name: Stworzenie modelu tętniaka aorty brzusznej u gryzoni poprzez zablokowanie przybyszowej perfuzji naczynia krwionośnego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-08T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Poznaj metodę tworzenia modelu tętniaka aorty brzusznej u szczurów poprzez zablokowanie perfuzji przybyszowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy rozwoju i pękania AAA, odzwierciedlając cechy ludzkiego schorzenia.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ta praca była wspierana przez Grants-in-Aid for Scientific Research (B) (20291958) dla N.U.; Dotacje dla młodych naukowców (A) (25713024) dla N.Z.

Opieka nad zwierzętami i eksperymenty zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi Komitetu Opieki nad Zwierzętami Uniwersytetu Hamamatsu w Szkole Medycznej Uniwersytetu Hamamatsu.
1. Zabieg chirurgiczny tworzenia modelu
UWAGA: Umieść narzędzia chirurgiczne w sterylizatorze perełkowym na 10 sekund przed operacją. Śródoperacyjnie używać sterylnych rękawiczek.
<ol>
	<li>Używaj samców szczurów o wadze 300 - 400 g. Pozwól szczurom na dostęp do pożywienia i wody ad libitum.</li>
	<li>Znieczulić szczura inhalacją izofluranu (2,0 - 3,0 ml/l). Potwierdź prawidłowe znieczulenie przez uszczypnięcie palca u nogi.</li>
	<li>Ogol włosy na brzuchu elektryczną maszynką do golenia i wyszoruj brzuch alkoholem i roztworem jodu powidonu.</li>
	<li>Ułóż szczura w pozycji leżącej na stole operacyjnym. Użyj maści weterynaryjnej na oczy szczura, aby zapobiec wysuszeniu podczas znieczulenia.</li>
	<li>Wykonaj laparotomię z brzusznym nacięciem brzucha w linii środkowej za pomocą nożyczek. Aby zabezpieczyć czyste pole operacyjne, należy zapakować zawartość jamy brzusznej do jamy brzusznej w sterylną gazę za pomocą retraktora rany.</li>
	<li>Aby odłączyć aortę od tkanki okołonaczyniowej, delikatnie podnieś i rozerwij zaotrzewnową pęsetą, aby odsłonić ścianę aorty i złuszczyć aortę podnerkową w przestrzeni zaotrzewnowej od poziomu lewej żyły nerkowej do rozwidlenia z tkanki okołonaczyniowej (<silna klasa = "xfig">Ryc. 1A).</li>
	<li>Podwiązuj naczynia rozgałęziające się od aorty brzusznej jedwabnym sznurkiem 5-0, aby zablokować dopływ krwi w punkcie oddalonym od aorty, który nie zwęża światła aorty.</li>
	<li>Aby zablokować przepływ krwi w aorcie, umieść klipsy naczyniowe tuż poniżej tętnicy nerkowej i tuż nad rozwidleniem aorty. 
	UWAGA: Rozmiar klipsów powinien być większy niż średnica aorty, aby całkowicie zablokować przepływ krwi. Tymczasowa ligatura jedwabnego sznurka 5-0 jest również wystarczająca do zablokowania przepływu krwi zamiast klipsów.</li>
	<li>Podobnie jak w przypadku tworzenia krwotoku punktowego na powierzchni ściany aorty, przeciąć przednią ścianę aorty za pomocą mikronożyczek 5 mm dystalnie od zacisku aorty, w sąsiedztwie gałęzi tętnicy nerkowej, w celu wprowadzenia cewnika poliuretanowego.</li>
	<li>Wprowadzić cewnik poliuretanowy (średnica zewnętrzna 0,55 mm, średnica wewnętrzna 0,37 mm) za pomocą igły o rozmiarze 24 płytko przez nacięcie, aby zmyć krew z aorty wodą. Podać strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną wodą do cewnika poliuretanowego i zmyć wodą pozostałą krew w aorcie. Po irygacji wyjmij cewnik z aorty.</li>
	<li>Przed włożeniem cewnika poliuretanowego (średnica zewnętrzna 1,20 mm, średnica wewnętrzna 0,94 mm) za pomocą igły o rozmiarze 18 należy przyciąć cewnik poliuretanowy do długości 10 mm (<klasa mocna = "xfig">Rysunek 1B).
	<ol>
		<li>Wprowadzić wycięty kawałek cewnika poliuretanowego do światła aorty z nacięcia wykonanego w kroku 1.9. Całkowicie umieść cewnik 10 mm w świetle aorty i zmień położenie punktu środkowego cewnika, aby dopasować go do miejsca nacięcia (tj. zakryj nacięcie cewnikiem).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Napraw nacięcie za pomocą przerwanych szwów za pomocą 8-0 sznurek monofilamentowy (<silna klasa="xfig">Rysunek 1C).</li>
	<li>Podwiązywać aortę brzuszną za pomocą kombinacji jedwabnego sznurka 5-0 i cewnika poliuretanowego (<klasa silna = "xfig" >Rysunek 1D). 
	UWAGA: Światło aorty może być utrzymywane przez cewnik założony na stałe. Mocno podwiązaj aortę, aby zapobiec nieprawidłowemu ustawieniu cewnika. Węzeł chirurga jest zalecany, ponieważ dodaje dodatkowego skrętu podczas wiązania pierwszego rzutu węzła, tworząc podwójny węzeł nad głową, a dodatkowy skręt zapewnia większe tarcie i może zmniejszyć poluzowanie.</li>
	<li>Po podwiązaniu usuń klips naczyniowy w rozwidleniu aorty, a następnie usuń klips naczyniowy poniżej tętnicy nerkowej, aby przywrócić przepływ krwi w kierunku poprzednim. Potwierdź dużą pulsację aorty.</li>
	<li>Zamknij nacięcie brzuszne w dwóch warstwach, otrzewnej i innych warstwach, za pomocą szwu polipropylenowego 4-0. Szczelnie zszyj nacięcie, aby zapobiec wystającemu narządowi.</li>
	<li>Zastosuj miejscowo lidokainę na nacięcie brzucha. Umieść szczura na poduszce grzewczej, aż odzyska przytomność. Nie pozostawiaj szczura bez opieki, dopóki nie odzyska wystarczającej przytomności, aby utrzymać leżący mostek. Nie zwracaj szczura, który przeszedł operację, do towarzystwa innych szczurów, dopóki w pełni nie wyzdrowieje.</li>
	<li>Uważnie monitoruj szczura po operacji. Wstrzyknąć podskórnie bolus sterylnego roztworu soli fizjologicznej (1,0 - 2,0 ml), jeśli szczur wykazuje oznaki niepokoju lub utraty masy ciała.</li>
	<li>Po operacji obserwuj przebieg w czasie rozwoju powiększonej aorty na echogramie ultrasonograficznym. Zmierz maksymalną średnicę od wewnętrznej krawędzi do zewnętrznej krawędzi aorty brzusznej zgodnie z opisem5.</li>
</ol>
2. Zbiór, utrwalanie i barwienie Elastica-van Gieson (EVG)
<ol>
	<li>Dwadzieścia osiem dni po operacji podaj pentobarbital sodu ≥ 100 mg / kg dootrzewnowo w celu eutanazji szczurów.</li>
	<li>Rozetnij brzusznie jamy brzuszne szczura. Wykonaj pierwsze nacięcie za pomocą skalpela. Pobrać tętniaka za pomocą nożyczek i umieścić pobrane aorty w 10% neutralnie buforowanej formalinie na 24 - 48 godzin 
	UWAGA: Chirurg musi zachować ostrożność, aby zapobiec uszkodzeniu aorty i innych narządów podczas odsłaniania tętniaka. Należy zaobserwować uniesiony narząd brzuszny, co wskazuje na powstawanie AAA. Rysunek 2 przedstawia obraz in vivo i obraz ex vivo; ta reprezentatywna próbka AAA nie jest pęknięta.</li>
	<li>EVG staining9
	<ol>
