Name: Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-05T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 1 s
Description: Naucz się izolować pierwotne mysie komórki zwojowe siatkówki za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów degeneracji siatkówki i utraty wzroku.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Panu Timowi Higginsowi, Starszemu Ilustratorowi z Wydziału Mikrobiologii, Immunologii i Biochemii, za techniczną pomoc wideo; Dr. Matthew W. Wilsonowi za dyskusje oraz członkom laboratoriów Jablonskiego i Moralesa-Tirado za ich pomocne komentarze. Prace te były wspierane przez Alcon Research Institute Young Investigator Award (VMM-T), University of Tennessee Research Foundation (VMM-T), National Eye Institute EY021200 (MMJ), Gerwin Fellowship (VMM-T); stypendium Gerwin Pre-doctoral Fellowship (ZKG), Dowództwo Badań Medycznych i Materiałowych Departamentu Obrony Armii (VMM-T) oraz Unrestricted Grant from Research to Prevent Blindness.

<ol><li>Flammer, J., Orgul, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood-flow+abnormalities+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Retin+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood-flow abnormalities in glaucoma.</a> Prog Retin Eye Res. 17 (2), 267-289 (1998).</li>
<li>Bathija, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optic+nerve+blood+flow+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Optom%22%5BJournal%5D)">Optic nerve blood flow in glaucoma.</a> Clin Exp Optom. 83 (3), 180-184 (2000).</li>
<li>Osborne, N. N., Melena, J., Chidlow, G., Wood, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+hypothesis+to+explain+ganglion+cell+death+caused+by+vascular+insults+at+the+optic+nerve+head%3A+possible+implication+for+the+treatment+of+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Ophthalmol%22%5BJournal%5D)">A hypothesis to explain ganglion cell death caused by vascular insults at the optic nerve head: possible implication for the treatment of glaucoma.</a> Br J Ophthalmol. 85 (10), 1252-1259 (2001).</li>
<li>Morgan, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulation+and+axonal+transport+in+the+optic+nerve%5BTitle%5D)+AND+%22Eye+%28Lond%29%22%5BJournal%5D)">Circulation and axonal transport in the optic nerve.</a> Eye (Lond). 18 (11), 1089-1095 (2004).</li>
<li>Tian, N., Hwang, T. N., Copenhagen, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+excitatory+and+inhibitory+spontaneous+synaptic+activity+in+mouse+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Analysis of excitatory and inhibitory spontaneous synaptic activity in mouse retinal ganglion cells.</a> J Neurophysiol. 80 (3), 1327-1340 (1998).</li>
<li>Schmidt, K. G., Bergert, H., Funk, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurodegenerative+diseases+of+the+retina+and+potential+for+protection+and+recovery%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Neuropharmacol%22%5BJournal%5D)">Neurodegenerative diseases of the retina and potential for protection and recovery.</a> Curr Neuropharmacol. 6 (2), 164-178 (2008).</li>
<li>Dreher, B., Sefton, A. J., Ni, S. Y., Nisbett, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+morphology%2C+number%2C+distribution+and+central+projections+of+Class+I+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+hooded+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Behav+Evol%22%5BJournal%5D)">The morphology, number, distribution and central projections of Class I retinal ganglion cells in albino and hooded rats.</a> Brain Behav Evol. 26 (1), 10-48 (1985).</li>
<li>Williams, R. W., Strom, R. C., Rice, D. S., Goldowitz, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+environmental+control+of+variation+in+retinal+ganglion+cell+number+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Genetic and environmental control of variation in retinal ganglion cell number in mice.</a> J Neurosci. 16 (22), 7193-7205 (1996).</li>
<li>Jeon, C. J., Strettoi, E., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+major+cell+populations+of+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The major cell populations of the mouse retina.</a> J Neurosci. 18 (21), 8936-8946 (1998).</li>
<li>Surgucheva, I., Weisman, A. D., Goldberg, J. L., Shnyra, A., Surguchov, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gamma-synuclein+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Gamma-synuclein as a marker of retinal ganglion cells.</a> Mol Vis. 14, 1540-1548 (2008).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brn3a+as+a+marker+of+retinal+ganglion+cells%3A+qualitative+and+quantitative+time+course+studies+in+naive+and+optic+nerve-injured+retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Brn3a as a marker of retinal ganglion cells: qualitative and quantitative time course studies in naive and optic nerve-injured retinas.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (8), 3860-3868 (2009).</li>
<li>Kwong, J. M., Caprioli, J., Piri, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+binding+protein+with+multiple+splicing%3A+a+new+marker+for+retinal+ganglion+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">RNA binding protein with multiple splicing: a new marker for retinal ganglion cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (2), 1052-1058 (2010).</li>
<li>Van Bergen, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recharacterization+of+the+RGC-5+retinal+ganglion+cell+line%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Recharacterization of the RGC-5 retinal ganglion cell line.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 50 (9), 4267-4272 (2009).</li>
<li>Wood, J. P., Chidlow, G., Tran, T., Crowston, J. G., Casson, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+of+differentiation+protocols+for+RGC-5+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">A comparison of differentiation protocols for RGC-5 cells.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 51 (7), 3774-3783 (2010).</li>
<li>Barres, B. A., Silverstein, B. E., Corey, D. P., Chun, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunological%2C+morphological%2C+and+electrophysiological+variation+among+retinal+ganglion+cells+purified+by+panning%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Immunological, morphological, and electrophysiological variation among retinal ganglion cells purified by panning.</a> Neuron. 1 (9), 791-803 (1998).</li>
<li>Hong, S., Iizuka, Y., Kim, C. Y., Seong, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+primary+mouse+retinal+ganglion+cells+using+immunopanning-magnetic+separation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Vis%22%5BJournal%5D)">Isolation of primary mouse retinal ganglion cells using immunopanning-magnetic separation.</a> Mol Vis. 18, 2922-2930 (2012).</li>
<li>Julius, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sensitivity+of+exponentials+and+other+curves+to+their+parameters%5BTitle%5D)+AND+%22Comput+Biomed+Res%22%5BJournal%5D)">The sensitivity of exponentials and other curves to their parameters.</a> Comput Biomed Res. 5 (5), 473-478 (1972).</li>
<li>Reif, A. E., Allen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Akr+Thymic+Antigen+and+Its+Distribution+in+Leukemias+and+Nervous+Tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">The Akr Thymic Antigen and Its Distribution in Leukemias and Nervous Tissues.</a> J Exp Med. 120, 413-433 (1964).</li>
