Name: Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj analizę makrofagów z mikrogleju i monocytów w ośrodkowym układzie nerwowym myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia identyfikację markerów komórkowych w badaniach neuroimmunologicznych.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Ta praca była wspierana przez granty z Agence Nationale pour la Recherche (ANR-12-MALZ-0003-02-P2X7RAD), Association France Alzheimer i Bpifrance. Nasze laboratorium jest również wspierane przez Inserm, CNRS, Université Pierre et Marie-Curie oraz program "Investissements d'avenir" ANR-10-IAIHU-06 (IHU-A-ICM). Chcielibyśmy podziękować za pomoc ze strony CELIS cell culture core facility.

Wszystkie opisane tutaj metody zostały zatwierdzone przez Instytucjonalny Komitet ds. Opieki i Użytkowania Zwierząt w Instytucie ICM oraz przez Francuski Komitet Etyki Zwierząt Darwina i są objęte protokołem 01407.02.
1. Przygotowanie
<ol>
	<li>Przygotuj koktajl wytrawiający w probówce o pojemności 1,5 ml, łącząc następujące składniki dla każdej myszy: 1 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS); 123 μl enzymu wytrawiającego (patrz tabela materiałów) w stężeniu 13 wunsch/ml (roztwór podstawowy), stężenie końcowe 1,6 wunsch/ml; i 5 μl DNazy I (patrz tabela materiałów) w stężeniu 100 mg/ml (roztwór podstawowy), stężenie końcowe 0,5 mg/ml.</li>
</ol>
2. Perfuzja i rozwarstwienie
<ol>
	<li>Poddaj myszy eutanazji śmiertelną dawką pentobarbitalu (100 μl przy 400 mg/ml).</li>
	<li>Ułóż zwierzę w pozycji leżącej na plecach i zwilż ciało 70% etanolem.</li>
	<li>Przetnij skórę brzuszną cienkimi nożyczkami tuż poniżej wyrostka ksylowego, aby odsłonić klatkę piersiową.</li>
	<li>Wykonaj nacięcie w przeponie i przetnij boczne aspekty klatki piersiowej cienkimi nożyczkami w kierunku ogonowym do rostralnego, aby odsłonić serce (i uniknąć cięcia innych narządów). Zidentyfikuj lewą komorę (LV) i prawy przedsionek (RA).</li>
	<li>Wprowadzić cewnik motylkowy z igłą 25 G do wnętrza LV. Wykonać nacięcie na RZS cienkimi nożyczkami i na początku przepływu krwi rozpocząć perfuzję z szybkością przepływu 10 ml / min przez LV z 20 ml PBS w celu usunięcia komórek i krwi z naczyń; udaną perfuzję obserwuje się poprzez blanszowanie płuc i wątroby w miarę przemieszczania się krwi.</li>
	<li>Odetnij głowę zwierzęcia średnimi nożyczkami. Wypreparuj kręgosłup cienkimi nożyczkami i oddziel go od ciała, wycinając mięśnie ściany brzucha po brzusznej stronie kręgosłupa i przecinając kręgosłup u podstawy ogona.</li>
	<li>Włożyć strzykawkę o pojemności 10 ml zawierającą PBS i zamontowaną końcówkę pipety o pojemności 200 μl do odcinka lędźwiowego kręgosłupa i przepłukać rdzeń kręgowy po stronie szyjnej. 
	UWAGA: Końcówkę pipety o pojemności 200 μl przecina się nożyczkami na jej najszerszym końcu (około 1 cm) i szczelnie wkłada na strzykawkę o pojemności 10 ml uprzednio wypełnioną PBS.</li>
	<li>Usuń skórę nad czaszką i użyj kleszczy, aby odsłonić mózg. Włóż ostrze nożyczek u podstawy czaszki i przetnij czaszkę zgodnie ze szwem strzałkowym. Włóż małe kleszcze do nacięcia i delikatnie unieś czaszkę. Wypreparuj mózg z głowy myszy i usuń opuszkę węchową i móżdżek.</li>
	<li>Zebrać mózg i rdzeń kręgowy do probówki o pojemności 1,5 ml zawierającej 1,128 ml PBS z koktajlem trawiennym (od kroku 1.1).</li>
</ol>
3. Dysocjacja komórek
<ol>
	<li>Za pomocą małych nożyczek drobno przeciąć mózg i rdzeń kręgowy w probówce o pojemności 1,5 ml (krok 2.9) na1-2 mm 3 części (<silna klasa="xfig">Rysunek 1).</li>
	<li>Inkubować probówkę o pojemności 1,5 ml zawierającą rozdrobnione tkanki przez 30 minut w inkubatorze w temperaturze 37 °C z 5% CO2, 
	UWAGA: Na tym etapie przygotuj gradient gęstości.</li>
	<li>Dodać 20 μl 0,5 M EDTA (roztwór podstawowy), końcowe stężenie 10 mM, do probówki o pojemności 1,5 ml, aby zatrzymać reakcję enzymatyczną.</li>
	<li>Delikatnie przygotować zawiesinę komórek, pipetując w górę i w dół za pomocą pipety o pojemności 5 ml.</li>
	<li>Przepuścić zawiesinę komórek przez nylonową siatkę (porów o wielkości 70 μm) w probówce o pojemności 50 ml za pomocą tłoka strzykawki o pojemności 10 ml.</li>
	<li>Umyj nylonową siatkę 20 ml 5% płodowej surowicy bydlęcej (FBS)-PBS.</li>
