Name: Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1 (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 3 s
Description: Poznaj standard montażu DNA C-Brick z użyciem białka Cpf1 do budowy złożonych obwodów genetycznych. Ta metoda niezależna od sekwencji umożliwia iteracyjny montaż konstruktów DNA w biologii syntetycznej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy firmie Shanghai Tolo Biotech za pomoc techniczną podczas opracowywania standardu C-Brick. Prace te zostały wsparte grantami z Programu Badawczego Priorytet Strategiczny Chińskiej Akademii Nauk (Grant No. XDB19040200).

1. Przygotowanie crRNA
<ol>
	<li>Przygotowanie matryc crRNA
	<ol>
		<li>Ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy (Tabela 1) w wodzie wolnej od RNaz do stężenia 10 μM.</li>
		<li>Dodać 22,5 μl oligonukleotydu górnej nici (T7-F w tabeli 1), 22,5 μl oligonukleotydu dolnej nici (tabela 1) i 5 μl 10-krotnego buforu do wyżarzania do probówki PCR o pojemności 0,2 ml. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 50 μL. 
		UWAGA: W tabeli 1 przedstawiono sześć różnych oligonukleotydów dolnej nici, z których każdy powinien być indywidualnie sparowany z górną nicią T7-F. Małe litery w tabeli 1 reprezentują sekwencję, która ma zostać transkrybowana do sekwencji prowadzącej crRNA. Zamiast 10-krotnego bufora do wyżarzania można użyć 10x bufora do wyżarzania.</li>
		<li>Umieść probówkę PCR w termocyklerze.</li>
		<li>Uruchom program wyżarzania: wstępna denaturacja w temperaturze 95 °C przez 5 minut, a następnie schładzanie od 95-20 °C, ze spadkiem temperatury o 1 °C na minutę na termocyklerze. 
		UWAGA: Natychmiast użyj próbek dla kroku 1.2.1.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Transkrypcja i oczyszczanie crRNA
	<ol>
		<li>Dodać 38 μl wody wolnej od RNaz, 8 μl matrycy z kroku 1.1.4, 20 μl 5x buforu transkrypcyjnego T7, 20 μl mieszaniny NTP (10 μM), 4 μl rekombinowanego inhibitora RNazy (RRI) i 10 μl polimerazy T7 RNA do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 100 μl.</li>
		<li>Umieścić probówkę mikrowirówki w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na noc (na około 16 godzin).</li>
		<li>Użyj zestawu do oczyszczania i zagęszczania RNA, aby oczyścić transkrybowane RNA; postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Oznaczyć ilościowo RNA za pomocą spektrofotometrów UV-Vis i rozcieńczyć RNA do stężenia 10 μM. Próbki należy zużyć natychmiast lub przechowywać je w temperaturze -80 °C. 
		UWAGA: Sekwencje crRNA są wymienione w tabeli 2.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Budowa części z cegiełki C (np. wstawianie części biologicznych do wektora standardowego z cegły C)
UWAGA: Ten krok składa się z trzech podetapów. W przypadku krótkich części biologicznych (np. promotorów i terminatorów) najlepiej jest użyć metody bezpośredniego PCR, aby wprowadzić części biologiczne do standardowego wektora C-Brick 4. Cała sekwencja wektorów jest pokazana w danych uzupełniających, a sekwencja prefiksu i sufiksu jest pokazana w <silna klasa="xfig">Rysunek 1 (krok 2.1, poniżej). W przypadku części biologicznych, które można łatwo uzyskać za pomocą PCR (np. z matrycami genomowego DNA, plazmidami lub sekwencjami DNA zsyntetyzowanymi de novo), najlepiej jest użyć metody bezszwowego składania w celu wstawienia części biologicznych do standardowego wektora C-Brick (krok 2.2 poniżej). W przypadku części uzyskanych ze wzorców BioBrick i BglBrick, trawienie za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych i ligacja za pośrednictwem ligazy DNA T4 mogą być stosowane do wprowadzania części biologicznych do standardowego wektora C-Brick (krok 2.3, poniżej).
<ol>
	<li>Budowa poprzez bezpośrednią amplifikację PCR
	<ol>
		<li>Zaprojektuj i zamów oligonukleotydy do amplifikacji PCR. 
		UWAGA: Koniec 5' oligonukleotydu zawiera sekwencję części DNA, a koniec 3' oligonukleotydu zawiera sekwencję wektorową (tj. "GGATCCACTAGTCTCTCCTCTCG" na końcu 3' nici przedniej i "GGATCCTTTCTCTTCTCTCTAG" na nici odwrotnej). Albo nie ma zwisu, albo można zaprojektować zwis ~20-bp na końcu 5' oligonukleotydu. Konkretne przykłady można znaleźć w poprzednim badaniu4.</li>
		<li>Ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy w ultraczystej wodzie do stężenia 10 μM.</li>
		<li>Ustaw reakcje PCR na lodzie w probówce PCR o pojemności 0,2 ml: dodaj 18 μl ultraczystej wody, 25 μl buforu 2x PCR, 1 μL dNTPs (10 μM), po 2,5 μl startera do przodu i do tyłu (10 μM) z kroku 2.1.2, 0,5 μl standardowego wektora C-Brick (50 ng) jako szablon, i 0,5 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 50 μl.</li>
