Name: Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-08-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj metodę fotoaktywacji kinazy PKA w żywych komórkach przy użyciu nanocząstek konwertujących promieniowanie NIR. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych bez fototoksyczności UV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Programowi Nano Science and Technology Academia Sinica oraz Ministerstwu Nauki i Technologii Tajwanu za dofinansowanie (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).

UWAGA: Protokół opisuje szczegółową modyfikację oprzyrządowania do fotoaktywacji wspomaganej konwersją w górę, syntetyczną procedurę generowania PKA-UCNP w klatce, transmisyjną mikroskopię elektronową (TEM) próbek UCNP pokrytych krzemionką i PKA-UCNP w klatkach, przygotowanie do fotolizy UV i NIR, przygotowanie komórek, mikroiniekcję PKA-UCNP, badanie fotoaktywacji oraz barwienie włókien stresowych komórek REF52.
1. Konfiguracja fluorymetru do pomiaru widma konwersji w górę
<ol>
	<li>Zamontuj soczewkę obiektywu 4X obok uchwytu kuwety spektrometru fluorescencyjnego, tak aby laser skupiał się na środku kuwety.</li>
	<li>Umieść przestrajalną diodę laserową 980 nm o mocy od 0,5 do 8 W pod kątem 90° do soczewki obiektywu. 
	UWAGA: Operator musi posiadać wiedzę na temat bezpieczeństwa lasera i nosić gogle laserowe NIR.</li>
	<li>Zainstaluj lustro z pełnym odbiciem w przecięciu ścieżki światła soczewki obiektywu i lasera. Umieść metalową płytkę anodowaną na czarno, aby zablokować okno wzbudzenia spektroskopii i chronić części wewnętrzne.</li>
	<li>Umieść kuwetę z roztworem UCNP pokrytym krzemionką (0,2 - 0,6 mg/ml) w uchwycie kuwety, aby można było uwidocznić jasną wiązkę konwersji w górę i wykorzystać ją do dostosowania najlepszego ustawienia światła do instalacji lustra.</li>
	<li>Przełącz spektroskopię w tryb luminescencji z najniższym PMT voltage ustawienie (dostosuj do wyższego ustawienia, jeśli sygnał jest zbyt słaby). Ustaw lustro w najlepszym ustawieniu, gdzie wiązka znajduje się na środku kuwety, a PMT odbiera najsilniejszy sygnał.</li>
	<li>Zmierz widmo konwersji w górę, po wyrównaniu, z żądanym ustawieniem mocy. Użyj miernika mocy pala termicznego, aby zbudować krzywą kalibracyjną mocy lasera w stosunku do odczytu prądu elektrycznego na zasilaczu laserowym. Stale sprawdzaj wydajność lasera, aby upewnić się, że wydajność mieści się w skalibrowanym zakresie.</li>
</ol>
2. Konfiguracja mikroskopu
UWAGA: Następująca konfiguracja działa dla mikroskopów wyposażonych w dwupoziomową ścieżkę optyczną. Jeśli użytkownik zamierza zainstalować przełącznik wzbudzenia źródła światła w tylnym porcie, aby laser NIR i lampa halogenkowa miały ten sam port, kolimator w tylnym porcie znacznie zablokuje NIR, ponieważ został zaprojektowany w celu zmniejszenia nagrzewania się próbki. Użytkownik musi dokonać trudnego wyboru: pozostawić kolimator w środku i cierpieć z powodu bardzo niskiej wydajności konwersji w górę, czy usunąć kolimator i poświęcić intensywność światła wzbudzającego na rzecz epifluorescencji.
UWAGA: Diagram przekroju pokazujący schemat ścieżki światła dla zmodyfikowanego spektrofluorometru, mikroskopii dla upkonwersji luminescencji i trybu fotolizy NIR oraz dla trybu epifluorescencji i fotolizy UV, a także konfiguracja eksperymentalna użyta w tym eksperymencie są zilustrowane w Rysunek 2.
<ol>
	<li>Wyposaż mikroskop fluorescencyjny w metalohalogenkowy światłowód, skierowany do tylnego portu. 
	UWAGA: Na tej ścieżce światła wyższego poziomu, gdzie znajduje się wieżyczka sześcienna, jedna pozycja sześcianu musi być pusta, aby umożliwić NIR nadciąganie z dolnej ścieżki światła.</li>
	<li>Zainstaluj przestrajalną diodę laserową o mocy od 0,5 do 8,0 W 980 nm w porcie po prawej stronie, przy otwartym kolimatorze portu bocznego. 
	UWAGA: Powoduje to powiększenie plamki świetlnej lasera do około 500 μm średnicy, gdy używana jest soczewka obiektywowa 10X. Usunięcie tego kolimatora powoduje powstanie plamki świetlnej o zasięgu mikrometrów i sprawia, że naświetlanie ogniw NIR jest niepraktyczne. Ten kolimator jest przezroczysty dla NIR.</li>
	<li>Zainstaluj zwierciadło dichroiczne (krótkoprzepustowe 850 nm) i filtr wzbudzenia (długoprzepustowy 950 nm) w dolnej ścieżce światła.</li>
	<li>Użyj rozwiązania UCNP, aby zwizualizować plamkę świetlną NIR. Dostosuj położenie lasera, aby wyśrodkować wiązkę światła NIR w polu view, aby zakończyć wyrównanie.</li>
</ol>
3. Przygotowanie i charakterystyka konstrukcji PKA-UCNP w klatce
<ol>
	<li>Inkubować rekombinowany PKA (9 μM) z 0,5 mM 2-nitrobenzylbromkiem (NBB) w buforze klatkowym (20 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl i 10 mM MgCl2; pH 8,5) przez 1-2 godziny w temperaturze 25 °C. Zgasić nadmiar NBB za pomocą 10 mM dtiotriitolu (DTT), a następnie dializować w buforze kwasu 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowego (HEPES) (10 mM, pH 7,5) w celu usunięcia nadmiaru odczynników i soli. 
	UWAGA: pH roztworu do sadzenia w sadzach jest obniżane z 8,5 do 7,5 podczas dializy z HEPES pH 7,5 w celu późniejszej reakcji unieruchomienia.</li>
	<li>Zmieszać sole lantanowców - Y(CH3CO2)3 hydrat (99,9%, 0,4527 g, 1,38 mmol), Yb(CH3CO2)3 hydrat (99,9%, 0,2533 g, 0,60 mmol) i Tm(CH3CO2)3 hydrat (99,9%, 0,0168 g, 0,02 mmol)-w oktadecenie (30 mL) i kwasie oleinowym (12 ml), podgrzewać mieszaninę do 115 °C przez 30 min, i schłodzić je do temperatury 50 °C. Następnie rozpuść mieszaninę reakcyjną w roztworze metanolowym (20 ml) z 0,2 g (5,0 mmol) osadu NaOH i 0,2964 g (8 mmol) fluorku amonu przez sonikację przez 15 minut. Zwiększ temperaturę reakcji do 300 °C, aby uzyskać nanocząstki rdzenia UCNP (β-NaYF4:1,0% Tm3 + / / 30% Yb3+).</li>
	<li>Rozpuść nanocząstki rdzenia (25 mg) w CO-520 (0,5 ml) w cykloheksanie (10 ml). Dodać amoniak (wag. 30% v/v, 0,08 ml) i tetraetyloortokrzemian (TEOS, 0,04 ml) i stosować ciągłe mieszanie przez 12 godzin w temperaturze pokojowej, aby uzyskać pokryte krzemionką nanocząstki rdzenia β-NaYF4:1,0%Tm3+/30%Yb3+.</li>
	<li>Inkubować PKA (6 nmol) lub PKA w klatce (6 nmol) z UCNP (1 mg)15 w buforze HEPES (10 mM, pH 7,5) w temperaturze 4 °C przez 3 godziny w celu unieruchomienia PKA na UCNP pokrytym krzemionką poprzez oddziaływania elektrostatyczne.</li>
	<li>Przefiltrować mieszaninę za pomocą filtra PVDF (0,45 μm), odwirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i ponownie rozproszyć granulat w HEPES (50 μL, 10 mM, pH 7,5) zawierającym 0,1% stabilizatora białkowego w celu otrzymania oczyszczonego kompleksu PKA-UCNP. Wirować przy 17 000 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C i zebrać supernatant do testu Bradforda w probówce o pojemności 1,5 ml.</li>
	<li>Przeanalizuj nieograniczoną PKA w supernatancie zapisanym z kroku 3.5 za pomocą testu Bradforda, aby obliczyć wstecznie poziom podstawienia PKA na cząstkach UCNP, które normalnie mają poziom podstawienia ~ 4,5 nmol PKA na mg cząstki. 
	UWAGA: Test Bradforda ujawnia silny niebieski kolor na granulkach, co sugeruje wysoki poziom i stabilną immobilizację białka bez desorpcji, podczas gdy frakcja supernatantowa roztworu PKA-UCNP w sadzce wykazuje kolor podobny do buforu HEPES (<silna klasa = "xfig" >Rysunek 4c-4e).</li>
