Name: Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-24T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 20 s
Description: Poznaj zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC. Metoda umożliwia przygotowanie do 1920 eksperymentów dyfuzji parowej w nanolitrowych kroplach dla badań strukturalnych białek, DNA i RNA.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ośrodek krystalizacji MRC-LMB jest uprzejmie wspierany przez Radę Badań Medycznych (UK). Dziękujemy członkom LMB za ich wsparcie: Oldze Perisic (PNAC), Tony'emu Warne'owi, Fusinicie Van den Ent i Patowi Edwardsowi (Badania Strukturalne), Steve'owi Scotcherowi i pozostałym członkom Warsztatu Mechanicznego, Neilowi Grantowi i Jo Westmoreland (Pomoce wizualne), Paulowi Hartowi i Tomowi Prattowi (IT). Chcielibyśmy również podziękować Steve'owi Elliotowi (Tecan, Wielka Brytania), Mitchellowi Stuartowi i Heather Ringrose (Hamilton Robotics, Wielka Brytania), Paulowi Thawowi, Robertowi Lewisowi i Joby'emu Jenkinsowi (TTP Labtech, Wielka Brytania), Paulowi Reardonowi (Swissci AG, Szwajcaria), George'owi Stephensowi i Donaldowi Oggowi (Alphabiotech, Wielka Brytania), Neilowi Williamsowi (Markem Imaje, Wielka Brytania) oraz Grahamowi Harrisowi (The Cleveland Agency) za pomoc techniczną.

1. Dwa w pełni zautomatyzowane systemy (wstępne badanie)
<ol>
	<li>System 1: przygotowanie 72 96-dołkowych płytek krystalizacyjnych wypełnionych zestawami do przesiewania (płytki LMB)
	<ol>
		<li>Przed wykonaniem procedury należy upewnić się, że roboty systemu są zainicjowane, a ich oprogramowanie sterujące jest otwarte. Włączyć agregat chłodniczy nośnika chłodzenia rurowego na około 30 minut przed rozpoczęciem programu głównego.</li>
		<li>Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt. Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy folia jest prawidłowo nałożona. Powtórz ten test jeszcze dwa razy, aby sprawdzić, czy uszczelniacz do płyt jest gotowy.</li>
		<li>Następnie dodaj 20 l wody dejonizowanej do głównego pojemnika urządzenia do obsługi cieczy. Odłączyć wkładki sprzęgające od małego pojemnika (20% roztwór płuczący etanolu) i podłączyć wkładki do głównego pojemnika.</li>
		<li>Wprowadź odpowiednią nazwę ekranu (Tabela 1) na ekranie dotykowym drukarki atramentowej. Następnie otwórz i zamknij drzwi karuzeli, aby uruchomić obrót karuzeli. Otwórz drzwi, gdy pojawi się pierwszy stos.</li>
		<li>Całkowicie załaduj pierwszy stos 22 płytkami krystalizacyjnymi, każda z kolumną 1 skierowaną na zewnątrz. W ten sam sposób w pełni załaduj kolejne dwa stosy.</li>
		<li>Załaduj pozostałe 6 talerzy na najwyższe pozycje czwartego stosu. Następnie zamknij drzwi karuzeli.</li>
		<li>Sprawdź, czy wyświetlacz agregatu chłodniczego wskazuje 14 °C. Delikatnie i wielokrotnie odwracaj wybrane zestawy przesiewcze przez 1 minutę. Następnie otwórz przedni panel uchwytu do cieczy.</li>
		<li>Otwórz rurki i umieść je w nośniku chłodzącym zgodnie ze standardowym układem 96 dołków (A1, A2 itd.). Po umieszczeniu każdej probówki w nosidełku umieść jej pokrywkę na tacy w tym samym układzie 96 dołków.</li>
		<li>Sprawdź krzyżowo pozycje rur i upewnij się, że wszystkie rurki są wypoziomowane i osadzone w nośniku. Następnie zamknij panel przedni.</li>
		<li>W oknie "Uruchamianie" oprogramowania do obsługi cieczy wybierz opcję "Uruchom konserwację" i otwórz program płukania. Uruchom program, aby wypłukać 20% etanol z systemu i umyć zewnętrzną część końcówek dozujących płyn</li>.
		<li>Po zakończeniu opróżniania kliknij "Anuluj", aby powrócić do "Uruchamiania". Wybierz opcję "Uruchom istniejący proces" i kliknij "Rozpocznij wybór". Otwórz program "Dozowanie zestawu MRC". Wpisz "18" dla "Instancji" na ekranie konfiguracji i uruchom program.</li>
		<li>Monitoruj system, gdy pierwsze cztery płytki są etykietowane, napełniane i plombowane.</li>
		<li>Po przygotowaniu wszystkich 72 płytek i umieszczeniu ich z powrotem w karuzeli, zmień wkładki sprzęgające z głównego pojemnika na mały pojemnik. Uruchom program 'Start up flush' (patrz krok 1.1.10).</li>
		<li>Wyłącz agregat chłodniczy i wyrzuć puste rurki zestawu przesiewającego. Ostrożnie wyjmij 72 przygotowane talerze z karuzeli. Wyrzuć nieprawidłowo wypełnione lub źle uszczelnione talerze. Gotowe do użycia talerze należy przechowywać w temperaturze 10 °C.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>System 2: ustawienie kropelek krystalizacji (stan 100 nL białka + 100 nL) z pojedynczej próbki na 20 płytkach LMB
	<ol>
		<li>Najpierw upewnij się, że roboty systemu są włączone, dozownik nanolitrów jest zainicjowany z otwartym oprogramowaniem, a menedżer metod obsługi cieczy jest otwarty. Włącz nośnik chłodzący mikrorurki na około 15 minut przed rozpoczęciem programu głównego.</li>
		<li>Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płyt. Uruchom zgrzewarkę do płyt i sprawdź, czy płyta jest prawidłowo uszczelniona. Przetestuj zgrzewarkę do płyt trzy razy.</li>
		<li>Następnie uruchom dozownik nanolitrów, aby ustawić 100-nL kropelki roztworu testowego na płytce testowej. Sprawdź pod mikroskopem, czy kropelki są prawidłowo ustawione. Zamknij oprogramowanie dozownika nanolitrów i wyjmij blok uchwytu paska z pokładu.</li>
		<li>Następnie włożyć do specjalnie zaprojektowanego uchwytu płytki (patrz Reprezentatywne wyniki: Urządzenia do krystalizacji opracowane w LMB) płytkę LMB z największą względną ilością lotnych odczynników w swoich warunkach (Tabela 1). Usuń folię samoprzylepną z płytki.</li>
		<li>Otwórz przedni panel wózka do obsługi cieczy i umieść nieuszczelnioną płytę na pokładzie, z tyłu pierwszego przesuwnego nośnika (przesuwne nośniki można wyciągnąć w celu ułatwienia dostępu).</li>
		<li>Przykryj talerz aluminiową pokrywką SBS. Ustaw pokrywę w kierunku tylnego lewego rogu nosidełka, delikatnie naciskając na przeciwległy róg pokrywy.</li>
		<li>Rozszczelnić, załadować do przesuwnych nośników i przykryć pozostałe 19 płyt w ten sam sposób, pracując w warunkach największej do najmniej lotnej. Gdy nośnik chłodzący mikrorurki osiągnie temperaturę 4 °C, co sygnalizuje zielone światło, zdejmij jego pokrywę.</li>
		<li>Odciąć pokrywkę mikroprobówki zawierającej (co najmniej) 440 μl próbki białka (tabela 2). Upewnij się, że próbka nie ma piany powyżej menisku, ponieważ będzie to kolidować z systemem wykrywania cieczy. Umieść rurkę w pozycji 1 nośnika chłodzącego mikrorurki.</li>
		<li>Umieść płytkę PCR na pokładzie do obsługi cieczy przed nośnikiem adaptera do przesuwania płyty. Następnie zamknij panel przedni.</li>
		<li>Po załadowaniu pokładu upewnij się, że pokład dozownika nanolitrów jest wolny od bloku uchwytu paska i że nośniki z tyłu stosów końcówek o pojemności 50 μl są wolne od aluminiowych pokryw SBS.</li>
		<li>W interfejsie "Zarządzanie metodami" w module obsługi cieczy wybierz opcję "Płyty nastawcze". Monitoruj inicjalizację obu systemów i wypełnij parametry uruchamiania. Postępuj zgodnie ze wskazówkami interfejsu zarządzania metodą (podpowiedzi, rysunki i system zarządzania końcówkami pomagają w przygotowaniu).</li>
		<li>Dokładnie sprawdź, czy wszystkie wymagane komponenty są gotowe, a następnie rozpocznij proces.</li>
		<li>Monitoruj system, gdy dozownik nanolitrów ustawia krople w pierwszej płytce, a następnie zgrzewarka do płytek uszczelnia płytkę.</li>
		<li>Gdy wszystkie 20 płytek zostanie przygotowanych z kropelkami krystalizacji i automatycznie zwróconych do przesuwanych nośników, otwórz panel przedni i delikatnie wyjmij płytki. Sprawdź, czy płytki są prawidłowo zamknięte przed przechowywaniem ich do krystalizacji.</li>
		<li>Oczyść pokrywki SBS 20% roztworem etanolu przed ułożeniem ich po lewej stronie pojemnika na płyny do przechowywania. Wyrzucić płytkę PCR i mikroprobówkę.</li>
		<li>Wyłącz nośnik chłodzący mikrorurki i zetrzyj kondensację. Pozostaw ręcznik papierowy na chłodniejszej powierzchni, aby wchłonąć dalszą kondensację. Następnie załóż pokrywę bagażnika i zamknij panel przedni.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Optymalizacja warunków
<ol>
	<li>Strzykawkowy płyn: wytwarzanie dwóch liniowych gradientów stężeń w zbiornikach płytki krystalizacyjnej (metoda 4-kątna).