		<li>Umieść probówkę bezpośrednio w termocyklerze i uruchom program termocyklera. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Program termocyklera: jeden cykl przez 3 minuty w temperaturze 98 °C; trzydzieści cykli przez 10 s w temperaturze 98 °C, 20 s w temperaturze 55 °C i 2 minuty w temperaturze 72 °C oraz jeden cykl przez 10 minut w temperaturze 72 °C. Utrzymywać próbkę w temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Dodać 9 μl mieszaniny z etapu 2.1.4 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml.</li>
		<li>Dodać 1 μl DpnI i inkubować przez 1 godzinę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. 
		UWAGA: Jeśli startery nie mają nakładających się sekwencji, dodać 0,5 μl kinazy polinukleotydowej T4 (PNK) i 0,5 μl ligazy DNA T4 i inkubować w łaźni wodnej o temperaturze 22 °C przez 1 godzinę. W przeciwnym razie, jeśli startery zawierają nakładającą się sekwencję ~ 20 nt, bezpośrednio przekształć produkty poddane działaniu DpnI w komórki kompetentne dla E. coli (DH10B) (krok 2.4). Zlinearyzowany produkt PCR zostanie poddany cyrkularyzacji przez system rekombinacji w gospodarzu.</li>
		<li>Próbki należy zużyć natychmiast lub przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa poprzez bezszwowy montaż
	<ol>
		<li>Zaprojektuj i zamów oligonukleotydy do amplifikacji PCR. 
		UWAGA: Koniec 3' oligonukleotydu zawiera końcową sekwencję części DNA, a koniec 5' oligonukleotydu zawiera koniec zlinearyzowanej sekwencji wektora standardowego C-Brick (tj. "CTAGAAAGAGGAGAAAGGATCC" dla końca 5' nici przedniej i "CGAGCTAGAGACTAGTGGATCC" dla końca 5' nici odwrotnej). Konkretne przykłady można znaleźć w poprzednim badaniu4.</li>
		<li>Ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy w ultraczystej wodzie do stężenia 10 μM.</li>
		<li>Ustaw reakcje PCR na lodzie w probówce PCR o pojemności 0,2 ml: dodać 18 μl ultraczystej wody, 25 μl buforu 2x PCR, 1 μl dNTP (10 μM), po 2,5 μl starterów do przodu i do tyłu (10 μM) z kroku 2.2.2, 0,5 μl matrycy (20-500 ng), i 0,5 μl polimerazy DNA o wysokiej wierności. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 50 μl.</li>
		<li>Umieść probówkę bezpośrednio w termocyklerze i uruchom program termocyklera. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C. 
		UWAGA: Ustaw program termocyklera na: jeden cykl przez 3 minuty w temperaturze 98 °C; 30 cykli przez 10 s w temperaturze 98 °C, 20 s w temperaturze 55 °C (w zależności od temperatury wyżarzania podkładu) i 1 min (w zależności od długości części biologicznych) w temperaturze 72 °C; i jeden cykl przez 10 minut w temperaturze 72 °C. Utrzymać próbkę w temperaturze 16 °C.</li>
		<li>Oczyść produkt PCR za pomocą zestawu do czyszczenia PCR; postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Trawić standardowy wektor C-Brick za pomocą BamHI: dodać 34 μl ultraczystej wody, 10 μl plazmidu (1 μg), 5 μl 10x buforu i 1 μl BamHI do probówki mikrowirówkowej. Inkubować do 2 godzin w temperaturze 37 °C w łaźni wodnej.</li>
		<li>Oczyść powyższy produkt za pomocą zestawu do czyszczenia żelem; postępuj zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Dodać 2 μl zlinearyzowanego wektora (50 ng) z kroku 2.2.7, 5 μl fragmentu (200 ng) z kroku 2.2.4, 2 μl 5x bezszwowego buforu montażowego i 1 μl bezszwowego enzymu montażowego z bezszwowego zestawu montażowego do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 10 μl.</li>
		<li>Umieścić je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C na 30 minut. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Budowa poprzez trawienie za pośrednictwem enzymów restrykcyjnych i ligację za pośrednictwem ligazy DNA T4. 
	UWAGA: W przypadku części uzyskanych ze standardów BioBrick (krok 2.3.4-2.3.7) i BglBrick (krok 2.3.1-2.3.3), trawienie za pośrednictwem enzymu restrykcyjnego i ligacja za pośrednictwem ligazy DNA T4 mogą być stosowane do wprowadzania części biologicznych do standardowego wektora C-Brick.
	<ol>
		<li>Trawić standardowe części BglBrick za pomocą BamHI i BglII: dodać 34 μl ultraczystej wody, 10 μl plazmidu (2 μg), 5 μl 10x buforu 3, 0,5 μl BamHI i 0,5 μl BglII do probówki mikrowirówkowej. Inkubować przez 2 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Uruchom elektroforezę w żelu agarozowym o stężeniu 1% i oczyść fragment za pomocą zestawu do czyszczenia żelem.</li>
		<li>Zligować fragment i standardowy wektor C-Brick: dodać 2 μl zlinearyzowanego wektora (50 ng) z kroku 2.1.12 i 6 μl fragmentu (200 ng) z kroku 2.3.3 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 μl 10 x bufor ligazy DNA T4 i 1 μl ligazy DNA T4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 22 °C. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Trawić standardowe części BioBrick za pomocą XbaI i SpeI: dodać 34 μl ultraczystej wody, 10 μl plazmidu (2 μg), 5 μl 10x buforu, 0,5 μl XbaI i 0,5 μl SpeI do probówki mikrowirówkowej. Inkubować przez 2 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Trawić standardowy wektor C-Brick za pomocą XbaI i SpeI: dodać 34 μl ultraczystej wody, 10 μl plazmidu (1 μg), 5 μl 10x buforu, 0,5 μl XbaI i 0,5 μl SpeI do probówki mikrowirówkowej. Inkubować przez 2 godziny w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.</li>