</ol>
4. Charakterystyka
UWAGA: Test kinazy służy do ilościowego określenia specyficznej aktywności kinazy pirogronianowej. Krótko mówiąc, fosforylacja peptydu, który jest sprzężony z kinazą pirogronianową i dehydrogenazą mleczanową, powoduje utlenianie NADH. Powstawanie tych ostatnich jest monitorowane poprzez pomiar spadku absorbancji NADH przy 340 nm.
<ol>
	<li>Oznaczyć aktywność PKA i PKA-UCNP w 60 μl całkowitej objętości mieszaniny do oznaczania zawierającej kwas 4-morfolinopropanosulfonowy (MOPS, 100 mM, pH 7,5), KCl (100 mM), fosfoenolopirogronian (PEP, 1 mM), trifosforan adenozyny (ATP, 1 mM), dinukleotyd β-nikotynamidoadeninowy, forma zredukowana (NADH, 0,8 mM), chlorek magnezu (MgCl2, 1 mM), kemptyd (0,4 mM), oraz mieszanina kinazy pirogronianowej i dehydrogenazy mleczanowej (30/40 jednostek PK/LDH).</li>
	<li>Zmierzyć spadek absorbancji NADH w czasie po dodaniu roztworu PKA (2 μl) do mieszaniny testowej. Oblicz nachylenie linii, aby bezpośrednio odzwierciedlić aktywność mierzonej kinazy.</li>
	<li>Zmierz aktywność PKA-UCNP15 i ogólną aktywność, która powinna być dobrze dopasowana do iloczynu mnożenia natywnej aktywności specyficznej dla PKA i obliczonej ilości PKA pokrytej powierzchniowo.</li>
</ol>
5. Konfiguracja fotolizy
<ol>
	<li>Zmierz całą moc źródeł światła za pomocą termicznego czujnika pala i oblicz gęstość mocy (PD = Moc (W)/Powierzchnia (cm2))18 na podstawie obszaru plamki świetlnej.</li>
	<li>Wykonaj eksperymenty fotolizy UV in vitro na komercyjnym systemie z diodą LED 365 nm (200 mW/cm2)15.</li>
	<li>W celu fotoaktywacji UV na stoliku mikroskopu, należy oświetlić roztwór PKA-UCNP światłem wzbudzającym przefiltrowanym przez komercyjną kostkę15. 
	UWAGA: Gęstość mocy wynosi ~15 mW/cm2, bez ustawiania ostrości obiektywu.</li>
	<li>W przypadku fotoaktywacji NIR in vitro na stoliku mikroskopu, należy oświetlić roztwór PKA-UCNP za pomocą lasera 980 nm z niestandardowymi ustawieniami filtra/lustra konwersji w górę, zainstalowanego na dolnej ścieżce światła, zwierciadła dichroicznego (krótkoprzepustowego 850 nm) i filtra wzbudzającego (950 nm długoprzepustowego). 
	UWAGA: Gęstość mocy wyjściowej wynosi 5 W/cm2 przed ustawieniem ostrości obiektywu 4X. Gęstość mocy szacuje się na ~ 68 W/cm2 po 4-krotnym ustawieniu ostrości obiektywu.</li>
</ol>
6. Przygotowanie próbki komórek i mikroiniekcja kompleksów PKA-UCNP
<ol>
	<li>Próbki należy wstępnie przefiltrować przez filtr 0,45 μm po unieruchomieniu PKA (krok 3.5).</li>
	<li>Inkubować komórki w 10% płodowej surowicy bydlęcej (FBS) zawierającej pożywkę L-15 w okresie mikroiniekcji w celu stabilnej kontroli pH na zewnątrz inkubatora. 
	UWAGA: Aby potwierdzić zakończenie mikroiniekcji, należy jednocześnie wstrzyknąć do komórek natywną PKA-UCNP, PKA-UCNP w klatce lub PEGylowaną UCNP (7,5 mg / ml)15 z 5(6)-karboksytetrametylorodaminą (TAMRA) (10 μM) do komórek.</li>
	<li>Dostosować stężenie cząstek PKA-UCNP tak, aby po mikroiniekcji stężenie cytozolowe wynosiło 1 - 3 μM PKA - fizjologiczny zakres stężeń dla PKA w komórce, przy założeniu, że objętość wstrzyknięcia wynosi 1/10 objętości komórki.</li>
	<li>Wykonaj mikroiniekcję do komórek (krok 6.2) za pomocą urządzenia do mikroiniekcji sprzężonego z jednoosiowym mikromanipulatorem hydraulicznym (<silna klasa="xfig">Rysunek 3).</li>
	<li>Użyj cyfrowego manometru, aby monitorować ciśnienie wywierane przez mikrowtryskiwacz znajduje się w zakresie roboczym (~50-200 hPa) i uszczelnij zawór dozujący w dostosowanej do potrzeb komorze ciśnieniowej, aby zapewnić ciśnienie kompensacyjne dla mikroiniekcji. Odciągnąć igłę za pomocą ściągacza.</li>
	<li>Utrzymuj ciśnienie wtrysku między 50 a 75 hPa, z czasem wstrzykiwania 200-300 ms i ciśnieniem kompensacyjnym na poziomie 15 hPa, aby zapobiec cofaniu się pożywki hodowlanej do igły przez działanie kapilarne.</li>
	<li>Sprawdź otwory końcówek igieł, aby upewnić się, że mają one średnicę zewnętrzną od 1,3 do 1,5 μm, co można potwierdzić, wykonując zdjęcia za pomocą obiektywu 40x.</li>
	<li>Po mikroiniekcji przemyć komórki 2 ml pożywki L-15 zawierającej 10% FBS. Obserwuj obrazowanie fluorescencji komórkowej z 5(6)-karboksytetrametylo-rodaminy (TAMRA), aby potwierdzić zakończenie mikroiniekcji.</li>
</ol>
7. Fotoaktywacja PKA-UCNP w klatce za pomocą światła UV lub NIR w żywych komórkach
<ol>
	<li>W celu fotoaktywacji UV po mikroiniekcji PKA-UCNP należy wyhodować komórki REF52 na szalce o grubości 3,5 μm, umieścić je na stoliku mikroskopu i naświetlić światłem UV przefiltrowanym przez kostkę przez 3 minuty bez ustawiania ostrości soczewki obiektywu. 
	UWAGA: Komórki REF52 utrzymywano w DMEM zawierającym 10% FBS w temperaturze 37 °C w inkubatorze 5% CO2 , a komórki hodowano, gdy konfluencja osiągała 90% co 2-3 dni.</li>
	<li>W celu fotoaktywacji NIR po mikroiniekcji PKA-UCNP należy oświetlić ogniwa laserem o długości fali 980 nm z niższych ustawień filtra/lustra, jak opisano w kroku 5.4. 
	UWAGA: Gęstość mocy wyjściowej wynosi 5 W/cm2 przed 10-krotnym ustawieniem ostrości obiektywu i szacuje się na 300 W/cm2 po 10-krotnym ustawieniu ostrości obiektywu. Konwersja w górę to proces, który wymaga dużej gęstości fotonów, zwłaszcza gdy potrzebne jest większe przesunięcie anty-Stoke'a. W związku z tym podczas fotoaktywacji potrzebne jest ustawianie ostrości.</li>
	<li>Gdy potrzebna jest większa plamka świetlna (650 μm x 520 μm), należy naświetlić te komórki NIR skupionym przez soczewkę obiektywu 10x z kolimatorem przez 15 minut. Pozostawić 5-minutowy odstęp między ciemnościami po każdych 5 minutach napromieniowania, aby uniknąć nagrzewania. 
	UWAGA: Gdy potrzebna jest wysoka rozdzielczość przestrzenna (subkomórkowa plamka świetlna), użyj soczewki obiektywowej 40X z otworkiem zainstalowanym na końcu wyjściowym światłowodu, aby wygenerować plamkę świetlną o wymiarze subkomórkowym (5 μm x 4 μm). W tym przypadku 1 s napromieniowania wystarcza do fotoaktywacji NIR ze względu na duży strumień fotonów.</li>
	<li>Po fotolizie UV lub NIR pozwól komórkom odzyskać siły w inkubatorze o stężeniu 5% CO2 w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę w kompletnym pożywce w celu wytworzenia odpowiedzi komórkowych. Następnie utrwal je w 1 ml 4% paraformaldehydu/soli fizjologicznej buforowanej fosforanem (PBS) przez 20 minut przed dalszym barwieniem. 
	UWAGA: Paraformaldehyd jest wysoce toksyczny; Unikaj kontaktu ze skórą, oczami lub błonami śluzowymi. Unikać wdychania proszku podczas odmierzania i przygotowywania.</li>
</ol>
8. Wizualizacja rozpadu włókien naprężeniowych spowodowanego fotoaktywacją NIR
<ol>
	<li>Po utrwaleniu użyj Alexa 594-falloidyny (dodaj 5 μl 6,6 μM roztworu podstawowego do 200 μl PBS w celu barwienia; inkubuj przez 25 minut w temperaturze pokojowej) do barwienia i wizualizacji włókien stresowych. Wizualizuj obrazy Alexy 594-falloidyny (Ex 581 nm/Em 609 nm) za pomocą zestawu filtrów.</li>
	<li>Inkubować komórki przez 5 minut w 4',6-diamidyno-2-fenyloindolu (DAPI) w temperaturze pokojowej. Po barwieniu umyj próbki PBS i oddzielnie wykonaj obrazy fluorescencyjne włókien i jąder naprężeń.</li>
</ol>