		<li>Przygotowanie roztworu
		<ol>
			<li>Przygotuj hematoksylinę Verhoeffa, mieszając w podanej kolejności: alkoholową hematoksylinę 20 ml, 10% chlorek żelaza 8,0 ml i jod Lugola 8 ml. Wymieszaj roztwór między każdym dodatkiem. To rozwiązanie można przygotować na świeżo w razie potrzeby.</li>
			<li>Przygotować roztwór Van Giesona, mieszając 1% kwasową fuksynę 1 ml i nasycony kwas pikrynowy 45 ml. Odstawić na noc i dobrze wymieszać. To rozwiązanie jest stabilne przez 2 tygodnie.</li>
			<li>Przygotować roztwór różnicujący (2% chlorku żelaza), mieszając 10% FeCl3 10 ml w 40 ml wody destylowanej. Roztwór ten można przygotować na świeżo, w zależności od potrzeb.</li>
			<li>Przygotować 5% hipo, rozpuszczając 5,0 g tiosiarczanu sodu w 100 ml wody destylowanej. To rozwiązanie jest stabilne przez 1 rok.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Procedura barwienia 
		UWAGA: Zobacz reference9, aby uzyskać szczegółowe informacje.
		<ol>
			<li>Krótko uwodnić utrwalone odcinki parafinowe pobranych aort w wodzie destylowanej przez 10 minut. Umieścić aorty w hematoksylinie Verhoeffa na 25 minut. Przemyć wodą i zanurzyć 10-30 razy w roztworze różnicującym (2% FeCl3). Spłucz w wodzie. Umieścić w 5% hypo na 1 min. Umyć w wodzie. Umieścić w roztworze Van Giesona na 5 minut.</li>
			<li>Odwodnić w alkoholu w następującej kolejności: 75%, 90%, 95%, 100% i 100% alkoholu przez 30 s każdy. Następnie dwukrotnie sklarować w ksylenie przez 5 minut. Umieścić na szkiełku nakrywkowym z żywicznym medium montażowym. 
			UWAGA: Włókna elastyczne mają kolor od niebiesko-czarnego do czarnego; jądra: niebieskie do czarnych; kolagen: czerwony; i inne elementy tkankowe: żółte.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wolinsky, H., Glagov, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+abdominal+and+thoracic+aortic+medial+structure+in+mammals.+Deviation+of+man+from+the+usual+pattern%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of abdominal and thoracic aortic medial structure in mammals. Deviation of man from the usual pattern.</a> Circ Res. 25 (6), 677-686 (1969).</li>
<li>Sano, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lymphangiogenesis+and+angiogenesis+in+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Lymphangiogenesis and angiogenesis in abdominal aortic aneurysm.</a> PLoS One. 9 (3), e89830(2014).</li>
<li>Vorp, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Association+of+intraluminal+thrombus+in+abdominal+aortic+aneurysm+with+local+hypoxia+and+wall+weakening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Surg%22%5BJournal%5D)">Association of intraluminal thrombus in abdominal aortic aneurysm with local hypoxia and wall weakening.</a> J Vasc Surg. 34 (2), 291-299 (2001).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adventitial+vasa+vasorum+arteriosclerosis+in+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Adventitial vasa vasorum arteriosclerosis in abdominal aortic aneurysm.</a> PLoS One. 8 (2), e57398(2013).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hypoperfusion+of+the+Adventitial+Vasa+Vasorum+Develops+an+Abdominal+Aortic+Aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Hypoperfusion of the Adventitial Vasa Vasorum Develops an Abdominal Aortic Aneurysm.</a> PLoS One. 10 (8), e0134386(2015).</li>
<li>Tanaka, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+Mass+Spectrometry+Reveals+a+Unique+Distribution+of+Triglycerides+in+the+Abdominal+Aortic+Aneurysmal+Wall%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vasc+Res%22%5BJournal%5D)">Imaging Mass Spectrometry Reveals a Unique Distribution of Triglycerides in the Abdominal Aortic Aneurysmal Wall.</a> J Vasc Res. 52 (2), 127-135 (2015).</li>
<li>Kugo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+preventive+effect+of+fish+oil+on+abdominal+aortic+aneurysm+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biosci+Biotechnol+Biochem%22%5BJournal%5D)">The preventive effect of fish oil on abdominal aortic aneurysm development.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 80 (6), 1186-1191 (2016).</li>
<li>Kugo, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocyte+in+vascular+wall+can+induce+the+rupture+of+abdominal+aortic+aneurysm%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Adipocyte in vascular wall can induce the rupture of abdominal aortic aneurysm.</a> Sci Rep. 6, 31268(2016).</li>
<li>Lichtenberg, A., Cebotari, S., Tudorache, I., Hilfiker, A., Haverich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biological+scaffolds+for+heart+valve+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Biological scaffolds for heart valve tissue engineering.</a> Methods Mol Med. 140, 309-317 (2007).</li>
<li>Heistad, D. D., Marcus, M. L., Larsen, G. E., Armstrong, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+vasa+vasorum+in+nourishment+of+the+aortic+wall%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Role of vasa vasorum in nourishment of the aortic wall.</a> Am J Physiol. 240 (5), H781-H787 (1981).</li>
<li>Yoshimura, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regression+of+abdominal+aortic+aneurysm+by+inhibition+of+c-Jun+N-terminal+kinase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Regression of abdominal aortic aneurysm by inhibition of c-Jun N-terminal kinase.</a> Nat Med. 11 (12), 1330-1338 (2005).</li>
<li>Azuma, J., Asagami, T., Dalman, R., Tsao, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Creation+of+murine+experimental+abdominal+aortic+aneurysms+with+elastase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Creation of murine experimental abdominal aortic aneurysms with elastase.</a> J Vis Exp. (29), (2009).</li>
<li>Lu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subcutaneous+Angiotensin+II+Infusion+using+Osmotic+Pumps+Induces+Aortic+Aneurysms+in+Mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Subcutaneous Angiotensin II Infusion using Osmotic Pumps Induces Aortic Aneurysms in Mice.</a> J Vis Exp. (103), (2015).</li>
<li>United Kingdom, E. T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.nejm.org/doi/full/10.1056/NEJMoa0909305#t=article">Endovascular versus open repair of abdominal aortic aneurysm.</a> N Engl J Med. 362 (20), 1863-1871 (2010).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