		<li>Przeprowadzić elektroforezę w żelu agarozowym o stężeniu 1% i oczyścić fragment z kroku 2.3.4 oraz wektor zlinearyzowany z kroku 2.3.5 za pomocą zestawu systemu czyszczenia żelem, postępując zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Zwiąż fragment i wektor C-Brick: dodaj 2 μl wektora linearyzowanego (50 ng) z kroku 2.3.5 i 6 μl fragmentu (200 ng) z kroku 2.3.4 do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 μl 10x buforu ligazy DNA T4 i 1 μl ligazy DNA T4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 22 °C. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Dodać 10 μl produktów z etapu 2.1.8, 2.2.9, 2.3.3 lub 2.3.7 w celu przemiany chemicznej do właściwych komórek E. coli (DH10B).</li>
	<li>Pobrać kilka klonów do 5 ml płynnej probówki Luria-Bertani (LB) i inkubować w temperaturze 37 °C na wytrząsarce (220 obr./min) przez noc.</li>
	<li>Ekstrahować plazmid za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu; postępować zgodnie z protokołem producenta.</li>
	<li>Zidentyfikuj poprawne klony, sekwencjonując metodą Sanger11.</li>
</ol>
3. Montaż cegieł C (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Trawienie wektora C-Brick za pomocą Cpf1
	<ol>
		<li>Dodać 22,5 μl wody wolnej od RNaz, 4 μl 10x buforu Cpf1, 10 μl plazmidu z kroku 2.6 (1 μg), 0,5 μl RRI i 1 μL Cpf1 (5 μM) do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml. 
		UWAGA: Cpf1 można kupić komercyjnie lub oczyścić zgodnie z protokołem z poprzedniego badania4.</li>
		<li>Aby wprowadzić obcy fragment DNA do miejsc T1 i T2, dodać 1 μl crRNA-T2 (10 μM) i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Add 1 μL crRNA-T1 (10 μM) i Cpf1 (5 μM) przez kolejne 30 min. 
		UWAGA: Alternatywnie, aby wprowadzić obcy fragment DNA do miejsc T3 i T4, dodać 1 μl crRNA-T3 (10 μM) i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 30 minut. Dodaj 1 μl crRNA-T4 (10 μM) przez kolejne 30 minut.</li>
		<li>Dodać 1 μl termoczułej fosfatazy alkalicznej i inkubować probówkę w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C przez kolejną 1 godzinę.</li>
		<li>Uruchom elektroforezę w żelu agarozowym i oczyść wektor za pomocą zestawu do czyszczenia żelem. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Trawienie fragmentu DNA za pomocą Cpf1
	<ol>
		<li>Do probówki mikrowirówki o pojemności 1,5 ml dodać 21,5 μl wody wolnej od RNaz, 4 μl 10x buforu Cpf1, 10 μl plazmidu z kroku 2.6 (2 μg), 0,5 μl RRI i 2 μl Cpf1 (5 μM).</li>
		<li>Aby wprowadzić obcy fragment DNA do miejsc T1 i T2, dodać 1 μl crRNA-T1 (10 μM) i 1 μl crRNA-T3 (10 μM) i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 h. 
		UWAGA: Alternatywnie dodać 1 μl crRNA-T2 (10 μM) i 1 μl crRNA-T4 (10 μM) i inkubować w łaźni wodnej w temperaturze 37 °C przez 2 godziny.</li>
		<li>Uruchom elektroforezę w żelu agarozowym i oczyść fragment za pomocą zestawu do czyszczenia żelem. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaż C-Brick i dalsza weryfikacja
	<ol>
		<li>Związać obcy fragment DNA i wektor C-Brick: dodać 2 μl zlinearyzowanego wektora (50 ng) z kroku 3.1.4 i 6 μl fragmentu DNA (200 ng) z kroku 3.2.3 do probówki mikrowirówkowej o pojemności 1,5 ml. Dodać 1 μl 10x buforu ligazy DNA T4 i 1 μl ligazy DNA T4. Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 22 °C. Próbki należy zużyć natychmiast lub zamrozić i przechowywać w temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Dodać 10 μl produktów ligacji (etap 3.3.1) w celu przemiany chemicznej w komórki kompetentne do E. coli (DH10B).</li>
		<li>Dodać kilka klonów do probówki LB o pojemności 5 ml i inkubować przez noc na wytrząsarce z prędkością 220 obr./min i 37 °C.</li>
		<li>Ekstrahować plazmid za pomocą zestawu do przygotowania plazmidu; postępować zgodnie z protokołem producenta.</li>
		<li>Zidentyfikuj poprawne klony za pomocą sekwencjonowania Sangera11.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wykonaj nową rundę montażu C-Brick. Poprawne klony z kroku 3.3.4 mogą być użyte jako nowy wektor C-Brick lub część DNA do dalszego iteracyjnego montażu C-Brick, zgodnie z tym samym protokołem z kroków 3.1-3.3. 
	UWAGA: Witryny T2' i T3' są zaprojektowane jako kopia zapasowa witryn T2 i T3 (<silna klasa="xfig">Rysunek 1a). W przypadku plazmidów uzyskanych z kroku 2.3.7 tylko T2' i T3' mogą być używane do standardowego montażu C-Brick.</li>
</ol>