<ol><li>Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light-Controlled+Tools%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Light-Controlled Tools.</a> Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).</li>
<li>Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Illuminating+the+Chemistry+of+Life%3A+Design%2C+Synthesis%2C+and+Applications+of+%22Caged%22+and+Related+Photoresponsive+Compounds%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of "Caged" and Related Photoresponsive Compounds.</a> ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).</li>
<li>Pavlovic, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+Delivery+and+Photochemical+Release+of+a+Caged+Inositol-pyrophosphate+Induces+PH-domain+Translocation+in+Cellulo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Commun%22%5BJournal%5D)">Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo.</a> Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).</li>
<li>Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+Wavelength+Photoactivation+of+cAMP-+and+cGMP-Dependent+Protein+Kinase+Signaling+Pathways%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways.</a> ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).</li>
<li>Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-Selective+One-+and+Two-Photon+Uncaging+of+GABA%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA.</a> ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).</li>
<li>Warther, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two-Photon+Uncaging%3A+New+Prospects+in+Neuroscience+and+Cellular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorg+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology.</a> Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).</li>
<li>Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merging+of+Confocal+and+Caging+Technologies%3A+Selective+Three-Color+Communication+with+Profluorescent+Reporters%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem.+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters.</a> Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).</li>
<li>Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Wavelength-selective+cleavage+of+photoprotecting+groups%3A+strategies+and+applications+in+dynamic+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems.</a> Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).</li>
<li>Klán, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoremovable+Protecting+Groups+in+Chemistry+and+Biology%3A+Reaction+Mechanisms+and+Efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy.</a> Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).</li>
<li>Chien, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light+Photocontrolled+Targeting%2C+Bioimaging%2C+and+Chemotherapy+with+Caged+Upconversion+Nanoparticles+in+Vitro+and+in+Vivo%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo.</a> ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).</li>
<li>Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near-Infrared+Light-Mediated+Photoactivation+of+a+Platinum+Antitumor+Prodrug+and+Simultaneous+Cellular+Apoptosis+Imaging+by+Upconversion-Luminescent+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).</li>
<li>Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR+Light+Controlled+Photorelease+of+siRNA+and+Its+Targeted+Intracellular+Delivery+Based+on+Upconversion+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles.</a> Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).</li>
<li>Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+UV-Blocking+Polymer+Shell+Prevents+One-Photon+Photoreactions+while+Allowing+Multi-Photon+Processes+in+Encapsulated+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).</li>
<li>Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-mediated+Construction+of+Hollow+Upconversion+Nanoparticles+for+Protein+Harvesting+and+Near-Infrared+Light+Triggered+Release%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Mater%22%5BJournal%5D)">DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release.</a> Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).</li>
<li>Gao, H. -D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+a+Near-Infrared-Activatable+Enzyme+Platform+To+Remotely+Trigger+Intracellular+Signal+Transduction+Using+an+Upconversion+Nanoparticle%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle.</a> ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).</li>
<li>Wehbi, V. L., Taskén, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+Mechanisms+for+cAMP-Mediated+Immunoregulation+in+T+cells+-+Role+of+Anchored+Protein+Kinase+A+Signaling+Units%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells - Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units.</a> Front Immunol. 7, (2016).</li>
<li>Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+Molecule+Fluorescence+Approaches+Shed+Light+on+Intracellular+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs.</a> Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).</li>
<li>Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/articles/srep22433">Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect.</a> Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).</li>
<li>Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0014579388807816">Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells.</a> FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).</li>
<li>Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).</li>
<li>Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remote-control+Photorelease+of+Caged+Compounds+Using+Near-infrared+Light+and+Upconverting+Nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chem+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles.</a> Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).</li>
<li>Garcia, J. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NIR-triggered+Release+of+Caged+Nitric+Oxide+Using+Upconverting+Nanostructured+Materials%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials.</a> Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).</li>
<li>Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+NIR-responsive+and+sugar-targeted+polypeptide+composite+nanomedicine+for+intracellular+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Commun%22%5BJournal%5D)">An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy.</a> Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Wcześniej Hofmann i współpracownicy odkryli, że po mikrowstrzyknięciu wolnego PKA19 zaobserwowano dramatyczne zmiany morfologiczne w komórkach REF52. W innym badaniu grupa Lawrence'a wykazała, że PKA w klatkach może być aktywowany in vivo, co prowadzi do zmian morfologicznych i rozpadu włókien stresowych po poddaniu fotolizie UV20. Wcześniejsze doniesienia na temat wykorzystania przetworzonego światła UV do fotoaktywacji wykazały aktywację kilku wspomaganych przez ...