<li>Watanabe, M., Noguchi, T., Tsukada, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional%2C+cellular%2C+and+subcellular+distribution+of+Thy-1+antigen+in+rat+nervous+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Neurochem+Res%22%5BJournal%5D)">Regional, cellular, and subcellular distribution of Thy-1 antigen in rat nervous tissues.</a> Neurochem Res. 6 (5), 507-519 (1981).</li>
<li>Haeryfar, S. M., Hoskin, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1%3A+more+than+a+mouse+pan-T+cell+marker%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thy-1: more than a mouse pan-T cell marker.</a> J Immunol. 173 (6), 3581-3588 (2004).</li>
<li>Sahagun, G., Moore, S. A., Fabry, Z., Schelper, R. L., Hart, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+murine+endothelial+cell+cultures+by+flow+cytometry+using+fluorescein-labeled+griffonia+simplicifolia+agglutinin%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Pathol%22%5BJournal%5D)">Purification of murine endothelial cell cultures by flow cytometry using fluorescein-labeled griffonia simplicifolia agglutinin.</a> Am J Pathol. 134 (6), 1227-1232 (1989).</li>
<li>Shoge, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rat+retinal+ganglion+cells+culture+enriched+with+the+magnetic+cell+sorter%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Rat retinal ganglion cells culture enriched with the magnetic cell sorter.</a> Neurosci Lett. 259 (2), 111-114 (1999).</li>
<li>Chintalapudi, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+Molecular+Profiling+of+Primary+Mouse+Retinal+Ganglion+Cells%3A+Comparison+of+Phenotypes+from+Healthy+and+Glaucomatous+Retinas%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Isolation and Molecular Profiling of Primary Mouse Retinal Ganglion Cells: Comparison of Phenotypes from Healthy and Glaucomatous Retinas.</a> Front Aging Neurosci. 8, 93(2016).</li>
<li>Nagdeve, N. G., Yaddanapudi, S., Pandav, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+different+doses+of+ketamine+on+intraocular+pressure+in+anesthetized+children%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pediatr+Ophthalmol+Strabismus%22%5BJournal%5D)">The effect of different doses of ketamine on intraocular pressure in anesthetized children.</a> J Pediatr Ophthalmol Strabismus. 43 (4), 219-223 (2006).</li>
<li>Ding, C., Wang, P., Tian, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+general+anesthetics+on+IOP+in+elevated+IOP+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Effect of general anesthetics on IOP in elevated IOP mouse model.</a> Exp Eye Res. 92 (6), 512-520 (2011).</li>
<li>Schmittgen, T. D., Livak, K. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analyzing+real-time+PCR+data+by+the+comparative+C%28T%29+method%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analyzing real-time PCR data by the comparative C(T) method.</a> Nat Protoc. 3 (6), 1101-1108 (2008).</li>
<li>Aerts, J., Nys, J., Arckens, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+highly+reproducible+and+straightforward+method+to+perform+in+vivo+ocular+enucleation+in+the+mouse+after+eye+opening%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A highly reproducible and straightforward method to perform in vivo ocular enucleation in the mouse after eye opening.</a> J Vis Exp. (92), e51936(2014).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+AP-2delta+reduces+retinal+ganglion+cell+numbers+and+axonal+projections+to+the+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Brain%22%5BJournal%5D)">Loss of AP-2delta reduces retinal ganglion cell numbers and axonal projections to the superior colliculus.</a> Mol Brain. 9 (1), 62(2016).</li>
<li>Moshiri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Near+complete+loss+of+retinal+ganglion+cells+in+the+math5%2Fbrn3b+double+knockout+elicits+severe+reductions+of+other+cell+types+during+retinal+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Near complete loss of retinal ganglion cells in the math5/brn3b double knockout elicits severe reductions of other cell types during retinal development.</a> Dev Biol. 316 (2), 214-227 (2008).</li>
<li>Danias, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+retinal+ganglion+cell+%28RGC%29+loss+in+aging+DBA%2F2NNia+glaucomatous+mice%3A+comparison+with+RGC+loss+in+aging+C57%2FBL6+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of retinal ganglion cell (RGC) loss in aging DBA/2NNia glaucomatous mice: comparison with RGC loss in aging C57/BL6 mice.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (12), 5151-5162 (2003).</li>
<li>Jakobs, T. C., Ben, Y., Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD15+immunoreactive+amacrine+cells+in+the+mouse+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">CD15 immunoreactive amacrine cells in the mouse retina.</a> J Comp Neurol. 465 (3), 361-371 (2003).</li>
<li>Uusitalo, M., Schlotzer-Schrehardt, U., Kivela, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrastructural+localization+of+the+HNK-1+carbohydrate+epitope+to+glial+and+neuronal+cells+of+the+human+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Invest+Ophthalmol+Vis+Sci%22%5BJournal%5D)">Ultrastructural localization of the HNK-1 carbohydrate epitope to glial and neuronal cells of the human retina.</a> Invest Ophthalmol Vis Sci. 44 (3), 961-964 (2003).</li>
<li>Jackson, C. J., Garbett, P. K., Nissen, B., Schrieber, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binding+of+human+endothelium+to+Ulex+europaeus+I-coated+Dynabeads%3A+application+to+the+isolation+of+microvascular+endothelium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Binding of human endothelium to Ulex europaeus I-coated Dynabeads: application to the isolation of microvascular endothelium.</a> J Cell Sci. 96 ( Pt 2), 257-262 (1990).</li>
<li>Pennartz, S., Perraut, M., Pfrieger, F. Purification of retinal ganglion cells from postnatal rats by magnetic cell sorting. MACSmore. 12 (2), 16-18 (2010).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Displaced+retinal+ganglion+cells+in+albino+and+pigmented+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neuroanat%22%5BJournal%5D)">Displaced retinal ganglion cells in albino and pigmented rats.</a> Front Neuroanat. 8, 99(2014).</li>
<li>Nadal-Nicolas, F. M., Salinas-Navarro, M., Vidal-Sanz, M., Agudo-Barriuso, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+methods+to+trace+retinal+ganglion+cells+with+fluorogold%3A+from+the+intact+optic+nerve+or+by+stereotactic+injection+into+the+optic+tract%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Two methods to trace retinal ganglion cells with fluorogold: from the intact optic nerve or by stereotactic injection into the optic tract.</a> Exp Eye Res. 131, 12-19 (2015).</li>
<li>Barnstable, C. J., Drager, U. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thy-1+antigen%3A+a+ganglion+cell+specific+marker+in+rodent+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Thy-1 antigen: a ganglion cell specific marker in rodent retina.</a> Neuroscience. 11 (4), 847-855 (1984).</li>
<li>Chiu, K., Lau, W. M., Yeung, S. C., Chang, R. C., So, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrograde+labeling+of+retinal+ganglion+cells+by+application+of+fluoro-gold+on+the+surface+of+superior+colliculus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retrograde labeling of retinal ganglion cells by application of fluoro-gold on the surface of superior colliculus.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
</ol>