	<li>Wirować przez 7 minut (300 x g) w temperaturze pokojowej (18 °C). Odrzuć supernatant przez aspirację i przejdź do następnego kroku. Zachowaj szczególną ostrożność podczas usuwania supernatantu; Nie należy naruszać osadu, który można łatwo zassać za pomocą pipety zasysającej.</li>
</ol>
4. Gradient gęstości
<ol>
	<li>Przygotować roztwór podstawowy pożywki o gradinie gęstości, dodając odpowiednią ilość 10x PBS do podłoża o gradiencie gęstości. 
	UWAGA: Dodaj jedną część 10X PBS do dziewięciu części gradientu gęstości.</li>
	<li>Rozcieńczyć podłoże o gradiencie gęstości materiałem 1x PBS dla różnych wartości procentowych, jak opisano w tabeli 1.</li>
	<li>Zawiesić osad (z kroku 3.7) za pomocą 4 ml pożywki o gradiencie gęstości 30% i przenieść do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umieść pipetę Pasteura na dnie probówki o pojemności 15 ml i powoli nałóż 4 ml pożywki o gradiencie gęstości 37%.</li>
	<li>Dodaj 4 ml pożywki o gradiencie gęstości 70%, jak opisano powyżej.</li>
	<li>Odwirowywać gradient przez 40 minut (800 x g) w temperaturze pokojowej (18 °C). Upewnij się, że wirówka zatrzymuje się z minimalnym hamulcem lub bez hamulca, aby interfaza nie została zakłócona. 
	UWAGA: Rurka będzie wyglądać na rozwarstwioną. Komórki ułożone warstwowo na granicy gradientu gęstości 70% - 37% to jednojądrzaste komórki odpornościowe (subpopulacje mikrogleju i makrofagów); górne poziomy to odpowiednio szczątki komórkowe i mielina (<silna klasa="xfig">Rysunek 2).</li>
	<li>Za pomocą pipety transferowej delikatnie usuń warstwę mieliny.</li>
	<li>Zbierz 3-4 ml interfazy gradientu gęstości 70-37% zawierającej komórki subpopulacji makrofagów do czystej probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Umyj komórki 3x PBS o łącznej objętości 15 ml. Upewnij się, że pożywka o gradiencie gęstości zawierająca komórki jest rozcieńczona co najmniej trzykrotnie PBS i wirować przez 7 minut (500 x g, 4 °C) przy włączonym hamulcu.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 1 ml PBS w celu znakowania komórek lub do innych testów funkcjonalnych.</li>
</ol>
5. Oznaczanie komórek do cytometrii przepływowej
<ol>
	<li>Przenieść komórki (krok 4.10) do probówki do cytometrii przepływowej.</li>
	<li>Dodać 1 μl możliwego do utrwalenia odczynnika do barwienia martwych komórek do każdej próbki komórek otrzymanej w kroku 4.10. Inkubować przez 30 minut na lodzie, chronić przed światłem.</li>
	<li>Przemyć komórki raz 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut (300 x g, 4 °C).</li>
	<li>Usunąć supernatant i ponownie zawiesić osad komórkowy za pomocą 400 μl PBS 1% BSA, 0,1% azydku.</li>
	<li>Dodać 1 μg przeciwciał CD16/CD32 do 100 μl komórek, aby zablokować receptory Fc. Inkubować 10-15 minut na lodzie, chronić przed światłem.</li>
	<li>Przygotować pierwszorzędową mieszaninę przeciwciał w PBS 1% BSA, 0,1% azydku lub PBS 1% BSA, 0,1% azydku, 0,25% saponiny, do przenikania komórek do barwienia wewnątrzkomórkowego.</li>
	<li>Dodać 100 μl mieszanki przeciwciał pierwszorzędowych (2x) i inkubować przez 30 minut na lodzie, chroniąc przed światłem. 
	UWAGA: Wszystkie przeciwciała powinny być miareczkowane przed przeprowadzeniem eksperymentu, aby zapewnić optymalne wyniki.</li>
	<li>Przemyć komórki 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut (300 x g, 4 °C). Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Dodać 100 μl przeciwciała drugorzędowego, jeśli przeciwciała pierwszorzędowe nie są bezpośrednio sprzężone z fluoroforem, i inkubować przez 30 minut na lodzie, chroniąc przed światłem.</li>
	<li>Przemyć komórki 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C). Powtórz ten krok trzy razy.</li>
	<li>Utrwalić komórki 100 μl 1% PFA przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. 
	UWAGA: Uwaga: PFA jest toksyczny. Stosować w dygestorium i nosić środki ochrony osobistej.</li>
	<li>Przemyć komórki 2 ml PBS i odwirować przez 5 minut w temperaturze 300 x g w temperaturze 4 °C. Powtórzyć ten krok trzy razy.</li>
	<li>Zawiesić osad komórkowy za pomocą 200 μl PBS i przystąpić do akwizycji i analizy cytometrii przepływowej. Postępuj zgodnie ze strategią bramkowania w Rysunek 3.</li>
</ol>