	<ol>
		<li>Najpierw upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy jest włączone i zainicjowane z otwartym oprogramowaniem.</li>
		<li>Na karcie 'GRADIENT': Otwórz żądany program, wybierz typ płytki krystalizacyjnej i końcową objętość w zbiornikach (Tabela 3). Zaawansowane ustawienie "maksymalnej objętości strzału" należy obniżyć z 6 000 do 3 000 w przypadku stosowania roztworów zawierających [izopropanol] > 10% v/v i [MPD] > 20% v/v.</li>
		<li>Przygotować strzykawki. Umieść tłok w każdej strzykawce (spiczastymi końcami do dołu) i włóż tylną część strzykawek do wyznaczonych rowków pod głowicą robota. Przekręcić strzykawkę zgodnie z ruchem wskazówek zegara, aby zablokować ją na miejscu (program rozpocznie się tylko wtedy, gdy wszystkie wymagane strzykawki są prawidłowo podłączone).</li>
		<li>Przygotuj koryta. Zdejmij ramę ze stali nierdzewnej i włóż koryta. 4 pozycje po lewej stronie odpowiadają 4 rogom A, B, C, D. Przełącz na zakładkę "SET UP", która wyświetla objętości roztworów wymagane w każdej strzykawce (w Tabeli 3 do wyświetlanych objętości dodano 0,5 ml martwej objętości). Wlej roztwory narożne do odpowiednich koryt i umieść ramę z powrotem na pokładzie (rama utrzymuje się na miejscu za pomocą 2 małych magnesów umieszczonych z przodu pokładu). Alternatywnym sposobem wykonania tego kroku jest wlanie roztworów do koryt, gdy są już umieszczone na pokładzie.</li>
		<li>Umieścić płytkę krystalizacyjną na zmotoryzowanym nośniku SBS.</li>
		<li>Kliknij "ASPIRATE" i poczekaj, aż ten krok zostanie zakończony (gdy tłoki zatrzymają się w drodze do góry).</li>
		<li>Przejdź do zakładki "URUCHOM" i uruchom program.</li>
		<li>Po zakończeniu programu wróć do zakładki SET UP i kliknij "USUŃ": system oczyszcza strzykawki z resztek roztworów, a następnie podnosi tłoki do góry. Zamiast "REMOVE" można zażądać "PURGE"; spowoduje to pozostawienie tłoków w dolnym położeniu, gotowych do zasysania większej liczby roztworów za pomocą tych samych strzykawek.</li>
		<li>Wyjąć strzykawki, przekręcając je w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.</li>
		<li>Wyrzuć strzykawki i koryta do odpowiedniego pojemnika (lub spłucz je wodą dejonizowaną, a następnie 20% v/v roztworem etanolu do ponownego użycia).</li>
		<li>Uszczelnij płytkę i umieść ją na mieszalniku do mikropłytek na 3 minuty przy 1 000 obr./min lub 10 minut, gdy mieszane są roztwory o dużej lepkości. Płytka jest gotowa do ustawiania kropelek krystalizacji na dozowniku nanolitrów.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół badania przesiewowego dodatków 1 (umieszczanie kropelek krystalizacji w 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej wstępnie wypełnionej sitkiem z dodatkami)
	<ol>
		<li>Najpierw należy przygotować warunek z początkowymi stężeniami odczynników zwiększonymi o 10% (min. obj. 15 ml przy przenoszeniu stanu z pojemnika na sito dodatku z płynem).</li>
		<li>Upewnij się, że urządzenie do obsługi cieczy jest gotowe do pracy. Otwórz program 'Dodaj sitko do dodatków' dla pojedynczej płytki (w zbiornikach wpisać objętość: '72 μL'). Podpowiedzi, cyfry i system zarządzania końcówkami (wymagane końcówki 12 x 1 000 μl) pomagają upewnić się, że robot jest gotowy do pracy zgodnie z wybranymi opcjami.</li>
		<li>Wyjmij sitko z dodatkiem z inkubatora o temperaturze -20 °C i natychmiast zdejmij jego aluminiową uszczelkę (użyj uchwytu na płytkę), a następnie umieść płytkę na pokładzie urządzenia do obsługi cieczy. Program działa w układzie pionowym (tabliczka jest umieszczona z rogiem A1 znajdującym się z przodu po lewej stronie nośnika). Umieść również pojemnik wypełniony stanem. Uruchom program.</li>
		<li>Po napełnieniu zbiorników płytki umieść ją na wytrząsarce do mikropłytek i uruchom program. Wypłukać pojemnik z kondycją wodą dejonizowaną i 20 % etanolem do ponownego użycia.</li>
		<li>Ustaw kropelki na dozowniku nanolitrów. Najpierw rozszczelnić płytkę krystalizacyjną (użyć uchwytu płytki). Następnie umieść płytkę i 8-dołkowy pasek białkowy w pierwszej pozycji bloku uchwytu paska. Zakładka "Ustawienia" w oprogramowaniu sterującym wyświetla rzeczywiste pozycje każdego elementu na pokładzie. Załadować każdą studzienkę paska próbką białka zgodnie z wymaganą wielkością kropli (Tabela 4). Uruchom program, aby przygotować kropelki.</li>
		<li>Po zakończeniu programu zdejmij płytkę z pokładu i natychmiast ją uszczelnij (użyj uszczelniacza do płyt, taśmy klejącej o szerokości 3 cali). Wyrzuć pasek do odpowiedniego pojemnika.</li>
		<li>Oceń wielkość, kształt i wyśrodkowanie kropelek pod mikroskopem przed przechowywaniem.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Protokół przesiewania dodatków 2 (umieszczanie kropelek krystalizacji na 96-dołkowej płytce krystalizacyjnej z sitkiem do wielokrotnego użytku)
	<ol>
		<li>Najpierw przygotuj sitko z dodatkiem: pozostaw odpowiednią zamrożoną 96-dołkową płytkę do hodowli komórkowej do rozmrożenia w temperaturze pokojowej przez 40 minut. Następnie odwirować przesiewanie dodatku o sile 1 000 x g przez 2 minuty.</li>
		<li>Przygotować warunek (min. 15 ml przy przenoszeniu warunku z pojemnika na sito dodatków za pomocą urządzenia do obsługi cieczy).</li>
		<li>Napełnij zbiorniki 96-dołkowej płytki krystalizacyjnej warunkiem. Na urządzeniu do obsługi cieczy postępować w taki sam sposób, jak w protokole 1, krok 2.2.2, ale wprowadzić "80 μl" dla objętości w zbiornikach.</li>
		<li>Umieść kropelki na dozowniku nanolitrów z 3 składnikami na pokładzie (płytka zawierająca sitko z dodatkiem, wraz z płytką krystalizacyjną i 8-dołkowym paskiem białkowym w pierwszej pozycji bloku uchwytu na paski, tabela 4).</li>
		<li>Uszczelnić płytkę do hodowli komórkowej zawierającą sito blachą aluminiową i umieścić ją z powrotem w inkubatorze o temperaturze -20 °C.</li>
		<li>Oceń wielkość, kształt i wyśrodkowanie kropelek pod mikroskopem przed przechowywaniem.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Rupp, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aRupp%2C+B+%22Biomolecular+Crystallography%3A+Principles%2C+Practice+and+Application+to+Structural+Biology%22">Biomolecular Crystallography: Principles, Practice and Application to Structural Biology</a>. , Garland Science. (2010).</li>
<li>McPherson, A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15325645">Introduction to protein crystallization.</a> Methods. 34, 254-265 (2004).</li>
<li>Bergfors, T. M. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergfors%2C+TM+%22Protein+crystallization%3A+techniques%2C+strategies%2C+and+tips%3A+a+laboratory+manual%22">Protein crystallization: techniques, strategies, and tips: a laboratory manual</a>. , International University Line. La Jolla, Calif. (1999).</li>
<li>Dessau, M. A., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+Crystallization+for+X-ray+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Protein Crystallization for X-ray Crystallography.</a> J. Vis. Exp. (47), e2285(2011).</li>
<li>Crick, F. H. C. <a target="_blank" href="https://profiles.nlm.nih.gov/ps/access/SCBBZV.pdf">X-Ray Diffraction of Protein Crystals.</a> Methods Enzymol. 4, 127-146 (1957).</li>
<li>Jaskolski, M., Dauter, Z., Wlodawer, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+brief+history+of+macromolecular+crystallography%2C+illustrated+by+a+family+tree+and+its+Nobel+fruits%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A brief history of macromolecular crystallography, illustrated by a family tree and its Nobel fruits.</a> FEBS J. 281, 3995-4009 (2014).</li>
<li>Chruszcz, M., Wlodawer, A., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+Protein+Structures-A+Series+of+Fortunate+Events%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Determination of Protein Structures-A Series of Fortunate Events.</a> Biophys. J. 95, 1-9 (2008).</li>
<li>Manjasetty, B. A., Büssow, K., Panjikar, S., Turnbull, A. P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC3376864/">Current methods in structural proteomics and its applications in biological sciences.</a> 3 Biotech. 2, 89-113 (2012).</li>
<li>Carter, C. W., Carter, C. W. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/500706">Protein crystallization using incomplete factorial experiments.</a> J. Biol. Chem. 254, 12219-12223 (1979).</li>
<li>Jancarik, J., Kim, S. H. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?S0021889891004430">Sparse matrix sampling: a screening method for crystallization of proteins.</a> J. Appl. Cryst. 23, 409-411 (1991).</li>