Autorzy oświadczają, że nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

FACS jest techniką z wyboru do oczyszczania populacji komórek. Inne metody izolacji obejmują immunopanting, kulki magnetyczne i zubożenie fiksacji dopełniacza. Przewaga FACS nad innymi metodologiami opiera się na jednoczesnej identyfikacji markerów na powierzchni komórki o różnym stopniu intensywności. Intensywność fluorescencji cząsteczki jest proporcjonalna do ilości ekspresji białka. Do tej pory izolacja RGC opierała się wyłącznie na dodatnim Thy1 (CD90) i ujemnym CD48 15,16,22,34, n...

RGC są nieuleczalnie zróżnicowanymi neuronami, dlatego do eksperymentów potrzebne są komórki pierwotne. Opracowanie protokołu izolacji i wzbogacania pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) ma zasadnicze znaczenie dla ujawnienia mechanizmów zdrowia i degeneracji RGC in vitro. Jest to szczególnie ważne w przypadku badań, które mają na celu wygenerowanie potencjalnych terapii promujących funkcję RGC i minimalizujących ich śmierć. Zwyrodnienie RGC jest związane z chorobami zwyrodnieniowymi siatkówki, takimi jak jaskra, retinopatia cukrzycowa i normalne starzenie się. Chociaż konkretne mechanizmy komórkowe leżące u podstaw utraty RGC są niejasne, zidentyfikowano szereg czynników ryzyka. Brak dotlenienia w głowie nerwu wzrokowego1,2,3 powoduje śmierć RGC4 i działa jako zaburzenie homeostazy między aktywacją receptorów pobudzających i hamujących w obrębie poszczególnych RGCs5,6. Szereg wyzwań hamuje postęp w kierunku wykorzystania tych komórek do dogłębnych badań. Po pierwsze, liczba RGC obecnych w siatkówce myszy jest niewielka. RGC stanowią mniej niż 1% wszystkich komórek siatkówki7,8,9. Po drugie, większość markerów specyficznych dla RGC to białka wewnątrzkomórkowe10,11,12. Selekcja na podstawie tych markerów sprawia, że komórki są niezdolne do życia, co wyklucza dalsze analizy funkcjonalne. Wreszcie, obecnie dostępne protokoły są długie i brakuje im standaryzacji13,14. Wczesne protokoły izolacji RGC opierały się na metodach immunopanningu. Barres i wsp.15 zaadaptował klasyczną technikę immunopanningu i dodał drugi krok, który wykluczał monocyty i komórki śródbłonka z większości komórek siatkówki przed pozytywną selekcją opartą na immunopozytywności anty-tymocytu antygenu (aka Thy1), markera powierzchni komórki. Wiele lat później Hong i in. połączyli techniki izolacji kulek magnetycznych ze strategiami sortowania komórek, aby wyizolować RGC o wyższej czystości16. Zastosowanie kulek magnetycznych jest nadal wykorzystywane w wielu zastosowaniach naukowych. Razem kulki magnetyczne i protokoły cytometrii przepływowej poprawiły czystość wyizolowanych komórek. Jednak te systemy oczyszczania nie zostały jeszcze znormalizowane do izolacji mysich RGC od zdysocjowanych siatkówk.
Cytometria przepływowa to potężna metoda analityczna, która mierzy charakterystyki optyczne i fluorescencyjne zawiesin komórkowych. Komórki są analizowane zarówno ilościowo, jak i jakościowo z wysokim poziomem czułości, zapewniając wielowymiarową analizę populacji komórek. Dyskryminacja komórkowa opiera się na dwóch głównych właściwościach fizycznych: rozmiarze lub powierzchni komórki oraz ziarnistości lub złożoności wewnętrznej17. Analizę wielowymiarową można przeprowadzić, łącząc przeciwciała oznaczone fluorochromami, które mają podobne długości fal wzbudzenia i różne emisje. Cytometria przepływowa jest szybka, powtarzalna i czuła. Lasery Multitpe pozwalają na jeszcze większe wielowymiarowe analizy pojedynczych komórek za pomocą cytometrii przepływowej. Jest to więc atrakcyjna metodologia badania próbek cytologicznych. Sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) wykorzystuje wielowymiarowe różnice fenotypowe zidentyfikowane za pomocą cytometrii przepływowej do sortowania pojedynczych komórek w odrębne subpopulacje.
W ostatnim dziesięcioleciu wiele białek powierzchniowych i wewnątrzkomórkowych zostało zidentyfikowanych jako potencjalne biomarkery dla selekcji komórek, w tym neuronów. Początkowe badania, które miały na celu wyizolowanie RGC od szczurów, wykorzystywały Thy1 jako marker komórek zwojowych. Niestety, Thy1, znany również jako CD90, ma wiele izoform u innych gatunków gryzoni18,19,20 i jest wyrażany przez wiele typów komórek siatkówki19,20, co czyni go niespecyficznym markerem dla RGC. Inny marker powierzchniowy, CD48, znajduje się w populacjach monocytowych siatkówki, w tym makrofagach i mikrogleju. Korzystając z tych dwóch znaczników powierzchniowych, opracowano zmodyfikowaną sygnaturę RGC - komórkineg Thy1+ i CD48 - 15,16,21,22. Niestety, te dwa kryteria selekcji nie są wystarczające do selekcji dla wysoce wzbogaconej populacji RGC. Aby odpowiedzieć na tę niezaspokojoną potrzebę, opracowano protokół cytometrii przepływowej23 oparty na wielowarstwowych kryteriach selekcji dodatniej i ujemnej przy użyciu znanych markerów powierzchni komórek w celu wzbogacenia i oczyszczenia pierwotnych mysich RGC.