Chemicznie modyfikowane białka, które mogą być fotoaktywowane (np. białka PKA w klatkach) zostały opracowane jako nowa dziedzina w biologii chemicznej do nieinwazyjnego manipulowania międzykomórkowymi procesami biochemicznymi1,2,3. Wykorzystanie światła jako bodźca zapewnia doskonałą rozdzielczość czasoprzestrzenną podczas aktywacji tych białek zamkniętych w klatkach. Jednak światło UV może powodować niepożądane zmiany morfologiczne, apoptozę i uszkodzenia DNA komórek4,5. W związku z tym ostatnie osiągnięcia w projektowaniu grup fotoklatowania koncentrują się na umożliwieniu fotorozszczepienia przy wzbudzeniu dłuższych fal lub dwóch fotonów w celu zmniejszenia fototoksyczności, a także zwiększenia penetracji tkanek głębokich6,7. Grupy klatkowe, które reagują na dłuższe fale, co pozwala nam wybrać odpowiednie długości fal bez klatki (tj. kanały), aby selektywnie aktywować bioefektory, gdy obecne są dwie lub więcej grup klatkowych7. Biorąc pod uwagę te użyteczne cechy, opracowanie nowych grup fotoklatowania światłem czerwonym jest bardzo ważną pracą przygotowawczą w metodologiach fotochemicznych dla badań biologicznych, począwszy od sondowania mechanizmów reakcji, a skończywszy na kontrolowaniu aktywności komórkowej8. Niemniej jednak grupa klatkownicza składająca się z dwóch fotonów jest zwykle zbyt hydrofobowa ze względu na stopioną strukturę pierścienia aromatycznego, a grupa klatkowania w świetle widzialnym jest zwykle metaloorganiczna z aromatycznymi ligandami. Ta hydrofobowa/aromatyczna właściwość nie jest odpowiednia, gdy bioefektorem jest białko lub enzym, ponieważ denaturuje miejsce aktywacji enzymu/białka i powoduje utratę funkcji, nawet jeśli koniugacja i fotoliza nadal działają na poziomie chemicznym2,9.
UCNP są skutecznymi przetwornikami, które przekształcają światło wzbudzenia NIR na UV. Ta wyjątkowa i fascynująca właściwość UCNP zaoferowała realistyczne rozwiązania, aby sprostać wyzwaniom związanym z fotoaktywacją i wyzwalała kontrolowane uwalnianie małych cząsteczek, w tym kwasu foliowego10, pochodne cisplatyny11, DNA/siRNA12, pęcherzyki kopolimerowe13 i puste cząstki14. Jednak, zgodnie z naszą najlepszą wiedzą, do tej pory nie przetestowano fotoaktywacji enzymów lub białek wspomaganej przez UCNP. Ponieważ nie ma udanego przypadku użycia czerwonego światła lub NIR do fotoaktywowania enzymu, zostaliśmy poproszeni o przeprowadzenie wywołanej przez NIR aktywacji konstruktu białko/enzymu złożonego z chemicznie zmodyfikowanych kompleksów enzymatycznych w klatkach z pokrytym krzemionką, domieszkowanym lantanowców UCNP15. W tym badaniu UCNP był sprzężony z szybko reagującą kinazą transdukcji sygnału w postaci klatki PKA. PKA kontroluje syntezę glikogenu i regulację cytoszkieletu, który reaguje na bodźce zewnętrzne poprzez cykliczną regulację fosforanu adenozyny (cAMP) w klasie cytozolu<sup="xref">16. Badaliśmy wykonalność aktywacji enzymów w sposób czasowy i przestrzenny w eksperymencie komórkowym po napromieniowaniu NIR. Ta platforma fotoaktywacji wspomagana przez UCNP jest nową metodologią fotoaktywacji enzymu za pomocą NIR i pozwala uniknąć niepożądanej odpowiedzi na transdukcję sygnału z komórek spowodowanej konwencjonalnym promieniowaniem UV2,4.
Bardzo trudno jest translokować duże bioefektory (np. białka) przez błonę komórkową w celu kontrolowania aktywności komórkowej. Chociaż białko unieruchomione przez cząstki może być łatwiejsze do translokacji poprzez endocytozę do cytozolu, endocytoza może zostać uszkodzona lub zdegradowana przez uwięzienie endosomalne i wynikającą z tego degradację lizosomalną2,4. Nawet jeśli białko w klatce jest nadal funkcjonalne po translokacji błony, przemieszczone ilości mogą nie wystarczyć do wywołania odpowiedzi komórkowej2,17. W przeciwieństwie do tego, mikroiniekcja jest bezpośrednim i ilościowym podejściem do dostarczania dużych bioefektorów do cytoplazmy komórki. Co więcej, bioefektor unieruchomiony przez UCNP wymaga aktywacji światła przekonwertowanego w górę. Dlatego oprzyrządowanie optyczne wymaga dalszych modyfikacji w celu pomiaru, wizualizacji i wykorzystania światła konwersji w górę. W niniejszej pracy szczegółowo opisane zostanie dostarczenie zamkniętego w klatce kompleksu PKA-UCNP do komórki za pomocą mikroiniekcji oraz następujące niezbędne modyfikacje spektroskopii i mikroskopii do fotoaktywacji NIR.

