Stworzenie modelu tętniaka aorty brzusznej u gryzoni poprzez zablokowanie przybyszowej perfuzji naczynia krwionośnego
8 listopada 2017
Wprowadzenie cewnika poliuretanowego do światła aorty i podwiązanie szwem aorty powoduje przewlekłe niedotlenienie z powodu hipoperfuzji naczynia krwionośnego przybyszowego. W artykule opisano nowy zwierzęcy model tętniaka aorty brzusznej (AAA) o charakterystyce podobnej do AAA u ludzi.
Ogólnym celem tej procedury jest wywołanie niedotlenienia tkanki aorty w celu zainicjowania tętniaka aorty brzusznej lub AAA z postępującym poszerzeniem aorty u szczura. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w okresie badań nad tętniakami aorty dotyczące mechanizmów odpowiedzialnych za rozwój i pękanie tętniaków aorty brzusznej. Główną zaletą tej techniki jest to, że cechy morfologiczne i patologiczne modelu szczurzego są podobne do tych obserwowanych w ludzkich tętniakach aorty brzusznej.
Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy badaliśmy inną możliwość wystąpienia AAA u ludzi. Wizualna demonstracja tej metody ma kluczowe znaczenie, ponieważ chirurgia indukcji hipoksji jest trudna do nauczenia się za pomocą samych instrukcji tekstowych. Procedurę zademonstrują Tatsuro Yata, nasz chirurg naczyniowy, i Hirona Kugo, oboje byli lekarze z naszego laboratorium.
Po potwierdzeniu odpowiedniego poziomu sedacji poprzez uszczypnięcie palca u nogi, użyj elektrycznej maszynki do golenia, aby ogolić włosy na brzuchu szczura o wadze od 300 do 400 miligramów, a następnie sekwencyjnie dezynfekuj odsłoniętą skórę roztworem alkoholu i jodu powidonu. Umieść szczura na stole operacyjnym w pozycji leżącej na plecach i nałóż maść na oczy zwierzęcia. Następnie za pomocą nożyczek wykonaj brzuszne nacięcie brzucha w linii środkowej i użyj sterylnej gazy i zwijacza rany, aby umieścić zawartość brzuszną w jamie brzusznej.
Aby odłączyć aortę od tkanki okołonaczyniowej, za pomocą pęsety delikatnie podnieś i rozerwij zaotrzewnową, odsłaniając ścianę aorty. Następnie złuszcz aortę podnerkową w przestrzeni zaotrzewnowej od lewej żyły nerkowej do rozwidlenia z tkanki okołonaczyniowej. Użyj jedwabnego szwu 5-0, aby podwiązać naczynia rozgałęziające się od aorty brzusznej, aby zablokować dopływ krwi w punkcie oddalonym od aorty, który nie zwęża światła aorty.
Aby zablokować przepływ krwi w aorcie, umieść klipsy naczyniowe tuż poniżej tętnicy nerkowej i tuż nad rozwidleniem aorty. Podobnie jak w przypadku tworzenia krwotoku punktowego na powierzchni ściany aorty, włóż mikronożyczki 5 mm dystalnie od zacisku aortalnego przylegającego do gałęzi tętnicy nerkowej, aby przeciąć przednią ścianę aorty i użyj igły o rozmiarze 24, aby płytko wprowadzić cewnik poliuretanowy przez nacięcie. Podłącz strzykawkę o pojemności 1 ml wypełnioną wodą do poliuretanu i wypłucz pozostałą krew z aorty.
Następnie wytnij nowy cewnik poliuretanowy o długości 10 mm i całkowicie włóż ten cewnik do nacięcia światła aorty. Zmień położenie środkowego punktu cewnika, aby dopasować go do miejsca nacięcia i użyj 8-0 szew monofilamentowy do zamknięcia nacięcia szwem przerywanym. Podwiązać aortę brzuszną węzłem chirurgicznym za pomocą jedwabnego szwu 5-0 i cewnika poliuretanowego.
Gdy cewnik jest zabezpieczony, usuń klipsy naczyniowe w rozwidleniu aorty i poniżej tętnicy nerkowej, aby przywrócić przepływ krwi w kierunku wstecznym i potwierdzić obecność dużego pulsowania aorty. Po zdjęciu gazy użyj nici polipropylenowej 4-0, aby szczelnie zamknąć nacięcie brzucha w dwóch warstwach, aby zapobiec wystającemu narządowi. Następnie nałóż miejscowo lidokainę na nacięcie brzucha i umieść szczura na poduszce grzewczej z monitorowaniem aż do pełnej rekompensaty.
Po operacji obserwuj przebieg rozwoju powiększonej aorty w czasie na echogramie ultrasonograficznym, mierząc maksymalną średnicę od wewnętrznej krawędzi do zewnętrznej krawędzi aorty brzusznej zgodnie ze standardowymi protokołami. 28 dni po operacji użyj skalpela, aby otworzyć jamę brzuszną z nowym nacięciem brzusznym i użyj nożyczek do pobrania tętniaka. Umieść pobrane aorty w 10% neutralnie buforowanej formalinie na 24 do 48 godzin.