<table><tbody><tr><td>Anty-mysz CD15 PE</td><td>BioLegend</td><td>125606</td><td>Clone MC-480</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD48 PE-Cy7</td><td>BioLegend</td><td>103424</td><td>Clone HM48-1</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD57</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6680-100TST</td><td>Klon VC1.1</td></tr><tr><td>Anty-mysz CD90.2 AF700</td><td>BioLegend</td><td>105320</td><td>Klon 30-H12</td></tr><tr><td>Brylantowy fiolet 421 Koza Anty-mysz IgG</td><td>BioLegend</td><td>405317</td><td>Clone Poly4053</td></tr><tr><td>Oczyszczony blok przeciw myszom CD16/32</td><td>BioLegend</td><td>101302</td><td>FcgRII/III, klon 93</td></tr><tr><td>Zombie Aqua&nbsp;</td><td>BioLegend</td><td>423102</td><td>Dyskryminacja żywych komórek/martwych komórek</td></tr><tr><td>Płodowa surowica bydlęca</td><td>Hyclon</td><td>SH30071.03</td><td>Pochodzenie amerykańskie</td></tr><tr><td>Zestaw kulek do całkowitej kompensacji przeciwciał AbC</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A10497</td><td>Wielogatunkowy Ig</td></tr><tr><td>Neurobasal Medium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>21103049</td><td>Dodaj surowicę do pożywki przed hodowlą.</td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10010049</td><td>roztwór soli</td></tr><tr><td>fizjologicznej Mikroskop preparacyjny</td><td>Olympus</td><td>SZ-PT Model</td><td>Mikroskop stereoskopowy</td></tr><tr><td>Wirówka Sorvall</td><td>Thermo Scientific</td><td>ST 16R</td><td>Wszystkie wirowanie wykonane&nbsp; na</td></tr><tr><td>płycie bazowej RT &ndash; Patelnia preparcyjna</td><td>Fisher Scientific</td><td>SB15233FIM</td><td>Można również użyć płytki woskowej</td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>Aesculap</td><td>5002-7</td><td>4 i frac12; cale</td></tr><tr><td>Nożyczki do tęczówki, proste</td><td>Aesculap</td><td>1360</td><td>5 i frac12; cale</td></tr><tr><td>Falcon 15 mL probówki stożkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352097</td><td>Rurki polipropylenowe</td></tr><tr><td>Falcon 50 mL rurki stożkowe</td><td>Fisher Scientific</td><td>352098</td><td>Rurki polipropylenowe</td></tr><tr><td>Rurki BD FACS Fisher</td><td>Scientific</td><td>352003</td><td>Rurki polipropylenowe Szalki</td></tr><tr><td>40 mm</td><td>MidSci</td><td>TP93040</td><td>Hodowla tkankowa poddana działaniu</td></tr><tr><td>70 &mu; m nylonowe sitko</td><td>MidSci</td><td>70ICS</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>40 &mu; m nylonowe sitko</td><td>MidSci</td><td>40ICS</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>&nbsp; Strzykawka BD 10 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>301604</td><td>Jednorazowa strzykawka bez igły</td></tr><tr><td>Tłuczki</td><td>MidSci</td><td>PEST</td><td>sterylne</td></tr><tr><td>fiolki Wheaton</td><td>Fisher Scientific</td><td>986734</td><td>Bez wkładki</td></tr><tr><td>Igła BD 30 G</td><td>Fisher Scientific 305128</td><td></td><td>1 cal</td></tr><tr><td>Hausser Scientific Bright-Line Szklana komora licząca</td><td>Fisher Scientific</td><td>0267151B</td><td>Hemocytometr</td></tr><tr><td>Gibco Trypan niebieski 0,4% roztwór</td><td>Fisher Scientific</td><td>15250061</td><td>Viability Dye</td></tr><tr><td>Probówki Eppendorfa</td><td>Fisher Scientific</td><td>05-402-25</td><td>1,5 ml</td></tr><tr><td>EVOS Obrazowanie komórek floidowych</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>447113</td><td>Obrazowanie fluorescencyjne z obiektywem 20X</td></tr><tr><td>100% etanolu</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-452</td><td>Służy do produkcji 70% etanolu</td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS L-1000XLS+</td><td>Pipeta Rainin</td><td>17014282</td><td>LTS</td></tr><tr><td>Pipeta Pipet-Lite LTS Pipeta L-200XLS+</td><td>Pipeta Rainin</td><td>17014391</td><td>LTS Pipeta</td></tr><tr><td>Pipet-Lite LTS Pipeta L-20XLS+</td><td>Rainin</td><td>17014392</td><td>LTS Stojak na pipety</td></tr><tr><td>LTS 1000 ml GPS-L1000S</td><td>Rainin</td><td>17005088</td><td>Stojak na sterylne końcówki z niebieskim stojakiem</td></tr><tr><td>LTS 250 ml &ndash; GPS-L250S</td><td>Rainin</td><td>17005092</td><td>Zielony stojak na sterylne końcówki</td></tr><tr><td>LTS 20 ml &ndash; GPS-L10S</td><td>Rainin</td><td>17005090</td><td>Red Rack Sterylne końcówki</td></tr><tr><td>FACSAria II Sorter komórek</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Zamówienie niestandardowe</td></tr><tr><td>Cytometr LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td>N/A</td><td>Zamówienie niestandardowe</td></tr><tr><td>Abca8a</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00462440_m1</td><td>M&uuml; Komórki</td></tr> <tr><td>Aldh1alThermo</td> <td>Fisher Scientific</td><td>Mm00657317_m1</td><td>M&uuml; Ller cells</td></tr><tr><td>Aqp4</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00802131_m1</td><td>Astrocyty</td></tr><tr><td>Calb2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00801461_m1</td><td>amakrynowe, poziome</td></tr><tr><td>Cd68</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm03047340_m1</td><td>Komórki nabłonka barwnikowego siatkówki</td></tr><tr><td>Gad2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00484623_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Hprt</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01545399_m1</td><td>Utrzymanie domu gene</td></tr><tr><td>Lhx1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01297482_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Lim2</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00624623_m1</td><td>Horizontal</td></tr><tr><td>Nrl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>Mm00476550_m1</td><td>Fotoreceptory</td></tr><tr><td>Ntrk1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01219406_m1</td><td></td></tr> <tr><td>PoziomePcp4</td><td>Thermo Fisher Scientific Mm00500973_m1</td><td></td><td>Bipolarne, Amacrine</td></tr><tr><td>Pou4f1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Komórki</td></tr> <tr>zwojowe siatkówki<td>Prdx6</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00725435_s1</td><td>Astrocyty</td></tr><tr><td>Prkca</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00440858_m1</td><td>Bipolarny</td></tr><tr><td>Prox1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00435969_m1</td><td></td></tr> <tr><td>PoziomyPvalb</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00443100_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Rbpms</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm02343791_m1</td><td>Komórki zwojowe siatkówki</td></tr><tr><td>Rom1</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00436364_g1</td><td>Fotoreceptory</td></tr><tr><td>Rpe65</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00504133_m1</td><td>Barwnik siatkówki Komórki nabłonkowe</td></tr><tr><td>Slc1a3</td><td>Thermo Fisher Naukowe</td><td>Mm00600697_m1</td><td>Astrocyty</td></tr><tr><td>Slc6a9</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00433662_m1</td><td>Amacrine</td></tr><tr><td>Sncg</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00488345_m1</td><td>Komórki zwojowe siatkówki</td></tr><tr><td>Tubb3</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm00727586_s1</td><td>Komórki zwojowe siatkówki</td></tr><tr><td>Vim</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Mm01333430_m1</td><td>M&uuml; Komórki</td></tr><tr><td>tlenowe Taqman Universal Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4440047</td><td>odczynnik qPCR</td></tr><tr><td>miRNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>217004</td><td>Zestaw do izolacji</td></tr><tr><td>RNA SuperScript VILO Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>11754250</td><td>syntezy cDNA</td></tr><tr><td>Taqman PreAmp Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4391128</td><td>etap wstępnej amplifikacji</td></tr><tr><td>BD Cytofix/ Cytoperm</td><td>BD Biosciences</td><td>554714</td><td>Utrwalanie/Bufor permeabilizacji</td></tr><tr><td>BD Perm/ Wash</td><td>BD Biosciences</td><td>554723</td><td>Roztwór do przenikania</td></tr><tr><td>RBPMS</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-86815</td><td>Przeciwciało wewnątrzkomórkowe</td></tr><tr><td>SNCG</td><td>Gene Tex</td><td>GTX110483</td><td>Przeciwciało wewnątrzkomórkowe</td></tr><tr><td>BRN3A</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-8429</td><td>przeciwciało wewnątrzkomórkowe</td></tr><tr><td>TUJ1</td><td>BioLegend</td><td>801202</td><td>przeciwciało wewnątrzkomórkowe</td></tr></tbody></table>

izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (rgc) za pomocą cytometrii przepływowej

Isolation of Primary Murine Retinal Ganglion Cells (RGCs) by Flow Cytometry

Choroby neurodegeneracyjne często mają niszczący wpływ na osoby dotknięte chorobą. Utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC) jest związana z szeregiem chorób, w tym retinopatią cukrzycową i jaskrą, a także z normalnym starzeniem się. Pomimo swojego znaczenia, RGC były do tej pory niezwykle trudne do zbadania, częściowo ze względu na fakt, że stanowią one tylko niewielki procent szerokiej gamy komórek w siatkówce. Ponadto obecne metody izolacji wykorzystują markery wewnątrzkomórkowe do identyfikacji RGC, które wytwarzają komórki niezdolne do życia. Techniki te obejmują również długie protokoły izolacji, więc brakuje praktycznych, ustandaryzowanych i niezawodnych metod uzyskiwania i izolowania RGC. Praca ta opisuje wydajną, kompleksową i niezawodną metodę izolowania pierwotnych RGC z siatkówki myszy przy użyciu protokołu opartego zarówno na pozytywnych, jak i negatywnych kryteriach selekcji. Przedstawione metody pozwalają na przyszłe badania RGC, mające na celu lepsze zrozumienie znacznego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Pogłębione badanie RGC jest utrudnione przez wiele czynników, w tym ich niską częstotliwość występowania oraz brak solidnej i standaryzowanej metodologii ich izolacji. Rysunek 1 przedstawia metodologię stosowaną do izolacji siatkówek. Istnieją różnice w procedurze enukleacji w zależności od rodzaju analizy, na przykład gdy enukleacja jest częścią eksperymentu in vivo27. Enukleacja w niniejszym protokole jest przeprowadzana na ...