<li>Stevens, R. C. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0959440X00001317">High-throughput protein crystallization.</a> Curr. Opin. Struct. Biol. 10, 558-563 (2000).</li>
<li>Berry, I. M., Dym, O., Esnouf, R. M., Harlos, K., Meged, R., Perrakis, A., Sussman, J. L., Walter, T. S., Wilson, J., Messerschmidt, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPINE+high-throughput+crystallization%2C+crystal+imaging+and+recognition+techniques%3A+current+state%2C+performance+analysis%2C+new+technologies+and+future+aspects%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">SPINE high-throughput crystallization, crystal imaging and recognition techniques: current state, performance analysis, new technologies and future aspects.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 62, 1137-1149 (2006).</li>
<li>Luft, J. R., Collins, R. J., Fehrman, N. A., Lauricella, A. M., Veatch, C. K., DeTitta, G. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+deliberate+approach+to+screening+for+initial+crystallization+conditions+of+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">A deliberate approach to screening for initial crystallization conditions of biological macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 142, 170-179 (2003).</li>
<li>Moraes, I., Evans, G., Sanchez-Weatherby, J., Newstead, S., Stewart, P. D. S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/23860256">Membrane protein structure determination-the next generation.</a> Biochim. Biophys. Acta. 1838, 78-87 (2014).</li>
<li>Stock, D., Perisic, O., Löwe, J. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/15652247">Robotic nanoliter protein crystallisation at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Prog. Biophys. Mol. Biol. 88, 311-327 (2005).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+current+approach+to+initial+crystallization+screening+of+proteins+is+under-sampled%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Cryst%22%5BJournal%5D)">The current approach to initial crystallization screening of proteins is under-sampled.</a> J. Appl. Cryst. 46, 795-797 (2013).</li>
<li>Hennessy, D. N., Narayanan, B., Rosenberg, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automatic+implementation+of+precise+grid+screens%3A+the+four-corners+method%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Automatic implementation of precise grid screens: the four-corners method.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1001-1003 (2009).</li>
<li>Cudney, R., Patel, S., Weisgraber, K., Newhouse, Y., McPherson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+and+optimization+strategies+for+macromolecular+crystal+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Screening and optimization strategies for macromolecular crystal growth.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 50, 414-423 (1994).</li>
<li>DiLorenzo, M. E., Timoney, C. F., Felder, R. A. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/full/10.1016/S1535-5535-04-00123-6">Technological Advancements in Liquid Handling Robotics.</a> JALA. 6, 36-40 (2001).</li>
<li>Jenkins, J., Cook, M. <a target="_blank" href="http://journals.sagepub.com/doi/abs/10.1016/j.jala.2004.04.020">Mosquito: An Accurate Nanoliter Dispensing Technology.</a> JALA. 9, 257-261 (2004).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+a+Robot+for+High-throughput+Crystallization+of+Membrane+Proteins+in+Lipidic+Mesophases%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Use of a Robot for High-throughput Crystallization of Membrane Proteins in Lipidic Mesophases.</a> J. Vis. Exp. (67), e4000(2012).</li>
<li>Till, M., Robson, A., Byrne, M. J., Nair, A. V., Kolek, S. A., Shaw Stewart, P. D., Race, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+Success+Rate+of+Protein+Crystallization+by+Random+Microseed+Matrix+Screening%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Improving the Success Rate of Protein Crystallization by Random Microseed Matrix Screening.</a> J. Vis. Exp. (78), e50548(2013).</li>
<li>Dierks, K., Meyer, A., Oberthür, D., Rapp, G., Einspahr, H., Betzel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+UV+detection+of+protein+crystals+enabled+by+fluorescence+excitation+at+wavelengths+longer+than+300+nm%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Efficient UV detection of protein crystals enabled by fluorescence excitation at wavelengths longer than 300 nm.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 66, 478-484 (2010).</li>
<li>Szewczak, A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Structural+studies+of+the+bacterial+MreBCD+complex%22">Structural studies of the bacterial MreBCD complex</a>. , University of Cambridge, UK. (2016).</li>
<li>Nayak, V., Dessau, M., Kucera, K., Anthony, K., Ledizet, M., Modis, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+dengue+virus+type+1+envelope+protein+in+the+postfusion+conformation+and+its+implications+for+membrane+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of dengue virus type 1 envelope protein in the postfusion conformation and its implications for membrane fusion.</a> J. Virol. 83, 4338-4344 (2009).</li>
<li>Gorrec, F., Palmer, C. M., Lebon, G., Warne, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pi+sampling%3A+a+methodical+and+flexible+approach+to+initial+macromolecular+crystallization+screening%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Pi sampling: a methodical and flexible approach to initial macromolecular crystallization screening.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 67, 463-470 (2011).</li>
<li>Parker, J. L., Newstead, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+trends+in+%CE%B1-helical+membrane+protein+crystallization%3A+An+update%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Current trends in α-helical membrane protein crystallization: An update.</a> Protein Sci. 21, 1358-1365 (2012).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MORPHEUS+II+protein+crystallization+screen%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">The MORPHEUS II protein crystallization screen.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 71, 831-837 (2015).</li>
<li>Yin, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hitting+the+target%3A+fragment+screening+with+acoustic+in+situ+co-crystallization+of+proteins+plus+fragment+libraries+on+pin-mounted+data-collection+micromeshes%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Hitting the target: fragment screening with acoustic in situ co-crystallization of proteins plus fragment libraries on pin-mounted data-collection micromeshes.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 70, 1177-1189 (2014).</li>
<li>Wu, P., Noland, C., Ultsch, M., Edwards, B., Harris, D., Mayer, R., Harris, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+the+Implementation+of+Acoustic+Droplet+Ejection+for+Protein+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22JALA%22%5BJournal%5D)">Developments in the Implementation of Acoustic Droplet Ejection for Protein Crystallography.</a> JALA. 21, 97-106 (2015).</li>
<li>Zipper, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+to+reduce+evaporation+of+crystallization+droplets+by+using+plate+lids+with+apertures+for+adding+liquids%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+F+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">A simple technique to reduce evaporation of crystallization droplets by using plate lids with apertures for adding liquids.</a> Acta Crystallogr F Biol Crystallogr. 70, 1707-1713 (2014).</li>
<li>Wagner, A., Duman, R., Stevens, B., Ward, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microcrystal+manipulation+with+laser+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Microcrystal manipulation with laser tweezers.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 69, 1297-1302 (2013).</li>
<li>Newman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+Evaluations+of+the+Reproducibility+of+Vapor-Diffusion+Crystallization%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Initial Evaluations of the Reproducibility of Vapor-Diffusion Crystallization.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 63, 826-832 (2007).</li>