W warunkach fizjologicznych wewnętrzne warstwy ściany aorty są odżywiane przez dyfuzję z przepływu światła krwi, podczas gdy warstwy zewnętrzna i środkowa są odżywiane przez VV, który przenika z przydanki do przyśrodkowej VV1. Przepływ krwi VV do ściany aorty brzusznej może pochodzić z następujących trzech kierunków/obszarów: (1) kierunek proksymalny przez ścianę aorty, (2) kierunek dystalny przez ścianę aorty i (3) tkanki okołonaczyniowe10. Wcześniej nasza analiza histologiczna tkanek ludzkich zidentyfikowała znaczne zwężenie lub okluzję VV w ścianie AAA, co sugeruje, że przepływ krwi VV do ściany aorty brzusznej może być zmniejszony4. Niezwykle ważnym punktem w tym protokole jest to, że podnerkowe tętniaki tętniakowe powstały w wyniku połączenia wprowadzenia cewnika poliuretanowego i podwiązania szwów aorty brzusznej podnerkowej. Aby ostrożnie złuszczyć warstwę tkanki, chirurdzy muszą płynnie wprowadzić cewnik poliuretanowy do aorty i mocno podwiązać aortę, aby spowodować przewlekłe niedotlenienie z powodu hipoperfuzji przybyszowego VV i powstania tętniaka. Stosując te techniki, przepływ krwi w ścianie aorty jest w konsekwencji zmniejszony i indukowane jest miejscowe środowisko niedotlenienia. Zmniejszenie przepływu krwi i powstawanie tętniaka wywołane niedotlenieniem wskazuje, że przepływ krwi VV do ściany aorty brzusznej odgrywa rolę w patogenezie powstawania AAA.
W szczególności model tętniaka aorty musi spełniać następujące warunki: 1,5-krotny wzrost średnicy naczynia w porównaniu z wartością wyjściową, zwyrodnienie osłonki środkowej i zapalenie ściany aorty. Najpopularniejsze modele zwierzęce zostały skonstruowane poprzez wywołanie reakcji zapalnych za pomocą substancji, takich jak CaCl211, elastaza12 i angiotensyna II13. Modele te mogą mieć wysoką powtarzalność i w oczywisty sposób powodować zmiany patologiczne i są powszechnie stosowane w badaniach naukowych. W naszym modelu ocenialiśmy średnicę aorty za pomocą ultrasonografii co 7 dni przed wykonaniem zabiegu do 28 dnia po zabiegu (ryc. 3). Wyniki wykazały, że średnica aorty umiarkowanie wzrosła w ciągu 28 dni, co wskazuje, że ta zmiana średnicy jest podobna do tej w poprzednich modelach gryzoni. Ogólna obserwacja kształtu naczyniowego wykazała gładki wrzecionowaty kształt (ryc. 2). W 28 dniu złożyliśmy szczury w ofierze i przeprowadziliśmy analizę histopatologiczną odzyskanej tkanki aorty. Zaobserwowano rozerwanie i zanik włókien elastycznych i kolagenowych osłonki środkowej i przydanki (ryc. 4). Co więcej, komórki zapalne, takie jak makrofagi, były obecne od osłonki przydanki do osłonki środkowej.
Obecnie dostępne opcje leczenia AAA są ograniczone do naprawy chirurgicznej i wewnątrznaczyniowego przeszczepu stentu, ze śmiertelnością 30 - 50% u pacjentów z pęknięciem AAA14. Jednak żaden lek nie został zatwierdzony do użytku klinicznego w leczeniu AAA. Toczy się dyskusja, że istnieją rozbieżności w patologicznych ustaleniach między ludźmi a ustalonymi modelami zwierzęcymi stosowanymi w badaniach AAA. Podobieństwa w patogenezie między ludzkimi i zwierzęcymi modelami AAA mają zasadnicze znaczenie dla rozwoju leczenia farmakologicznego. Jeśli chodzi o skuteczność modeli gryzoni, nasz model szczurzy jest morfologicznie podobny do ludzkiego pod względem śródświetlnej skrzepliny5 i adipogenezy8. Co więcej, około 20% szczurów w tym badaniu miało pęknięcie AAA i zmarło w ciągu 28 dni po zabiegu. Chociaż pęknięcie tętniaka aorty jest najbardziej krytycznym zdarzeniem w tej chorobie, pęknięcie jest rzadkie w przypadku ustalonych eksperymentalnych modeli AAA, a mechanizm nie został jeszcze wyjaśniony. Dlatego model ten jest przydatny do zrozumienia mechanizmu rozszerzania średnicy aorty i pękania tętniaka.
Stworzenie tego modelu jest wymagane w przypadku niektórych zabiegów chirurgicznych. Dlatego badacze muszą ćwiczyć tworzenie tego modelu, co jest ograniczeniem tego modelu. W przyszłości chcielibyśmy stworzyć model gryzonia, w którym będziemy mogli zmniejszać przepływ krwi poprzez stopniowe pogrubianie ścian VV, co skutkuje samoistnym tętniakiem aorty.