<ol><li>Canton, B., Labno, A., Endy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refinement+and+standardization+of+synthetic+biological+parts+and+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Refinement and standardization of synthetic biological parts and devices.</a> Nat Biotechnol. 26 (7), 787-793 (2008).</li>
<li>Shetty, R. P., Endy, D., Knight, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+BioBrick+vectors+from+BioBrick+parts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering BioBrick vectors from BioBrick parts.</a> J Biol Eng. 2, (2008).</li>
<li>Knight, T. <a target="_blank" href="https://dspace.mit.edu/handle/1721.1/21168">Idempotent Vector Design for Standard Assembly of Biobricks</a>. , MIT Artificial Intelligence Laboratory; MIT Synthetic Biology Working Group. 1-11 (2003).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-Brick%3A+A+New+Standard+for+Assembly+of+Biological+Parts+Using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-Brick: A New Standard for Assembly of Biological Parts Using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Anderson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((BglBricks%3A+A+flexible+standard+for+biological+part+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Eng%22%5BJournal%5D)">BglBricks: A flexible standard for biological part assembly.</a> J Biol Eng. 4 (1), (2010).</li>
<li>Liu, J. K., Chen, W. H., Ren, S. X., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iBrick%3A+a+new+standard+for+iterative+assembly+of+biological+parts+with+homing+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">iBrick: a new standard for iterative assembly of biological parts with homing endonucleases.</a> PLoS One. 9 (10), e110852(2014).</li>
<li>Hsu, P. D., Lander, E. S., Zhang, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+applications+of+CRISPR-Cas9+for+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Development and applications of CRISPR-Cas9 for genome engineering.</a> Cell. 157 (6), 1262-1278 (2014).</li>
<li>Wright, A. V., Nunez, J. K., Doudna, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biology+and+Applications+of+CRISPR+Systems%3A+Harnessing+Nature%27s+Toolbox+for+Genome+Engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Biology and Applications of CRISPR Systems: Harnessing Nature's Toolbox for Genome Engineering.</a> Cell. 164 (1-2), 29-44 (2016).</li>
<li>Jinek, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Zetsche, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cpf1+is+a+single+RNA-guided+endonuclease+of+a+class+2+CRISPR-Cas+system%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cpf1 is a single RNA-guided endonuclease of a class 2 CRISPR-Cas system.</a> Cell. 163 (3), 759-771 (2015).</li>
<li>Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+sequencing+with+chain-terminating+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">DNA sequencing with chain-terminating inhibitors.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).</li>
<li>Shanghai Tolo Biotechnology Company Limited. , Shanghai 200233, China. Available from:
 <a target="_blank" href="http://www.tolobio.com/">http://www.tolobio.com/</a> (2017).</li>
<li>Engler, C., Kandzia, R., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+one+pot%2C+one+step%2C+precision+cloning+method%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A one pot, one step, precision cloning method.</a> PLoS One. 3 (11), e3647(2008).</li>
<li>Gibson, D. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+assembly+of+DNA+molecules+up+to+several+hundred+kilobases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Enzymatic assembly of DNA molecules up to several hundred kilobases.</a> Nat Methods. 6 (5), 343-345 (2009).</li>
<li>Casini, A., Storch, M., Baldwin, G. S., Ellis, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bricks+and+blueprints%3A+methods+and+standards+for+DNA+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Bricks and blueprints: methods and standards for DNA assembly.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 16 (9), 568-576 (2015).</li>
<li>Cameron, D. E., Bashor, C. J., Collins, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">A brief history of synthetic biology.</a> Nat Rev Microbiol. 12 (5), 381-390 (2014).</li>
<li>Keasling, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+synthetic+chemistry%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for synthetic chemistry.</a> ACS Chem Biol. 3 (1), 64-76 (2008).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten opisuje procedurę dla standardu montażu DNA C-Brick. Najważniejszym krokiem w tym protokole jest linearyzacja standardowego wektora C-Brick; Niepełne rozszczepienie wektora może poważnie wpłynąć na wskaźnik sukcesu. Dodatkowo, chociaż Cpf1 głównie rozszczepia docelowe sekwencje DNA we wzorze rozszczepienia "18-23", wykryto również niedokładne rozszczepienie w pobliżu dwóch zasad4, co może powodować niewielką liczbę mutacji po złożeniu DNA. Dlatego sekwencjonowanie Sangera jest potrzeb...

