Analiza oddziaływań białko-białko i kolokalizacji między składnikami połączeń szczelinowych, ścisłych i adherenowych w mysich gruczołach sutkowych

Ogólnym celem tej metody jest ustalenie, czy dwa lub więcej białek połączeń międzykomórkowych kolokalizuje się w komórkach i dalsza ocena ich fizycznej interakcji poprzez koimmunoprecypitację. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania z zakresu biologii gruczołu sutkowego, w tym roli odgrywanej przez połączenia w prawidłowym rozwoju i chorobach, takich jak rak piersi. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona dostarczyć istotnych informacji na temat interakcji białko-białko in vivo przy stosunkowo niskich kosztach.

Aby przeprowadzić barwienie koimmunofluorescencyjne, należy pobrać odpowiednie preparaty mikroskopowe z zamrażarki. Natychmiast przymocuj sekcje, zanurzając je w czteroprocentowym formaldehydzie na 15 minut w temperaturze pokojowej. Następnie zanurz szkiełka w roztworze soli fizjologicznej buforowanej fosforanami w temperaturze pokojowej.

Pozostaw slajdy tam, aż przejdziesz do następnego kroku. Zakreśl każdą sekcję szkiełka za pomocą dostępnej w handlu bariery hydrofobowej lub wodoodpornego pisaka laboratoryjnego. Natychmiast dodaj krople PBS do tkanki i umieść szkiełko w ludzkiej komorze histologicznej na pozostałą część zabiegu.

Zablokuj każdy odcinek tkanki 100 do 200 mikrolitrami trzyprocentowej soli fizjologicznej buforowanej albuminą trisem w surowicy bydlęcej, 0,1% polisorbatu-20, przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Podczas gdy próbki blokują się, przygotuj pierwszorzędowe i drugorzędowe roztwory przeciwciał, rozcieńczając przeciwciała w TBS 0,1% polisorbatu-20. Po usunięciu roztworu blokującego przez aspirację, inkubować skrawki w 100 do 200 mikrolitrach rozcieńczonego przeciwciała pierwszorzędowego przez 60 minut w temperaturze pokojowej.

Następnie usunąć pierwotny roztwór przeciwciała przez aspirację i przemyć skrawki 250 do 500 mikrolitrami TBS 0,1% polisorbatu-20 przez pięć minut. Usuń roztwór myjący przez aspirację przed dwukrotnym powtórzeniem prania. Zassać roztwór płuczący i inkubować skrawki z 100 do 200 mikrolitrami odpowiedniego sprzężonego z fluoro-4 przeciwciała drugorzędowego przez 60 minut w temperaturze pokojowej.

Po usunięciu wtórnego roztworu przeciwciała przez aspirację, przemyć skrawki 250 do 500 mikrolitrami TBS 0,1% polisorbatu-20 przez pięć minut. Usuń roztwór myjący i powtórz dwukrotnie. Powtórz te kroki, używając odpowiedniej kombinacji ciał pierwszorzędowych i drugorzędowych dla wszelkich kolejnych białek będących przedmiotem zainteresowania.

Po usunięciu końcowego płukania należy przeprowadzić barwienie jąder przez inkubację sekcji z 100 do 200 mikrolitrami jednego miligrama na mililet DAPI i TBS 0,1% polisorbatu-20 przez pięć minut w temperaturze pokojowej. Zassać roztwór DAPI i zamontować szkiełka za pomocą rozpuszczalnego w wodzie, niefluorescencyjnego medium montażowego i szkiełek nakrywkowych. Umieść szkiełka płasko w lodówce o temperaturze czterech stopni Celsjusza na co najmniej osiem godzin.

Przejdź do obrazowania pod mikroskopem fluorescencyjnym zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Zebrać od 500 do 1000 mikrogramów lizatu i rozcieńczyć go w PBS do każdej końcowej objętości 200 mikrolitrów w każdej probówce o pojemności 1,5 mililitra. Dodać przeciwciało przeciwko badanemu antygenowi do pierwszej probówki lizatu i trzymać je na lodzie.

Inkubować probówki przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na mieszalniku rurowo-walcowym z niską prędkością. Następnego dnia dodaj 50 mikrolitrów kulek magnetycznych do nowych 1,5-mililitrowych probówek do prania wstępnego. Umieść rurki zawierające koraliki na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom migrować w kierunku magnesu.

Usuń bufor do przechowywania z kulek za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Umyj kulki, dodając 500 mikrolitrów PBS 0,1% polisorbatu-20 i energicznie wiruj probówki przez 10 sekund. Następnie umieść rurki z powrotem na stojaku magnetycznym i pozwól koralikom migrować w kierunku magnesu.

Usunąć nadmiar buforu do płukania, pipetując pipetą o pojemności 200 mikrolitrów. Dodaj kompleks reakcji przeciwciał lizatu do kulek i inkubuj przez 90 minut w temperaturze pokojowej na mieszalniku rolkowym. Po inkubacji umieść rurki na stojaku magnetycznym i pozwól kulkom migrować w kierunku magnesu.

Za pomocą pipety o pojemności 200 mikrolitrów odessać i wyrzucić lizat, a następnie umieścić probówki na lodzie. Umyj kulki dwukrotnie, dodając 500 mikrolitrów PBS, umieszczając probówki na stojaku magnetycznym i usuwając płyn jak poprzednio. Podczas etapów mycia należy unikać wirowania i utrzymywać próbki na lodzie.