<table><tbody><tr><td>Odczynnik</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroksymetylo)aminometan</td><td>Sigma</td><td>154563</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek magnezu sześciowodny</td><td>Sigma</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek sodu&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>31434</td><td></td></tr><tr><td>Chlorek potasu</td><td>Sigma</td><td>12636</td><td></td></tr><tr><td>Octan itru&nbsp; hydrat</td><td>Sigma 326046</td><td></td><td>Y(C2H3CO2)3 &middot; xH2O</td></tr><tr><td>Hydrat octanu tulu(III)</td><td>Alfa Aesar</td><td>14582</td><td>Tm(CH3CO2)3 &middot; xH2O</td></tr><tr><td>Tetrahydrat octanu iterbu(III)</td><td>Sigma</td><td>326011</td><td>Yb(C2H3O2)3 &middot; 4H2O</td></tr><tr><td>1-oktadecen</td><td>Sigma</td><td>O806</td><td></td></tr><tr><td>Kwas oleinowy</td><td>Sigma</td><td>364525</td><td></td></tr><tr><td>metanol&nbsp;</td><td>macron</td><td>304168</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek sodu</td><td>Sigma</td><td>30620</td><td></td></tr><tr><td>Fluorek amonu</td><td>J.T.Baker</td><td>69804</td><td></td></tr><tr><td>IGEPAL&nbsp; CO-520</td><td>Sigma</td><td>238643</td><td></td></tr><tr><td>Cykloheksan</td><td>J.T.Baker</td><td>920601</td><td></td></tr><tr><td>Wodorotlenek amonu (28% - 30%)</td><td>J.T.Baker</td><td>972101</td><td>Ortokrzemian tetraetylu amoniaku</td></tr><tr><td>(TEOS)</td><td>Sigma</td><td>8658</td><td></td></tr><tr><td>DL-Ditiothreitol (DTT)</td><td>Sigma</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>N-hydroksymaleimid (NHM)</td><td>Sigma</td><td>226351</td><td>PKA odczynnik blokujący aktywność</td></tr><tr><td>Roztwór stabilizatora białka Prionex z kolagenu wieprzowego</td><td>Sigma</td><td>81662</td><td>Roztwór stabilizujący białko</td></tr><tr><td>Bromek 2-nitrobenzylu (NBB)</td><td>Sigma</td><td>107794</td><td>PKA odczynnik do sadzenia</td></tr><tr><td>8-(4-chlorofenylotio)adenozyny 3&prime,5&prime;-cykliczny monofosforan soli sodowej</td><td>Sigma</td><td>C3912</td><td>8-CPT-cAMP</td></tr><tr><td>Kinaza pirogronianowa/dehydrogenaza mlekowa enzymy z mięśni królika</td><td>Sigma</td><td>P0294</td><td>PK / LDH</td></tr><tr><td>Adenozyno-5'-trifosforan disodowy</td><td>Sigma</td><td>A2387</td><td>ATP</td></tr> <tr><td>& beta;-NADH zredukowany z dipotasu</td><td>Sigma</td><td>N4505</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolopirogronian</td><td>Sigma</td><td>P7127</td><td>PEP</td></tr><tr><td>Coomassie Odczynnik do oznaczania białek, 950 ml</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td>Odczynnik do oznaczania Bradforda</td></tr><tr><td>Kinaza białkowa zależna od cAMP</td><td>Promega</td><td>V5161</td><td>PKA kontrola aktywności</td></tr><tr><td>plazmid pET15b-PKACAT</td><td>Addgene</td><td>#14921</td><td></td></tr><tr><td>plazmid pKaede-MC1</td><td>CoralHue</td><td>AM-V0012</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS), pH 7,4</td><td>Thermo Scientific</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, wysoka zawartość glukozy, pirogronian</td><td>Gibco</td><td>12800-017</td><td>Komórka pożywka</td></tr><tr><td>hodowlana Leibovitz L-15 Medium</td><td>Biological Industries</td><td>01-115-1A</td><td>Pożywka do hodowli komórkowych</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Biological Industries</td><td>04-001-1A</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd</td><td>ACROS</td><td>416785000</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen</td><td>D1306</td><td>Barwnik do barwienia jądra</td></tr><tr><td>Alexa 594-falloidyna</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Barwnik barwiący F-aktynę</td></tr><tr><td>5(6)-karboksytetrametylorodamina&nbsp;</td><td>Novabiochem</td><td>8.51030.9999</td><td></td></tr><tr><td>Pierce Coomassie (Bradford) Zestaw do oznaczania białek</td><td>Thermo Scientific</td><td>23200</td><td></td></tr><tr><td>CelluSep T4 Rurki/Nominalna ocena filtra MWCO 12,000 - 14,000 Da</td><td>Membrane Filtration Products, Inc.</td><td>1430-33</td><td>Membrana do dializy</td></tr><tr><td>Millex-HV Filtr strzykawkowy, 0,45 &mikro; m, PVDF, 13 mm, sterylizowany promieniami gamma</td><td>EMD Milipore</td><td>SLHVX13NL</td><td></td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS</td> Transmisyjny mikroskop elektronowy <td>Malvern</td><td>M104</td><td></td></tr> Spektrofotometr fluorescencyjny <tr><td></td><td>JEOL</td><td>JEM-1400</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>10075200</td><td>Cary'ego Eclipse'a&nbsp;</td></tr><tr><td>Spektrofotometr UV-VIS</td><td>Agilent Technologies</td><td>10068900</td><td>Cary 50&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikroskop fluorescencyjny</td><td>Olympus</td><td>IX-71</td><td></td></tr><tr><td>950 nm filtr długoprzepustowy&nbsp;</td><td>Thorlabs</td><td>FEL0950</td><td></td></tr><tr><td>850 nm zwierciadło dichroiczne krótkie przepustowe</td><td>Chroma</td><td>NC265609</td><td></td></tr><tr><td>Kolorowy system CCD RT3</td><td>SPOT</td><td>RT2520</td><td></td></tr><tr><td>Oświetlenie fluorescencyjne</td><td>PRIOR</td><td>Lumen 200</td><td></td></tr><tr><td>980 nm Laser diodowy na podczerwień</td><td>CNI</td><td>MDL-N-980-8W</td><td></td></tr><tr><td>UV LED Spot Light Source</td><td>UVATA</td><td>UVATA-UPS412</td><td>Z diodą LED UPH-056-365 nm o mocy 200 mW/cm2</td></tr><tr><td>Termiczny czujnik stosu</td><td>OPHIR</td><td>12A-V1-ROHS</td><td></td></tr><tr><td>Picospritzer III</td><td>Parker Hannifin</td><td>052-0500-900</td><td>Wewnątrzkomórkowe systemy dozowania mikroiniekcji</td></tr><tr><td>PC-10 Ściągacz igieł</td><td>Narishige</td><td>PC-10</td><td></td></tr><tr><td>MANOMETR Cyfrowy manometr</td><td>Lutron</td><td>PM-9100</td><td></td></tr><tr><td>Jednoosiowy Mikromanipulator olejowo-hydrauliczny</td><td>Narishige</td><td>MMO-220A</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka Heraeus Fresco 17, chłodzona</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002421</td><td></td></tr></tbody></table>

zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

An Integrated System to Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction by Upconversion Nanoparticle-mediated Kinase Photoactivation

Fotoaktywacja za pośrednictwem nanocząsteczek w górę (UCNP) to nowe podejście do zdalnego sterowania bioefektorami o znacznie mniejszej fototoksyczności i głębszej penetracji tkanek. Jednak istniejące na rynku oprzyrządowanie nie jest łatwo kompatybilne z aplikacją do konwersji w górę. W związku z tym modyfikacja dostępnego na rynku instrumentu jest niezbędna dla tych badań. W tym artykule najpierw zilustrowaliśmy modyfikacje konwencjonalnego fluorymetru i mikroskopu fluorescencyjnego, aby były kompatybilne z eksperymentami z konwersją fotonów w górę. Następnie opisujemy syntezę kinazy białkowej w klatce wyzwalanej w bliskiej podczerwieni (NIR) podjednostki katalitycznej (PKA) unieruchomionej na kompleksie UCNP. Podano również parametry dla procedur mikroiniekcji i fotoaktywacji NIR. Po mikrowstrzyknięciu PKA-UCNP w klatce do komórek fibroblastów REF52, napromieniowanie NIR, które jest znacznie lepsze niż konwencjonalne promieniowanie UV, skutecznie uruchamia szlak transdukcji sygnału PKA w żywych komórkach. Ponadto eksperymenty z kontrolą pozytywną i ujemną potwierdzają, że szlak indukowany przez PKA prowadzący do rozpadu włókien stresowych jest specyficznie wyzwalany przez promieniowanie NIR. W związku z tym zastosowanie UCNP modyfikowanego białkiem zapewnia innowacyjne podejście do zdalnego sterowania eksperymentami komórkowymi modulowanymi światłem, w których należy unikać bezpośredniej ekspozycji na światło UV.

Budowa konstruktu enzymu w klatce z UCNP została przedstawiona na Rysunku 1. Enzym PKA poddano najpierw reakcji z 2-nitrobenzylobromkiem w celu wytworzenia nieaktywnej formy PKA w klatce, a następnie unieruchomiono go elektrostatycznie na powierzchni UCNP. UCNPs emitują światło upkonwertowane, co prowadzi do fotolitycznego rozszczepienia grup o-nitrobenzylowych przy Cys 199 i Cys 343, generując aktywną formę PKA. Obrazy TEM oraz test Bradforda potwierdziły un...

W tym protokole, kinaza białkowa A (PKA), bioefektor transdukcji sygnału komórkowego, została unieruchomiona na powierzchni nanocząsteczki, mikrowstrzyknięta do cytozolu i aktywowana przez przekonwertowane światło UV z bliskiej podczerwieni (NIR), indukując rozpad włókien naprężeniowych w cytozolu.

Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

Upconversion nanoparticle (UCNP)-mediated photoactivation is a new approach to remotely control bioeffectors with much less phototoxicity and with deeper ...