<ol><li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Ginhoux, F., Lim, S., Hoeffel, G., Low, D., Huber, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Origin+and+differentiation+of+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Origin and differentiation of microglia.</a> Front Cell Neurosci. 7, 45(2013).</li>
<li>Ginhoux, F., Jung, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monocytes+and+macrophages%3A+developmental+pathways+and+tissue+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Monocytes and macrophages: developmental pathways and tissue homeostasis.</a> Nat Rev Immunol. 14 (6), 392-404 (2014).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+Myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>London, A., Cohen, M., Schwartz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+and+monocyte-derived+macrophages%3A+functionally+distinct+populations+that+act+in+concert+in+CNS+plasticity+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia and monocyte-derived macrophages: functionally distinct populations that act in concert in CNS plasticity and repair.</a> Front Cell Neurosci. 7, 34(2013).</li>
<li>Miron, V. E., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophages+and+CNS+remyelination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurochem%22%5BJournal%5D)">Macrophages and CNS remyelination.</a> J Neurochem. 130 (2), 165-171 (2014).</li>
<li>Mildner, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+non-redundant+roles+of+microglia+and+myeloid+subsets+in+mouse+models+of+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Distinct and non-redundant roles of microglia and myeloid subsets in mouse models of Alzheimer's disease.</a> J Neurosci. 31 (31), 11159-11171 (2011).</li>
<li>Boillee, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Onset+and+progression+in+inherited+ALS+determined+by+motor+neurons+and+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Onset and progression in inherited ALS determined by motor neurons and microglia.</a> Science. 312 (5778), 1389-1392 (2006).</li>
<li>Yamasaki, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+roles+of+microglia+and+monocytes+in+the+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Differential roles of microglia and monocytes in the inflamed central nervous system.</a> J Exp Med. 211 (8), 1533-1549 (2014).</li>
<li>Wu, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+microglial+activation+is+neuroprotective+in+the+1-methyl-4-phenyl-1%2C2%2C3%2C6-tetrahydropyridine+mouse+model+of+Parkinson+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Blockade of microglial activation is neuroprotective in the 1-methyl-4-phenyl-1,2,3,6-tetrahydropyridine mouse model of Parkinson disease.</a> J Neurosci. 22 (5), 1763-1771 (2002).</li>
<li>Cartier, N., Lewis, C. A., Zhang, R., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25107477">The role of microglia in human disease: therapeutic tool or target?</a> Acta Neuropathol. 128 (3), 363-380 (2014).</li>
<li>Ajami, B., Bennett, J. L., Krieger, C., McNagny, K. M., Rossi, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infiltrating+monocytes+trigger+EAE+progression%2C+but+do+not+contribute+to+the+resident+microglia+pool%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Infiltrating monocytes trigger EAE progression, but do not contribute to the resident microglia pool.</a> Nat Neurosci. 14 (9), 1142-1149 (2011).</li>
<li>Funk, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+peripheral+hematopoietic+stem+cells+and+monocytes+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mov+Disord%22%5BJournal%5D)">Characterization of peripheral hematopoietic stem cells and monocytes in Parkinson's disease.</a> Mov Disord. 28 (3), 392-395 (2013).</li>
<li>Butovsky, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+inflammatory+monocytes+with+a+unique+microRNA+gene+signature+ameliorates+murine+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Modulating inflammatory monocytes with a unique microRNA gene signature ameliorates murine ALS.</a> J Clin Invest. 122 (9), 3063-3087 (2012).</li>
<li>Lewis, C. A., Solomon, J. N., Rossi, F. M., Krieger, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+cells+in+the+central+nervous+system+of+a+mouse+model+of+amyotrophic+lateral+sclerosis+are+associated+with+blood+vessels+and+express+CX%283%29CR1%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived cells in the central nervous system of a mouse model of amyotrophic lateral sclerosis are associated with blood vessels and express CX(3)CR1.</a> Glia. 57 (13), 1410-1419 (2009).</li>