<li>Reis, N. M., Chirgadze, D. Y., Blundell, T. L., Mackley, M. R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/19923710">The effect of protein-precipitant interfaces and applied shear on the nucleation and growth of lysozyme crystal.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 65, 1127-1139 (2009).</li>
<li>McPherson, A., Koszelak., S., Axelrod, H., Day, J., Robinson, L., McGrath, M., Williams, R., Cascio, D. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0022024886901715">The effects of neutral detergents on the crystallization of soluble proteins.</a> J. Crystal Growth. 76 (3), 547-553 (1986).</li>
<li>Sauter, C., Ng, J. D., Lorber, B., Keith, G., Brion, P., Hosseini, M. W., Lehn, J. -M., Giegé, R. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0022024898008525">Additives for the crystallization of proteins and nucleic acids.</a> J. Crystal Growth. 196, 365-376 (1999).</li>
<li>McPherson, A., Cudney, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Searching+for+silver+bullets%3A+an+alternative+strategy+for+crystallizing+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Struct.+Biol%22%5BJournal%5D)">Searching for silver bullets: an alternative strategy for crystallizing macromolecules.</a> J. Struct. Biol. 156, 387-406 (2006).</li>
<li>Gorrec, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystallization+screens+developed+at+the+MRC+Laboratory+of+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov.+Today%22%5BJournal%5D)">Protein crystallization screens developed at the MRC Laboratory of Molecular Biology.</a> Drug Discov. Today. 21, 819-825 (2016).</li>
<li>Ericsson, U. B., Hallberg, B. M., DeTitta, G. T., Dekker, N., Nordlund, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thermofluor-based+high-throughput+stability+optimization+of+proteins+for+structural+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Thermofluor-based high-throughput stability optimization of proteins for structural studies.</a> Anal. Biochem. 357, 289-298 (2006).</li>
<li>Chari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ProteoPlex%3A+stability+optimization+of+macromolecular+complexes+by+sparse-matrix+screening+of+chemical+space%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">ProteoPlex: stability optimization of macromolecular complexes by sparse-matrix screening of chemical space.</a> Nat. Methods. 12, 859-865 (2015).</li>
<li>Newman, J., Egan, D., Walter, T. S., Meged, R., Berry, I., Ben Jelloul, M., Sussman, J. L., Stuart, D. I., Perrakis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+rationalization+of+crystallization+screening+for+small-+to+medium-sized+academic+laboratories%3A+the+PACT%2FJCSG%2B+strategy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Towards rationalization of crystallization screening for small- to medium-sized academic laboratories: the PACT/JCSG+ strategy.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 61, 1426-1431 (2005).</li>
<li>Wilson, J. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/08893110410001664837">Automated Evaluation of Crystallisation Experiments.</a> Cryst. Rev. 10, 73-84 (2004).</li>
<li>Snell, E. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishing+a+training+set+through+the+visual+analysis+of+crystallization+trials.+Part+I%3A+%E2%88%BC150+000+images%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallogr+D+Biol+Crystallogr%22%5BJournal%5D)">Establishing a training set through the visual analysis of crystallization trials. Part I: ∼150 000 images.</a> Acta Crystallogr D Biol Crystallogr. 64, 1123-1130 (2008).</li>
<li>Haupert, L. M., Simpson, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Screening+of+protein+crystallization+trials+by+second+order+nonlinear+optical+imaging+of+chiral+crystals+%28SONICC%29%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Screening of protein crystallization trials by second order nonlinear optical imaging of chiral crystals (SONICC).</a> Methods. 55, 379-386 (2011).</li>
<li>Newman, J., Fazio, V., Lawson, B., Peat, T. <a target="_blank" href="http://pubs.acs.org/doi/abs/10.1021/cg1004209">The C6 Web Tool: A Resource for the Rational Selection of Crystallization Conditions.</a> Cryst. Growth & Des. 13, 12219-12223 (2010).</li>
</ol>

Niniejszym stwierdzamy sprzeczny interes komercyjny, ponieważ LifeArc komercjalizuje następujące elementy: 96- i 48-dołkowe płytki MRC, wiszącą uszczelkę kroplową MRC, ekrany krystalizacji MORPHEUS, Pi, ANGSTROM i LMB.

1- Przygotowanie i wykorzystanie wstępnych sit przechowywanych na płytkach
Zestawy do przesiewania należy wymieszać przed dozowaniem do płytek, ponieważ podczas przechowywania w niektórych probówkach dochodzi do lekkiego wytrącania się lub separacji faz. Gdy ekran składa się z dwóch zestawów (2 x 48 rurek), pierwsza rurka drugiego zestawu jest umieszczana w miejscu E1 nośnika chłodzącego. Gdy ekran składa się z 4 zestawów (4 x 24 rurki), pierwsza rura drugiego zestawu jest umieszczana w lokalizacji C1, pierwsza rura trzeciego zestawu jest umieszczana w lokalizacji E1, a pierwsza rura czwartego zestawu jest umieszczana w lokalizacji G1. Podczas wkładania probówek do ich nośnika chłodzącego, pokrywki są umieszczane na tacy zgodnie ze standardowym 96-dołkowym układem poziomym. Ponieważ numery studzienek są podane przez producentów na górze pokryw, umożliwia to sprawdzenie krzyżowe, czy wszystkie probówki zostały umieszczone we właściwej kolejności. Pomaga to również w wymianie odpowiednich pokrywek na tubkach podczas napełniania zmniejszonej liczby płytek.
Wstępnie napełnione płytki przechowujemy w temperaturze 10 °C, co jest kompromisem, aby uniknąć zamarzania i przechowywania w temperaturze 4 °C, co może spowodować pogorszenie warunków i problemy z uszczelnieniem. Płyty są przechowywane przez okres do kilku miesięcy, zwykle bez zauważalnej kondensacji na wewnętrznej powierzchni uszczelki. Jest to mniej prawdziwe w przypadku płytek LMB05, LMB06, LMB09 i LMB10, ponieważ zawierają one warunki o stosunkowo wysokich stężeniach lotnych odczynników (tabela 1). Niewielka ilość kondensatu po wewnętrznej stronie uszczelki zmniejsza skuteczność uszczelniania i może powodować zanieczyszczenie krzyżowe między studzienkami podczas rozszczelniania płyt. Aby zapobiec kondensacji pary wodnej podczas wstępnego chłodzenia, płyty można najpierw przenieść z karuzeli do izolowanej chłodziarki piknikowej, która jest przechowywana przez noc w chłodni o temperaturze 4 °C. Bardzo powolne chłodzenie minimalizuje powstawanie gradientów temperatury w uszczelnionych studzienkach, a tym samym zmniejsza ogólną kondensację15. Ponadto, po przechowywaniu płytek w inkubatorze w temperaturze 10 °C, na płytce na górze każdego stosu umieszcza się niestandardową pokrywę z polistyrenu SBS (nie pokazano).
Cały zestaw naszych wstępnie napełnionych płytek może być używany jako duże sito początkowe w stosunku do nowej, rozpuszczalnej w wodzie próbki białka. Alternatywnie można wybrać mniejszą liczbę płyt, aby dopasować je do określonych wymagań. Na przykład LMB15 i LMB19 są ekranami opracowanymi specjalnie dla próbek białek błonowych26,27, lub LMB20 to badanie przesiewowe sformułowane z ciężkimi atomami w celu ułatwienia eksperymentalnego fazowania danych dyfrakcyjnych28 (patrz również: <a href="https://www.youtube.com/watch?v=Gpb4SypWnQY&t=11s">Formułowanie ekranów krystalizacji białek MORPHEUS</a>).
2. Ustawianie kropelek krystalizacji
W przypadku korzystania z systemu 2 w pierwszej kolejności należy przetworzyć zestawy do badań przesiewowych ze znacznymi ilościami odczynników lotnych. Pozwala to uniknąć tworzenia się kondensatu na gumie pokryw SBS, co mogłoby wpłynąć na obsługę pokrywy i uszczelnienie płyty. Pokrywka SBS ma niewielki prześwit, gdy znajduje się na wierzchu płyty, dlatego należy je początkowo wyrównać (patrz Protokół, krok 1.2.6). Martwe objętości białka w dołkach płytki PCR są stosunkowo duże (0,8 μl, patrz legenda w tabeli 2). Należy zauważyć, że równie duże objętości martwe są stosowane w przypadku stosowania dozownika nanolitrów pojedynczo z białkiem w 8-dołkowych paskach (Tabela 4). Mniejsze objętości martwe mogą działać, jednak niektóre próbki przylegają do końcówek, kalibracja robota może stać się nieco niedokładna, pomieszczenie może być cieplejsze niż zwykle itp. Wszystko to prowadzi do ubytków próbek pokrywanych przez duże objętości martwe w celu utrwalenia podejścia.