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Neurodegenerative diseases often have a devastating impact on those affected. Retinal ganglion cell (RGC) loss is implicated in an array of diseases, ...

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wzbogaconej, homogenicznej populacji pierwotnych komórek zwojowych siatkówki myszy. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania w dziedzinie badań nad komórkami zwojowymi siatkówki dotyczące mechanizmów leżących u podłoża spadku ostrości wzroku w populacjach starzejących się oraz w populacjach z chorobami degeneracyjnymi siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że oferuje ona szybki, widoczny, powtarzalny i zestandaryzowany protokół izolacji wzbogaconych pierwotnych komórek zwojowych siatkówki myszy.Pomysł na tę metodę pojawił się, gdy Sumana Chintalapudi, która była wówczas doktorantką w moim laboratorium i pierwszą autorką niniejszej pracy, przedstawiła podczas naszego klubu czasopism artykuł z 2013 roku autorstwa Krishny Murtheadola; ich badanie jednoznacznie wykazało, że linia komórkowa RGC five, pierwotnie stworzona jako unieśmiertelniona linia komórek zwojowych siatkówki szczura, nie była już pochodzenia szczurzego ani nie posiadała fenotypu RGC. Stało się dla nas jasne, że problem ten pozostawił znaczną lukę w zasobach dostępnych dla społeczności badawczej zajmującej się wzrokiem, w tym dla naszego laboratorium. Sumana i ja skontaktowaliśmy się z dr. Morales-Tirado i wspólnie w trójkę opracowaliśmy nową metodę izolacji żywych i wysoce wzbogaconych komórek RGC.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ jej celem jest wyizolowanie żywej i silnie wzbogaconej populacji komórek, które mogą być następnie hodowane jako komórki pierwotne lub unieśmiertelnione w postaci linii komórkowej. Z tego powodu należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić izolowanych komórek. Ponadto parametry metody sortowania komórek muszą być dostosowane do konkretnego rodzaju komórek, które zamierza się wyizolować.Obie metody wymagają specjalistycznych umiejętności. Procedury zaprezentują dr Xiang Di Wang, adiunkt z laboratorium dr. Jablonskiego oraz pan Zach Goldsmith, doktorant z mojego laboratorium. Aby przeprowadzić enukleację oka, najpierw wprowadź pęsetę pod gałkę oczną.Chwyć nerw wzrokowy i pociągnij go do góry. Gałka oczna zostanie enukleowana z nienaruszonym nerwem wzrokowym. Umieść oko w probówce z PBS na lodzie, a następnie enukleuj drugie oko.Po zebraniu wszystkich gałek ocznych, umieść jedno oko w szalce Petriego z nowym roztworem PBS pod mikroskopem sekcyjnym i za pomocą pęsety ostrożnie chwyć gałkę u podstawy nerwu wzrokowego. Używając ostrej igły o rozmiarze 30 G, przebij rogówkę, aby umożliwić odpłynięcie cieczy wodnistej, co ułatwi utrzymanie oka pęsetą. Trzymając rogówkę pęsetą, wykonaj nożyczkami małe nacięcie w tkance rogówki, a następnie za pomocą pęsety delikatnie odwarstw rogówkę i twardówkę.Gdy gałka oczna zostanie obrana do połowy, należy za pomocą pęsety wysunąć siatkówkę i soczewkę. Siatkówkę należy umieścić w małej 40 milimetrowej płytce Petri zawierającej PBS i 1% FBS w komorze z laminarnym przepływem powietrza i przemyć ją trzy razy w świeżym PBS z dodatkiem FBS, używając nowej porcji roztworu do każdego przemycia. Po przemyciu wszystkich oczu należy umieścić do 12 siatkówek na sterylnym nylonowym sicie o oczkach 70 mikronów, zwilżonym PBS i FBS, a następnie delikatnie rozetrzeć siatkówki tylnym końcem tłoka strzykawki 10 mililitrów, wykonując ruchy okrężne.Po całkowitej dysocjacji komórek należy umieścić sitko nad polipropilenową probówką zbiorczą i za pomocą pipety P1000 przefiltrować komórki przez sitko do probówki. Sitko należy przepłukać PBS i FBS, zbierając płuczynkę w probówce zbiorczej. Należy dodać odpowiednią ilość PBS z FBS, aby uzyskać końcową objętość jednej mililitra roztworu na jedną siatkówkę, a następnie zebrać komórki poprzez wirowanie.Następnie, jeśli immunoznakowanie ma zostać przeprowadzone natychmiast, resuspender osad w PBS z dodatkiem FBS w stężeniu jeden mililitr medium na pięć siatkówek. Alternatywnie, inkubować komórki resuspenderowane w medium do komórek neuronalnych przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w pozycji poziomej. Aby przeprowadzić immunoznakowanie komórek siatkówki, odwirować zawiesinę komórek siatkówki i resuspender osad w 50 mikrolitrów świeżego PBS z dodatkiem FBS w probówce typu fax.Odstaw pięć probówek zawierających 10⁶ komórek każda jako nieznakowaną kontrolę negatywną. Następnie, w każdej probówce zablokuj nieswoiste wiązanie receptorów FC, dodając 1 µL przeciwciała anty-mysie CD 16 32 na 10⁶ komórek i inkubując przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Po zakończeniu inkubacji blokującej, dodaj do komórek odpowiedni koktajl przeciwciał, delikatnie mieszając pipetą, a następnie inkubuj przez 30 minut w lodzie, chroniąc próbki przed światłem.Następnie komórki należy przemyć dwukrotnie w objętości końcowej PBS i FBS. Komórki należy znakować odpowiednim przeciwciałem wtórnym przez kolejne 30 minut w lodzie, w warunkach ochrony przed światłem, a następnie dwukrotnie przemyć w PBS z dodatkiem FBS, zgodnie z wcześniejszą procedurą. Osady należy zawiesić w świeżym