Zintegrowany system do zdalnego wyzwalania wewnątrzkomórkowej transdukcji sygnału poprzez fotoaktywację kinazy za pośrednictwem nanocząstek w górę

Celem tego eksperymentu jest wykazanie możliwości fotoaktywacji enzymu za pomocą promieniowania w bliskiej podczerwieni. Kinaza białkowa A w Caged jest unieruchomiona na tej powierzchni nanocząstek konwersji w górę mikrowstrzykiwanych do komórek, a odpowiedź indukowana przez kinazę w żywych komórkach jest obserwowana po napromieniowaniu w bliskiej podczerwieni. Tradycyjna fotoaktywacja wymaga fototoksycznego światła UV i nieuchronnie wywoła niepożądaną reakcję chemiczną i podobną reakcję, jednak w naszych przyjaznych opcjach, takich jak promieniowanie w bliskiej podczerwieni, nie może wywołać reakcji ze względu na niską energię.

Nanocząstka konwersji w górę może skutecznie przekształcać przyjazny dla środowiska foton o niskiej energii w pobliżu podczerwieni w wysokoenergetyczny foton UV, aby wywołać reakcję chemiczną w pobliżu powierzchni cząstki bez bezpośredniego promieniowania UV. Kinaza odgrywa kluczową rolę w onkogenezie, ta technika może pomóc nam zbadać więcej informacji o transdukcji sygnału przy znacznie niższym szumie zakłócającym wynikającym z fototoksyczności UV i jej reakcji ubocznej. Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej dziedzinie napotkają trudności w modyfikowaniu instrumentów i konfiguracji optycznej do aplikacji konwersji w górę.

Aby rozpocząć, zainstaluj soczewkę obiektywu 4x obok uchwytu kuwety fluorospektrometru, aby laser mógł być skupiony na środku kuwety. Umieść przestrajalną diodę laserową o długości 980 nanometrów pod kątem 90 stopni względem soczewki obiektywu. Zainstaluj lustro z pełnym odbiciem i przecięcie ścieżki światła soczewki obiektywu i lasera.

Nie zapomnij umieścić anodowanej metalowej płytki, aby zablokować okno wzbudzenia spektrometru, aby chronić części wewnętrzne. Następnie umieść kuwetę z roztworem nanocząstek pokrytym krzemionką w górę konwersji w górę. Jasną wiązkę konwersji w górę można zwizualizować po włączeniu lasera.

Przełącz spektroskopię w tryb luminescencji, z najniższym napięciem PMT podczas osiowania. Dostosuj zwierciadło i laser stage tak, aby wiązka przechodziła przez środek kuwety, aby PMT odebrał najsilniejszy sygnał. Po zainstalowaniu zwierciadła dichroicznego i filtra wzbudzenia, zainstaluj diodę laserową o długości 980 nanometrów w dolnej ścieżce światła.

Dodaj kolimator pomiędzy laserem a lustrem, aby pomóc w dyfuzji i powiększeniu obszaru naświetlania NIR w płaszczyźnie ogniskowej. Następnie użyj roztworu nanocząstek do konwersji w górę, aby zobrazować wiązkę bliskiej podczerwieni. Dostosuj położenie stolika laserowego, aby wyśrodkować wiązkę światła bliskiej podczerwieni, aby zakończyć wyrównanie.

Wykonaj syntezę caged-PKA i zdemobilizuj caged-PKA/UCNP, aby wygenerować caged-PKA/UCNP zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby zmierzyć aktywność obu konstruktów przed fotolizą UV, należy zmierzyć spadek absorbentów NADH w mieszaninie testowej w czasie po dodaniu dwóch mikrolitrów roztworu PKA do mieszaniny testowej. Powtórz pomiar dla PKA/UCNP.

Następnie przeprowadź fotolizę UV przy 200 miliwatach na centymetr kwadratowy PKA w klatce i PKA/UCNP w klatce, w lodowatej kąpieli wodnej, aby upewnić się, że PKA może zostać aktywowany. Aktywność PKA jest oznaczana za pomocą testu sprzężonego z enzymem kinazy pirogronianowej i dehydrogenazy mleczanowej. Wraz ze spadkiem absorbentów NADH, mierzy się w czasie po dodaniu roztworu PKA.

Inkubować komórki w 10% płodowej surowicy bydlęcej zawierającej pożywkę L15 w okresie mikroiniekcji w celu stabilnej kontroli pH na zewnątrz inkubatora. Skonfiguruj ściągacz igieł do końcówki w kształcie stożka o średnicy około 1,5 mikrona do późniejszego otwarcia końcówki. Aby otworzyć końcówkę, zainstaluj igłę na mikrowstrzykiwaczu, przesuń końcówkę igły w kontakcie z krawędzią szkiełka i postępuj zgodnie z łagodnym pokrętłem na stoliku mikroskopu.

Ta siła wibracji jest wystarczająca, aby lekko złamać końcówkę i powiększyć otwór. Sprawdź otwór igły, aby upewnić się, że ma średnicę zewnętrzną od 1,3 do 1,5 mikrona, co można potwierdzić za pomocą obrazów mikroskopowych przy użyciu soczewki obiektywowej 40x. Następnie należy ustawić ciśnienie iniekcji od 50 do 75 hektopaskalów w odstępie między czasami od 200 do 300 milisekund i ustawić stałe ciśnienie kompensacyjne na 15 do 30 hektarów, aby zapobiec cofaniu się medium do igły.

Załadować kompleks PKA/UCNP z klatką barwnikiem TAMRA w tylnej pozycji igły. Załadowana igła jest następnie ustawiana na jednoosiowym mikromanipulatorze hydraulicznym, pod kątem od 30 stopni do 45 stopni. Sprawdź igłę pod mikroskopem, aby upewnić się, że po załadowaniu próbki nie powstały pęcherzyki.

Po zanurzeniu igły w pożywce przełącz się w tryb fluorescencji, aby potwierdzić pękające uwalnianie barwnika po zastosowaniu ciśnienia wtrysku i powolne uwalnianie barwnika, gdy ciśnienie kompensacyjne było stale stosowane. Następnie przełącz się na tryb jasnego pola z kontrastem fazowym, aby rozpocząć mikroiniekcję komórek. Falę uderzeniową membrany można zaobserwować przy udanych iniekcjach.

Umyj komórki dwukrotnie i sprawdź, czy wstrzyknięte komórki nie mają fluorescencji TAMRA we wstrzyknięciu, aby zlokalizować pomyślnie wstrzyknięte mikrokomórki. Komórka z przyjęciem UCNP, ale bez jednocześnie wstrzykniętego sygnału barwnika, wskazuje, że błona komórkowa została pęknięta podczas wstrzyknięcia i powinna zostać wykluczona z dalszych eksperymentów. Naświetl komórki diodą laserową o długości 980 nanometrów na dolnej ścieżce światła skupionej przez soczewkę obiektywową 10x przez 15 minut.

Pozostawić pięciominutową przerwę w ciemności po każdych pięciu minutach napromieniowania, aby uniknąć nagrzania. Jeśli potrzebny jest krótszy czas aktywacji, na przykład sekundy lub nawet subsekundy, po prostu przełącz się na soczewkę obiektywu 40x, aby uzyskać wyższą gęstość fotonów ostrości. Po fotolizie i odzyskaniu komórek utrwal komórki w jednym mililitrze lub 4% paraformaldehydzie w PBS przez 20 minut, a następnie alexa 594 w ramach barwienia.

Na koniec zwizualizuj rozpad włókien naprężeniowych wywołany przez NIR. Po napromieniowaniu NIR, komórki mikroiniekowane klatką-PKA/UCNP, jak wskazują białe strzałki, wykazują emisję konwersji w górę. Rozpad włókien naprężeniowych spowodowany udaną fotoaktywacją PKA NIR odsłania więcej f aktyny, a w konsekwencji powoduje silne zielone zabarwienie w pobliżu UCNP.

Kontrola negatywna, w której komórki są mikrowstrzykiwane, ale pozostają w ciemności, nie wykazuje rozpadu włókien stresowych. Poziom ekspozycji na f aktynę po fotoaktywacji NIR można wybarwić za pomocą alexa 594, a następnie określić ilościowo za pomocą obrazu J. Krzywe intensywności barwienia aktyną f wzdłuż czerwonej strzałki zostały wykreślone, dostarczając ilościowych informacji o rozpadzie włókien naprężeniowych, które można skorelować z aktywnością PKA indukowaną przez NIR. Po zapoznaniu się z mikroiniekcją, technikę tę można wykonać w ciągu jednego dnia, łącznie z przygotowaniem i kontrolą jakości klatki-PKA/UCNP.

Dzięki naszym instrukcjom modyfikacji przyrządów i eksperymentów, pożądana reakcja może zostać wywołana przez bliską podczerwień, w wysoce przestrzennej rozdzielczości czasowej, takiej jak tradycyjne UV dla metod miareczkowania, ale bez fototoksyczności nie jest zaraźliwa. Po obejrzeniu tego filmu mam nadzieję, że dobrze rozumiesz, jak dostarczyć kompleks nanocząstek enzymatycznych do komórki za pomocą mikroiniekcji i fotoaktywować enzym za pomocą dzwonka kompatybilnego ze światłem w bliskiej podczerwieni. Technika ta utorowała drogę naukowcom w dziedzinie biologii chemicznej, którzy muszą używać światła do wywołania pożądanej reakcji enzymatycznej w żywych komórkach w celu przestrzennej rozdzielczości czasowej, gdy komórka nie toleruje fototoksyczności UV.

Zgodnie z tą procedurą, inne czynniki biologiczne mogą być powiązane z nanocząstkami konwersji w górę, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, które wymagają przestrzennej czasowej fotoaktywacji. Jeśli bio afektor działa zewnątrzkomórkowo, mikroiniekcja nie jest nawet potrzebna. Platforma fotoaktywacji w bliskiej podczerwieni może również zapewnić większą głębokość penetracji w tkance i dlatego może być stosowana u małych zwierząt w celu wywołania pożądanych reakcji w danym czasie i miejscu.