Ostatnie osiągnięcia umożliwiły dalszą miniaturyzację eksperymentów, dzięki czemu objętość próbki wymagana do badania przesiewowego warunków krystalizacji może zostać znacznie zmniejszona poprzez integrację odpowiedniej technologii29,30. Jednak niektóre aspekty dalszej miniaturyzacji wymagają starannego rozważenia, takie jak parowanie kropel31 i manipulacja mikrokryształami32.
Wreszcie, odwirowanie płytki (2 000 obr./min, 1 min) może być zintegrowane jako rutynowy ostatni etap tworzenia kropel krystalizacji (w sferycznych studzienkach górnych). Bardziej spójna wielkość i kształt kropelek wynikający z wirowania może zmniejszyć problemy z odtwarzalnością33,34. Z pewnością wyśrodkowane krople ułatwią późniejszą ocenę eksperymentów przy użyciu mikroskopu, ponieważ wymagana ogniskowa będzie podobna na całej płycie.
3. Zalety metody 4-narożnej
Najważniejszą zaletą metody 4-corner jest jej prostota, która minimalizuje błędy i ułatwia proste automatyczne protokoły. Na przykład 4 rozwiązania narożne będą zawsze umieszczane na pokładzie maszyny do obsługi cieczy zgodnie z tym samym układem. Ponadto wszystkie programy opierają się na stałych proporcjach między roztworami (rysunek 3C). Ręczne przygotowanie 4 roztworów narożnych jest preferowane w stosunku do zautomatyzowanego obchodzenia się z roztworami o wysokich stężeniach, które mogą mieć wysoką lepkość. Stosunkowo szybkie i dokładne zasysanie/dozowanie jest możliwe w większości typów urządzeń do obsługi cieczy przy minimalnych wymaganiach dotyczących optymalizacji klas cieczy. Niemniej jednak niektóre rozwiązania narożne mogą być nadal zbyt lepkie, aby robot pracujący z systemem cieczowym mógł działać wydajnie. Z tego powodu zdecydowaliśmy się na wózek do obsługi cieczy pracujący z wypornością (ilustracja 3B).
Oprócz 2 liniowych gradientów stężeń, trzeci składnik (tj. zestaw/dodatków) może być testowany w stałym stężeniu w wygodny sposób. W tym celu najpierw przygotowuje się stosunkowo dużą objętość rdzeniowego zestawu roztworów narożnych o odpowiednio wyższym stężeniu, z wyłączeniem składnika, który ma być zmieniany. Następnie dodaje się roztwory podstawowe zawierające ten składnik w celu dostosowania końcowych stężeń. Na przykład przygotowuje się 50 ml zestawu 4 roztworów narożnych w stężeniach o 10% wyższych niż początkowo. Ten zestaw podstawowy jest następnie dzielony na 5 mniejszych podzbiorów po 4. Na koniec do każdego podzestawu dodaje się 10% objętości różnych roztworów buforowych pH.
4. Formaty i rodzaje sit addytywnych
Sita są zwykle przechowywane w temperaturze -20 °C (rysunek 4), ponieważ nie są regularnie używane i zawierają lotne/niestabilne związki. Użycie sita z zamrożonymi dodatkami przechowywanymi w bloku głębokiej studzienki (1 ml w studzienkach) musi być zaplanowane wcześnie, ponieważ całkowite rozmrożenie wszystkich roztworów dodatków w temperaturze pokojowej zajmie 12-24 godziny. Ponadto wielu użytkowników korzysta z tego samego sita dodatków, co może powodować problemy z zanieczyszczeniem krzyżowym. Wreszcie, wysokość bloków studni głębinowych sprawia, że nie nadają się one do większości dozowników nanolitrowych. Wygodnym rozwiązaniem pozwalającym obejść te problemy jest przeniesienie ekranu z bloku studni głębinowej na płyty niskoprofilowe (rysunek 4).
Historycznie rzecz biorąc, badania addytywne, które obejmują szeroką gamę pojedynczych odczynników (o pojedynczych stężeniach), były bardzo popularne35,36. Opracowano jednak inne rodzaje przesiewów dodatków, które integrują mieszaniny dodatków37 lub zmniejszoną liczbę pojedynczych dodatków występujących w różnych stężeniach38. Wreszcie, podejściem uzupełniającym jest zbadanie wpływu dodatków na próbki przed krystalizacją39,40.
5. Więcej uwag
Dobra praktyka: Większość ekranów zawiera szkodliwe, a nawet toksyczne substancje, dlatego podczas protokołów należy stosować odpowiednią ochronę osobistą. Podobnie, ruchome części robotów mogą prowadzić do obrażeń, zwłaszcza podczas próby ręcznego zakłócenia podczas działania programu (chociaż większość robotów ma przycisk/system zatrzymania awaryjnego). Ze względu na złożoność techniczną, regularne sprawdzanie robotów, ekranów i programów z wcześniej scharakteryzowanymi próbkami testowymi jest ważne dla utrzymania wysokiego poziomu odtwarzalności.
Przepustowość: Orientacyjnie, za pomocą systemu 1 produkuje się od 4 000 do 8 000 płytek LMB rocznie (a następnie wykorzystuje się je przez użytkowników do wstępnych badań przesiewowych). Nie jest przystosowany do przechowywania dużej ilości wstępnie napełnionych płytek w temperaturze 10 °C, gdy oczekiwany obrót jest znacznie niższy, ponieważ po 4-5 miesiącach niektóre warunki zaczną się pogarszać i parować. W małych i średnich laboratoriach wdrożono różne podejścia do protokołów automatyzacji41.
Przechowywanie i ocenianie eksperymentów: Po przygotowaniu kropel talerze są przechowywane na półkach o niskim poziomie wibracji w pomieszczeniu o temperaturze 4 lub 18 °C o ściśle kontrolowanej temperaturze (maksymalne odchylenie +/- 0,5 °C). Eksperymenty są oceniane przy użyciu mikroskopów z zimnym źródłem światła. Na rynku dostępne są różne zautomatyzowane systemy obrazowania, jednak należy dokładnie rozważyć wszystkie aspekty: Czy prędkość wymagana do zeskanowania płytki będzie wystarczająca do uzyskania wysokiej przepustowości? Czy obiekty inne niż kryształy będą zakłócać działanie autofokusa? Czy uzyskana jakość obrazów będzie wystarczająca do dostrzeżenia bardzo małych kryształów (zwłaszcza wokół krawędzi kropel)? 42,43,44 
Porównanie warunków krystalizacji: Po dokładnym zbadaniu natury początkowo otrzymanych kryształów, można przeanalizować trendy i podobieństwa w różnych warunkach, korzystając z <a href="https://search.mrc-lmb.cam.ac.uk/screens2/search.html">bazy danych ekranu LMB</a> lub C6 <a href="http://c6.csiro.au/">Web Tool</a>45.

Krystalografia rentgenowska jest szeroko stosowana, aby dalej rozwijać nasze zrozumienie mechanizmów biologicznych i chorobowych na poziomie atomowym, a następnie wspomagać racjonalne podejścia do odkrywania leków1. W tym celu oczyszczone i skoncentrowane (2-50 mg/ml) makrocząsteczkowe próbki białek, DNA, RNA, innych ligandów i ich kompleksów są testowane pod kątem ich skłonności do tworzenia uporządkowanych trójwymiarowych sieci poprzez krystalizację2,3,4. Gdy uzyskuje się wysokiej jakości kryształy, które załamują promienie rentgenowskie, struktura krystaliczna może być rozwiązana w rozdzielczości bliskiej atomowej5,6. Co najważniejsze, nie można przewidzieć warunków krystalizacji nowej próbki, a wydajność kryształów wysokiej jakości jest zwykle bardzo niska. Podstawowym powodem jest to, że wiele interesujących próbek ma trudne właściwości biochemiczne, które sprawiają, że są niestabilne w odpowiedniej skali czasowej krystalizacji (zwykle kilka dni). Wreszcie, proces ten jest spotęgowany przez czas potrzebny do wyprodukowania próbek i wariantów próbek oraz optymalizacji ich oczyszczania i krystalizacji7,8.
Warunek krystalizacji to roztwór z precydentem, który zmniejsza rozpuszczalność próbki, a warunki często zawierają również i dodatki. Setki takich odczynników są dobrze przystosowane do zmiany parametrów eksperymentów krystalizacji, ponieważ mają niską skłonność do ingerowania w integralność próbki (takiej jak rozwijanie białka lub kwasu nukleinowego). Podczas gdy testowanie milionów kombinacji odczynników do krystalizacji nie jest wykonalne, testowanie od kilku do wielu zestawów przesiewowych - opracowanych przy użyciu różnych strategii9,10 - jest możliwe dzięki zminiaturyzowanym próbom i zautomatyzowanym protokołom. W tej perspektywie najbardziej podatną techniką jest prawdopodobnie dyfuzja pary wodnej z kropelkami o wielkości 100-200 nL osadzonymi na małej studni nad zbiornikiem zawierającym stan krystalizacji (25-250 μL), zaimplementowana w specjalistycznych płytkach krystalizacyjnych11,12. Próbka i stan białka są często łączone w stosunku 1:1 w celu uzyskania całkowitej objętości 200 nL podczas umieszczania kropelek w górnych studzienkach. Zrobotyzowana krystalizacja białek w nanolitrach może być realizowana za pomocą alternatywnych technik i płytek, takich jak under-oil batch13 i Lipidic Cubic Phase14 (najnowsza z nich jest stosowana specjalnie do białek transbłonowych, które są bardzo słabo rozpuszczalne w wodzie).