Standaryzacja biologicznych części DNA jest ważna dla rozwoju biologii syntetycznej1. Opracowanie procedury składania DNA może zastąpić doraźne projekty eksperymentalne i wyeliminować wiele nieoczekiwanych wyników, które pojawiają się podczas składania składników genetycznych w większe systemy. Standard BioBrick (BBF RFC 10) był jednym z najwcześniejszych zaproponowanych standardów składania DNA. Używa sekwencji prefiksów (zawierającej miejsca cięcia EcoRI i XbaI) oraz sekwencji sufiksów (zawierającej miejsca cięcia SpeI i PstI)2,3. Ponieważ XbaI i SpeI mają komplementarne, spójne końce, części DNA BioBrick, które są cięte za pomocą XbaI i SpeI, mogą być ze sobą łączone, generując nowy BioBrick do dalszego iteracyjnego składania.
Niektóre defekty zostały zidentyfikowane za pomocą standardu BioBrick4. Na przykład wytwarza bliznę o długości 8 pz między częściami DNA, która nie pozwala na budowę białek infuzyjnych. Poza tym cztery wyżej wymienione typy miejsc restrykcyjnych 6-pz muszą zostać usunięte z części DNA, co jest bardzo niewygodne. Standard BglBrick został ustanowiony w celu rozwiązania pierwszego problemu5. Tworzy bliznę o długości 6 pz "GGATCT", wytwarzając Gly-Ser i umożliwiając fuzję wielu białek lub domen białkowych. iBrick został opracowany, aby poradzić sobie z drugim problemem6. Wykorzystuje endonukleazy naprowadzające (HE), które rozpoznają długie sekwencje DNA. Ponieważ miejsca rozpoznawania HE rzadko występują w naturalnych sekwencjach DNA, standard iBrick może być używany do bezpośredniej budowy części iBrick bez modyfikacji ich sekwencji DNA. Jednak standard iBrick pozostawia bliznę o długości 21 pz między częściami DNA, co może być powodem jego niepopularności.
W ostatnich latach szybko rozwinął się system CRISPR (clustered regularly interspaced short palindromic repeats)7,8. Wśród białek związanych z CRISPR (Cas) endonukleaza Cas9 ze Streptococcus pyogenes jest obecnie szeroko stosowana. Najczęściej wprowadza dwuniciowe pęknięcia DNA (DSB) z końcami9.
W 2015 roku Zhang i współpracownicy po raz pierwszy scharakteryzowali Cpf1 (CRISPR od Prevotella i Francisella 1). Należy do systemu CRISPR-Cas klasy 2 typu V i jest endonukleazą sterowaną przez CRISRP RNA (crRNA) 10. W przeciwieństwie do Cas9, Cpf1 wprowadza DSB z 4 lub 5 nt 5' overhang10. Opierając się na tej charakterystyce, Cpf1 został wykorzystany do opracowania standardu składania DNA, C-Brick4. Na standardowym wektorze C-Brick cztery miejsca docelowe Cpf1 z prefiksem T1/T2 i przyrostkiem T3/T4 flankują części biologiczne; jest to podobne do standardu BioBrick. Ponieważ rozszczepienie miejsc T2 i T3 wytwarza komplementarne, lepkie końce, możliwe jest wykonanie iteracyjnego składania części DNA przy jednoczesnym generowaniu blizny "GGATCC" między częściami. Warto zauważyć, że standard C-Brick ma dwie główne zalety: rozpoznawanie długich sekwencji docelowych i pozostawianie krótkich blizn. Blizna 6 pz "GGATCC" generowana przez C-Brick koduje Gly-Ser, co pozwala na budowę białek fuzyjnych. Co więcej, standard C-Brick jest również częściowo kompatybilny ze standardami BglBrick i BioBrick.