Po zanurzeniu aort w parafinie i uzyskaniu wycinków tkanki aorty, zgodnie ze standardowymi protokołami, utrwalone skrawki parafiny należy uwodnić w wodzie destylowanej przez 10 minut, a następnie inkubować w hematoksylinie Verhoeffa. Rdzewienie i korozję można zidentyfikować za pomocą hematoksyliny Verhoeffa i działania laboratoryjnego roztworu van Giesona. Dlatego świeżość i czas inkubacji tych barwników tkankowych są ważne dla archiwizacji i opcjonalnego barwienia.
Po 25 minutach spłucz sekcje trzema 1-minutowymi płukaniami w wodzie, a następnie zanurz od 10 do 30 razy w roztworze różnicującym. Ponownie przepłukać skrawki trzykrotnie w wodzie i umieścić próbki w 5% tiosiarczanie sodu na jedną minutę. Po kolejnym przemyciu wodą zanurzyć próbki w roztworze van Giesona na pięć minut.
Następnie odwodnić tkanki w 30-sekundowych wstępujących zanurzeniach w etanolu, a następnie usunąć za pomocą dwóch 5-minutowych inkubacji ksylenu. Następnie za pomocą rezonansowego medium montażowego przykryj sekcje szkiełkami nakrywkowymi o odpowiedniej wielkości. Na tych zdjęciach pokazany jest reprezentatywny tętniak aorty brzusznej, 28 dni po wprowadzeniu cewnika.
Pomiar górnego i dolnego końca aorty za pomocą ultrasonografii przezbrzusznej ujawnia normalną średnicę bez rozszerzenia bezpośrednio po założeniu cewnika, która zwiększa się do maksymalnego rozmiaru po około 14 dniach od założenia i pozostaje niezmieniona lub nieznacznie wzrasta do końca okresu eksperymentalnego. Analiza histopatologiczna tętniaka w 28 dniu ujawnia wyraźną degradację włókien elastycznych w porównaniu z tą obserwowaną w dniu zero. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w około godzinę, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.
Zgodnie z tą procedurą można przeprowadzić inne metody, takie jak analiza in vitro, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące poszczególnych funkcji szeregowych. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się tętniakami aorty brzusznej do zbadania choroby w określonych grupach demograficznych pacjentów. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wywołać niedotlenienie tkanki aorty w celu zainicjowania tętniaków aorty brzusznej z postępującym poszerzeniem aorty u szczura.
Nie zapominaj, że praca z narzędziami chirurgicznymi może być niezwykle niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności przed urazami i infekcjami.
Przegląd
Niniejszy artykuł przedstawia nowy model zwierzęcy do badania tętniaków aorty brzusznej (AAA) u szczurów, który naśladuje charakterystykę ludzkich AAA. Model ten jest tworzony poprzez wprowadzenie cewnika poliuretanowego i ligację szwami, co prowadzi do przewlekłej hipoksji i rozszerzenia aorty.
Kluczowe elementy badania
Dziedzina nauki
- Neuronauka
- Biologia naczyń
- Modele zwierzęce
Wstęp
- Tętniaki aorty brzusznej stanowią istotny problem zdrowotny.
- Istniejące modele nie odzwierciedlają w sposób adekwatny warunków panujących w tętniakach aorty brzusznej u ludzi.
- Celem niniejszego badania jest opracowanie bardziej odpowiedniego modelu zwierzęcego.
- Zrozumienie mechanizmów powstawania tętniaków aorty brzusznej może pomóc w opracowaniu strategii terapeutycznych.
Cel badania
- W celu wywołania niedotlenienia tkanki aorty u szczurów.
- W celu stworzenia modelu odzwierciedlającego progresję AAA u ludzi.
- W celu zbadania mechanizmów rozwoju i pękania AAA.
Zastosowane metody
- Wprowadzenie cewnika poliuretanowego do aorty.
- Podwiązanie aorty brzusznej za pomocą szwu w celu wywołania hipoperfuzji.
- Monitorowanie rozszerzenia aorty za pomocą badania USG.
- Analiza histopatologiczna tkanki aorty po operacji.
Główne wyniki
- Model pomyślnie wywołał przewlekłą hipoksję i rozszerzenie aorty.
- Analiza histopatologiczna wykazała degradację włókien elastycznych.
- Pomiary średnicy aorty wskazały na postępujące rozszerzenie w czasie.
- Opanowanie techniki zajmuje około jednej godziny.
Wnioski
- Model ten dostarcza wiedzy na temat mechanizmów AAA.
- Może on ułatwić badania nad AAA w określonych grupach demograficznych pacjentów.
- Przyszłe badania mogą opierać się na tej technice w celu dalszej eksploracji.
Najczęściej zadawane pytania
Znaczenie dla Przemysłu
Ten model gryzoni wypełnia krytyczną lukę w badaniach przedklinicznych nad tętniakiem aorty brzusznej (AAA), odtwarzając przypominające ludzkie uszkodzenia hipoksyczne w ścianie aorty, co umożliwia mechanistyczną redukcję ryzyka w badaniach nad patologią naczyniową. Model ten wspomaga walidację celów terapeutycznych oraz przesiew fenotypowy, zapewniając system istotny z punktu widzenia choroby, charakteryzujący się postępującym poszerzeniem aorty i degradacją włókien elastycznych. Jego użyteczność polega na zwiększeniu wiarygodności prognostycznej interwencji terapeutycznych ukierunkowanych na formowanie tętniaka indukowanego hipoksją.
Strategiczne zastosowania w badaniach i rozwoju biofarmaceutycznym
Wczesne etapy odkrywania i walidacja celu
- Wartość naukowa: Umożliwia badanie szlaków pośredniczących w hipoksji w przebudowie ściany aorty i inicjacji tętniaka.
- Wartość operacyjna: Zapewnia powtarzalny system do oceny oddziaływania związków naczynioaktywnych lub przeciwzwłóknieniowych na cel terapeutyczny.
- Wartość naukowa: Wspiera walidację funkcjonalną perfuzji vasa vasorum w warstwie zewnętrznej jako modyfikowalnego elementu w patogenezie AAA.
Przesiewy i opracowanie testu
- Wartość naukowa: Pozwala na uzyskanie mierzalnych punktów końcowych, w tym średnicy aorty za pomocą badania ultrasonograficznego oraz oceny histopatologicznej integralności włókien elastycznych.
- Wartość operacyjna: Standaryzowany protokół chirurgiczny umożliwia spójne indukowanie modelu w różnych laboratoriach i punktach czasowych.
- Wartość naukowa: Umożliwia podłużne monitorowanie postępu tętniaka, co wspiera projektowanie analiz zależności dawka-odpowiedź oraz przebiegu czasowego.
Badania translacyjne i przedkliniczne
- Wartość naukowa: Odzwierciedla kluczowe cechy morfologiczne i patologiczne ludzkiego tętniaka aorty brzusznej (AAA), zwiększając istotność translacyjną.
- Wartość operacyjna: Ułatwia przedkliniczną ocenę potencjalnych terapii w modelu z rozszerzeniem indukowanym przewlekłą hipoksją.
- Wartość naukowa: Wspiera odkrywanie biomarkerów związanych z degradacją macierzy pozakomórkowej i sygnalizacją zapalną w ścianie aorty.
Integracja potoku i przepływu pracy
Model ten wpisuje się w kontinuum procesu odkrywania leków, od walidacji celu, poprzez identyfikację wiodących związków, aż po przedkliniczne testy skuteczności, w szczególności w przypadku czynników modulujących hipoksję lub stabilizujących macierz.
- Biologia odkrywcza: Umożliwia testowanie hipotez dotyczących odpowiedzi na stres hipoksyczny w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych oraz aktywacji fibroblastów.
- Przesiewanie: Zapewnia znormalizowaną platformę do oceny związków z mierzalnymi wynikami anatomicznymi i histologicznymi.
- Analityka: Dostarcza ilościowe obrazowanie (średnica w badaniu USG) oraz półilościową histologię (degradacja włókien elastycznych) do analizy porównawczej.
- Badania translacyjne: Łączy odkrycia mechanistyczne z walidacją przedkliniczną poprzez fenotypy AAA istotne dla ludzi.
- Ponowne wykorzystanie w przedsiębiorstwie: Tworzy powtarzalny model chirurgiczny do iteracyjnej redukcji ryzyka celów terapeutycznych w ramach programów biologii naczyniowej.
Wpływ operacyjny i przedsiębiorczy
- Wartość naukowa: Zmniejsza niejednoznaczność mechanistyczną poprzez powiązanie niedotlenienia błony zewnętrznej z patologią ściany aorty.
- Wartość operacyjna: Oferuje znormalizowaną, powtarzalną procedurę z określonym monitorowaniem pooperacyjnym i oceną punktu końcowego.
- Wartość strategiczna: Usprawnia podejmowanie decyzji o kontynuacji lub przerwaniu badań (go/no-go) poprzez walidację celów w patofizjologicznie istotnym modelu AAA.
- Wpływ na portfolio: Umożliwia priorytetyzację terapii naczyniowych z uwzględnieniem ryzyka, w oparciu o modulację celów w modelach tętniaka indukowanego niedotlenieniem.
Wskazówki dotyczące wdrożenia
- Wymagana jest wiedza z zakresu chirurgii naczyniowej gryzoni oraz technik mikrochirurgicznych.
- Metoda zależy od dostępu do systemów obrazowania ultradźwiękowego w celu pomiaru średnicy aorty wzdłużnej.
- Niezbędna jest infrastruktura histologiczna do barwienia metodą Verhoeffa i analizy włókien elastynowych.
- Stosowalność modelu może różnić się w zależności od szczepów szczurów i wymaga walidacji w kohortach starszych lub z chorobami współistniejącymi.
- Opieka pooperacyjna i protokoły przeciwbólowe są niezbędne dla dobrostanu zwierząt i spójności danych.