<a href="http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/groups/JYL/WWWrobots/robot.html">Instalacja krystalizacji w MRC-LMB</a> została uruchomiona na początku 2000 roku, a wczesne podsumowanie naszych automatycznych protokołów zostało przedstawione w 2005 roku15. Przedstawiono historyczne wprowadzenie do krystalizacji białek, a także zarys zalet robotycznego podejścia nanolitrowego (wówczas nowatorskiego podejścia do rutynowych eksperymentów). Ponieważ krystalizacja makromolekularna jest zasadniczo procesem stochastycznym, w którym nie ma zbyt wielu użytecznych informacji wstępnych, zastosowanie szerokiej gamy (odpowiednich) warunków początkowych zwiększa wydajność wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych16. Poza tym często pomijaną zaletą dużego ekranu początkowego jest w wielu przypadkach znaczne zmniejszenie potrzeby optymalizacji próbek i kryształów. Oczywiście, może być jeszcze konieczne przystąpienie do optymalizacji niektórych warunków początkowych w późniejszym czasie. Zazwyczaj stężenie odczynników i pH są następnie systematycznie badane. Do zoptymalizowanych warunków można również wprowadzić więcej odczynników, aby jeszcze bardziej zmienić parametry krystalizacji. Z pewnością należy podjąć próbę krystalizacji ze świeżo przygotowaną próbką, stąd odpowiednie protokoły muszą być proste i dostępne w każdej chwili.
Tutaj w pełni opisane są dwa w pełni zautomatyzowane systemy zaprojektowane w MRC-LMB (systemy 1 i 2) oraz odpowiadające im protokoły. Głównym zastosowaniem tych dwóch systemów jest wstępne przesiewanie przez dyfuzję pary w płytkach krystalizacyjnych w kropli siedzącej. System 1 integruje urządzenie do obsługi cieczy, automatyczną karuzelę do magazynowania płyt, drukarkę atramentową do etykietowania płyt oraz samoprzylepną zgrzewarkę do płyt. W systemie 1 72 96-dołkowe płytki są wypełnione dostępnymi na rynku zestawami przesiewowymi (80 μl stanu przeniesionego do zbiornika z początkowej objętości 10 ml w probówkach), oznakowanymi i zaplombowanymi. Płytki są następnie przechowywane w inkubatorze o temperaturze 10 °C, gdzie są dostępne dla użytkowników w dowolnym momencie (jako początkowe sita zwane "płytkami LMB").
System 2 integruje obsługę płynów, dozownik nanolitrów i samoprzylepny uszczelniacz do płyt. W systemie 2 siedzące kropelki (100-1000 nL) do eksperymentów dyfuzji parowej są wytwarzane przez połączenie warunków i próbki w górnych studzienkach 20 48- lub 96-dołkowych płytek wstępnie wypełnionych warunkami. Oznacza to, że testowanych jest 1 920 wstępnych warunków przesiewowych przy użyciu 20 płytek LMB w systemie 2.
Roboty są również używane indywidualnie do optymalizacji wybranych warunków, a odpowiednie protokoły półautomatyczne są również opisane. Metoda 4-rogowa17 jest rutynowo stosowana do tworzenia ekranów optymalizacyjnych. Odpowiedni protokół wymaga najpierw ręcznego przygotowania 4 roztworów ("A, B, C i D"). Dwa liniowe gradienty stężeń (dla dwóch głównych czynników krystalizacyjnych) są następnie automatycznie generowane bezpośrednio do zbiorników płytki krystalizacyjnej. W tym celu strzykawka do obsługi płynów dozuje 4 roztwory narożne w różnych proporcjach.
Aby jeszcze bardziej zoptymalizować warunek, można zastosować sita addytywne, które potencjalnie poprawiają właściwości powstałych kryształów18. Dostępne są dwa podejścia do badania przesiewowego dodatków: protokół rozpoczynający się od dodatków dozowanych do zbiorników płytek krystalizacyjnych przed ustawieniem kropelek (protokół 1) oraz drugi protokół, w którym sitko dodatku jest dozowane bezpośrednio na kropelki (protokół 2).
Inne użyteczne rozwiązania, które zostały zainicjowane w MRC-LMB w celu ułatwienia automatycznej krystalizacji makromolekularnej, są również prezentowane. Zasadniczo płytki krystalizacyjne i związane z nimi urządzenia, takie jak pokrywka Society of Biomolecular Screening (SBS), która minimalizuje parowanie warunków podczas korzystania z systemu 2.
Dla zwięzłości, zakłada się, że użytkownicy są zaznajomieni z podstawowymi funkcjami i obsługą dozownika nanolitrów, drukarki atramentowej i samoprzylepnego uszczelniacza do płyt. O ile nie określono inaczej, tabliczki znamionowe na pokładzie robotów są umieszczone w taki sposób, aby studzienka A1 ("narożnik A1") była skierowana w stronę lewego tylnego rogu plate carriera.

<table><tbody><tr><td>Robots</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freedom EVO&reg;</td><td>Tecan</td><td>nie dotyczy</td><td>Maszyna do obsługi cieczy (System 1). Aspiracja/dozowanie w oparciu o płyn systemowy. Integruje automatyczną karuzelę. Oprogramowanie sterujące EVOware plus v.2.4.12.0.&nbsp;</td></tr><tr><td>Mikrolab&reg; STAR & handel;</td><td>Hamilton</td><td>nie dotyczy</td><td>Maszyna do obsługi cieczy (System 2). Aspiracja/dozowanie w oparciu o wyporność (technologia CO-RE&trade). Oprogramowanie sterujące Hamilton STAR v.4.3.5.4785 z interfejsem zarządzania metodami.</td></tr><tr><td>Komar&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Dozownik nanolitrowy na bazie mikrostrzykawki służący do ustawiania kropelek (System 2 i samodzielny), 3-pozycyjny pokład. Oprogramowanie sterujące v.3.11.0.1422.&nbsp;</td></tr><tr><td>Ważka&reg;</td><td>TTP Labtech</td><td>n/a</td><td>Strzykawkowy wózek do obsługi cieczy stosowany do produkcji sit optymalizacyjnych (metoda 4-kątna). Oprogramowanie sterujące v.1.2.1.10196.&nbsp;</td></tr><tr><td>Samoprzylepna zgrzewarka do płyt</td><td>Brandel</td><td>n/a</td><td>Zintegrowana z systemami 1 i 2 (używana również jako samodzielny robot).</td></tr><tr><td>Drukarka atramentowa 9232</td><td>Markem-Imaje</td><td>n/a</td><td>Zintegrowana z Systemem 1. Interfejs ekranu dotykowego.</td></tr><tr><td>< silne>Ekrany krystalizacji</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Crystal Screen&trade; 1</td> Zestaw do krystalizacji <td>Hampton Research</td><td>HR2-110</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB01</td></tr><tr><td>Crystal Screen 2&handel;</td><td>Zestaw do</td> krystalizacji Hampton Research <td>HR2-112</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB01</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Klasyczny zestaw do</td> krystalizacji <td>1 Rigaku 1009530</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB02</td><td></td></tr><tr><td>Wizard&trade; Klasyczny zestaw do</td> krystalizacji <td>2 Rigaku 1009531</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB02</td><td></td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Siarczan amonu</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-211</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG/LiCl</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-217</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB03</td></tr><tr><td>Quick Screen&trade;</td><td>Zestaw do</td> krystalizacji Hampton Research <td>HR2-221</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; Chlorek sodu</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-219</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB03</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; PEG 6000</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-213</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB04</td></tr><tr><td>Grid Screen&trade; MPD</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-215</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB04</td></tr><tr><td>MemFac i handlu;</td><td>Zestaw do</td> krystalizacji Hampton Research <td>HR2-114</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB04</td></tr><tr><td>PEG/Ion&trade;</td><td>Zestaw do</td> krystalizacji Hampton Research <td>HR2-126</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB05</td></tr><tr><td>Natrix&trade;</td><td>Zestaw do</td> krystalizacji Hampton Research <td>HR2-116</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB05</td></tr><tr><td>Crystal Screen Lite&trade;</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-128</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w ekranie LMB06</td></tr><tr><td>Custom Lite</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>nie dotyczy</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB06</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Zestaw</td> do krystalizacji <td>Cryo 1 Rigaku</td><td>1009536</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB07</td></tr><tr><td>Wizard&trade; Cryo 2</td><td>Rigaku</td><td>1009537</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB07</td></tr><tr><td>JBS1</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-101L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08</td></tr><tr><td>JBS2</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-102L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08</td></tr><tr><td>JBS3</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-103L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08</td></tr><tr><td>JBS4</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-104L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB08</td></tr><tr><td>JBS5</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-105L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09</td></tr><tr><td>JBS6</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-106L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09</td></tr><tr><td>JBS7</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-107L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB09</td></tr><tr><td>JBS8</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-108L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB09</td></tr><tr><td>JBS9</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-109L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB10</td></tr><tr><td>JBS10</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-110L</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 