<li>Sedgwick, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+direct+characterization+of+resident+microglial+cells+from+the+normal+and+inflamed+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation and direct characterization of resident microglial cells from the normal and inflamed central nervous system.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 88 (16), 7438-7442 (1991).</li>
<li>Ford, A. L., Goodsall, A. L., Hickey, W. F., Sedgwick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+adult+ramified+microglia+separated+from+other+central+nervous+system+macrophages+by+flow+cytometric+sorting.+Phenotypic+differences+defined+and+direct+ex+vivo+antigen+presentation+to+myelin+basic+protein-reactive+CD4%2B+T+cells+compared%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Normal adult ramified microglia separated from other central nervous system macrophages by flow cytometric sorting. Phenotypic differences defined and direct ex vivo antigen presentation to myelin basic protein-reactive CD4+ T cells compared.</a> J Immunol. 154 (9), 4309-4321 (1995).</li>
<li>Martin, E., Boucher, C., Fontaine, B., Delarasse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+inflammatory+phenotypes+of+microglia+and+monocyte-derived+macrophages+in+Alzheimer%27s+disease+models%3A+effects+of+aging+and+amyloid+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Aging+Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct inflammatory phenotypes of microglia and monocyte-derived macrophages in Alzheimer's disease models: effects of aging and amyloid pathology.</a> Aging Cell. , (2016).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Jin, L. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dysregulation+of+glutamine+transporter+SNAT1+in+Rett+syndrome+microglia%3A+a+mechanism+for+mitochondrial+dysfunction+and+neurotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Dysregulation of glutamine transporter SNAT1 in Rett syndrome microglia: a mechanism for mitochondrial dysfunction and neurotoxicity.</a> J Neurosci. 35 (6), 2516-2529 (2015).</li>
<li>Bedi, S. S., Smith, P., Hetz, R. A., Xue, H., Cox, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+enrichment+and+flow+cytometric+characterization+of+mouse+microglia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic enrichment and flow cytometric characterization of mouse microglia.</a> J Neurosci Methods. 219 (1), 176-182 (2013).</li>
<li>Nikodemova, M., Watters, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+isolation+of+live+microglia+with+preserved+phenotypes+from+adult+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Efficient isolation of live microglia with preserved phenotypes from adult mouse brain.</a> J Neuroinflammation. 9, 147(2012).</li>
<li>Mizutani, M., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22079990">The fractalkine receptor but not CCR2 is present on microglia from embryonic development throughout adulthood.</a> J Immunol. 188 (1), 29-36 (2012).</li>
<li>Lecoeur, H., Ledru, E., Gougeon, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cytofluorometric+method+for+the+simultaneous+detection+of+both+intracellular+and+surface+antigens+of+apoptotic+peripheral+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">A cytofluorometric method for the simultaneous detection of both intracellular and surface antigens of apoptotic peripheral lymphocytes.</a> J Immunol Methods. 217 (1-2), 11-26 (1998).</li>
<li>Richter, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glioma-associated+microglia+and+macrophages%2Fmonocytes+display+distinct+electrophysiological+properties+and+do+not+communicate+via+gap+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Glioma-associated microglia and macrophages/monocytes display distinct electrophysiological properties and do not communicate via gap junctions.</a> Neurosci Lett. 583, 130-135 (2014).</li>
<li>Mahad, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulating+CCR2+and+CCL2+at+the+blood-brain+barrier%3A+relevance+for+multiple+sclerosis+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Modulating CCR2 and CCL2 at the blood-brain barrier: relevance for multiple sclerosis pathogenesis.</a> Brain. 129 (Pt 1), 212-223 (2006).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia

Wykazano, że mikroglej i MDM mają różne funkcje i fenotypy w OUN, a zatem identyfikacja i analiza tych subpopulacji makrofagów są niezbędne do lepszego zrozumienia chorób neurologicznych 9,18,25. Analiza cytometrii przepływowej przy użyciu dwóch markerów (CD11b i CD45) pozwala na rozróżnienie każdej subpopulacji (ryc. 3C). Strategia ta została wcześniej zwalidowana przy użyciu innych specyficznych m...

Mikroglej to makrofagi ośrodkowego układu nerwowego (OUN) rezydujące w tkance miąższowej. Odgrywają dwie kluczowe role funkcjonalne: obronę immunologiczną i utrzymanie homeostazy OUN. W przeciwieństwie do MDM, które są stale odnawiane z hematopoetycznych komórek macierzystych w szpiku kostnym, komórki mikrogleju różnicują się od prymitywnych hematopoetycznych komórek progenitorowych pochodzących z woreczka żółtkowego (YS), który skolonizował mózg podczas rozwoju embrionalnego1,2,3. U gryzoni czynnik transkrypcyjny Myb odgrywa kluczową rolę w rozwoju wszystkich monocytów i makrofagów pochodzących ze szpiku kostnego, ale w przypadku mikrogleju pochodzącego z YS czynnik ten jest zbędny, a różnicowanie pozostaje zależne od czynnika transkrypcyjnego PU.14.
W zdrowym OUN, mikroglej to dynamiczne komórki, które nieustannie próbkują swoje środowisko, skanując i badając w poszukiwaniu atakujących patogenów lub uszkodzeń tkanek5. Wykrycie takich sygnałów inicjuje drogę do rozwiązania urazu. Mikroglej szybko przechodzi z morfologii rozgałęzionej na ameboidalną, po której następuje fagocytoza i uwalnianie różnych mediatorów, takich jak cytokiny pro- lub przeciwzapalne. Tak więc, w zależności od swojego mikrośrodowiska, aktywowany mikroglej może uzyskiwać spektrum różnych stanów primingu6.
Mikroglej ma ogromny wpływ na rozwój i postęp wielu zaburzeń neurologicznych. W modelach gryzoni choroby Alzheimera (AD)7, stwardnienia zanikowego bocznego (ALS)8, stwardnienia rozsianego (MS)9 lub choroby Parkinsona (PD)10, wykazano, że mikroglej odgrywa podwójną rolę, albo wywołując szkodliwą neurotoksyczność, albo działając w sposób neuroprotekcyjny, który zależy od konkretnej choroby, stadium choroby i tego, czy na chorobę miał wpływ układowy układ odpornościowy compartment7,8,9,10,11. Większość zmian w OUN obserwowanych w wyżej wymienionych chorobach zawiera niejednorodną populację komórek szpikowych, w tym nie tylko mikroglej miąższowy, ale także makrofagi okołonaczyniowe i oponowo-rdzeniowe, a także MDM naciekający OUN. Te typy komórek mogą w różny sposób przyczyniać się do mechanizmów patofizjologicznych związanych z uszkodzeniem i naprawą7,12,13,14,15. Obecnym wyzwaniem dla badaczy, którzy badają te modele chorób, jest ustalenie, czy obwodowe monocyty i makrofagi infiltrują OUN, a jeśli tak, to odróżnienie rezydującego mikrogleju od tych komórek. Rzeczywiście, komórki mikrogleju są bardzo plastyczne; Po ich aktywacji mikroglej ponownie wyraża markery, które zwykle są wyrażane przez obwodowe monocyty i makrofagi. Problem polega zatem na zidentyfikowaniu markerów, które mogą odróżnić rezydujący mikroglej od naciekających monocytów i makrofagów.
Dyskryminacja tych populacji na wycinkach mózgu za pomocą aplikacji immunohistologicznych jest ograniczona ze względu na brak specyficznych przeciwciał. Jednak analiza cytometrii przepływowej jest skuteczną techniką oceny ekspresji kilku markerów i rozróżniania populacji komórek (na przykład limfocytów, makrofagów/MDM CD11b+CD45 high i microglea CD11b+CD45med), a także subpopulacji komórek16,17,18. Protokół ten opisuje procedury izolowania komórek jednojądrzastych od mysiego OUN w modelach chorób neurologicznych przy użyciu zoptymalizowanej, enzymatycznej dysocjacji tkanek i wirowania w gradiacji gęstości; a także metodę różnicowania populacji mikrogleju i MDM w OUN za pomocą cytometrii przepływowej.
Innym podejściem jest wyeliminowanie mieliny i oczyszczenie komórek za pomocą kulek magnetycznych sprzężonych z określonymi przeciwciałami19,20,21. Usuwanie mieliny za pomocą kulek magnetycznych antymielinowych jest droższe i wpływa na żywotność i wydajność izolowanych komórek22. Ten krok i następująca po nim immunomagnetyczna separacja mikrogleju ograniczają dalsze badania określonych populacji komórek odpornościowych21,22.
Te procedury zapewniają łatwy sposób na badanie subpopulacji makrofagów w rozwoju choroby oraz na określenie efektów leków lub modyfikacji genów na fenotypy makrofagów i stany aktywacji.

