Kwantyfikacja gęstości rozgałęzień w całych wierzchowcach gruczołu sutkowego szczura przy użyciu metody analizy Sholla

Ogólnym celem tej metody wspomaganej komputerowo jest obiektywne określenie ilościowe gęstości rozgałęzień oraz zaniku rozgałęzień gruczołu mlekowego – dwóch ważnych wskaźników rozwojowych u gryzoni – poprzez zastosowanie zmodyfikowanej analizy Sholla do obrazów całych preparatów gruczołów mlekowych. Metoda ta może pomóc w udzieleniu odpowiedzi na pytania z zakresu biologii gruczołu mlekowego, takie jak wpływ ekspozycji chemicznej na rozwój gruczołu mlekowego. Główną zaletą tej techniki jest wykorzystanie oprogramowania otwartoźródłowego do obiektywnego określenia ilościowego podstawowych cech rozwoju gruczołu mlekowego.

W tej procedurze należy wykorzystać obrazy całych preparatów, przedstawiające nabłonek gruczołowy przy stałym powiększeniu. W pierwszej kolejności otwórz obraz w programie ImageJ. Następnie wybierz narzędzie do rysowania swobodnego (freehand tool).

Obrysuj nabłonek gruczołowy i oczyść obszar wokół niego. Następnie obrysuj węzeł chłonny i usuń tę część obrazu za pomocą polecenia wycinania. Jeśli tło obrazu jest czarne, należy zmienić je na białe.

Kliknij Edytuj, następnie Opcje, a potem Kolory. W oknie dialogowym wybierz kolor biały z menu rozwijanego opcji tła. Mimo że tło może pozostać czarne, podczas przetwarzania obrazu zostanie ono potraktowane jako białe.

Następnie rozdziel kanały kolorów na trzy ośmiobitowe obrazy w skali szarości. Wybierz kanał o najlepszym kontraście, którym zazwyczaj jest kanał niebieski. Teraz odejmij tło z wybranego kanału kolorów.

Następnie należy przejść do wyboru pożądanych parametrów i podglądu wprowadzonych zmian. Zaznacz opcję jasnego tła (light background) i podgląd w oknie dialogowym, a następnie dostosuj liczbę pikseli, aż do uzyskania pożądanego kontrastu. Jeśli wymagany jest dodatkowy kontrast, skorzystaj z opcji maskowania wyostrzającego (Unsharp Mask).

Zaznacz opcję Podgląd w oknie dialogowym i dostosuj promień pikseli oraz wagę maski, aż do uzyskania pożądanego kontrastu. Po zastosowaniu filtra maskowania wyostrzającego usuń obramowanie utworzone przez filtr. Kliknij przycisk z podwójną czerwoną strzałką na pasku narzędzi i wybierz Narzędzia rysunkowe.

Następnie wybierz narzędzie Gumka. Dostosuj jej średnicę, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia Gumka, a następnie przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby usunąć obramowanie. Podczas usuwania dostępny jest tylko jeden poziom cofania zmian, dlatego należy zachować ostrożność.

Po zastosowaniu jednego z filtrów należy ręcznie usunąć pozostałe szumy. Korzystając z kopii oryginalnego obrazu, usuń zidentyfikowane szumy, klikając najpierw przycisk z podwójną czerwoną strzałką na pasku narzędzi i wybierając narzędzia do rysowania. Następnie wybierz narzędzie gumka.

Dostosuj jego średnicę, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia gumki. Następnie, przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby usunąć szum. Podczas wymazywania możliwe jest tylko jedno cofnięcie operacji, dlatego należy zachować ostrożność.

Następnie dostosuj próg obrazu. Przesuń suwaki, aby zmienić minimalną i maksymalną wartość progu w celu poprawy obrazu gruczołu. Następnie kliknij Zastosuj.

Usuń dodatkowy szum automatycznie, korzystając z jednej z dwóch metod. Pierwszą opcją jest użycie polecenia despeckle. Drugą opcją jest użycie polecenia remove outliers.

Proces ten zastępuje piksel medianą z jego bezpośredniego otoczenia tylko wtedy, gdy wartość piksela odbiega od mediany o więcej niż zdefiniowany przez użytkownika próg. Teraz, wykorzystując oryginalny obraz do porównania, odtwórz fragmenty nabłonka gruczołowego, które zostały usunięte podczas progowania i usuwania szumów. Podczas rekonstrukcji obrazu należy postępować ostrożnie i ograniczyć się do niezbędnego minimum, aby zachować integralność obrazu.

Wybierz narzędzie puszki z farbą z narzędzi rysunkowych. Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia puszki z farbą, aby dostosować rozmiar narzędzia, a następnie starannie wypełnij brakujące sekcje gruczołu za pomocą lewego przycisku myszy. Następnie utwórz obraz szkieletowy gruczołu do analizy Sholl.

Najpierw należy przekształcić obraz do formatu binarnego. Następnie wykonuje się szkieletyzację obrazu. Proces ten polega na wielokrotnym usuwaniu pikseli z krawędzi obrazu binarnego, aż do momentu, gdy zostanie zredukowany do kształtu o szerokości jednego piksela.

Następnie wykonaj dylatację obrazu jeden raz, aby zamknąć luki powstałe w wyniku progowania i szkieletyzacji. Potem zapisz obraz jako nowy plik, korzystając z polecenia „zapisz jako”. Na koniec sprawdź dokładność obrazu szkieletu w odniesieniu do oryginału, nakładając oba obrazy na siebie.

W oknie dialogowym dodawania obrazu wybierz obraz szkieletu i ustaw jego przezroczystość na 30%. Następnie zapisz nałożoną warstwę jako nowy obraz do późniejszego wykorzystania. Na początek otwórz obraz szkieletu i przekonwertuj go do formatu binarnego. Teraz zdefiniuj skalę obrazu.

Wprowadź liczbę pikseli na milimetr, następnie ustaw zarówno znaną odległość, jak i współczynnik proporcji pikseli na jeden, po czym wybierz milimetry jako jednostkę długości i przełącz opcję globalną, aby zastosować skalę do wszystkich obrazów. Następnie, za pomocą narzędzia do rysowania linii, określ promień końcowy dla analizy Sholla. Narysuj linię od początku przewodu głównego do najbardziej dystalnego punktu nabłonka gruczołowego.

Następnie naciśnij klawisz M, aby wyświetlić odległość linii. Teraz wprowadź ustawienia dla analizy Sholla. Najpierw wybierz opcje w sekcji definicji powłok (definition of shells), ustawiając promień początkowy na 0.00 milimetrów oraz krok promienia na 0.1 milimetrów.

Ustaw liczbę próbek na jedną. Długość właśnie narysowanej linii zostanie automatycznie wprowadzona w polu promienia końcowego. W opcjach wielu próbek na promień wybierz średnią (mean) dla całkowania.

W sekcji deskryptorów i opcji dopasowania krzywych ustaw wartość odcięcia promienia otaczającego na jeden. W polu liczby gałęzi głównych wybierz opcję wnioskowania z promienia początkowego, a następnie zaznacz opcje dopasowania liniowego oraz najlepszego stopnia dopasowania. Następnie, w sekcji profilów bez normalizacji, wybierz opcję najbardziej informatywną.

Następnie, w sekcji sholl methods, wybierz area for normalized profile. Na koniec, w sekcji output, zaznacz create intersections mask, aby utworzyć mapę cieplną przecięć. Teraz otwórz okno podglądu obrazu z pierścieniami i potwierdź obszar analizy.

Jeśli wszystko wygląda poprawnie, kliknij OK, aby uruchomić analizę. Uruchomienie analizy utworzy okno liniowe profilu Sholla, okno półlogarytmiczne profilu Sholla, okno wyników Sholla zawierające wszystkie wartości wyjściowe Sholla oraz okno nazw plików profilu Sholla, które podaje liczbę przecięć w każdym promieniu wyznaczoną przez wielomian. Aby zmierzyć MEA, należy pracować na obrazie szkieletowym gruczołu w programie ImageJ.

Otwórz narzędzie wielokąta i obrysuj wielokątem obwód gruczołu. Klikaj myszą, aby dodawać kolejne odcinki linii. Po opasaniu całego obszaru nabłonka kliknij dwukrotnie, aby zamknąć wielokąt.

Następnie naciśnij klawisz M, aby otworzyć okno wyników. Wartość w kolumnie area odpowiada MEA. Jeśli nabłonek gruczołowy rozciąga się poza węzeł chłonny, podczas obliczania gęstości rozgałęzień należy odjąć powierzchnię węzła chłonnego od MEA.

Powierzchnię węzła chłonnego można zmierzyć w ten sam sposób, co powierzchnię MEA. Z zastosowaniem opisanych metod przeanalizowano dwie grupy szczurów w tym samym wieku. Zwierzęta w grupie B leczono substancją chemiczną znaną z wywoływania przedwczesnego rozwoju gruczołów mlekowych.

Wykreślenie liczby przecięć gałęzi wzdłuż promienia od gruczołu obrazuje zmienność uzyskanych wyników. Wyniki analizy Sholla wykazały wyraźną różnicę w średniej liczbie przecięć pomiędzy grupami. Jednakże, aby wyciągnąć wnioski, dane dotyczące przecięć muszą zostać znormalizowane do powierzchni gruczołu mlekowego.

Analiza Sholl oraz pomiary powierzchni nabłonka gruczołu mlekowego dostarczają dwóch parametrów fizjologicznych przydatnych do przeprowadzenia analizy porównawczej. Wyraźnie widać, że rozmiar gruczołów był znacznie większy w grupie badawczej. Analiza Sholl dostarcza wartość Sum N, która służy do obliczenia gęstości rozgałęzień oraz wartości k.

W grupie badanej wyższa średnia gęstość rozgałęzień oraz niższa średnia wartość k, odzwierciedlająca niższe tempo zaniku rozgałęzień, wskazują, że zwierzęta poddane działaniu preparatu miały lepiej rozwinięte gruczoły niż zwierzęta nieleczone. Podczas wykonywania tej procedury należy pamiętać, że usunięcie szumów jest najważniejszym etapem. Usunięcie zbyt dużej lub zbyt małej ilości szumów może naruszyć integralność gruczołu i zniekształcić wyniki.

Podczas stosowania tej metody ważne jest, aby rozpocząć od nieskazitelnego preparatu całego kopca piersiowego. Dokładnego obrazu szkieletowego nie można uzyskać, jeśli występują niedoskonałości, takie jak rozdarcia lub fałdy. Stworzenie precyzyjnego obrazu szkieletowego wymaga cierpliwości i praktyki.

Po opanowaniu tej techniki, przy prawidłowym wykonaniu, analiza jednej przywiaszki zajmuje od 15 do 20 minut.