Aorta brzuszna składa się z następujących trzech warstw: wewnętrznej ściany naczynia (intima), warstwy przyśrodkowej (media) i zewnętrznej ściany naczynia (adventitia), a spośród nich, przydanka posiada unikalny system ukrwienia znany jako vasa vasorum (VV). Tkanka aorty jest zaopatrywana w tlen poprzez przybyszową perfuzję VV i prostą dyfuzję tlenu z przepływu krwi w aorcie1. Jednak geograficznie aorta brzuszna ma najmniejszy rozkład VV w porównaniu z innymi częściami aorty. 2
Poprzednie badanie opisywało niedotlenienie tkanek w ścianach ludzkiego tętniaka aorty brzusznej (AAA) z grubą śródświetlną skrzepliną (ILT)3. Dodatkowo wykazano, że przybyszowy VV w ścianach tętniaków jest niedrożny ze zmianami miażdżycowymi w znacznie większym stopniu, co wiąże się z niedotlenieniem tkanek w ścianach AAA4. Na podstawie tych ustaleń stworzono nowy model AAA u gryzoni poprzez indukcję przybyszowej hipoperfuzji VV5. W tym modelu hipoperfuzja VV spowodowała niedotlenienie tkanek i rozwój podnerkowego AAA, który miał cechy morfologiczne i patologiczne podobne do cech ludzkiego AAA6. Najlepszymi przykładami były obecność ILT i akumulacja hiperplastycznych adipocytów6 oraz możliwość spowodowania pęknięcia7,8. Odkrycia te były rzadko obserwowane w poprzednich modelach gryzoni. Dlatego model ten może znacznie przyczynić się do głębszego zrozumienia mechanizmu odpowiedzialnego za rozwój i zerwanie AAA. Przedstawiamy i opisujemy standardowy protokół stosowany do indukcji AAA poprzez przybyszową hipoperfuzję VV oraz wyjaśniamy, jak wywołać niedotlenienie w ścianie aorty za pomocą technik chirurgicznych.