<table><tbody><tr><td>5-miesięczne myszy</td><td>Janvier</td><td>C57BL/6J</td><td></td></tr><tr><td>Liberase TL Research Grade</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>5401020001</td><td>Enzym trawienny</td></tr><tr><td>Deoksyrybonukleaza I z trzustki bydlęcej</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>DN25</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0891-01</td><td>Gradient gęstości średni</td></tr><tr><td>Rozmiar sitka komórkowego 70 i mikro; m Nylon</td><td>Corning</td><td>731751</td><td></td></tr><tr><td>Venofix 25 G</td><td>BRAUN</td><td>4056370</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka tłokowa 10 ml</td><td>Terumo</td><td>SS+10ES1</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Pasteura 230 mm</td><td>Dustcher</td><td>20420</td><td></td></tr><tr><td>Probówka 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>0030 123.328</td><td></td></tr><tr><td>15 ml tubka</td><td>TPP</td><td>91015</td><td></td></tr><tr><td>50 ml</td><td>tubka TPP</td><td>91050</td><td></td></tr><tr><td>5 ml polistyrenowa rurka okrągłodenna</td><td>BD Falcon</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (1x) bez Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14190-094</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (10x) bez Ca2+/Mg2+</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>14200-067</td><td></td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E4884</td><td></td></tr><tr><td>Roztwór albuminy surowicy bydlęcej 30%</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A7284</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyd 32% roztwór</td><td>Mikroskopia elektronowa Sciences</td><td>15714-S</td><td>Uwaga -Toksyczna</td></tr><tr><td>saponina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2002</td><td></td></tr><tr><td>Azydek sodu</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47036</td><td></td></tr><tr><td>PerCPCy5.5 Szczur anty-mysz CD11b (klon M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>45-0112</td><td></td></tr><tr><td>Kontrola izotypu szczura IgG2b K PerCP-cyjanina5.5</td><td>eBioscience</td><td>45-4031</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Szczur anty-mysz CD45 (klon 30-F11)</td><td>BD Biosciences</td><td>563890</td><td></td></tr><tr><td>BV421 Szczur IgG2b, &kappa; Kontrola izotypu RUO</td><td>BD Biosciences</td><td>562603</td> Królik przeciw myszom TMEM119 <td></td></tr><tr><td>(klon28 - 3)</td><td>Abcam</td><td>ab209064</td><td></td></tr><tr><td>AlexaFluor 647 Osioł anty-królik IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A31573</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse CD16/CD32 Oczyszczony</td><td>eBioscience</td><td>14-0161</td><td>Mysz Fc Block</td></tr><tr><td>Naprawialne zestawy do barwienia martwych komórek</td><td>Invitrogen</td><td>L34969</td><td></td></tr><tr><td>Mysie przeciwciało sprzężone z APC CCR2</td><td>R& D</td><td>FAB5538A</td><td></td></tr><tr><td>Szczur IgG2B Kontrola izotypu sprzężona z APC</td><td>R& D</td><td>IC013A</td><td></td></tr><tr><td>Mysz CX3CR1 Przeciwciało sprzężone z PE</td><td>R& D</td><td>FAB5825P</td><td></td></tr><tr><td>Kozie przeciwciało sprzężone IgG PE</td><td>R& D</td><td>IC108P</td><td></td></tr><tr><td>Wirówka</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Analizator komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>BD FACSVERSE</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do analizy danych</td><td>FlowJo LLC</td><td>FlowJo</td><td></td></tr><tr><td>Drobne nożyczki</td><td>FST</td><td>14090-11</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze o standardowym wzorze</td><td>FST</td><td>11000-13</td><td></td></tr><tr><td>Nożyczki Mayo</td><td>FST</td><td>14010-15</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze Dumont #5</td><td>FST</td><td>11251-20</td><td></td></tr></tbody></table>

analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Analysis of Microglia and Monocyte-derived Macrophages from the Central Nervous System by Flow Cytometry

Liczne badania wykazały rolę komórek odpornościowych, w szczególności makrofagów, w patologiach ośrodkowego układu nerwowego (OUN). W OUN istnieją dwie główne populacje makrofagów: (i) mikroglej, który jest makrofagami rezydującymi w OUN i pochodzi z komórek progenitorowych woreczka żółtkowego podczas embriogenezy, oraz (ii) makrofagi pochodzące z monocytów (MDM), które mogą infiltrować OUN podczas choroby i pochodzą z komórek progenitorowych szpiku kostnego. Role każdej subpopulacji makrofagów różnią się w zależności od badanej patologii. Ponadto nie ma zgody co do markerów histologicznych lub kryteriów wyróżniających stosowanych dla tych subpopulacji makrofagów. Jednak analiza profili ekspresji markerów CD11b i CD45 za pomocą cytometrii przepływowej pozwala nam odróżnić mikroglej (CD11b+CD45med) od MDM (haj CD11b+CD45). W tym protokole pokazujemy, że wirowanie w gradionym gradiencie gęstości i analiza cytometrii przepływowej mogą być wykorzystane do scharakteryzowania tych subpopulacji makrofagów OUN oraz do zbadania kilku markerów zainteresowania wyrażanych przez te komórki, jak niedawno opublikowaliśmy. W związku z tym technika ta może pogłębić naszą wiedzę na temat roli makrofagów w mysich modelach chorób neurologicznych, a także może być wykorzystana do oceny wpływu leków na te komórki.

Po wirowaniu w gradiencie gęstości i barwieniu przeciwciałami komórki poddano analizie na cytometrze przepływowym, stosując następującą strategię bramkowania morfologicznego. Pierwszą bramkę zdefiniowano na wykresie kropkowym Forward-Scattered-Area (FSC-A) versus Forward-Scattered-Height (FSC-H), aby odróżnić pojedyncze komórki od dubletów (Rycina 3A). Następnie pojedyncze komórki wybrano na wykresach kropkowych FSC-A versus Side-Scattered-A...

Ten protokół zapewnia analizę subpopulacji makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym dorosłej myszy za pomocą cytometrii przepływowej i jest pomocny w badaniu wielu markerów wyrażanych przez te komórki.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Numerous studies have demonstrated the role of immune cells, in particular macrophages, in central nervous system (CNS) pathologies. There are two main ...

Ogólnym celem niniejszego eksperymentu jest ocena różnych markerów eksprymowanych przez subpopulacje makrofagów w obrębie ośrodkowego układu nerwowego (OUN). Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny neuroimmunologii, takie jak próby rozróżnienia makrofagów w OUN oraz określenie fenotypów makrofagów w OUN. Głównymi zaletami tej techniki są izolacja licznej populacji wysoko oczyszczonych subpopulacji makrofagów, a także kwantyfikacja markerów komórkowych subpopulacji makrofagów.Zacznij od użycia precyzyjnych nożyczek do przecięcia skóry brzusznej tuż poniżej wyrostka mieczowatego, aby odsłonić jamę klatki piersiowej. Wykonaj nacięcie w przeponie i przetnij boczne części klatki piersiowej w kierunku od ogonowym do głowowego, aby odsłonić serce. Po zidentyfikowaniu lewej komory i prawego przedsionka, wprowadź kaniulę motylkową z igłą 25G do lewej komory.Wykonaj nacięcie w prawym przedsionku i zacznij przetłaczać 20 ml PBS przez cewnik z prędkością 10 ml na minutę, gdy tylko zacznie płynąć krew. Prawidłowe przetłaczanie będzie widoczne poprzez bladnięcie płuc i wątroby w miarę wypierania krwi. Następnie, używając precyzyjnych nożyczek, dokonaj sekcji

analysis-microglia-monocyte-derived-macrophages-from-central-nervous

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia i infekcje

Mikroglią są rezydentne makrofagi, które stanowią pierwszą linię obrony i nadzoru immunologicznego ośrodkowego układu nerwowego. MikroRNA to cząsteczki regulacyjne, które odgrywają istotną rolę w wielu procesach fizjologicznych, w tym w aktywacji i różnicowaniu makrofagów. W niniejszym artykule opisujemy metodę pomiaru mikroRNA w mikroglii.

Wykrywanie mikroRNA w mikrogleju za pomocą PCR w czasie rzeczywistym w prawidłowym OUN oraz podczas neurostanu zapalnego

Ten film demonstruje cytometrię przepływową do pomiaru wychwytu mikrogleju przez fluorescencyjne biocząstki po dostrzodowisku do ciała szklistego w oku myszy. Cytometria przepływowa wykrywa żywe komórki wykazujące ekspresję CD11b i odróżnia fagocytarne komórki mikrogleju wykazujące zieloną fluorescencję od innych komórek szpikowych, w tym monocytów eksprymujących Ly6C i neutrofili wykazujących ekspresję Ly6G.