PBS i FBS w celu policzenia komórek.Aby dostosować kompensację, do jednej sterylnej probówki typu fax na każdy florafor należy dodać trzy krople mikrosfer polistyrenowych oraz jeden mikrogram odpowiedniego floraforu do każdej probówki. Inkubować mikrosfery przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc je przed światłem. Następnie przemyć mikrosfery w trzech mililitrach PBS i FBS, a następnie ostrożnie usunąć nadsącz.Resuspenduj osady mikrosfer w 250 µL PBS i FBS, a następnie umieść probówkę z nieznakowaną próbką w cytometrze przepływowym. W oprogramowaniu cytometru przepływowego wybierz eksperyment, konfigurację kompensacji i utwórz kontrole kompensacji. Dodaj specyficzne kontrole florafor z wyświetlonej listy i kliknij OK. Zweryfikuj rozproszenie światła przednie i boczne, a następnie wyznacz bramkę dla populacji początkowej.Następnie zamontuj probówkę z kontrolą negatywną w cytometrze i kliknij load. Upewnij się, że wyświetla się populacja docelowa lub P1, a następnie zaznacz tę populację. Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1 i wybierz calculate compensation.Następnie kliknij przycisk rejestracji danych. Po zakończeniu rejestracji kliknij przycisk wyładuj, aby wyjąć probówkę, a następnie załaduj kolejną probówkę kontrolną w celu dostrojenia kompensacji. Po zarejestrowaniu wszystkich próbek kontrolnych utwórz wykres rozrzutu FSC (forward scatter) względem SSC (side scatter) dla pierwszej probówki eksperymentalnej i wyznacz bramkę dla populacji P1.Następnie otwórz wykres pseudo-kolorowy wysokości rozproszenia bocznego (side scatter height) względem szerokości rozproszenia bocznego (side scatter width) i wyznacz bramkę dla pojedynczych komórek. Wykorzystując populację pojedynczych komórek, stwórz wykres wysokości rozproszenia przedniego (forward scatter height) względem szerokości rozproszenia przedniego (forward scatter width) i wyznacz bramkę w celu wykluczenia dubletów. Następnie wygeneruj wykres pseudo-kolorowy CD48 względem CD90.2 i wyznacz bramkę dla komórek CD90.2-dodatnich i CD48-ujemnych, aby wyeliminować monocyty, a następnie stwórz wykres pseudo-kolorowy CD57 względem CD15, aby wyeliminować ewentualne zanieczyszczenia komórkami amakrynowymi.Następnie zdefiniuj populacje do zebrania dla danej próbki w arkuszu układu sortowania i przeprowadź sortowanie komórek. Po zakończeniu sortowania pobierz alikwot 2,5 × 10⁴ komórek, aby potwierdzić czystość wyizolowanej populacji komórek. Po przesianiu siatkówek przez sitko komórkowe można zwizualizować wiele komórek wewnętrznej warstwy siatkówki, mimo że komórki zwojowe siatkówki utraciły swoją charakterystyczną morfologię w wyniku aksotomii podczas procedury izolacji komórek.Klasyczny fenotyp powierzchniowy Dye 1 dodatni i CD48 ujemny nie jest wystarczający do identyfikacji i izolacji komórek zwojowych siatkówki myszy, ponieważ komórki te wykazują ekspresję genów związanych z komórkami amakrynymi, komórkami Müllera, komórkami bipolarnymi, komórkami poziomymi, fotoreceptorami oraz komórkami nabłonka barwnikowego siatkówki. Posortowane komórki wykazują również ekspresję wewnątrzkomórkowych markerów związanych z komórkami zwojowymi siatkówki, takich jak synukleina gamma, BRN3A, TUJ1 i RBPMS, a wewnątrzkomórkowa lokalizacja tych markerów została dodatkowo potwierdzona za pomocą cytometrii przepływowej z obrazowaniem. Niektóre z posortowanych komórek zaczynają nawet przejawiać morfologię charakterystyczną dla komórek zwojowych siatkówki po hodowli komórkowej in vitro.Ponadto analiza ilościowa PCR silnie wzbogaconej, posortowanej populacji komórek wykazuje wielokrotny wzrost ekspresji genów kodujących wewnątrzkomórkowe markery specyficzne dla komórek zwojowych siatkówki. Po opanowaniu technika ta może zostać zrealizowana w czasie krótszym niż sześć godzin, jeśli zostanie przeprowadzona prawidłowo. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby zachować sterylność zawiesiny komórkowej, zablokować receptory FC w zawiesinie komórkowej w celu uniknięcia niespecyficznego wiązania przeciwciał oraz omówić szczegóły lub strategię sortowania komórek z operatorem sortownika komórkowego.Po wykonaniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak QPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące profilowania ekspresji genów. Należy pamiętać, że obsługa specjalistycznego sprzętu, takiego jak sorter komórek, wymaga wysoko wykwalifikowanego operatora. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę badaczom z zakresu okulistyki i wizji, pomagając zrozumieć mechanizmy przeżycia i śmierci komórek zwojowych siatkówki, co przyczyniło się do opracowania nowych terapii w celu zachowania wzroku.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak wyizolować wzbogaconą, homogeniczną populację pierwotnych komórek zwojowych siatkówki myszy.

isolation-primary-murine-retinal-ganglion-cells-rgcs-flow

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Bioinżynieria

Niniejszy artykuł zawiera opis sposobu wycinania i rejestrowania aktywności z izolowanego preparatu siatkówki myszy. W szczególności opisujemy, jak rejestrować odpowiedzi na światło z populacji komórek zwojowych znakowanych fluorescencyjnie, a następnie identyfikować i analizować ich morfologię.<br...