<table><tbody><tr><td>szczur</td><td>Japonia SLC. Inc</td><td>Slc:SD szczur</td><td>Sprague&ndash; Dawley ratTM</td></tr><tr><td>roztwór jodu powidonu</td><td>Libatape Pharmaceutical Co., Ltd.</td><td></td><td></td>4987335 111457</tr><tr><td>5-0 jedwabny sznurek</td><td>Akiyama Medical MFG. CO., LTD</td><td>JIS No.1</td><td></td></tr><tr><td>klipsy naczyniowe</td><td>Natsume Seisakusho Co., Ltd.</td>Cewnik poliuretanowy <td>C-42-S-2</td><td></td></tr><tr><td>(igła do montażu w miejscu 24G)</td><td>MEDIKIT</td><td>24G</td><td>Supercath Z4VTM,</td></tr> cewnik poliuretanowy z igłą w miejscu 24G <tr><td>(igła do montażu w miejscu 18x)</td><td>MEDIKIT</td><td>18G</td><td>Supercath Z3VTM, igła do montażu w miejscu w miejscu w rozmiarze 18</td></tr><tr><td>Sznurek monofilamentowy 8-0</td><td>Ethicon Szew</td><td>c-42-S-2</td><td>PROLENE Szew polipropylenowy, Napraw nacięcie szwem</td></tr></tbody></table>

stworzenie modelu tętniaka aorty brzusznej u gryzoni poprzez zablokowanie przybyszowej perfuzji naczynia krwionośnego

Creation of a Rodent Model of Abdominal Aortic Aneurysm by Blocking Adventitial Vasa Vasorum Perfusion

Przyrostowy vasa vasorum (VV) dostarcza tlen i pożywienie do ściany aorty. Niedotlenienie ściany aorty może powodować powiększenie tętniaków aorty brzusznej (AAA). W artykule przedstawiono i opisano standardowy protokół stosowany do indukcji tętniaków tętniaka poprzez przybyszową hipoperfuzję VV utworzoną z połączenia wprowadzenia cewnika poliuretanowego do światła aorty i podwiązania szwów aorty brzusznej podnerkowej.
Protokół zakłada wykorzystanie samców szczurów o wadze 300-400 g, które otrzymują jedzenie i wodę ad libitum. Po laparotomii z brzusznym nacięciem linii środkowej brzucha wykonuje się złuszczanie aorty, która blokuje przepływ krwi z tkanki okołonaczyniowej. Wykonuje się aortotomię polegającą na małym nacięciu przylegającym do gałęzi tętnicy nerkowej i wprowadza się cewnik poliuretanowy za pomocą igły umieszczonej na stałe w rozmiarze 18. Po naprawieniu nacięcia, ścisłe podwiązanie aorty nad cewnikiem blokuje przepływ krwi VV z kierunku proksymalnego przez ścianę aorty, nie zakłócając przepływu krwi w aorcie. Ta technika może wywołać AAA z postępującym poszerzeniem aorty.
Największą zaletą tego modelu jest to, że hipoperfuzja VV powoduje niedotlenienie tkanek i rozwój podnerkowego AAA, który ma cechy morfologiczne i patologiczne podobne do tych u ludzkiego AAA.

