Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1

Poniższe filmy szczegółowo opisują procedurę użycia standardu C-Brick do składania części DNA przy użyciu białka związanego z CRISPR, Cpf1. Metoda ta może przyczynić się do dalszego rozwoju składania DNA w dziedzinie biologii syntetycznej. Na przykład poprzez ułatwianie budowy skomplikowanych obwodów genetycznych.

Główną zaletą tej metody jest to, że jest niezależna od sekwencji i pozwala na iteracyjne składanie konstruktów DNA. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że Cpf1 jest prowadzony przez pojedyncze siRNA i katalityczne DNA, które są ułożone w stos. W związku z tym generowanie DKN.

Procedurę zademonstruje Shi-Yuan Li, doktorant z mojego laboratorium. Aby naprawić matryce crRNA, ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy w wodzie wolnej od RNaz do stężenia 10 mikromolowych. Do probówki PCR o pojemności 0,2 mililitra dodaj oligonukleotyd górnej nici, oligonukleotyd dolnej nici i 10-krotny bufor do wyżarzania, jak opisano w dołączonym dokumencie.

Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 50 mikrolitrów. Ta tabela przedstawia sześć różnych oligonukleotydów dolnej nici, z których każdy powinien być indywidualnie sparowany z górną nicią, T7-F. Małe litery reprezentują sekwencję, która ma zostać przepisana na sekwencję prowadzącą crRNA.

Umieść probówkę PCR w termocyklerze. Uruchom program wyżarzania ze wstępnym denitracją w temperaturze 95 stopni Celsjusza przez pięć minut, a następnie schładzaniem z 95 do 20 stopni Celsjusza ze spadkiem o jeden stopień Celsjusza na minutę. Po wyżarzaniu należy natychmiast przeprowadzić transkrypcję, łącząc wyżarzony produkt z wodą wolną od RNazy, buforem transkrypcyjnym T-7, mieszaniną NTP, rekombinowanym inhibitorem RNazy i polimerazą RNazy T-7 w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej.

Inkubuj reakcję w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez noc. Następnego dnia użyj zestawu do oczyszczania i zagęszczania RNA, aby oczyścić transkrybowane RNA. Użyj spektrofotometru UV-Vis, aby określić ilościowo RNA.

Następnie rozcieńczyć RNA do stężenia 10 mikromolowych. Jeśli próbki nie zostaną natychmiast zużyte, przechowuj je w temperaturze 80 stopni Celsjusza. Budowa części z cegły C może być wykonana na kilka sposobów.

W tej części filmu trzy kasety chromoproteinowe, cjBlue, eforRed i amilGFP, zostaną zmontowane przy użyciu metody montażu bezszwowego. Zacznij od zaprojektowania i zamówienia oligonukleotydów do amplifikacji PCR kaset chromoproteinowych. Po dotarciu oligonukleotydów należy je ponownie zawiesić w ultraczystej wodzie do stężenia 10 mikromolowych.

Następnie, aby ustawić reakcje PCR, umieść 0,2 mililitra probówek PCR na lodzie. Dodaj ultraczystą wodę, dwa XPCR, DNTP, startery do przodu i do tyłu, matrycę chromoproteinową i polimerazę DNA o wysokiej wierności. Umieść probówki bezpośrednio w termocyklerze i uruchom program.

Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Po amplifikacji oczyść produkty PCR za pomocą zestawu. Następnie, aby strawić standardowy wektor C-Brick za pomocą BamH1, dodaj ultraczystą wodę, plazmid, 10-krotny bufor i BamH1 do probówki.

Inkubować do dwóch godzin w temperaturze 37 stopni Celsjusza w łaźni wodnej. Oczyść zlinearyzowany wektor za pomocą zestawu do czyszczenia żelem. Po oczyszczeniu połącz zlinearyzowany wektor, produkt PCR, 5x bezszwowy bufor montażowy i bezszwowy enzym montażowy z bezszwowego zestawu montażowego w 1,5-mililitrowej probówce do mikrowirówki.

Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 10 mikrolitrów. Umieść go w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza na 30 minut. Po inkubacji należy natychmiast zużyć próbki lub zamrozić je na lodzie i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Do 90 mikrolitrów E coli DH10B dodaj 10 mikrolitrów konstruktu. Wykonaj przemianę chemiczną. Następnie rozprowadź przekształcone komórki na płytce LB i inkubuj w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Następnego dnia wybierz kilka klonów do hodowli w pięciomililitrowych probówkach z płynem LB i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza na wytrząsarce z prędkością 220 obr./min przez noc. Ekstrahuj plazmid za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu. Następnie zidentyfikuj właściwe klony za pomocą sekwencjonowania Sangera.