Umyj kulki raz za pomocą PBS 0,1% polisorbatu-20 bez wirowania i wyrzuć ostatni bufor do płukania za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów. Aby wymyć, dodaj 20 mikrolitrów 0,2 molowej kwaśnej glicyny do probówek i potrząsaj nimi przez siedem minut na mikserze rolkowym. Po odwirowaniu z dużą prędkością przez kilka sekund, zebrać supernatant do świeżej, lodowatej probówki.

Powtórz kroki płukania i elucji dla każdej probówki. Następnie dodaj 10 mikrolitrów buforu 4x do eluowanej próbki o pojemności 40 mikrolitrów. Natychmiast dodaj jeden molowy Tris do eluowanych próbek, kropla po kropli, aż jego kolor zmieni kolor na niebieski, a następnie przejdź do kolejnych probówek.

Gotować wymyte próbki w temperaturze od 70 do 90 stopni Celsjusza przez 10 minut. Przygotowane lizaty i wytrącone próbki należy załadować obok siebie do żelu akrylowego SDS-PAGE. Uruchom żel w buforze do pracy pod napięciem 100 woltów przez około 95 minut lub do momentu, gdy krawędź migrujących białek dotrze do dna żelu.

Następnie przenieś żele do membrany nitrocelulozowej lub PVDF przy użyciu standardowego protokołu. Następnie zablokuj membranę na godzinę na bujaku na niskich obrotach w pięcioprocentowym TTBS mleka w proszku. Aby określić, czy wytrącanie się powiodło, należy zbadać błonę za pomocą pierwszego przeciwciała przeciwko wytrąconemu białku.

Rozcieńczyć go w pięcioprocentowym mleku w proszku TTBS w stężeniu zalecanym przez producenta. Inkubuj błonę przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza na kołyszącej się platformie, powoli mieszając. Następnego dnia umyj membranę trzy razy przez pięć minut, każdy z TTBS na platformie bujanej z dużym mieszaniem.

Następnie inkubować błonę w odpowiednim przeciwciałie drugorzędowym sprzężonym z peroksydazą chrzanową, rozcieńczonym w TTBS, przez jedną godzinę w temperaturze pokojowej na platformie kołyszącej z powolnym mieszaniem. Wykonaj od trzech do sześciu prań, każde przez pięć minut, z TTBS na bujanej platformie z dużym mieszaniem. Przeanalizuj sygnał przeciwciała drugorzędowego, inkubując membranę z dostępnym w handlu roztworem luminolu i postępuj zgodnie z instrukcjami producenta.

Wykryj sygnał za pomocą systemu obrazowania chemiluminescencyjnego. Aby zidentyfikować białka oddziałujące na siebie, powtórz te kroki, używając odpowiednich przeciwciał na tej samej plamie. Aby ustalić, czy elementy połączenia szczelinowego, połączenia adherencyjnego i połączenia ścisłego mogą wchodzić ze sobą w interakcje w gruczole sutkowym, przeprowadzono testy koimmunofluorescencyjne.

Test koimmunofluorescencji pokazuje, że beta-katenina, integralne białko połączenia adherens i Connexin 26, białko połączenia szczelinowego, kolokalizują się na błonie komórkowej w gruczołach sutkowych myszy w siódmym dniu laktacji, co odzwierciedla żółty kolor. Jądra komórkowe są wizualizowane za pomocą niebieskiego barwienia DAPI. Kriosekcje z gruczołów sutkowych w 18 dniu ciąży zostały wycięte i wybarwione immunofluorescencyjnie dla Claudin 7, białka ścisłego połączenia pokazanego na zielono, E-Cadherin, białka połączenia adherens pokazanego na czerwono i Connexin 26, białka połączenia szczelinowego pokazanego na niebiesko koralowym.

Jądra wybarwiono niebieskim DAPI. Kolokalizacja E-Kadheryny i Claudyny 7 jest wyświetlana jako kolor od żółtego do jasnopomarańczowego, podczas gdy kolokalizacja Connexin 26 z E-Kadheryną i Claudyną 7 spowodowała zabarwienie z białymi punktami. Aby dowiedzieć się, które białka połączeniowe mieszają się ze sobą i fizycznie wiążą ze sobą na błonie komórkowej, przeprowadzono koimmunoprecypitację przy użyciu tkanek gruczołu sutkowego myszy w okresie laktacji.

Wyniki wykazały, że Connexin 43, składnik połączenia szczelinowego, oddziałuje z E-Kadheryną i Claudyną 7, ale nie z Claudinem 3. Wyniki te zostały potwierdzone przez wzajemne immunoprecypitacje. Kiedy E-kadheryna została poddana działaniu immunoprecypitacji, wchodziła w interakcję z Connexin 43 i Claudin 7.

Po opanowaniu tej techniki można wykonać w ciągu dwóch dni w celu koimmunofluorescencji dla czterech do ośmiu szkiełek, a szkiełka można obrazować następnego dnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Podejmując próbę procedury koimmunofluorescencji, należy pamiętać o wyborze różnych przeciwciał sprzężonych z Fluoro 4 wytwarzanych w różnych przestrzeniach o nienakładających się długościach fal oraz o doborze odpowiednich kulek magnetycznych białka A lub G kompatybilnych z przeciwciałami stosowanymi do koimmunoprecypitacji. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się biologią komórki do zbadania wzajemnych oddziaływań połączeń międzykomórkowych w mysich gruczołach sutkowych.

Nie zapominaj, że praca jest niezwykle niebezpieczna i podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności.