Analiza makrofagów pochodzących z mikrogleju i monocytów z ośrodkowego układu nerwowego za pomocą cytometrii przepływowej

Ogólnym celem tego eksperymentu jest ocena różnych markerów wyrażanych przez subpopulacje makrofagów w ośrodkowym układzie nerwowym lub OUN. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie neuroimmunologii, takie jak makrofagi duperry'ego, gdy próbujemy zrobić zawroty głowy u OUN i jakie są fenotypy OUN w makrofagach. Głównymi zaletami tej techniki jest izolacja dużej liczby wysoce oczyszczonych subpopulacji makrofagów, a także koncentracja markera komórkowego subpopulacji makrofagów.

Zacznij od użycia cienkich nożyczek, aby przeciąć skórę brzuszną tuż pod wyrostkiem mieczykowatym, aby odsłonić jamę piersiową. Wykonaj nacięcie w przeponie i przetnij boczne aspekty klatki piersiowej w kierunku ogonowym do rostralnego, aby odsłonić serce. Po zidentyfikowaniu lewej komory i prawego przedsionka wprowadzić cewnik motylkowy z igłą o średnicy 25 G do lewej komory.

Wykonaj nacięcie na prawym przedsionku i zacznij wylewać 20 mililitrów PBS przez cewnik z szybkością dziesięciu mililitrów na minutę, gdy tylko krew zacznie płynąć. Udana obfitość będzie wskazywana przez blanszowanie płuc i wątroby w miarę przemieszczania się krwi. Następnie użyj cienkich nożyczek, aby wypreparować kręgosłup.

Wycięcie mięśni ściany brzucha po brzusznej stronie kręgosłupa i przecięcie kręgosłupa u podstawy ogona w celu usunięcia kręgosłupa podczas jego pobierania. Włóż dziesięciomililitrową strzykawkę PBS wyposażoną w zmodyfikowaną końcówkę pipety o pojemności 200 mikrolitrów do odcinka lędźwiowego kręgosłupa. Następnie przepłucz rdzeń kręgowy po stronie szyjnej

Usuń skórę nad czaszką i włóż jedną końcówkę nożyczek u podstawy czaszki. Przeciąć czaszkę po szwie strzałkowym. Następnie włóż małe kleszcze do nacięcia i delikatnie usuń górną część czaszki.

Wypreparuj mózg z głowy myszy i usuń opuszkę węchową i móżdżek. Następnie umieść mózg i rdzeń kręgowy w jednopunktowej pięciomililitrowej probówce zawierającej jeden punkt, jeden, dwa osiem mililitrów koktajlu trawiennego. Aby oddzielić komórki, użyj małych nożyczek, aby drobno pociąć mózg i rdzeń kręgowy na jeden do dwóch milimetrowych kawałków sześciennych i umieść je w temperaturze 37 stopni Celsjusza i pięciu procent dwutlenku węgla na 30 minut.

Pod koniec inkubacji należy przerwać trawienie za pomocą 20 mikrolitrów pięciomolowego EDTA w punkcie zerowym, a następnie delikatnie rozcierać za pomocą pięciomililitrowej pipety. Przefiltruj powstałą zawiesinę komórek przez sitko o siatce 70 mikronów do stożkowej rurki o pojemności 50 mililitrów, używając tłoka dziesięciomililitrowej strzykawki, aby delikatnie macerować pozostałą tkankę mózgu lub rdzenia kręgowego. Opłucz sitko 20 mililitrami pięcioprocentowego FBS i PBS.

I zbierz przefiltrowane komórki przez odwirowanie. Następnie ostrożnie zassać supernatant, nie naruszając osadu. W celu oddzielenia komórek w gradinie gęstości zawieszamy osad za pomocą czterech mililitrów 30-procentowego podłoża gradientowego o gęstości i przenosimy komórki do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów.

Delikatnie umieść cztery mililitry pożywki o gradiencie gęstości 37 procent, a następnie cztery mililitry pożywki o gradiencie gęstości 70 procent pod pożywką o gradinie gęstości 37 procent. Przenieś probówkę do wirówki stołowej, aby oddzielić komórki. Komórki mikrogleju i makrofagów znajdą się na styku warstw gradientu gęstości 70 i 37 procent.