1 pH 4,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 1 pH 5,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB10</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 1 pH 6,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 1 pH 7,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 1 pH 8,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 2 pH 4,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB11</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 2 pH 5,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 2 pH 6,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 2 pH 7,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB12</td></tr><tr><td>Clear Strategy&trade; Ekran 2 pH 8,5</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-16LMB</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w indeksie LMB12</td></tr><tr><td>i handlu;</td>Zestaw do krystalizacji <td>Hampton Research</td><td>HR2-144</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB13</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 1</td> Zestaw do krystalizacji <td>Hampton Research</td><td>HR2-107</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB14</td></tr><tr><td>SaltRX&trade; 2</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-109</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB14</td></tr><tr><td>MemStar i handlu;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-21</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB15</td></tr><tr><td>MemSys&trade;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-25</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB15</td></tr><tr><td>JCSG-plus&trade; Zestaw</td> do krystalizacji <td>Qiagen</td><td>130720</td><td>(probówki, 10 ml na warunek) używany w LMB16</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; screen</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-46</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) używany w minimalnym ekranie LMB17</td></tr><tr><td>Pi</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-127</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na stan) stosowany w ekranie LMB18</td></tr><tr><td>Pi-PEG</td><td>JenaBioScience</td><td>CS-128</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w LMB19</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; II ekran</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-91</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w</td></tr><tr><td>ekranie krystalizacji LMB20 LMB i handlu;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-98</td><td>Zestaw do krystalizacji (probówki, 10 ml na warunek) stosowany w</td></tr> <tr><td>ekranach addytywnych LMB21Additive</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT</td><td>Hampton Research</td><td>HR2-138</td><td>Zamrożony w 96-dołkowym bloku głębokiej studni (1 ml na studzienkę).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; przesiewanie dodatków</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93-500</td><td>Mrożone w 96-dołkowym bloku studni głębinowej (500 &mikro; L na studzienkę).</td></tr><tr><td>Przesiewacz dodatków ANGSTROM i handel; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100</td><td>Zamrożony w 96-dołkowym bloku głębokiej studni (1 ml na studzienkę).</td></tr><tr><td>MORPHEUS&reg; przesiewacz dodatków</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-93</td><td>Mrożony w 96-dołkowej hodowli komórkowej Costar&reg; płytka z dołkami w kształcie litery V (100 &mikro; L na studzienkę).</td></tr><tr><td>Przesiewacz dodatków ANGSTROM i handel; &nbsp;</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>MD1-100-FX</td><td>Zamrożony w 96-dołkowej hodowli komórkowej Costar i reg; płytka z dołkiem w kształcie litery V (100 &mikro; L na studzienkę).</td></tr><tr><td>Siatka dodatków HIPPOCRATES</td><td>Molecular Dimensions Ltd</td><td>n/a</td><td>48 pojedynczych dodatków (związki lecznicze znalezione w MORPHEUS&reg; III).</td></tr><tr><td><mocny>Inne materiały eksploatacyjne</mocny></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>96-dołkowa płyta MRC 2-kroplowa</td><td>Swissci</td><td>MRC 96T-UVP</td><td>Sitting-drop, płyta dyfuzyjna parowa. Zalecana pojemność zbiornika: 80&nbsp; &micro;L. Zakres użytecznych objętości kropli: 10-1000 nL. Przepuszczalny dla promieni UV.</td></tr><tr><td>48-dołkowa płytka MRC 1-kroplowa&nbsp; ("Tabliczka MAXI")</td><td>Szwajcaria</td><td>MMX01-UVP&nbsp;</td><td>Płyta dyfuzyjna do montażu w pozycji siedzącej do zwiększania skali/optymalizacji. Zalecana objętość zbiornika: 200&nbsp; &micro;L. Zakres użytecznych objętości kropel: 0,1-10 &micro;L. Przepuszczalność UV.</td></tr><tr><td>Wisząca uszczelka kroplowa MRC</td><td>Swissci</td><td>n/a</td><td>Wisząca-kroplowa, kompatybilna z obiema płytami dyfuzyjnymi MRC (MRC 96T-UVP i MMX01-UVP). Przepuszczalne promieniowanie UV i rentgenowskie.</td></tr><tr><td>Taśma klejąca</td><td>Hampton Research</td><td>HR4-50</td><td>o szerokości 3 cali Duck&reg; HD Clear&trade; do zgrzewania i ręcznego uszczelniania.</td></tr><tr><td>Samoprzylepna blacha aluminiowa</td><td>Beckman Coulter</td><td>538619</td><td>Służy do ponownego uszczelniania sit dodatkowych.</td></tr><tr><td>Wkład atramentowy</td><td>Markem-Imaje</td><td>9651</td><td>System 1 (drukarka atramentowa).</td></tr><tr><td>Kartridż rozpuszczalnikowy</td><td>Markem-Imaje</td><td>8652</td><td>System 1 (drukarka atramentowa).</td></tr><tr><td>50 &mikro; L porady&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>235947</td><td>System 2 (STAR & trade; maszyna do obsługi cieczy). Pudełko z 6 zestawami z 1920 x CO-RE&trade; końcówki w jednorazowych stosach.</td></tr><tr><td>Pojemnik na odczynnik</td><td>Hamilton</td><td>194052</td><td>Służy do dozowania warunku do płytki (płytek) podczas protokołów przesiewania dodatków.&nbsp;</td></tr><tr><td>Płytka PCR</td><td>Thermo Scientific&trade;</td><td>AB-2150</td><td>System 2 (zawiera białko do przeniesienia do Mosquito&reg;). Abgene Diamond ultra, 384 studnie w kształcie litery V.</td></tr><tr><td>mikrostrzykawki</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03020</td><td>Szpula 26 000 mikrostrzykawek do dozownika Mosquito&reg; nanolitr (rozstaw 9mm).</td></tr><tr><td>blok uchwytu paskowego</td><td>TTP Labtech</td><td>3019-05013</td><td>Urządzenie SSB do pasków Mosquito&reg, znane również jako "4-kierunkowy uchwyt na odczynnik".</td></tr><tr><td>2 i mikro; L 8-dołkowy pasek</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03110</td><td>Zawiera białko na pokładzie Mosquito&reg;. Pudełko zawierające 40 pasków, maksymalna objętość w studzience wynosi 3,2 &mikrolitra.</td></tr><tr><td>5 & mikro; L 8-dołkowy pasek</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-03100</td><td>Zawiera białko na pokładzie Mosquito&reg;. Pudełko z 40 paskami, maksymalna objętość w studni wynosi 7,5 &mikro;L.</td></tr><tr><td>Strzykawki 5 ml</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07100</td><td>Korpus strzykawki i tłok do płynu Dragonfly&reg;. Opakowanie 100 szt.</td></tr><tr><td>Koryta/zbiorniki</td><td>TTP Labtech</td><td>4150-07103</td><td>Zawiera roztwory podstawowe na pokładzie Dragonfly&reg;. Opakowanie 50 szt.</td></tr><tr><td>Wytrząsarka orbitalna do mikropłytek</td><td>CamLab Limited</td><td>n/a</td><td>Variomag&reg; do mieszania warunków na jednej płytce (0-2000 obr./min).</td></tr><tr><td>Mieszalnik do mikropłytek</td><td>TTP Labtech</td><td>3121-01015</td><td>MxOne. Warunki mieszania na jednej płytce z 96 kołkami wibracyjnymi.</td></tr></tbody></table>

zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w laboratorium biologii molekularnej mrc

Automated Protocols for Macromolecular Crystallization at the MRC Laboratory of Molecular Biology

Gdy uzyskuje się wysokiej jakości kryształy, które załamują promieniowanie rentgenowskie, struktura krystaliczna może być rozwiązana w rozdzielczości bliskiej atomowej. Nie można jednak przewidzieć warunków krystalizacji białek, DNA, RNA i ich kompleksów. Stosowanie szerokiej gamy warunków jest sposobem na zwiększenie wydajności wysokiej jakości kryształów dyfrakcyjnych. W Laboratorium Biologii Molekularnej MRC (Cambridge, Anglia, MRC-LMB) opracowano dwa w pełni zautomatyzowane systemy, które ułatwiają badanie przesiewowe krystalizacji w stosunku do 1920 warunków początkowych poprzez dyfuzję pary w nanolitrowych kropelkach. Opracowano również półautomatyczne protokoły w celu optymalizacji warunków poprzez zmianę stężeń odczynników, pH lub wprowadzenie dodatków, które potencjalnie poprawiają właściwości otrzymanych kryształów. Wszystkie odpowiednie protokoły zostaną szczegółowo opisane i pokrótce omówione. Podsumowując, umożliwiają one wygodną i wysoce wydajną krystalizację makromolekularną w obiekcie dla wielu użytkowników, dając jednocześnie użytkownikom kontrolę nad kluczowymi parametrami ich eksperymentów.