<table><tbody><tr><td>Komercyjny oligonukleotyd</td><td>Sangon Biotech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>10x Taq PCR Bufor</td><td>Transgen</td><td>#J40928</td><td></td></tr><tr><td>Ultra czysta woda destylowana</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>5x Bufor transkrypcyjny RNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>K0441</td><td></td></tr><tr><td>T7 Polimeraza RNA</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EP0111</td><td></td></tr><tr><td>Mieszanina NTP</td><td>Sangon</td><td>#ND0056</td><td></td></tr><tr><td>RRI (rekombinowany inhibitor RNazy)</td> <td>Takara</td><td>2313A</td><td></td></tr><tr><td>RNA Clean & Concentrator-5</td><td>Zymo Research</td><td>R1015</td><td></td></tr><tr><td>Spektrometr UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>Nano-Drop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>2x Phanta Max Buffer</td><td>Vazyme</td><td>PB505</td><td>Bufor PCR</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Transgen</td><td>AD101</td><td></td></tr><tr><td>Phanta Max Super-Fidelity DNA Polimeraza</td><td>Vazyme</td><td>P505-d1</td><td></td></tr><tr><td>Ezmax do jednoetapowego klonowania</td><td>Tolobio</td><td>24303-1</td><td>bezszwowy zestaw montażowy</td></tr><tr><td>5x Bufor do Ezmax Jednoetapowe klonowanie</td><td>Tolobio</td><td>32006</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>NEB</td><td>#R0136L</td><td></td></tr><tr><td>BamHI-HF</td><td>NEB</td><td>#R3136L</td><td></td></tr><tr><td>BglII&nbsp;</td><td>NEB</td><td>#R0144L</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>#R0145L</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>NEB</td><td>#R3133L</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor 3</td><td>NEB</td><td>#B7003S</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor CutSmart</td><td>NEB</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>10x Bufor ligazy DNA T4</td><td>Tolobio</td><td>32002</td><td></td></tr><tr><td>T4 PNK</td><td>Tolobio</td><td>32206</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA ligaza</td><td>Tolobio</td><td>32210</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>NEB</td><td>#R01762</td><td></td></tr><tr><td>SV Żel i system czyszczenia PCR</td><td>Promega</td><td>A9282</td><td></td></tr><tr><td>Plasmid Mini Kit I</td><td>Omega</td><td>D6943-02</td> zestaw <td>do przygotowania plazmidu</td></tr><tr><td>termoczuła fosfataza alkaliczna&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>#EF0651</td><td>FastAP</td></tr><tr><td>10x bufor Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32008</td><td></td></tr><tr><td>Cpf1</td><td>Tolobio</td><td>32105</td><td>Termocykler FnCpf1</td></tr><tr><td></td><td>Applied Biosystems</td><td>veriti 96 well</td><td></td></tr><tr><td>C-Brick standardowy wektor</td><td>Tolobio</td><td>98101</td><td></td></tr><tr><td>E. coli [DH10B]</td><td>Invitrogen</td><td>18297010</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Luria-Bertani (trypton)</td><td>Oxoid</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Luria-Bertani (ekstrakt drożdżowy)</td><td>Pożywka Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka Luria-Bertani (NaCl)</td><td>Sangon, Biotech</td><td>B126BA0007</td><td></td></tr></tbody></table>

