Protokół wykorzystania analizy wzbogacenia zestawu genów w celu zidentyfikowania odpowiedniego modelu zwierzęcego do badań translacyjnych

Ogólnym celem tej procedury jest zidentyfikowanie odpowiedniego modelu zwierzęcego dla translacyjnych pytań badawczych. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na jedno kluczowe pytanie w badaniach translacyjnych: w jaki sposób wybrać odpowiedni model zwierzęcy dla konkretnej choroby ludzkiej, którą chcę zbadać? Główną zaletą tej techniki jest porównywanie danych z całego genomu pomiędzy modelami zwierzęcymi a badaniami nad chorobami ludzi.

Dzięki temu podejście to pozwala uniknąć stronniczej interpretacji związanej z porównaniami pojedynczych genów. Chociaż metoda ta dostarcza wiedzy na temat przydatności modeli mysich w badaniach nad chorobami zapalnymi, można ją również zastosować do innych modeli chorób. GSEA pomaga badać regulację polityki w ramach badań nad ekspresją genów.

Wyniki dla każdego modelu zwierzęcego i badania choroby stanowią podstawę do dalszych porównań. Rozpocznij tę procedurę od pobrania oprogramowania i danych, a następnie przejdź do obsługi i formatowania danych zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Następnie uruchom narzędzie programistyczne GSEA.

Kliknij przycisk Load Data po lewej stronie głównego okna. Otworzy się nowa karta służąca do importowania wymaganych plików danych. W nowej karcie wybierz plik z danymi dotyczącymi ekspresji genów oraz plik z fenotypami.

W przypadku braku połączenia GSEA z internetem należy również wczytać pobrane pliki bazy sygnatur molekularnych oraz pliki adnotacji mikroarray DNA. Pomyślnie zaimportowane dane pojawią się w sekcji ładowania danych. Kliknij przycisk Run GSEA po lewej stronie głównego okna.

Otwarta zostanie nowa karta w celu ustawienia parametrów analizy. Karta jest podzielona na trzy części: pola wymagane, pola podstawowe i pola zaawansowane. W polach wymaganych należy najpierw wybrać zestaw danych ekspresji.

Następnie wybierz bazę zestawów genów z podłączonej strony internetowej lub z ręcznie zaimportowanego pliku zestawu genów. Edytuj etykiety fenotypów, aby wybrać grupy próbek, które mają zostać ze sobą porównane. Na przykład grupę chorobową w zestawieniu z grupą kontrolną zdrową.

Następnie wybierz opcję collapse dataset to gene symbols równą true, aby przekształcić identyfikatory sond w zbiorze danych ekspresji na oficjalne symbole genów Hugo używane w bazie danych zestawów genów. Wybierz false, jeśli zbiór danych ekspresji zawiera już symbole genów Hugo. Ustaw liczbę permutacji na domyślną wartość 1 000.

Zmień typ permutacji na zbiór genów, ponieważ permutacja fenotypowa jest zalecana tylko wtedy, gdy w każdym fenotypie znajduje się więcej niż siedem próbek. Na koniec wybierz platformę mikromacierzy użytą do wygenerowania danych ekspresji genów, albo z połączonej strony internetowej, albo z ręcznie zaimportowanego pliku z adnotacjami chipów DNA. W polach podstawowych edytuj nazwę analizy oraz sekcję zapisu wyników w folderze.

Ponadto można zmienić dodatkowe parametry statystyczne. Aby uzyskać więcej szczegółów na temat parametrów i sekcji pól zaawansowanych, należy przejść do przewodnika użytkownika GSEA. Jeśli zastosowane zostaną zewnętrznie obliczone metryki grup dla danych ekspresji genów, należy użyć narzędzia GSEA pre-ranked.

Analizę tę przeprowadza się w oparciu o prostą listę genów przypisanych wcześniej do obliczonych wskaźników grupowych, które służą do rankingowania genów. Po wczytaniu alternatywnego pliku z ekspresją genów należy przejść do głównego paska nawigacji i kliknąć Narzędzia, GseaPreranked. W ten sposób otworzy się nowa karta służąca do ustawienia parametrów analizy.