Opisane techniki operacyjne pozwalają na stworzenie nowego modelu zwierzęcego przewlekłego tętniaka wywołanego niedotlenieniem aorty, wykorzystując kombinację wprowadzenia cewnika z poliuretanu oraz podwiązania szwem aorty brzusznej poniżej nerek u szczurów. Szczury opisane w sekcji Protokół zostały poddane eutanazji 28 dni po zabiegu. Aorty zostały pobrane i poddane obrazowaniu w celu wizualizacji powstania tętniaka. Rysunek 2 przedstawia rozwój wrzecionowatego AAA. Górny i dolny koniec aorty ex vivo ma prawidłową średnicę bez rozszerzenia. Średnice aorty mierzono za pomocą ultrasonografii przezbrzusznej (Rysunek 3). Średnica zazwyczaj osiąga maksymalną wielkość około 14 dni po zabiegu; następnie pozostaje bez zmian lub nieznacznie zwiększa się. Rysunek 4 przedstawia obraz histopatologiczny tętniaka o maksymalnej średnicy po barwieniu EVG. Obraz tkanki w 28. dniu (tętniak) wykazał wyraźną degradację włókien elastycznych w porównaniu do obrazu z dnia 0.
<img alt="Etapy procedury chirurgicznej: złuszczanie, wprowadzenie cewnika, zszycie nacięcia, podwiązanie; schemat medyczny." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig1.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 1"> 
Rycina 1: Procedury chirurgiczne w celu wywołania tętniaka aorty brzusznej (AAA). 
(A) Aorta podnerkowa zostaje odseparowana od otaczających tkanek. (B) Przez małe nacięcie w aorcie wprowadzany jest odcięty na długość 10 mm cewnik poliuretanowy. (C) Nacięcie zostaje zszyte mononicią 8-0, a przepływ krwi zostaje przywrócony. (D) Aorta zostaje podwiązana jedwabną nicią 5-0 powyżej wprowadzonego cewnika. Pasek skali = 5 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig1large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, kliknij tutaj.</a>
<img alt="Porównanie tkanek in vivo i ex vivo, schemat, wizualizacja różnic strukturalnych, badanie naukowe." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig2.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rycina 2"> 
Rysunek 2: Reprezentatywne wyniki pooperacyjne. 
Widok makroskopowy w 28. dobie pooperacyjnej wykazujący rozwój wrzecionowatych tętniaków aorty brzusznej. Uniesiona krawędź przestrzeni zaotrzewnowej odpowiada zewnętrznej krawędzi tętniaka (linie przerywane; lewa strona). Górny i dolny koniec aorty w ex vivo są prawidłowe (po prawej). Pasek skali = 3 mm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig2large.jpg" target="_blank">Prosimy o kliknięcie tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej figury.</a>
<img alt="Wykres słupkowy przedstawiający zwiększenie średnicy aorty w ciągu 28 dni po zabiegu; wynik analizy danych." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig3.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 3"> 
Rysunek 3: Maksymalne średnice aorty zmierzone za pomocą transabdominalnego badania ultrasonograficznego. 
Średnica aorty w tym modelu szczurzym sukcesywnie wzrastała. Średnice aorty przedstawiono jako średnią ± odchylenie standardowe (n = 12). <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig3large.jpg" target="_blank">Kliknij tutaj, aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny.</a>
<img alt="Schemat histologiczny budowy ściany tętnicy, tętniak w dniu 0. vs w dniu 28., z widoczną warstwą środkową i zewnętrzną." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55763/55763fig4.jpg" data-altupdatedat="1788250015000" data-alt="Rysunek 4"> 
Rycina 4: Reprezentatywne obrazy tkanki tętniaka z barwieniem Elastica van Gieson. 
Ocena histologiczna z barwieniem EVG wykazująca degenerację błony sprężystej w tunice pośrodkowej oraz tworzenie zakrzepu w świetle naczynia 28 dni po zabiegu (po prawej). W 28. dniu obserwuje się fragmentację włókien sprężystych w tunice pośrodkowej aorty oraz rzadkie włókna kolagenowe w tunice zewnętrznej aorty. Dzień 0 to czas przed zabiegiem (po lewej). Pasek skali = 500 µm. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/55763/55763fig4large.jpg" target="_blank">Aby wyświetlić powiększoną wersję tej ryciny, należy kliknąć tutaj.</a>

Wprowadzenie cewnika poliuretanowego do światła aorty i podwiązanie szwem aorty powoduje przewlekłe niedotlenienie z powodu hipoperfuzji naczynia krwionośnego przybyszowego. W artykule opisano nowy zwierzęcy model tętniaka aorty brzusznej (AAA) o charakterystyce podobnej do AAA u ludzi.

Stworzenie modelu tętniaka aorty brzusznej u gryzoni poprzez zablokowanie przybyszowej perfuzji naczynia krwionośnego

The adventitial vasa vasorum (VV) provides oxygen and nourishment to the aortic wall. Hypoxia in the aortic wall can cause enlarged abdominal aortic ...

Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie niedotlenienia tkanki aorty w celu inicjacji tętniaka aorty brzusznej (AAA) z postępującym poszerzeniem aorty u szczura. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania w badaniach nad tętniakami aorty dotyczące mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój i pękanie tętniaków aorty brzusznej. Główną zaletą tej techniki jest fakt, że charakterystyka morfologiczna i patologiczna w modelu szczurzym jest podobna do tej obserwowanej w przypadku tętniaków aorty brzusznej u ludzi.Pomysł na tę metodę pojawił się podczas badania innej możliwości powstania ludzkiego tętniaka aorty brzusznej (AAA). Wizualna prezentacja tej metody jest kluczowa, ponieważ operacja indukcji hipoksji jest trudna do opanowania wyłącznie na podstawie instrukcji tekstowych. Procedurę zaprezentują Tatsuro Yata, nasz chirurg naczyniowy, oraz Hirona Kugo, oboje byli stażyści z naszego laboratorium.Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uciśnięcie palca u nogi, należy użyć golarki elektrycznej do usunięcia owłosienia z brzucha szczura o masie od 300 do 400 mg, a następnie sekwencyjnie zdezynfekować odsłoniętą skórę roztworem alkoholu i povidonem jodowym. Szczura należy umieścić na stole operacyjnym w pozycji grzbietowej i nałożyć maść do oczu zwierzęcia. Następnie, za pomocą nożyczek, należy wykonać cięcie wzdłuż linii pośrodkowej brzucha, a za pomocą sterylnej gazy i rozwieraka rany odsunąć i zabezpieczyć zawartość jamy brzusznej wewnątrz tej jamy.Aby oddzielić aortę od tkanki okołznaczyniowej, należy za pomocą pęsety delikatnie uchwycić i przerwać tkankę zaotrzewnową, odsłaniając ścianę aorty. Następnie należy oddzielić aortę podnerkową w przestrzeni zaotrzewnowej od tkanki okołznaczyniowej, od lewej żyły nerkowej aż do rozwidlenia. Do podwiązania naczyń odchodzących od aorty brzusznej należy użyć nici jedwabnej 5-0, aby zablokować dopływ krwi w punkcie oddalonym od aorty, który nie zwęża jej światła.Aby zablokować przepływ krwi w aorcie, należy założyć klipsy naczyniowe tuż poniżej tętnicy nerkowej oraz tuż powyżej rozwidlenia aorty. Podobnie jak podczas tworzenia krwawienia punktowego na powierzchni ściany aorty, należy wprowadzić mikronożyczki 5 mm dystalnie od klipsa aortalnego, w sąsiedztwie odgałęzień tętnicy nerkowej, aby naciąć przednią ścianę aorty, a następnie za pomocą igły wenflonowej 24G płytko wprowadzić cewnik poliuretanowy przez nacięcie. Do cewnika poliuretanowego należy podłączyć strzykawkę 1 mL wypełnioną wodą i wypłukać pozostałą krew z aorty.Następnie odciąć nowy cewnik poliuretanowy o długości 10 mm i całkowicie wprowadzić go do nacięcia w świetle aorty. Przesunąć punkt środkowy cewnika tak, aby pokrywał się z miejscem nacięcia, a następnie zamknąć nacięcie szwem przerywanym, używając jednowłóknistej nici chirurgicznej 8-0. Podwiązać aortę brzuszną węzłem chirurgicznym, wykorzystując jedwabną nić 5-0 oraz cewnik poliuretanowy.Po unieruchomieniu cewnika należy usunąć klamry naczyniowe w miejscu rozwidlenia aorty oraz poniżej tętnicy nerkowej, aby przywrócić przedni przepływ krwi i potwierdzić obecność wyraźnych pulsacji aorty. Po usunięciu gazy należy użyć szwy z polipropylenu 4-0, aby szczelnie zamknąć nacięcie brzuszne w dwóch warstwach, zapobiegając wypadnięciu narządów. Następnie należy zastosować miejscowo lidokainę na nacięcie brzuszne i umieścić szczura na podgrzewaczu z monitorowaniem aż do pełnego wybudzenia.Po operacji obserwuj przebieg czasowy powiększenia aorty na echogramie USG, mierząc maksymalną średnicę od wewnętrznej do zewnętrznej krawędzi aorty brzusznej zgodnie ze standardowymi protokołami. 28 dni po zabiegu, za pomocą skalpela wykonaj nowe cięcie brzuszne w celu otwarcia jamy brzusznej, a następnie za pomocą nożyczek pobierz tętniaka. Pobrane aorty umieść w 10% neutralnie buforowanej formalinie na 24 do 48 godzin.Po zatopieniu aorty w parafinie i pobraniu przekrojów tkanki aortalnej zgodnie ze standardowymi protokołami, należy nawodnić utrwalone skrawki parafinowe w wodzie destylowanej przez 10 minut, a następnie inkubować w hematoksylinie Verhoeffa. Procesy rdzewienia i korozji można zidentyfikować podczas ćwiczeń laboratoryjnych z wykorzystaniem hematoksyliny Verhoeffa i roztworu van Giesona. W związku z tym świeżość oraz czasy inkubacji tych barwników tkankowych są istotne dla archiwizacji i opcjonalnego barwienia.Po 25 minutach wypłucz preparaty trzykrotnie przez 1 minutę w wodzie, a następnie zanurz od 10 do 30 razy w roztworze różnicującym. Ponownie wypłucz preparaty trzykrotnie w wodzie i umieść próbki w 5% tiosiarczanie sodu na jedną minutę. Po kolejnym płukaniu wodą zanurz próbki w roztworze van Giesona na pięć minut.Następnie odwadnia się tkanki w 30-sekundowych, wzrastających stężeniowo kąpielach etanolu, a następnie przeprowadza przejaśnianie w dwóch 5-minutowych inkubacjach w ksylenie. Następnie należy użyć medium montażowego Resonance, aby przykryć skrawki odpowiednio dobranymi szkiełkami nakrywkowymi. Na tych obrazach przedstawiono reprezentatywny tętniak aorty brzusznej, 28 dni po wprowadzeniu cewnika.Pomiar górnego i dolnego odcinka aorty za pomocą ultrasonografii przezbrzusznej wykazuje prawidłową średnicę bez rozszerzenia bezpośrednio po wprowadzeniu cewnika, która wzrasta do maksymalnej wartości około 14 dni po zabiegu i pozostaje bez zmian lub nieznacznie zwiększa się do końca okresu eksperymentalnego. Analiza histopatologiczna tętniaka w 28. dniu wykazuje wyraźną degradację włókien elastycznych w porównaniu z obserwacjami z dnia zerowego. Po opanowaniu techniki, prawidłowo przeprowadzona procedura zajmuje około jednej godziny.Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak analizy in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące poszczególnych funkcji seryjnych. Po opracowaniu ta technika utorowała drogę badaczom zajmującym się tętniakami aorty brzusznej do badania tej choroby w konkretnych grupach demograficznych pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak indukować niedotlenienie tkanki aorty w celu inicjacji tętniaków aorty brzusznej z postępującym poszerzeniem aorty u szczura.Należy pamiętać, że praca z instrumentami chirurgicznymi może być niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury zawsze należy przestrzegać środków ostrożności w celu uniknięcia urazów i zakażeń.

creation-rodent-model-abdominal-aortic-aneurysm-blocking-adventitial

Research

JoVE Journal

Medicine

Medycyna

W niniejszym filmie pokazano, jak indukować tętniaki aorty brzusznej (AAA) u myszy poprzez przejściową infuzję wewnątrznaczyniową elastazy trzustkowej pochodzenia świńskiego do odcinka podnerkowego aorty brzusznej. Model ten pozwala na uzyskanie szerokiego wglądu w patobiologię AAA dzięki dostępności licznych myszy transgenicznych i z nokautem genowym.

