Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Ogólnym celem tej procedury jest wytworzenie wysokiej jakości kryształów w warunkach wstępnego badania przesiewowego krystalizacji. Kryształy mogą być wykorzystywane do badania struktur białek, DNA, RNA i ich kompleksów. Coś na temat struktur makromolekularnych staje się coraz większym wyzwaniem.

Zapewnienie szerokiej gamy warunków początkowych zwiększa wydajność użytecznych kryształów, jednocześnie zmniejszając potrzebę optymalizacji próbek i kryształów. Dwa w pełni zautomatyzowane systemy, LMB, ułatwiają przygotowanie do 1 920 eksperymentów dyfuzji pary w nanolitrowych kropelkach. Dla zwięzłości zakłada się, że użytkownicy są już zaznajomieni z podstawowymi funkcjami i konserwacją dozownika nanolitrów, drukarki atramentowej i zgrzewarki do płyt samoprzylepnych.

Przed wykonaniem procedury należy upewnić się, że roboty systemu są zainicjowane, a ich oprogramowanie sterujące jest otwarte. Włącz agregat chłodniczy rurowego nośnika chłodzącego na około 30 minut przed rozpoczęciem programu głównego. Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt.

Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy folia jest prawidłowo nałożona. Powtórz ten test jeszcze dwa razy, aby sprawdzić, czy uszczelniacz do płyt jest gotowy. Następnie dodaj 20 litrów wody dejonizowanej do głównego pojemnika urządzenia do obsługi cieczy.

Odłącz wkładki sprzęgające od mniejszego pojemnika z 20% roztworem płuczącym etanolu i podłącz wkładki do głównego pojemnika. Wprowadź odpowiednią nazwę ekranu na ekranie dotykowym drukarki atramentowej. Następnie otwórz i zamknij drzwi karuzeli, aby uruchomić obrót karuzeli.

Otwórz drzwi, gdy pojawi się pierwszy stos. W pełni załaduj pierwszy stos 22 płytkami krystalizacyjnymi, każda z kolumną skierowaną na zewnątrz. W ten sam sposób w pełni załaduj kolejne dwa stosy.

Załaduj pozostałe sześć talerzy w najwyższe pozycje czwartego stosu, a następnie zamknij drzwi karuzeli. Sprawdź, czy wyświetlacz agregatu chłodniczego wskazuje 14 stopni Celsjusza. Delikatnie i wielokrotnie odwracaj wybrane zestawy do badań przesiewowych przez jedną minutę.

Następnie otwórz przedni panel uchwytu do cieczy. Otwórz rurki i umieść je w nośniku chłodzącym w standardowym układzie 96-dołkowym. Po umieszczeniu każdej probówki w nosidełku umieść jej pokrywkę na tacy w tym samym układzie 96 dołków.

W przypadku korzystania z Systemu 1 przewody etykiet są umieszczane na tacy w układzie 96-dołkowym, aby umożliwić sprawdzenie, czy probówki są prawidłowo ułożone. Sprawdź krzyżowo pozycje rur, a następnie upewnij się, że wszystkie rurki są wypoziomowane i osadzone w nośniku. Następnie zamknij panel przedni.

W oknie Start(Start) oprogramowania do obsługi cieczy (Liquid handler) wybierz opcję Run Maintenance (Uruchom konserwację) i otwórz program Flushing (Płukanie). Uruchom program, aby wypłukać 20% etanol z systemu i umyć zewnętrzną część końcówek dozujących płyny. Po zakończeniu opróżniania kliknij przycisk Anuluj, aby powrócić do uruchamiania.

Wybierz opcję Uruchom istniejący proces i kliknij przycisk Rozpocznij wybór. Otwórz program dozowania MRC Kit. Wypełnij 18 "dla instancji na ekranie konfiguracji i uruchom program, monitoruj system, gdy pierwsze cztery tabliczki są oznaczone, wypełnione i zapieczętowane.

Nie pozostawiaj systemu bez nadzoru, dopóki nie zostanie zakończone przygotowanie pierwszych czterech płytek. Po przygotowaniu wszystkich 72 płytek i umieszczeniu ich z powrotem w karuzeli, zmień wkładki sprzęgające z pojemnika na wodę dejonizowaną na pojemnik na 20% etanolu. Uruchom program do opróżniania startowego, korzystając z tego samego procesu, co poprzednio.

Wyłącz agregat chłodniczy i wyrzuć puste rurki zestawu przesiewającego. Ostrożnie wyjmij 72 przygotowane talerze z karuzeli. Wyrzuć nieprawidłowo wypełnione lub źle uszczelnione płyty.

Gotowe do użycia talerze przechowuj w temperaturze 10 stopni Celsjusza. Najpierw upewnij się, że roboty systemu są włączone, dozownik nanolitrów jest zainicjowany z otwartym oprogramowaniem, a menedżer metod osoby zajmującej się obsługą płynów jest otwarty. Włącz nośnik chłodzący mikrorurkę na około 15 minut przed rozpoczęciem programu głównego.

Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt. Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy płyta jest prawidłowo uszczelniona. Przetestuj zgrzewarkę do płyt trzy razy.

Następnie uruchom dozownik nanolitrów, aby ustawić 100 nanolitrowych kropelek roztworu testowego na płytce testowej. Pokazano tutaj świetlistą mikrofotografię kropli o pojemności 100 nanolitrów, wytworzonej przez dozownik nanolitrowy, z roztworem testowym wykonanym z czerwonego barwnika. Zamknij oprogramowanie dozownika nanolitrów i wyjmij blok uchwytu paska z pokładu.

Następnie umieść w specjalnie zaprojektowanym uchwycie płytki, wstępnie napełnioną 96-dołkową płytkę krystalizacyjną z największą względną ilością lotnych odczynników w swoich warunkach. Usuń folię samoprzylepną z płytki. Otwórz przedni panel obsługi cieczy i umieść nieuszczelnioną płytę na pokładzie z tyłu pierwszego przesuwanego nośnika.

Przykryj talerz aluminiową pokrywką SBS. Ustaw pokrywę w kierunku tylnego lewego rogu nosidełka, delikatnie naciskając na przeciwległy róg pokrywy. W przypadku korzystania z Systemu 2 należy najpierw przetworzyć zestawy przesiewowe ze znacznymi ilościami odczynników lotnych.

Pozwala to uniknąć tworzenia się kondensatu na przewodach SBS, co mogłoby spowodować automatyczne przekazywanie przewodów lub uszczelnianie płyt. Rozszczelnić, załadować do przesuwnych nośników i przykryć pozostałe 19 płyt w ten sam sposób, pracując w warunkach największej do najmniej lotnej. Gdy nośnik chłodzący mikrorurkę osiągnie temperaturę 4 stopni Celsjusza, co sygnalizuje zielone światło, zdejmij jego pokrywę.

Odciąć pokrywkę mikroprobówki zawierającej co najmniej 440 mikrolitrów próbki białka. Upewnij się, że próbka nie ma piany powyżej menisku, ponieważ będzie to kolidować z systemem wykrywania cieczy. Umieść rurkę w pozycji 1 nośnika chłodzącego mikroprobówki.

Umieścić płytkę PCR na pokładzie do obsługi cieczy przed ruchomym nośnikiem adaptera z płytą. Następnie zamknij panel przedni. W interfejsie zarządzania metodą obsługi cieczy wybierz opcję Setup Plates (Płyty montażowe).

Monitoruj inicjalizację obu systemów i wypełniaj parametry przebiegu, w tym typ płyty i liczbę kropli dla każdego warunku, rozmiar kropli, pozycję pierwszej płyty do obróbki oraz liczbę płyt. Kliknij Nie, gdy pojawi się pytanie, czy potrzebujesz pomocy przy ładowaniu talii. Po sprawdzeniu, czy nie ma pustych stojaków na końcówki, kliknij przycisk OK. Po sprawdzeniu, czy jest wystarczająca liczba wskazówek dotyczących przebiegu, kliknij przycisk OK. W razie potrzeby zaktualizuj system zarządzania końcówkami i kliknij przycisk OK. Upewnij się, że pokład dozownika nanolitrów jest wolny od bloku uchwytu paska, a nośnik znajduje się z tyłu stosów końcówek o pojemności 50 mikrolitrów, z dala od aluminiowych pokryw SBS.

Dokładnie sprawdź, czy wszystkie inne wymagane komponenty są gotowe, a następnie rozpocznij proces. Monitoruj system, gdy dozownik nanolitrów ustawia krople w pierwszej płytce, a następnie zgrzewarka do płytek uszczelnia płytkę. Nie pozostawiaj systemu bez nadzoru, dopóki nie zakończy się przygotowanie pierwszej płytki.

Gdy wszystkie 20 płytek zostanie przygotowanych z kropelkami krystalizacji i automatycznie powróci do przesuwanych nośników, otwórz panel przedni i delikatnie wyjmij płytki. Sprawdź, czy płytki są prawidłowo zamknięte przed przechowywaniem ich do krystalizacji. Oczyść pokrywki SBS 20% roztworem etanolu przed ułożeniem ich po lewej stronie pojemnika na płyny do przechowywania.

Wyrzucić płytkę PCR i mikroprobówkę. Wyłącz pojemnik chłodzący mikrorurki i zetrzyj kondensację. Pozostaw ręcznik papierowy na chłodniejszej powierzchni, aby wchłonąć dalszą kondensację.

Następnie załóż pokrywę bagażnika i zamknij panel przedni. OmpF i MreB zostały początkowo przebadane przy użyciu tych w pełni zautomatyzowanych protokołów. Kryształy OmpF o jakości wystarczającej do dyfrakcji rentgenowskiej znaleziono w studzience A4 płytki LMB 7.

Kryształy o jakości dyfrakcyjnej MreB znaleziono w studzience D12 płytki LMB 20. Przechowywanie płyt paliwowych w temperaturze 10 stopni Celsjusza to kompromis, który pozwala uniknąć zamarzania i przechowywania w temperaturze 4 stopni, co może spowodować pogorszenie warunków krystalizacji i problemy związane z kondensacją. Przechowywane w ten sposób płytki mogą być zużyte w ciągu czterech do pięciu miesięcy.

Rocznie w Systemie 1 produkowanych jest od 4 do 8 000 płytek LMB, które są następnie wykorzystywane do wstępnych badań przesiewowych. Protokoły powinny być inaczej optymalizowane, gdy oczekiwany obrót jest znacznie niższy. Cały nasz zestaw płyt paliwowych jest zwykle używany jako duże sito początkowe dla nowej próbki.

Można jednak wybrać mniej płytek do bardzo szczegółowych wymagań próbki. Po przygotowaniu kropel talerze są przechowywane na półkach o niskim poziomie wibracji, w których temperatura jest ściśle kontrolowana na poziomie 4 lub 18 stopni Celsjusza. Eksperymenty są oceniane za pomocą mikroskopów ze spiralnymi źródłami światła.

Po dokładnym zbadaniu natury kryształów, cechy i podobieństwa w różnych warunkach mogą być analizowane za pomocą narzędzi internetowych, takich jak bazy danych LMB lub C6 Screen. Dalsza optymalizacja warunków krystalizacji może być nadal konieczna. Dodatkowe zautomatyzowane protokoły, z metodami 4-narożnymi i przesiewowym addytywnym, są opisane w naszym manuskrypcie.