Wiedz, że budowa ścieżek C-Brick może być również osiągnięta przez reaktywną aplikację PCI lub przez ograniczenie natychmiastowego trawienia pożywki ligazy DNA T4 do ligacji. Następnie, aby strawić wektor C-Brick z Cpf1, połącz wodę wolną od RNazy, 10x bufor Cpf1, plazmid, rekombinowany inhibitor RNazy i Cpf1 w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Aby wprowadzić obcy fragment DNA do miejsc T1 i T2, dodaj jeden mikrolitr crRNA T2 i inkubuj probówkę w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez 30 minut.

Następnie, trzymając probówkę w łaźni wodnej, dodaj jeden mikrolitr crRNA T1, jeden mikrolitr Cpf1 i inkubuj przez kolejne 30 minut. CrRNA T2 jest dodawany jako pierwszy, ponieważ dwa miejsca rozpoznawania znajdują się bliżej DNA wektora. Wiązanie Cpf1 w miejscu T1 może wpływać na ściółkę miejsca T2.

Ponadto, jeśli miejsce T2 zastępowałoby miejsce T2, miejsce T2 zostałoby zakłócone, gdyby crRNA T1 zostało dodane jako pierwsze. Dodaj jeden mikrolitr termoczułej fosfatazy alkalicznej i inkubuj probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza przez kolejną godzinę. Wykonaj elektroforezę w żelu agarozowym i oczyść wektor za pomocą zestawu do czyszczenia żelem.

Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Aby strawić interesujący fragment DNA za pomocą Cpf1, połącz wodę wolną od RNazy, 10x bufor Cpf1, plazmid, rekombinowany inhibitor RNazy i Cpf1 w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej. Aby wprowadzić obcy fragment DNA do miejsc T1 i T2, dodaj jeden mikrolitr crRNA T1 i jeden mikrolitr crRNA T3 do probówki i inkubuj w łaźni wodnej w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez dwie godziny.

Po inkubacji należy wykonać elektroforezę w żelu agarozowym i oczyścić fragment za pomocą żelowego zestawu do czyszczenia. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza. Następnie, aby podwiązać obcy fragment DNA w wektorze C-Brick, połącz zlinearyzowany wektor i fragment DNA w 1,5-mililitrowej probówce mikrowirówkowej.

Dodaj 10x bufor ligazy DNA T4 i ligazę DNA T4. Następnie inkubuj przez dwie godziny w temperaturze 22 stopni Celsjusza. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze 20 stopni Celsjusza.

Dodaj 10 mikrolitrów produktów ligacji do komórek kompetentnych E coli DH10B i przeprowadź przemianę chemiczną. Następnie rozprowadź przekształcone bakterie E coli na płytkach LB i inkubuj je w temperaturze 37 stopni Celsjusza. Następnego dnia dodaj kilka klonów do 5-mililitrowych probówek LB z płynem i inkubuj je przez noc na wytrząsarce z prędkością 220 obr./min i 37 stopni Celsjusza.

Ekstrahuj plazmid za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu. Następnie zidentyfikuj właściwe klony za pomocą sekwencjonowania Sangera. Wykonaj nową rundę montażu C-Brick.

Korzystając z próbki, tak zwane klony pęknięć mogą być używane jako nowy wektor C-Brick lub fragment DNA do dalszego iteracyjnego składania C-Brick. Trzy kasety chromoproteinowe, cjBlue, eforRed i amilGFP, zostały zmontowane zgodnie z opisem w tym filmie. Trzy chromoproteiny uległy ekspresji w E. coli wyhodowanej na szalce.

Bakterie kontroli negatywnej, bez chromoprotein, pokazano na czwartej płytce. Następnie dwie kasety z ekspresją kolorów zostały dodatkowo zmontowane ze standardem C-Brick, aby uzyskać więcej kolorów. Trzy chromoproteiny i trzy złożone podwójne chromoproteiny uległy ekspresji w E. coli hodowanej w płynnym podłożu LB.

Od jednego do sześciu, wyrażone konstrukty to eforRed, jeden, amilGFP, dwa, cjBlue, trzy, amilGFP plus eforRed, cztery, eforRed plus cjBlue, pięć i amilGFP plus cjBlue, sześć. Kolorowe bakterie na jednej płytce lub w pojedynczej probówce do mikrowirówki zostały wyhodowane z pojedynczego klonu zweryfikowanego sekwencyjnie. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu tygodnia, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.

Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że wszystkie materiały powinny być wolne od RNaz w celu przygotowania siRNA i usunięcia Cpf1. Nadal polecam, ta taktyka pomogła naukowcom w dziedzinie biologii syntetycznej zbudować genetyczną wizytówkę szlaków metabolicznych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak złożyć ścieżkę DNA za pomocą standardu C-Brick.