Celem niniejszego eksperymentu jest wykazanie możliwości fotoaktywacji enzymu przy użyciu naświetlania bliską podczerwienią. „Zaklatkowana” kinaza białkowa A zostaje unieruchomiona na powierzchni nanocząsteczek konwersji w górę, które są mikroiniekowane do komórek, a następnie obserwuje się indukowaną przez kinazę odpowiedź w żywych komórkach po naświetlaniu bliską podczerwienią. Tradycyjna fotoaktywacja wymaga fototoksycznego światła UV, co nieuchronnie współindukuje niepożądane reakcje chemiczne i podobne odpowiedzi; natomiast w naszych bezpieczniejszych opcjach, takich jak naświetlanie bliską podczerwienią, reakcje te nie są wywoływane ze względu na niską energię promieniowania.Nanocząsteczki konwertujące w górę mogą skutecznie przekształcać biokompatybilne fotony bliskiej podczerwieni o niskiej energii w fotony UV o wysokiej energii, aby wywołać reakcję chemiczną w pobliżu powierzchni cząsteczki bez bezpośredniego naświetlania promieniowaniem UV. Kinazy odgrywają kluczową rolę w onkogenezie, a technika ta może pomóc w badaniu większej liczby informacji o transdukcji sygnału przy znacznie niższym poziomie szumów zakłócających wynikających z fototoksyczności UV i towarzyszących jej reakcji ubocznych. Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę w tej dziedzinie napotykają trudności w modyfikacji aparatury oraz ustawień optycznych dla zastosowań konwersji w górę.Na początek zainstaluj obiektyw 4x obok uchwytu na kuwetę fluorospektrometru, tak aby wiązka lasera mogła zostać skupiona w środku kuwety. Umieść regulowaną diodę laserową o długości fali 980 nanometrów pod kątem 90 stopni względem obiektywu. Zainstaluj lustro w pełni odbijające w punkcie przecięcia drogi optycznej obiektywu i lasera.Należy pamiętać o umieszczeniu anodowanej płytki metalowej w celu zablokowania okna wzbudzenia spektrometru, aby chronić jego części wewnętrzne. Następnie należy umieścić w uchwycie kuwetę z roztworem nanocząstek upkonwersyjnych powlekanych krzemionką. Po włączeniu lasera widoczna będzie jasna wiązka upkonwersyjna.Przełącz spektroskop do trybu luminescencji, ustawiając najniższe napięcie PMT podczas kalibracji. Wyreguluj pozycje lustra i lasera tak, aby wiązka przechodziła przez środek kuwety, co pozwoli PMT na zarejestrowanie najsilniejszego sygnału. Po zamontowaniu lustra dichroicznego i filtra wzbudzenia, zainstaluj diodę laserową 980 nanometr w dolnej ścieżce optycznej.Umieść kolimator pomiędzy laserem a lustrem, aby pomóc w rozproszeniu i powiększeniu obszaru naświetlania NIR w płaszczyźnie ogniskowej. Następnie użyj roztworu nanocząsteczek konwertujących w górę, aby zwizualizować wiązkę bliskiej podczerwieni. Dostosuj położenie stolika laserowego, aby wycentrować wiązkę światła bliskiej podczerwieni i zakończyć proces wyrównywania.Przeprowadzić syntezę klatkowanego PKA i zdemobilizować kompleks caged-PKA/UCNP, aby otrzymać caged-PKA/UCNP zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zmierzyć aktywność obu konstruktów przed fotolizą UV, należy zmierzyć spadek absorbancji NADH w mieszaninie testowej w czasie, po dodaniu 2 µL roztworu PKA do mieszaniny testowej. Powtórzyć pomiar dla PKA/UCNP.Następnie przeprowadź fotolizę UV z mocą 200 mW/cm² dla caged-PKA oraz caged-PKA/UCNP w kąpieli wodno-lodowej, aby upewnić się, że PKA może zostać aktywowana. Aktywność PKA określa się za pomocą sprzężonego testu enzymatycznego z wykorzystaniem kinazy pirogronianowej i dehydrogenazy mleczanowej. Pomiar spadku absorbancji NADH jest prowadzony w czasie po dodaniu roztworu PKA.Inkubuj komórki w 10% płodowej surowicy bydlęcej w pożywce L15 podczas okresu mikroiniekcji, aby zapewnić stabilną kontrolę pH poza inkubatorem. Skonfiguruj wyciągacz igieł tak, aby uzyskać stożkowatą końcówkę o średnicy około 1,5 mikrona w celu późniejszego otwarcia wierzchołka. Aby otworzyć końcówkę, zamontuj igłę w mikroinjektorze, dotknij wierzchołkiem igły krawędzi szkiełka przedmiotowego, a następnie wykonaj delikatny ruch pokrętłem stolika mikroskopu.Siła wibracji ta jest wystarczająca, aby lekko uszkodzić końcówkę i powiększyć otwór. Należy sprawdzić otwór igły, aby upewnić się, że jego średnica zewnętrzna wynosi od 1,3 do 1,5 mikronów, co można potwierdzić na obrazach mikroskopowych przy użyciu obiektywu 40x. Następnie należy ustawić ciśnienie wtrysku w zakresie od 50 do 75 hektopaskali z odstępem ciśnieniowym od 200 do 300 milisekund oraz ustawić stałe ciśnienie kompensacyjne na poziomie od 15 do 30 hektopaskali, aby zapobiec cofaniu się medium do igły.Napełnij tylną część igły kompleksem caged-PKA/UCNP z barwnikiem TAMRA. Następnie zamontuj napełnioną igłę w jednoosiowym hydraulicznym mikromanipulatorze pod kątem od 30 do 45 stopni. Sprawdź igłę pod mikroskopem, aby upewnić się, że podczas ładowania próbki nie powstały pęcherzyki powietrza.Po zanurzeniu igły w medium przełącz urządzenie w tryb fluorescencji, aby potwierdzić gwałtowne uwolnienie barwnika po przyłożeniu ciśnienia wtrysku oraz powolne uwalnianie barwnika przy stałym stosowaniu ciśnienia kompensacyjnego. Następnie przełącz urządzenie w tryb jasnego pola z kontrastem fazowym, aby rozpocząć mikrowstrzykiwanie do komórek. W przypadku udanych wtryskiwań można zaobserwować falę uderzeniową membrany.Przemyć komórki dwukrotnie i sprawdzić wstrzyknięte komórki pod kątem współwstrzykniętej fluorescencji TAMRA, aby zlokalizować komórki, w których mikroiniekcja przebiegła pomyślnie. Komórki, w których stwierdzono obecność UCNP, ale brak sygnału współwstrzykniętego barwnika, wskazują na przerwanie błony komórkowej podczas iniekcji i powinny zostać wykluczone z dalszych eksperymentów. Naświetlać komórki diodą laserową o długości fali 980 nanometr w dolnej ścieżce optycznej, skupioną za pomocą obiektywu 10x, przez 15 minut.Aby uniknąć przegrzania, po każdych pięciu minutach naświetlania należy zastosować pięciominutowy interwał w ciemności. Jeśli wymagany jest krótszy czas aktywacji, np. rzędu sekund lub nawet ułamków sekund, wystarczy użyć obiektywu 40x w celu uzyskania wyższej gęstości fotonów w punkcie skupienia. Po fotolizie i regeneracji komórek należy utrwalić komórki w 1 ml 4% paraformaldehydu w PBS przez 20 minut, a następnie przeprowadzić barwienie z użyciem alexa 594.Na koniec zwizualizuj dezintegrację włókien stresowych indukowaną promieniowaniem NIR. Po naświetlaniu NIR komórki, do których wstrzyknięto klatkowane-PKA/UCNP (wskazane białymi strzałkami), wykazują emisję konwersji w górę. Dezintegracja włókien stresowych spowodowana skuteczną fotoaktywacją PKA przez NIR odsłania więcej f aktyny, co w konsekwencji prowadzi do silnego zielonego barwienia w pobliżu UCNP.W kontroli negatywnej, w której komórki poddano mikroiniekcji, ale pozostawiono w ciemności, nie zaobserwowano dezintegracji włókien stresowych. Poziom ekspozycji f-aktyny po fotoaktywacji NIR można wybarwić barwnikiem Alexa 594, a następnie przeanalizować i skwantyfikować za pomocą programu ImageJ. Wykreślono krzywe intensywności barwienia f-aktyny wzdłuż czerwonej strzałki, co dostarczyło ilościowych informacji o dezintegracji włókien stresowych, które można powiązać z indukowaną przez NIR aktywnością PKA. Po opanowaniu techniki mikroiniekcji, cała procedura, wliczając przygotowanie i kontrolę jakości caged-PKA/UCNP, może zostać wykonana w ciągu jednego dnia.Dzięki naszym instrukcjom dotyczącym modyfikacji aparatury oraz przeprowadzania eksperymentów, pożądana reakcja może zostać wywołana za pomocą bliskiej podczerwieni (near IR), zapewniając wysoką rozdzielczość czasowo-przestrzenną, podobnie jak tradycyjne metody miareczkowania z użyciem UV, ale bez fototoksyczności, ponieważ nie jest ona szkodliwa. Mamy nadzieję, że po obejrzeniu tego filmu będą Państwo mieli jasne wyobrażenie o tym, jak wprowadzić kompleks nanocząsteczek enzymu do komórki za pomocą mikroiniekcji i fotoaktywować enzym, wykorzystując kompatybilne z komórką światło bliskiej podczerwieni. Technika ta utorowała drogę badaczom z dziedziny biologii chemicznej, którzy muszą wykorzystać światło do wywołania pożądanej reakcji enzymatycznej w żywych komórkach w celu uzyskania rozdzielczości czasowo-przestrzennej w sytuacjach, gdy komórka nie toleruje fototoksyczności UV.Po zastosowaniu tej procedury do nanocząsteczek konwersji w górę można dołączyć inne bioefektory, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania wymagające czasowo-przestrzennej fotoaktywacji. Jeśli bioefektor działa zewnątrzkomórkowo, mikrowstrzyknięcie nie jest nawet konieczne. Platforma fotoaktywacji w bliskiej podczerwieni może również zapewnić większą głębokość penetracji w tkance, a zatem może być stosowana u małych zwierząt w celu wywołania pożądanych reakcji w określonym czasie i miejscu.

an-integrated-system-to-remotely-trigger-intracellular-signal

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Mikroskopia wielofotonowa umożliwia sterowanie fotonami o niskiej energii przy głębokiej penetracji optycznej i zredukowanej fototoksyczności. Opisujemy zastosowanie tej technologii do znakowania żywych komórek w embrionach danio pręgowanego. Protokół ten można łatwo dostosować do fotoindukcji różnych cząsteczek reagujących na światło.

Fotoaktywacja oparta na dwufotonach w żywych zarodkach danio pręgowanego

Ten film opisuje BiFC-PALM ― połączenie fotoaktywowanej mikroskopii lokalizacyjnej i dwucząsteczkowej komplementacji fluorescencji ― do oceny interakcji białko-białko. BiFC polega na fuzji dwóch fluorescencyjnych fragmentów białek z dwoma oddziałującymi białkami będącymi przedmiotem zainteresowania. Kiedy te dwa białka wchodzą w interakcję, fragmenty są zbliżane do siebie, co pozwala obu częściom połączyć się i odtworzyć funkcjonalne białko fluorescencyjne. Fluorescencja pojedynczego fluoroforu...

Mikroskopia lokalizacji fotoaktywowanej sprzężona z fluorescencją fluorescencji bimolekularnej

Pokazujemy użycie mikroskopii lokalizacji fotoaktywacji fluorescencji (FPALM) do jednoczesnego obrazowania wielu typów fluorescencyjnie znakowanych cząsteczek w komórkach. Opisane techniki pozwalają na lokalizację od tysięcy do setek tysięcy pojedynczych białek znakowanych fluorescencyjnie, z precyzją do dziesiątek nanometrów w pojedynczych komórkach.

Jednoczesne wielobarwne obrazowanie struktur biologicznych z fluorescencyjną mikroskopią lokalizacji fotoaktywacji

Organiczne cząsteczki barwnika i nanocząstki nanocząsteczkowe pokryte kwasem oleinowym nie są rozpuszczalne w wodzie. Protokół ten opisuje metodę "plug and play", która umożliwia przenoszenie cząsteczek barwnika organicznego i przekształcanie cząstek w górę z ich początkowego rozpuszczalnika hydrofobowego do wody.

Metoda "plug and play" do tworzenia dyspergowalnych w wodzie nanozespołów zawierających amfifilowy polimer, barwniki organiczne i nanocząstki przekształcające się w górę

Ten protokół opisuje strategię optogenetyczną do modulowania aktywności kinazy białkowej aktywowanej mitogenem (MAPK) podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus. Metoda ta pozwala na odwracalną aktywację szlaku sygnałowego MAPK w hodowli komórek ssaków oraz w wielokomórkowych organizmach żywych, takich jak zarodki Xendopus, z wysoką rozdzielczością przestrzenną i czasową.

Odwracalna modulacja szlaku kinazy białkowej aktywowanej mitogenem za pośrednictwem światła podczas różnicowania komórek i rozwoju embrionalnego Xenopus

Ten protokół opisuje opartą na obrazowaniu metodę aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego peptydu-MHC, umożliwiając precyzyjną czasoprzestrzenną kontrolę aktywacji limfocytów T.

Przestrzenna i czasowa kontrola aktywacji limfocytów T za pomocą fotoaktywowanego agonisty

Tutaj prezentujemy protokół do analizy transferu informacji oscylacyjnych między komórkami za pomocą kontroli optogenetycznej i monitorowania ekspresji genów na żywo. Podejście to stanowi unikalną platformę do testowania funkcjonalnego znaczenia programów dynamicznej ekspresji genów w systemach wielokomórkowych.

Metoda optogenetyczna do kontroli i analizy wzorców ekspresji genów w interakcjach międzykomórkowych

Przedstawiono procedurę wizualizacji aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się jak myszy. Ulepszony reporter aktywności kinazy A, tAKARα, ulega ekspresji w neuronach korowych i jest dostępny do obrazowania przez okno czaszkowe. Mikroskopia obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej służy do wizualizacji aktywności PKA in vivo podczas wymuszonej lokomocji.

Wizualizacja aktywności kinazy białkowej A u myszy zachowujących się z głową przy użyciu mikroskopii obrazowania czasu życia fluorescencji dwufotonowej in vivo

Ściśle skoncentrowany laser femtosekundowy może dostarczać precyzyjną stymulację komórkom poprzez połączenie z mikroskopią konfokalną, umożliwiając obserwację w czasie rzeczywistym i fotostymulację. Fotostymulacja może aktywować zdarzenia molekularne komórki, w tym szlak sygnałowy ERK i mitochondrialne błyski reaktywnych form tlenu.

Fotostymulacja laserem femtosekundowym aktywuje sygnalizację kinazy regulowanej sygnałem zewnątrzkomórkowym (ERK) lub zdarzenia mitochondrialne w komórkach docelowych

Bioluminescencja - światło emitowane przez enzym lucyferazy utleniający substrat o małych cząsteczkach, lucyferynę - może być wykorzystane do aktywacji białek fotosensorycznych, dodając w ten sposób kolejny wymiar do stymulacji świetlnej i umożliwiając manipulowanie wieloma funkcjami zależnymi od światła w komórkach w skalach czasowych i przestrzennych.

Optogenetyka bioluminescencyjna 2.0: wykorzystanie bioluminescencji do aktywacji białek fotosensorycznych in vitro i in vivo

Ten protokół obejmuje transfekcję czujników cAMP i bPAC-nLuc, białka optogenetycznego, w celu dokładnego śledzenia jego dystrybucji komórkowej i odpowiedzi na stymulację światłem. Innowacyjne podejście polegające na stworzeniu mapy odpowiedzi cAMP przy użyciu systemu skanowania punktowego ma potencjał do przyspieszenia badań nad białkami optogenetycznymi w różnych dziedzinach.

Mapowanie dystrybucji komórkowej białka optogenetycznego za pomocą siatki stymulacji świetlnej

Poznaj metodę fotoaktywacji kinazy PKA w żywych komórkach przy użyciu nanocząstek konwertujących promieniowanie NIR. Technika ta umożliwia badanie szlaków sygnałowych bez fototoksyczności UV.

Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę (Wideo) | JoVE Journal

Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

Przeglądaj więcej filmów