Następnie kliknij przycisk Run w prawym dolnym rogu okna. Kliknij zakończoną pomyślnie analizę w sekcji raportu GSEA, aby otworzyć wyniki analizy. Następnie kliknij szczegółowe wyniki wzbogacenia w formacie Excel, aby wyeksportować wyniki analizy do arkusza kalkulacyjnego.

Wyeksportuj wyniki oddzielnie dla obu fenotypów. W programie Excel połącz dane z wynikami w jednym pliku arkusza kalkulacyjnego. W celu późniejszego porównania danych o ekspresji genów z kilku badań zachowaj co najmniej nazwę zestawu genów, jego znormalizowany wynik wzbogacenia (normalized enrichment score) oraz wartość FDR.

Powtórz analizę wzbogacenia zestawów genów (GSEA) dla drugiego badania oraz dla wszystkich kolejnych badań, które mają zostać ze sobą porównane. Uwzględnij jak najwięcej ludzkich badań klinicznych oraz różnych modeli mysich, aby zidentyfikować optymalny model mysi dla postawionego pytania badawczego w zakresie badań translacyjnych. Aby wyłonić optymalny model zwierzęcy naśladujący sytuację ludzką, porównaj ze sobą wyniki GSEA ze wszystkich badań.

Należy wykorzystać wyniki wzbogacenia oraz wartości FDR, aby zaklasyfikować szlaki jako aktywowane, zahamowane lub neutralne. W przypadku porównywania wielu badań zaleca się stosowanie skryptów R. Dla każdego porównania dwóch badań należy policzyć liczbę realizacji dziewięciu możliwych kombinacji regulacji szlaków, zgodnie z tablicą kontyngencji o wymiarach trzy na trzy.

Oceń korelację między dwoma badaniami poprzez obliczenie dodatniej wartości predykcyjnej oraz ujemnej wartości predykcyjnej, które z definicji stanowią część ścieżek wykazujących tę samą regulację w obu badaniach. Następnie oszacuj część ścieżek, których korelacja była spodziewana jedynie przypadkowo, reprezentowaną przez ppv chance i npv chance. Na koniec oblicz zysk informacji.

Wszystkie obliczenia można wykonać za pomocą programów do arkuszy kalkulacyjnych, jednak zaleca się stosowanie funkcji języka R. Użyj tabeli kontyngencji dla pary badań, aby obliczyć wartość P za pomocą testu chi-kwadrat, na przykład stosując funkcję chi-squared test w programie R lub programy do arkuszy kalkulacyjnych. Przechowuj dane z tabeli kontyngencji w macierzy X. Następnie porównaj wyniki GSEA dla wszystkich kombinacji badań wybranych do analizy.

Posortuj wszystkie kombinacje według przyrostu informacji. Do porównania wielu zbiorów danych wykorzystaj macierz i zwizualizuj wyniki za pomocą kolorowej mapy ciepła. Wybierz model zwierzęcy z najwyższym przyrostem informacji.

Aby ocenić istotność przyrostu informacji, należy wziąć pod uwagę również test chi-kwadrat. Przedstawiono tutaj macierz korelacji porównań szlaków między badaniami nad ludźmi a badaniami nad myszami. Pokrycie regulacji szlaków jest przedstawione jako przyrost informacji, który można uzyskać z jednego badania, aby przewidzieć efekty w innym badaniu.

Kolor niebieski oznacza niską korelację, a czerwony wysoką korelację między danymi. Porównanie zbiorów danych ludzkich i mysich ujawniło podgrupę modeli mysich, które były silnie skorelowane z badaniami prowadzonymi u ludzi. W związku z tym modele mysie te najlepiej nadają się do odwzorowania sytuacji ludzkiej.

Z kolei badania siódme, ósme i dziewiąte nie wykazały korelacji z badaniami nad chorobami ludzi. Po opanowaniu techniki tej można ją przeprowadzić w ciągu kilku dni, pod warunkiem prawidłowego wykonania. Czas ten zależy od ilości oraz dostępności danych.

Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że wiarygodność wyników zależy od jakości i istotności wybranych danych. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo mieć dobrą wiedzę na temat tego, jak dobrać odpowiedni model zwierzęcy dla konkretnej ludzkiej choroby na podstawie danych transkrypcyjnych.