protokoły standardowego montażu dna c-brick przy użyciu cpf1

Protocols for C-Brick DNA Standard Assembly Using Cpf1

białko związane z CRISPR, Cpf1, rozszczepia dwuniciowe DNA pod kierunkiem CRISPR RNA (crRNA), generując lepkie końce. Ze względu na tę cechę, Cpf1 został wykorzystany do ustanowienia standardu składania DNA o nazwie C-Brick, który ma tę zaletę, że ma długie miejsca rozpoznawania i krótkie blizny. Na standardowym wektorze C-Brick znajdują się cztery miejsca rozpoznawania Cpf1 – prefiks (miejsca T1 i T2) oraz przyrostek (miejsca T3 i T4) – flankujące biologiczne części DNA. Rozszczepienie miejsc T2 i T3 wytwarza komplementarne lepkie końce, które pozwalają na składanie części DNA z miejscami T2 i T3. Tymczasem po montażu między częściami generowana jest krótka blizna "GGATCC". Ponieważ nowo powstały plazmid ponownie zawiera cztery miejsca rozszczepienia Cpf1, metoda pozwala na iteracyjne składanie części DNA, które jest podobne do tych stosowanych w standardach BioBrick i BglBrick. Procedura przedstawiająca zastosowanie standardu C-Brick do składania części DNA jest opisana tutaj. Standard C-Brick może być szeroko stosowany przez naukowców, studentów studiów magisterskich i licencjackich, a nawet amatorów.

Niniejszy protokół przedstawia montaż trzech kaset chromoprotein (cjBlue (BBa_K592011), eforRed (BBa_K592012) oraz amilGFP (BBa_K592010)). W pierwszej kolejności sekwencje kodujące trzy wyżej wymienione geny oraz terminatory sklonowano pojedynczo do standardowego wektora C-Brick. Krótkie fragmenty DNA, promotor i terminator, wprowadzono do wektora C-Brick poprzez amplifikację PCR z użyciem starterów zawierających krótkie fragmenty DNA na końcu 5'. Następnie zastosowano metodę samoligacji....

Białko związane z CRISPR, Cpf1, może być prowadzone przez specjalnie zaprojektowane RNA CRISPR (crRNA) do rozszczepiania dwuniciowego DNA w pożądanych miejscach, generując lepkie końce. Na podstawie tej cechy ustalono standard składania DNA (C-Brick), a protokół szczegółowo opisujący jego użycie opisano tutaj.

Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1

CRISPR-associated protein Cpf1 cleaves double-stranded DNA under the guidance of CRISPR RNA (crRNA), generating sticky ends. Because of this ...

Poniższe filmy szczegółowo opisują procedurę użycia standardu C-Brick do składania części DNA przy użyciu białka związanego z CRISPR, Cpf1. Metoda ta może przyczynić się do dalszego rozwoju składania DNA w dziedzinie biologii syntetycznej. Na przykład poprzez ułatwianie budowy skomplikowanych obwodów genetycznych.Główną zaletą tej metody jest to, że jest niezależna od sekwencji i pozwala na iteracyjne składanie konstruktów DNA. Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, gdy zauważyliśmy, że Cpf1 jest prowadzony przez pojedyncze siRNA i katalityczne DNA, które są ułożone w stos. W związku z tym generowanie DKN.Procedurę zademonstruje Shi-Yuan Li, doktorant z mojego laboratorium. Aby naprawić matryce crRNA, ponownie zawiesić poszczególne oligonukleotydy w wodzie wolnej od RNaz do stężenia 10 mikromolowych. Do probówki PCR o pojemności 0,2 mililitra dodaj oligonukleotyd górnej nici, oligonukleotyd dolnej nici i 10-krotny bufor do wyżarzania, jak opisano w dołączonym dokumencie.Upewnij się, że całkowita objętość wynosi 50 mikrolitrów. Ta tabela przedstawia sześć różnych oligonukleotydów dolnej nici, z których każdy powinien być indywidualnie sparowany z górną nicią, T7-F. Małe lit

protocols-for-c-brick-dna-standard-assembly-using-cpf1

Research

JoVE Journal

Genetics

Genetyka

Zaprojektowano zrównoważony, samoregulujący się system bakteryjny do remediacji zanieczyszczeń ropą naftową, wykorzystując standardowe, wymienne części DNA (BioBricks). Zmodyfikowany szczep E. coli został wykorzystany do degradacji alkanów poprzez β-oksydację w toksycznych środowiskach wodnych. Odpowiednie enzymy pochodzące od różnych gatunków wykazały aktywność degradującą alkany. Ponadto, poprzez wprowadzenie genów z bakterii tolerujących alkany, osiągnięto zwiększoną tolerancję na n-heksan.