Pomiar wychwytu mikrogleju przez cząstki fluorescencyjne dostarczane do ciała szklistkowego za pomocą cytometrii przepływowej

Źródło: Hidmark, A. S., et al. {{}}Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy za pomocą cytometrii przepływowej. J. Vis. Exp.{{TAG_ 27}} (2017).  Ten film demonstruje zastosowanie cytometrii przepływowej do analizy komórek odpornościowych w nerwach kulszowych myszy i zwojach korzenia grzbietowego (DRG). Proces ten polega na znakowaniu komórek odpornościowych przeciwciałami znakowanymi fluoroforem i biotyną, stabilizacji i...

Analiza komórek odpornościowych w tkankach nerwowych myszy za pomocą cytometrii przepływowej

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Analiza ilościowa zawartości komórek w mysim nerwie kulszowym jest trudna ze względu na niedostatek tkanki. Protokół ten opisuje metodę trawienia i przygotowania tkanek, która zapewnia wystarczającą ilość komórek do analizy cytometrii przepływowej populacji komórek odpornościowych z nerwów poszczególnych myszy.

Analiza komórek odpornościowych w pojedynczych nerwach kulszowych i zwoju korzenia grzbietowego od pojedynczej myszy przy użyciu cytometrii przepływowej

Przedstawiono protokół izolacji pierwotnego mikrogleju z mysich mózgów. Technika ta pomaga w pogłębieniu obecnego zrozumienia schorzeń neurologicznych. Wirowanie w gradiencie gęstości i separacja magnetyczna są połączone w celu uzyskania wystarczającej wydajności próbki o wysokiej czystości. Ponadto przedstawiamy etapy charakterystyki mikrogleju.

Charakterystyka i izolacja pierwotnego mikrogleju myszy za pomocą wirowania w gradifikacji gęstości

Tutaj prezentujemy dwa protokoły do ilościowego oznaczania pochłaniania mikrogleju przez synapsy vGLUT1-dodatnie oraz surowych synaptosomów pHRodo znakowanych na czerwono za pomocą cytometrii przepływowej.

Kwantyfikacja pochłaniania mikrogleju przez materiał synaptyczny za pomocą cytometrii przepływowej

Identyfikacja mikrogleju (MG) i obwodowych naciekających makrofagów (Mø) w uszkodzonym rdzeniu kręgowym jest trudna. W tym protokole zastosowano cytometrię przepływową (FCM) do identyfikacji odpowiednio MG podobnego do M1, MG podobnego do M2, M1-podobnego Mø i M2-podobnego Mø. Technologia ta może być również stosowana w innych chorobach ośrodkowego układu nerwowego, aby zrozumieć rolę MG i Mø.

Identyfikacja mikrogleju i makrofagów naciekających obwodowo w uszkodzonym rdzeniu kręgowym za pomocą cytometrii przepływowej

W tym miejscu przedstawiamy protokół oceny funkcji komórek odpornościowych po udarze niedokrwiennym za pomocą analizy cytometrii przepływowej w modelu mini-udaru. Metoda ta umożliwia szczegółowe badanie interakcji neuroimmunologicznych i może być zaadaptowana do badania innych chorób neurodegeneracyjnych, pogłębiając naszą wiedzę na temat odpowiedzi immunologicznych w patologii udaru.

Izolacja i cytometryczna ocena interakcji neuroimmunologicznych w mysim modelu mini-udaru

Protokół ten łączy cytometrię przepływową i sekwencjonowanie RNA pojedynczej komórki w celu wyizolowania i scharakteryzowania stanów komórek mikrogleju w móżdżku wczesnych postnatalnych mózgów myszy. Wykorzystuje dysocjację enzymatyczną, wirowanie Percoll i barwienie immunologiczne, aby ujawnić heterogeniczność mikrogleju i poprawić zrozumienie ich roli w rozwoju i chorobie móżdżku.

Cytometria przepływowa i analiza pojedynczych komórek w celu scharakteryzowania aktywacji mikrogleju we wczesnym pourodzeniowym rozwoju mózgu myszy

Poznaj analizę makrofagów z mikrogleju i monocytów w ośrodkowym układzie nerwowym myszy za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia identyfikację markerów komórkowych w badaniach neuroimmunologicznych.

Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów