Kwantyfikacja gęstości rozgałęzień w całych wierzchowcach gruczołu sutkowego szczura przy użyciu metody analizy Sholla

Ogólnym celem tej metody wspomaganej komputerowo jest obiektywne ilościowe określenie gęstości rozgałęzień gruczołu sutkowego i rozpadu rozgałęzień, dwóch ważnych wskaźników rozwojowych u gryzoni, poprzez zastosowanie zmodyfikowanej analizy Sholla do obrazów gruczołu sutkowego w całości. Ta metoda może pomóc odpowiedzieć na pytania z zakresu biologii gruczołu sutkowego, takie jak to, w jaki sposób narażenie chemiczne może zmienić rozwój gruczołu sutkowego. Główną zaletą tej techniki jest to, że wykorzystuje ona oprogramowanie open source do obiektywnego ilościowego określenia podstawowych cech rozwoju gruczołu sutkowego.

Do tej procedury należy mieć zdjęcia całych wierzchowców pokazujących nabłonek gruczołowy w stałym powiększeniu. Aby rozpocząć, otwórz obraz w ImageJ. Następnie wybierz narzędzie odręczne.

Obrysuj wokół nabłonka gruczołowego i oczyść okolicę. Następnie obrysuj okolice węzła chłonnego i usuń tę część obrazu za pomocą polecenia wytnij. Jeśli tło obrazu jest czarne, należy je przekonwertować na białe.

Kliknij Edycja, następnie Opcje, a następnie Kolory. W oknie dialogowym wybierz kolor biały z menu rozwijanego opcji tła. Chociaż tło może pozostać czarne, podczas przetwarzania obrazu będzie traktowane jako białe.

Teraz rozdziel kanały kolorów na trzy ośmiobitowe obrazy w skali szarości. Następnie wybierz kanał o najlepszym kontraście, którym zazwyczaj jest kanał niebieski. Teraz odejmij tło od wybranego kanału koloru.

Następnie przystąp do wyboru żądanych parametrów i wyświetlenia podglądu zmian. Sprawdź jasne tło i podgląd w oknie dialogowym, a następnie dostosuj liczbę pikseli, aż do uzyskania żądanego kontrastu. Jeśli potrzebny jest dodatkowy kontrast, użyj opcji Maska wyostrzająca.

Zaznacz opcję Podgląd w oknie dialogowym i dostosuj promień pikseli oraz grubość maski, aż do uzyskania żądanego kontrastu. Po zastosowaniu filtra maski wyostrzającej usuń obramowanie utworzone przez filtr. Kliknij przycisk podwójnej czerwonej strzałki na pasku narzędzi i wybierz Narzędzia do rysowania.

Następnie wybierz narzędzie Gumka. Dostosuj jego średnicę, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia gumki, a następnie przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby usunąć obramowanie. Podczas wymazywania dozwolony jest tylko jeden poziom cofania, więc bądź ostrożny.

Po zastosowaniu jednego z filtrów usuń pozostały szum ręcznie. Zapoznaj się z kopią oryginalnego obrazu i usuń zidentyfikowany szum, klikając najpierw przycisk podwójnej czerwonej strzałki na pasku narzędzi i wybierając narzędzia do rysowania. Następnie wybierz narzędzie gumki.

Dostosuj jego średnicę, klikając prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia gumki. Następnie przytrzymaj lewy przycisk myszy, aby usunąć szum. Podczas wymazywania dozwolony jest tylko jeden poziom cofania, więc bądź ostrożny.

Następnie dostosuj próg obrazu. Przesuń suwaki, aby dostosować minimalne i maksymalne wartości progowe, aby poprawić obraz gruczołu. Następnie kliknij przycisk Zastosuj.

Usuń dodatkowy szum automatycznie, korzystając z jednej z dwóch metod. Pierwszą opcją jest użycie polecenia despeckle. Drugą opcją jest użycie polecenia usuwania wartości odstających.

W tym procesie piksel jest zastępowany medianą jego bezpośredniego otoczenia tylko wtedy, gdy piksel odbiega od mediany o więcej niż wartość progową zdefiniowaną przez użytkownika. Teraz, korzystając z oryginalnego obrazu do porównania, zrekonstruuj części nabłonka gruczołowego, które zostały usunięte przez progowanie i usuwanie szumów. Podczas rekonstrukcji obrazu należy pamiętać, aby zrobić to ostrożnie i w minimalnym stopniu, aby zachować integralność obrazu.

Wybierz narzędzie do puszki ze sprayem z narzędzi do rysowania. Kliknij prawym przyciskiem myszy przycisk narzędzia do puszki ze sprayem, aby dostosować rozmiar narzędzi, a następnie ostrożnie wypełnij brakujące sekcje dławika za pomocą lewego przycisku myszy. Następnie utwórz szkieletowy obraz dławika do analizy Sholla.

Najpierw umieść obraz w formacie binarnym. Następnie zszkieletuj obraz. Powoduje to wielokrotne usuwanie pikseli z krawędzi obrazu binarnego, aż zostanie on zredukowany do pojedynczego kształtu o szerokości piksela.

Teraz rozszerz obraz raz, aby zamknąć luki powstałe w wyniku progowania i szkieletowania. Następnie zapisz obraz jako nowy plik za pomocą polecenia Zapisz jako. Na koniec sprawdź dokładność obrazu szkieletu w stosunku do oryginału, nakładając na siebie dwa obrazy.

W oknie dialogowym dodawania obrazu wybierz obraz szkieletu i ustaw jego krycie na 30%Następnie zapisz nakładkę jako nowy obraz do wykorzystania w przyszłości. Aby rozpocząć, otwórz obraz szkieletu i przekonwertuj go na format binarny. Teraz zdefiniuj skalę obrazu.

Wprowadź liczbę pikseli na milimetr, a następnie ustaw zarówno znaną odległość, jak i proporcje pikseli na jeden, a następnie wprowadź milimetry jako jednostkę długości i przełącz opcję globalną, aby zastosować skalę do wszystkich obrazów. Następnie określ promień końcowy dla analizy Sholla za pomocą narzędzia do rysowania linii. Narysuj linię od początku przewodu pierwotnego do najbardziej dystalnego punktu nabłonka gruczołowego.

Następnie naciśnij M, a odległość linii zostanie podana w komunikacie. Teraz wprowadź ustawienia dla analizy Sholla. Najpierw wybierz opcje w sekcji definicji powłok, ustaw promień początkowy na 0,00 milimetra i ustaw rozmiar kroku promienia na 0,1 milimetra.

Ustaw liczbę próbek na jedną. Długość właśnie narysowanej linii jest automatycznie wprowadzana w polu promienia końcowego. W przypadku opcji wielu próbek na promień wybierz średnią dla całkowania.

W przypadku deskryptorów i opcji dopasowania zakrzywionego należy ustawić wartość odcięcia promienia obudowy na jeden. Wybierz opcję Wywnioskuj z promienia początkowego dla liczby gałęzi podstawowych i wybierz opcje stopnia liniowego i najlepiej dopasowanego. Następnie w obszarze profile bez normalizacji wybierz najbardziej pouczające.

Teraz w sekcji metod Sholla wybierz obszar dla profilu znormalizowanego. Na koniec w sekcji danych wyjściowych wybierz opcję utwórz maskę skrzyżowań, aby utworzyć mapę cieplną skrzyżowań. Teraz otwórz okno podglądu obrazu z pierścieniami i potwierdź obszar analizy.

Jeśli wszystko wygląda dobrze, kliknij przycisk OK, aby uruchomić analizę. Uruchomienie analizy spowoduje utworzenie okna liniowego profilu Sholl, okna półlogarytmu profilu Sholl, okna wyników Sholl, które zawiera wszystkie wartości wyjściowe profilu Sholla oraz okna Profile Sholla o nazwie pliku, które zawiera liczbę przecięć w każdym promieniu określoną przez wielomian. Aby zmierzyć MEA, pracuj na podstawie obrazu szkieletu gruczołu w ImageJ.

Otwórz narzędzie wielokąta i narysuj wielokąt wokół obwodu dławika. Użyj kliknięć myszą, aby dodać segmenty linii. Gdy cały obszar nabłonka zostanie ominięty, kliknij dwukrotnie, aby zamknąć wielokąt.

Następnie naciśnij M, aby otworzyć okno wyników. Wartość w kolumnie obszaru odpowiada MEA. Jeśli nabłonek gruczołowy jest wysunięty poza węzeł chłonny, odejmij obszar węzła chłonnego od MEA przy obliczaniu gęstości rozgałęzień.

Obszar węzłów chłonnych można zmierzyć w taki sam sposób, jak MEA. Za pomocą opisanych metod przeanalizowano dwie grupy szczurów w tym samym wieku. Zwierzętom z grupy B podawano substancję chemiczną, o której wiadomo, że powoduje przedwczesny rozwój gruczołu sutkowego.

Wykreślenie liczby przecięć gałęzi wzdłuż promienia od dławika ilustruje zmienność wyników. Wyniki analizy Sholla ujawniły wyraźną różnicę w średniej liczbie przecięć między grupami. Jednak dane dotyczące przecięć muszą zostać znormalizowane do obszaru gruczołu sutkowego, aby wyciągnąć wnioski.

Analiza Sholla i pomiary obszaru nabłonka gruczołu sutkowego dostarczają dwóch parametrów fizjologicznych przydatnych do przeprowadzania analizy porównawczej. Wyraźnie widać, że rozmiar gruczołów był znacznie większy w grupie leczonej. Analiza Sholla zwraca wartość Sumy N, która jest używana do obliczania gęstości rozgałęzień i wartości k.

W grupie leczonej wyższa średnia gęstość rozgałęzień i niższa średnia, k, która odzwierciedla niższe tempo rozpadu rozgałęzień, wskazują, że leczone zwierzęta miały lepiej rozwinięte gruczoły niż zwierzęta nieleczone. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać, że usunięcie hałasu jest najważniejszym krokiem. Usunięcie zbyt dużej lub zbyt małej ilości może zakłócić integralność gruczołu i zniekształcić wyniki.

Korzystając z tej metody, ważne jest, aby zacząć od całego kopca sutka ryscynowego. Nie można uzyskać dokładnego obrazu szkieletowego, jeśli występują niedoskonałości, takie jak rozdarcia lub fałdy. Stworzenie dokładnego szkieletowego obrazu wymaga cierpliwości i praktyki.

Po opanowaniu tę technikę można wykonać w ciągu 15 do 20 minut na analizowany gruczoł, jeśli zostanie wykonana prawidłowo.