Rurka będzie wyglądała na rozwarstwioną. Po ostrożnym usunięciu górnej warstwy mieliny, przenieś trzy do czterech mililitrów warstwy interfazowej makrofagów mikrogleju do nowej 15-mililitrowej probówki. Następnie umyj komórki odpornościowe trzema wirówkami w 15 mililitrach PBS, ponownie zawieszając osad w jednym mililitrze PBS po ostatnim myciu.

Aby ocenić ekspresję markera subpopulacji makrofagów, przenieś komórki do pięciomililitrowej probówki do analizy cytometrii przepływowej, a następnie dodaj jeden mikrolitr możliwego do naprawienia odczynnika do barwienia martwych komórek. Po 30 minutach na lodzie, chronionym przed światłem, umyj próbki w dwóch mililitrach PBS i ponownie zawieś osad w 400 mikrolitrach buforu faksowego na probówkę do analizy eksperymentalnej. Podziel komórki na odpowiednią liczbę pięciomililitrowych probówek do analizy cytometrii przepływowej.

Następnie zablokuj niespecyficzne wiązanie receptora FC za pomocą jednego mikrograma koktajlu przeciwciał blokujących CD 16 CD 32 na 100 mikrolitrów komórek przez 10 do 15 minut inkubacji na lodzie, chroniony przed światłem. Następnie oznacz komórki 100 mikrolitrami odpowiednich przeciwciał pierwszorzędowych, na 30-minutową inkubację na lodzie, chronionym przed światłem. Pod koniec inkubacji przemyj komórki w dwóch mililitrach PBS cztery razy.

Następnie dodać 100 mikrolitrów odpowiednich przeciwciał drugorzędowych przez 30 minut na lodzie, chronionym przed światłem, a następnie cztery płukania w PBS, jak właśnie pokazano. Po ostatnim praniu delikatnie ponownie zawiesić granulki w 100 mikrolitrach jednoprocentowego paraformaldehydu na 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie umyj komórki cztery razy w PBS.

Ponownie zawiesić końcowe granulki w 200 mikrolitrach świeżego PBS i przeanalizować komórki za pomocą cytometrii przepływowej. Mikroglej i makrofagi pochodzące z rdzenia kręgowego i monocytów są identyfikowane na podstawie ich ekspresji CD 11 B i CD 45. Ekspresja CX3CR1 i Tmem119 przez średnie komórki mikrogleju CD 11 B dodatnie CD 45 pozwala na dalsze odróżnienie tej populacji komórek od makrofagów CD 11 C dodatnich CD 45 pochodzących z wysokich monocytów, które nie wyrażają żadnego z tych markerów, ale wyrażają CCR2.

Po rozdzieleniu w gradiencie gęstości od 85 do 95 procent komórek jest nadal zdolnych do życia. W przypadku braku izolacji gradientu gęstości, subpopulacje makrofagów nie są możliwe do zidentyfikowania na dwustronnym wykresie rozproszenia do przodu, ze względu na obecność komórek innych niż makrofagi i szczątków mieliny. Ponieważ epitop rozpoznawany przez przeciwciało anty-Tmem119 jest wewnątrzkomórkowy, do znakowania tego ważnego markera komórek mikrogleju wymagana jest przepuszczalność.

Należy jednak pamiętać, że przenikanie indukuje kurczenie się komórek, powodując jednak, że subpopulacje makrofagów wydają się mniejsze w analizie rozproszenia do przodu i boku. Po opanowaniu tej techniki można ją wykonać w ciągu pięciu godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Chociaż próbowałem wykonać tę procedurę, ważne jest, aby pamiętać, aby bardzo ostrożnie ustawić gradiację gęstości.

Zgodnie z tą procedurą można wykonać inne metody, takie jak ilościowy rt-PCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące szlaków sygnałowych subpopulacji makrofagów. Po jej opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom z dziedziny neurobiologii do zbadania aktywacji subpopulacji makrofagów w mysim modelu choroby neurologicznej. Po obejrzeniu tego filmu należy przeprowadzić testy lub postępować zgodnie z tą tradycją jako subpopulacje makrofagów za pomocą cytometrii przepływowej.

Nie zapominaj, że praca z paraformaldehydem może być bardzo niebezpieczna i że podczas wykonywania tej procedury należy zawsze zachować środki ostrożności, takie jak używanie kaptura.