Izolowany preparat siatkówki do rejestracji odpowiedzi świetlnej genetycznie znakowanych komórek zwojowych siatkówki

Ten film demonstruje procedurę izolowania mysich pierwotnych komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej. Metoda ta pozwala na przyszłe badania RGC, w celu lepszego zrozumienia poważnego spadku ostrości wzroku, który wynika z utraty funkcjonalnych RGC w chorobach neurodegeneracyjnych.

Izolowanie mysich komórek zwojowych siatkówki za pomocą sortowania komórek aktywowanych fluorescencją

Źródło: Laboissonniere, et. al. Jednokomórkowy sekwencjoner RNA zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki. J. Vis. exp. (2017).  Ten film demonstruje technikę fluorescencyjnego śledzenia w celu identyfikacji podtypów komórek zwojowych siatkówki (RGC) w transgenicznej siatkówce myszy. Proces ten polega na zabezpieczeniu izolowanej siatkówki w komorze rejestracyjnej, utrzymaniu żywotności komórek za pomocą natlenionej perfuzji i celowaniu w znakowane fluorescencyjnie RGC za pomocą...

Identyfikacja podtypów komórek zwojowych siatkówki myszy za pomocą śledzenia fluorescencyjnego

Fagocytoza mikrogleju jest kluczowa dla utrzymania homeostazy tkanek, a nieodpowiednia funkcja fagocytarna została zamieszana w patologię. Jednak ocena funkcji mikrogleju in vivo jest technicznie trudna. Opracowaliśmy prostą, ale solidną technikę precyzyjnego monitorowania i ilościowego określania potencjału fagocytarnego mikrogleju w warunkach fizjologicznych.

Ocena funkcji fagocytarnej mikrogleju siatkówki in vivo przy użyciu testu opartego na cytometrii przepływowej

Tutaj prezentujemy kombinatoryczne podejście do klasyfikacji typów komórek neuronalnych przed izolacją i późniejszej charakterystyki transkryptomów jednokomórkowych. Protokół ten optymalizuje przygotowanie próbek do udanego sekwencjonowania RNA (RNA-Seq) i opisuje metodologię zaprojektowaną specjalnie w celu lepszego zrozumienia różnorodności komórkowej.

Sekwencja RNA pojedynczej komórki zdefiniowanych podzbiorów komórek zwojowych siatkówki

Ten protokół przedstawia dwie techniki izolowania subkomórkowych przedziałów fotoreceptorów mysich pręcików do analizy białek. Pierwsza metoda wykorzystuje żywe siatkówki i celulozową bibułę filtracyjną do oddzielenia zewnętrznych segmentów pręcika, podczas gdy druga wykorzystuje liofilizowane siatkówki i taśmę klejącą do odklejania wewnętrznych i zewnętrznych warstw segmentów pręcika.

Dwie metody peelingu do izolacji przedziałów komórek fotoreceptorowych w siatkówce myszy w celu analizy białek

Ten protokół opisuje metodę izolacji mysich komórek śródbłonka siatkówki po urodzeniu, zoptymalizowanych pod kątem wydajności, czystości i żywotności komórek. Komórki te nadają się do sekwencjonowania nowej generacji.

Izolacja mysich komórek śródbłonka siatkówki do sekwencjonowania nowej generacji

Ten manuskrypt opisuje szczegółowy protokół izolowania komórek Müllera glejowych siatkówki od oczu myszy. Protokół rozpoczyna się od enukleacji i sekcji oczu myszy, po której następuje izolacja, wysiew i hodowla komórek Müllera.

Izolacja pierwotnych komórek glejowych Müllera siatkówki myszy

Nabłonek barwnikowy siatkówki (RPE) działa jako kluczowa bariera między naczyniówką a siatkówką, promując zdrowie i funkcję typów komórek siatkówki, takich jak fotoreceptory. W tym miejscu opisujemy prosty i skuteczny protokół izolacji i hodowli dorosłego mysiego RPE.

Uproszczona metoda izolacji i hodowli komórek nabłonka barwnikowego siatkówki od dorosłych myszy

Ten protokół opisuje procedurę izolowania całej siatkówki myszy i przeprowadzania barwienia immunologicznego w celu oznaczenia wszystkich komórek zwojowych siatkówki (RGC). Po procesie następuje obrazowanie i automatyczne zliczanie RGC za pomocą oprogramowania opartego na sztucznej inteligencji, co zapewnia prostą, szybką i dokładną metodę ilościowego określania RGC w całej siatkówce myszy.

Barwienie immunologiczne w całości i automatyczne zliczanie komórek zwojowych siatkówki myszy

Ten artykuł przedstawia szczegółowy protokół izolacji pierwotnych komórek Müllera siatkówki od noworodków szczurów Sprague-Dawley (SD). Procedura obejmuje wyłuszczenie gałek ocznych, wypreparowanie tkanki siatkówki, ekstrakcję i identyfikację komórek oraz kluczowe kwestie dotyczące późniejszej hodowli komórek.

Izolacja i hodowla pierwotnych komórek Müllera siatkówki od szczurów Sprague-Dawley (SD)

Naucz się izolować pierwotne mysie komórki zwojowe siatkówki za pomocą cytometrii przepływowej. Ta metoda umożliwia badanie mechanizmów degeneracji siatkówki i utraty wzroku.

Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Przeglądaj więcej filmów