Wytwarzanie eksperymentalnych tętniaków aorty brzusznej u myszy z użyciem elastazy

W niniejszym filmie zaprezentowano model ortotopowego przeszczepu aorty jako prosty model do badania rozwoju waskulopatii przeszczepu (TVP) u szczurów. <br...

Ortotopowy przeszczep aorty: model szczurzy do badania rozwoju przewlekłej waskulopatii

Modyfikacje histologiczne i biochemiczne po wykluczeniu endoprzeszczepu tętniaka są nadal niejasne. Opisujemy nowy model implantacji endprzeszczepu na tętniaku myszy. Dzięki analizie skrzepliny z utrzymującym się interfejsem krążącego krwiobiegu i bez niego oraz ocenie nowych biomateriałów wewnątrznaczyniowych, model ten pomoże lepiej zrozumieć patobiologię wykluczenia tętniaka wewnątrznaczyniowego.

Nowy mysi model wewnątrznaczyniowej naprawy tętniaka aorty

Mikrochirurgiczne tętniaki ściany bocznej u szczurów powstają w wyniku zespolenia przeszczepu aorty z boku do końca. Przedstawiamy instrukcje krok po kroku i omawiamy szczegóły anatomiczne i chirurgiczne, aby pomyślnie stworzyć eksperymentalnego tętniaka workowatego.

Mikrochirurgiczny model tętniaka ściany bocznej Helsinki Rat

Ten nowatorski model tworzy silne tętniaki aorty podnerkowej u świń za pomocą kombinacji angioplastyki balonowej, perfuzji elastazy/kolagenazy, miejscowego stosowania elastazy i doustnego podawania związków β-aminopropionitrylu, które zakłócają sieciowanie kolagenu.

Świński model tętniaka aorty brzusznej

Obecny protokół opisuje ustandaryzowaną metodę chirurgiczną dla modelu AAA wywołanego elastazą poprzez bezpośrednie zastosowanie elastazy do przydanki podnerkowej aorty brzusznej u myszy.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej indukowany przez okołonaczyniowe zastosowanie elastazy

Ten protokół opisuje mysi model tętniaka aorty brzusznej (AAA) wywołanego fosforanem wapnia w celu zbadania cech patologicznych i mechanizmów molekularnych AAA.

Model tętniaka aorty brzusznej myszy wywołany fosforanem wapnia

Ten manuskrypt przedstawia protokół tworzenia mysiego modelu tętniaka aorty brzusznej myszy przy użyciu chlorku wapnia i elastazy, łącząc zalety poprzednich metod modelowania. Model ten można wykorzystać do badania mechanizmów patofizjologicznych leżących u podstaw tętniaków aorty brzusznej.

Mysi model tętniaka aorty brzusznej za pomocą okołoprzybytkowego nacieku chlorku wapnia i elastazy

Ten protokół opisuje metodyczne podejście chirurgiczne do modelowania zaawansowanych tętniaków aorty brzusznej u myszy poprzez kombinację bezpośredniego stosowania elastazy do aorty podnerkowej i podawania ß-aminopropionitrylu przez wodę pitną.

Zaawansowane modelowanie tętniaka aorty brzusznej u myszy poprzez połączenie miejscowej elastazy i doustnego ß-aminopropionitrylu

Protokół ten zapewnia szczegółową, krok po kroku procedurę indukcji rozwarstwienia aorty piersiowej u myszy. W szczególności obejmuje dokładne obliczenie wymaganych dawek β-aminopropionitrylu i angiotensyny II, procedurę napełniania pompy osmotycznej oraz technikę implantacji pompy osmotycznej.

Mysi model rozwarstwienia aorty piersiowej wywołanego doustną infuzją β-aminopropionitrylu i podskórnej angiotensyny II

Ten protokół zapewnia powtarzalną i niezawodną metodę wywoływania tętniaków tętnicy brzusznej (TTB) u myszy C57BL/6 przy użyciu uczulenia elastyny i przynaczynowego stosowania elastazy, jako model TTB, który obejmuje komponent uczulenia immunologicznego.

Wiarygodne stworzenie modelu tętniaka tętnicy brzusznej u myszy przy użyciu uczulenia na elastynę i peryvaskularnej elastazy

Poznaj metodę tworzenia modelu tętniaka aorty brzusznej u szczurów poprzez zablokowanie perfuzji przybyszowej. Technika ta pozwala badać mechanizmy rozwoju i pękania AAA, odzwierciedlając cechy ludzkiego schorzenia.

Stworzenie modelu tętniaka aorty brzusznej u gryzoni poprzez zablokowanie przybyszowej perfuzji naczynia krwionośnego

Przeglądaj więcej filmów