Izolacja pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki (RGC) za pomocą cytometrii przepływowej

Miliony ludzi cierpią na choroby zwyrodnieniowe siatkówki, które prowadzą do nieodwracalnej ślepoty. Wspólnym elementem wielu z tych chorób jest utrata komórek zwojowych siatkówki (RGC). Ten szczegółowy protokół opisuje izolację pierwotnych mysich RGC przez selekcję dodatnią i ujemną za pomocą cytometrii przepływowej.

Ogólnym celem tej procedury jest wyizolowanie wzbogaconej jednorodnej populacji pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na pytania w dziedzinie komórek zwojowych siatkówki dotyczące mechanizmów leżących u podstaw pogarszającej się ostrości wzroku w populacjach wiekowych i w populacjach z chorobą zwyrodnieniową siatkówki. Główną zaletą tej techniki jest to, że może ona zaoferować szybki, widoczny, powtarzalny i ustandaryzowany protokół izolacji wzbogaconych pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki.

Po raz pierwszy wpadliśmy na pomysł tej metody, kiedy Sumana Chintalapudi, która była wtedy doktorantką w moim laboratorium i pierwszą autorką tego badania, przedstawiła w naszym klubie naukowym artykuł Krishny Murtheadola z 2013 roku, a ich badanie wyraźnie wykazało, że pięciokomórkowa linia komórkowa RGC, która została pierwotnie wygenerowana jako nieśmiertelnie unieśmiertelniona linia komórkowa siatkówki siatkówki szczura, nie był już pochodzenia szczurzego, ani nie posiadał fenotypu RGC. Stało się dla nas jasne, że ten problem pozostawił dużą lukę w zasobach dostępnych dla społeczności badaczy wzroku, w tym w naszym własnym laboratorium. Sumana i ja skontaktowaliśmy się z dr Morales-Tirado i razem opracowaliśmy nową metodę izolowania żywych i wysoce wzbogaconych RGC.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby nowe w tej metodzie będą miały trudności, ponieważ celem tej metody jest wyizolowanie żywej i wysoce wzbogaconej populacji komórek, które mogą być hodowane jako komórki pierwotne lub unieśmiertelnione jako linia komórkowa. Z tego powodu należy być bardzo ostrożnym, aby nie uszkodzić komórek, które próbuje się wyizolować. Ponadto parametry metody sortowania komórek muszą być dostosowane do konkretnych komórek, które próbuje się wyizolować.

Obie metody wymagają specjalnych zestawów umiejętności. Procedury zademonstrują dr Xiang Di Wang, pracownik naukowy z laboratorium dr Jablonskiego, oraz pan Zach Goldsmith, doktorant z mojego laboratorium. Aby wyłuszczyć oko, najpierw włóż kleszcze pod gałkę oczną.

Chwyć nerw wzrokowy i podciągnij się. Kula zostanie wyłuszczona z nienaruszonym nerwem wzrokowym. Umieścić oko w fiolce z PBS na lodzie i wyłuszczyć drugie oko.

Po zebraniu wszystkich oczu umieść jedno oko na szalce Petriego ze świeżym PBS pod mikroskopem preparacyjnym i użyj kleszczy, aby ostrożnie chwycić gałkę u podstawy nerwu wzrokowego. Za pomocą ostrej igły o rozmiarze 30 nakłuj rogówkę, aby woda wodnista mogła spłynąć, co ułatwia trzymanie oka kleszczami. Trzymając rogówkę kleszczami, użyj nożyczek, aby wykonać małe nacięcie w tkance rogówki i użyj kleszczy, aby delikatnie oderwać rogówkę i twardówkę.

Gdy kula jest oderwana do połowy, użyj kleszczyków, aby rozwinąć siatkówkę i soczewkę. Umieść siatkówkę na małej 40-milimetrowej szalce Petriego zawierającej PBS i 1% FPS w komorze bezpieczeństwa biologicznego i umyj siatkówkę trzy razy w świeżym PBS plus FBS przy każdym płukaniu. Po umyciu wszystkich oczu umieść do 12 siatkówk na sterylnym nylonowym sitku o grubości 70 mikronów zwilżonym PBS i FBS i delikatnie maceruj siatkówki tylnym końcem 10-mililitrowego tłoka strzykawki, wykonując okrężne ruchy.

Gdy wszystkie komórki zostaną zdysocjowane, umieść sitko na polipropylenowej probówce zbiorczej i użyj pipety P1000, aby przefiltrować komórki przez sitko do probówki zbiorczej. Przepłucz sitko za pomocą PBS i FBS, zbierając płyn w probówce zbiorczej. Dodaj tyle PBS plus FBS, aby doprowadzić końcową objętość do jednego mililitra roztworu na siatkówkę i zebrać komórki przez odwirowanie.

Następnie ponownie zawiesić osad w PBS plus FBS w stężeniu jednego mililitra pożywki na pięć siatkówk, jeśli znakowanie immunologiczne ma być wykonane natychmiast. Alternatywnie, inkubuj komórki ponownie zawieszone w pożywce komórek nerwowych przez noc w temperaturze czterech stopni Celsjusza w pozycji poziomej. Aby znakować immunologicznie komórki siatkówki, odwiruj zawiesinę komórek siatkówki i ponownie zawieś osad w 50 mikrolitrach świeżego PBS i FBS w probówce faksowej.

Odłóż pięć razy 10 do szóstych komórek na nieoznakowaną kontrolę ujemną. Następnie zablokuj wszelkie niespecyficzne wiązania receptora FC w każdej probówce za pomocą jednego mikrolitra przeciwciała anty mysiego CD 16 32 na jeden razy 10 do szóstej komórki, przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Pod koniec inkubacji blokującej dodać do komórek interesujący nas koktajl przeciwciał za pomocą delikatnego pipetowania przez 30-minutową inkubację na lodzie chronionym przed światłem.

Następnie umyj komórki dwa razy w litrze formuły końcowej objętości PBS i FBS. Oznacz komórki odpowiednim przeciwciałem drugorzędowym przez kolejne 30 minut na lodzie chronionym przed światłem, a następnie wykonaj dwa płukania w PBS plus FBS, jak właśnie pokazano. Ponownie zawiesić granulki w świeżych PBS i FBS w celu zliczenia komórek.

Aby dostosować kompensację, dodaj trzy krople mikrosfer polistyrenu do jednej sterylnej rurki faksowej na florafor i jeden mikrogram odpowiedniego floraforu do każdej probówki. Inkubować mikrosfery przez 15 minut w temperaturze pokojowej, chroniąc przed światłem. Następnie umyj mikrosfery w trzech mililitrach PBS i FBS i ostrożnie usuń supernatant.

Zawiesić granulki mikrosfery w 250 mikrolitrach PBS i FBS i załadować nieoznakowaną probówkę z próbką do cytometru przepływowego. W oprogramowaniu cytometru przepływowego wybierz eksperyment, konfigurację kompensacji i utwórz kontrolki kompensacji. Dodaj florędla określonych kontrolek z wyświetlonej listy i kliknij przycisk OK. Sprawdź światło rozproszone do przodu i z boku, a następnie przesuń początkową populację.

Następnie zainstaluj rurkę kontroli ujemnej na cytometrze i kliknij obciążenie. Sprawdź, czy jest wyświetlana populacja będąca przedmiotem zainteresowania lub P1, a następnie wybierz populację. Kliknij prawym przyciskiem myszy bramkę P1 i wybierz opcję Oblicz kompensację.

Następnie kliknij przycisk nagraj dane. Po zakończeniu nagrywania kliknij przycisk rozładuj, aby wyjąć rurkę i załaduj następną rurkę kontrolną, aby dostosować elementy sterujące kompensacją. Po zarejestrowaniu wszystkich próbek kontrolnych utwórz wykres punktowy do przodu i z boku dla pierwszej probówki doświadczalnej i przelej populację P1.

Następnie otwórz wykres pseudo koloru wysokości bocznego rozproszenia w stosunku do szerokości bocznego rozproszenia i bramkuje pojedyncze komórki. Korzystając z pojedynczych komórek, utwórz wykres wysokości rozproszenia do przodu w stosunku do szerokości rozproszenia do przodu, a następnie bramkę, aby wykluczyć dublety. Następnie wygeneruj pseudo wykres koloru CD48 kontra CD90.2 i bramkuje CD90.2 dodatnie komórki CD48 ujemne w celu wyeliminowania monocytów, a następnie pseudo wykres koloru CD57 kontra CD15 w celu wyeliminowania wszelkich zanieczyszczeń komórek amakrynowych.

Teraz zdefiniuj populacje, które mają zostać zebrane dla próbki w arkuszu układu sortowania, a następnie posortuj komórki. Na końcu sortowania użyj 2,5 razy 10 do czwartej podwielokrotności komórek, aby potwierdzić czystość izolowanej populacji komórek. Po zasianiu siatkówki w siatku komórkowym można uwidocznić wiele wewnętrznych komórek siatkówki, mimo że komórki zwojowe siatkówki utraciły swoją charakterystyczną morfologię z powodu akskotomii podczas procedury izolacji komórek.

Klasyczny fenotyp ujemnej powierzchni CD48 z jednym dodatnim barwnikiem nie jest wystarczający do identyfikacji i wyizolowania mysich komórek zwojowych siatkówki, ponieważ komórki te wyrażają geny związane z komórkami nabłonka amakryny, mullera, dwubiegunowego, poziomego fotoreceptora i nabłonka barwnikowego siatkówki. Posortowane komórki wyrażają również markery wewnątrzkomórkowe związane z komórkami zwojowymi siatkówki, takie jak synukleina gamma, BRN3A, TUJ1 i RBPMS, przy czym wewnątrzkomórkowa lokalizacja markerów jest dodatkowo potwierdzona przez obrazową cytometrię przepływową. Niektóre z posortowanych komórek zaczynają nawet wykazywać morfologię komórek zwojowych siatkówki po hodowli komórkowej in vitro.

Co więcej, ilościowa analiza PCR wysoko wzbogaconej populacji posortowanych komórek ujawnia wielokrotny wzrost genów kodujących markery wewnątrzkomórkowe specyficzne dla zwojów siatkówki. Po opanowaniu tej techniki można ukończyć w mniej niż sześć godzin, jeśli zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o utrzymaniu sterylności zawiesiny komórkowej, zablokowaniu receptorów FC przed zawiesiną komórkową, uniknięciu niespecyficznego wiązania przeciwciał oraz omówieniu szczegółów lub strategii sortowania komórek z operatorem sortera komórek.

Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak QPCR, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania dotyczące profilowania ekspresji genów. Nie zapominaj, że praca specjalistycznego sprzętu, takiego jak sortownik komórek, wymaga wysoce wyspecjalizowanego operatora. Po opracowaniu technika ta utorowała drogę naukowcom zajmującym się wzrokiem, aby pomóc w zrozumieniu mechanizmów przeżycia i śmierci w komórkach zwojowych siatkówki, w celu opracowania nowych metod leczenia zachowania wzroku.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak wyizolować wzbogaconą jednorodną populację pierwotnych mysich komórek zwojowych siatkówki.