Zestaw narzędzi umożliwiających konwersję węglowodorów w środowiskach wodnych

Techniki rekombinacji homologicznej znacznie rozwijają genetykę Drosophila, umożliwiając tworzenie molekularnie precyzyjnych mutacji.  Niedawne zastosowanie rekombinacji pozwala na manipulowanie dużymi fragmentami DNA i przekształcanie ich w Drosophila6. Przedstawione tutaj metody łączą te techniki w celu szybkiego generowania dużych wektorów rekombinacji homologicznej.

Rekombinowanie homologicznych konstruktów rekombinacji u Drosophila

Synteza niestandardowych plazmidów jest pracochłonna i czasochłonna. Protokół ten opisuje zastosowanie klonowania zespołu Gibsona w celu zmniejszenia pracy i czasu trwania niestandardowej procedury klonowania DNA. Opisany protokół pozwala również na uzyskanie wiarygodnych znakowanych konstruktów białkowych do ekspresji ssaków przy podobnych kosztach jak w przypadku tradycyjnego klonowania DNA metodą "wytnij i wklej".

Generowanie wektorów plazmidowych eksprymujących białka znakowane FLAG pod regulacją promotora ludzkiego czynnika wydłużenia-1α przy użyciu zespołu Gibsona

Tutaj prezentujemy składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego (CAPRRESI), protokół oparty na wstawianiu miejsc enzymów restrykcyjnych do sekwencji synonimów DNA i funkcjonalnym odzyskiwaniu plazmidu. Protokół ten jest szybką i tanią metodą fuzji genów kodujących białka.

CAPRRESI: Składanie chimery przez regenerację plazmidu i insercję enzymu restrykcyjnego

Identyfikacja fizycznych interakcji między genami a elementami regulatorowymi jest trudna, ale została ułatwiona dzięki metodom wychwytywania konformacji chromosomów. Ta modyfikacja protokołu 4C-seq łagodzi stronniczość PCR, minimalizując nadmierną amplifikację matryc PCR i maksymalizując mapowalność odczytów poprzez włączenie etapu trawienia enzymu ograniczającego dodawanie.

Wysokoprzepustowa identyfikacja sekwencji regulatorowych genów przy użyciu sekwencjonowania nowej generacji wychwytywania konformacji chromosomów kołowych (4C-seq)

Opisujemy szczegółowy protokół projektowania, symulacji, eksperymentów w laboratorium mokrym i analizy dla rekonfigurowalnego stojaka harmonijkowego DNA o oczkach 6 na 6.

Projekt i synteza rekonfigurowalnego stojaka na akordeon DNA

Tutaj prezentujemy klonowanie gRNA (STAgR), metodę łatwego multipleksowania wektorów gRNA dla podejść CRISPR/Cas9. STAgR sprawia, że multipleksowanie gRNA jest proste, wydajne i konfigurowalne.

Konfigurowalny protokół klonowania gRNA ze składaniem ciągów (STAgR)

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół ligacji T4 i denaturacji PAGE oczyszczania małych kolistych cząsteczek DNA, wyżarzania i natywnej analizy PAGE okrągłych płytek, montażu i obrazowania AFM nanostruktur DNA 1D i 2D, a także elektroforezy w żelu agarozowym i wirowania oczyszczania skończonych nanostruktur DNA.

Stabilne motywy DNA, nanostruktury 1D i 2D zbudowane z małych kolistych cząsteczek DNA

Tutaj szczegółowo prezentujemy adaptację techniki przechwytywania konformacji chromosomów (3C) z naciskiem na zaangażowanie i naukę na studiach licencjackich.

Uzyskanie A z 3Cs: Przechwytywanie konformacji chromosomów dla studentów

Niniejszy artykuł przedstawia krok po kroku protokół demonstrujący, jak klonowanie modułowe (MoClo) można dostosować do klonowania operonów policistronnych.

Standaryzowany modułowy montaż operonów policistronnych z klonowaniem modularnym (MoClo) z wykorzystaniem zestawu narzędzi In-Cloning

Opisujemy protokół wysokoprzepustowej metody klonowania, klonowania wahadłowego opartego na CRISPR (klonowanie wahadłowe CRISPR), który umożliwia transfer interesujących fragmentów DNA między wektorami bez konieczności amplifikacji fragmentów DNA metodą PCR.

Klonowanie wahadłowe oparte na CRISPR: metoda klonowania o wysokiej przepustowości

Poznaj standard montażu DNA C-Brick z użyciem białka Cpf1 do budowy złożonych obwodów genetycznych. Ta metoda niezależna od sekwencji umożliwia iteracyjny montaż konstruktów DNA w biologii syntetycznej.

Protokoły standardowego montażu DNA C-Brick przy użyciu Cpf1

Przeglądaj więcej filmów