Zautomatyzowane systemy i protokoły do rutynowego przygotowania dużej liczby ekranów i nanolitrowych kropelek krystalizacji do eksperymentów dyfuzji par są opisane i omówione.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

When high quality crystals are obtained that diffract X-rays, the crystal structure may be solved at near atomic resolution. The conditions to crystallize ...

Ogólnym celem niniejszej procedury jest otrzymanie wysokiej jakości kryształów na podstawie wstępnych warunków przesiewowych krystalizacji. Kryształy te mogą być wykorzystane do badania struktur białek, DNA, RNA oraz ich kompleksów. Badanie struktur makromolekularnych staje się coraz większym wyzwaniem.Zapewnienie szerokiej gamy warunków początkowych zwiększa wydajność uzyskiwania użytecznych kryształów, jednocześnie ograniczając potrzebę optymalizacji próbek i kryształów. Dwa w pełni zautomatyzowane systemy, w tym LMB, ułatwiają przygotowanie do 1 920 eksperymentów dyfuzji pary w kroplach nanolitrowych. Dla zwięzłości przyjmuje się, że użytkownicy są już zaznajomieni z podstawowymi funkcjami i konserwacją dozownika nanolitrowego, drukarki atramentowej oraz urządzenia do uszczelniania płytek za pomocą folii klejącej.Przed przystąpieniem do procedury należy upewnić się, że roboty systemowe zostały zainicjowane, a ich oprogramowanie sterujące jest uruchomione. Włączyć chłodziarkę nośnika chłodzącego probówki około 30 minut przed uruchomieniem programu głównego. Umieścić płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płytek.Uruchom urządzenie do uszczelniania płytek i sprawdź, czy folia została prawidłowo nałożona. Powtórz ten test jeszcze dwukrotnie, aby zweryfikować gotowość urządzenia do uszczelniania płytek. Następnie wlej 20 liters wody dejonizowanej do głównego pojemnika automatycznego dozownika cieczy.Odłącz wkładki sprzęgające od mniejszego pojemnika z 20% roztworem płuczącym etanolu i podłącz wkładki do pojemnika głównego. Wprowadź odpowiednią nazwę ekranu na ekranie dotykowym drukarki atramentowej. Następnie otwórz i zamknij drzwiczki karuzeli, aby uruchomić jej obrót.Otwórz drzwiczki, gdy pojawi się pierwszy stos. W pełni załaduj pierwszy stos, umieszczając w nim 22 płytki do krystalizacji, tak aby kolumna pierwsza była skierowana na zewnątrz. W ten sam sposób w pełni załaduj dwa kolejne stosy.Włóż pozostałe sześć płytek na najwyższe pozycje w czwartym stosie, a następnie zamknij drzwiczki karuzeli. Sprawdź, czy wyświetlacz chłodziarki wskazuje 14 °C. Delikatnie i wielokrotnie odwracaj wybrane zestawy przesiewowe przez jedną minutę.Następnie otwórz przedni panel analizatora do obsługi cieczy. Otwórz probówki i umieść je w nośniku chłodzącym zgodnie ze standardowym układem 96 dołków. Po umieszczeniu każdej probówki w nośniku, połóż jej nakrętkę na tacy w tym samym układzie 96 dołków.Podczas korzystania z Systemu 1 etykiety prowadzące umieszcza się na tacy w układzie 96-dołkowym, aby umożliwić weryfikację poprawności rozmieszczenia probówek. Należy sprawdzić pozycje probówek, a następnie upewnić się, że wszystkie probówki są wypoziomowane i stabilnie osadzone w uchwycie. Następnie należy zamknąć przedni panel.W oknie Startowym oprogramowania do obsługi robota do pipetowania wybierz opcję Run Maintenance i otwórz program Flushing. Uruchom program, aby wypłukać 20%ethanol z systemu oraz umyć zewnętrzne powierzchnie końcówek dozujących. Po zakończeniu płukania kliknij Cancel, aby powrócić do okna Startowego.Wybierz opcję Uruchom istniejący proces i kliknij Rozpocznij wybieranie. Otwórz program dozujący MRC Kit. W ekranie konfiguracji wpisz 18" w polu Instancje i uruchom program. Monitoruj system podczas etykietowania, napełniania i zamykania pierwszych czterech płytek.Nie należy pozostawiać systemu bez nadzoru do czasu zakończenia przygotowania pierwszych czterech płytek. Po przygotowaniu wszystkich 72 płytek i umieszczeniu ich z powrotem w karuzeli, należy przenieść wkładki sprzęgające z pojemnika z wodą dejonizowaną do pojemnika z 20% ethanol. Następnie należy uruchomić program płukania startowego, stosując tę samą procedurę co poprzednio.Wyłącz chłodziarkę i wyrzuć puste probówki z zestawu do przesiewania. Ostrożnie wyjmij 72 przygotowane płytki z karuzeli. Płytki wypełnione nieprawidłowo lub nieszczelne należy wyrzucić.Gotowe płytki należy przechowywać w temperaturze 10°C. Najpierw należy upewnić się, że roboty systemu są włączone, dozownik nanolitrowy został zainicjowany a jego oprogramowanie jest otwarte, oraz że menedżer metod manipulatora cieczy jest uruchomiony. Chłodzący transporter probówek typu microtube należy włączyć około 15 minut przed rozpoczęciem głównego programu.Umieść płytkę testową na zmotoryzowanym nośniku SBS zgrzewarki do płytek. Uruchom zgrzewarkę i sprawdź, czy płytka została prawidłowo zamknięta. Przeprowadź test zgrzewarki trzykrotnie.Następnie uruchom dozownik nanolitrowy, aby nanieść krople 100 nanolitrów roztworu testowego na płytkę testową. Przedstawiona tutaj mikrofotografia świetlna ukazuje kroplę o objętości 100 nanolitrów, naniesioną przez dozownik nanolitrowy, zawierającą roztwór testowy z czerwonym barwnikiem. Zamknij oprogramowanie dozownika nanolitrowego i wyjmij blok uchwytu pasków z platformy.Następnie, w specjalnie zaprojektowanym uchwycie, umieść wcześniej napełnioną płytkę krystalizacyjną z 96 dołkami, w której warunki zawierają najwyższą względną ilość odczynników lotnych. Usuń folię przylepną z płytki. Otwórz przedni panel robota do manipulacji cieczami i umieść odsłoniętą płytkę na blacie, z tyłu pierwszego wysuwanego nośnika.Przykryj płytkę aluminiową pokrywką SBS. Osadź pokrywkę w stronę tylnego lewego narożnika nośnika, wywierając delikatny nacisk na przeciwległy narożnik pokrywki. Podczas korzystania z Systemu 2 w pierwszej kolejności należy przetworzyć zestawy przesiewowe zawierające znaczne ilości reagentów lotnych.Zapobiega to powstawaniu kondensacji na prowadnicach SBS, co mogłoby wpłynąć na zautomatyzowaną obsługę prowadnic lub uszczelnianie płytek. Odkryj, załaduj do przesuwnych nośników i przykryj pozostałe 19 płytek w ten sam sposób, zaczynając od warunków najbardziej, a kończąc na najmniej lotnych. Gdy nośnik chłodzący mikroprowetki osiągnie 4 stopni Celsius, co zostanie zasygnalizowane zielonym światłem, zdejmij jego pokrywę.Odetnij pokrywkę mikroprowetki zawierającej co najmniej 440 µL próbki białka. Upewnij się, że nad meniskiem próbki nie ma piany, ponieważ zakłóciłoby to działanie systemu detekcji cieczy. Umieść probówkę w pozycji 1 chłodzącego statywu na mikroprowetki.Umieść płytkę PCR na pokładzie robota do obsługi cieczy przed nośnikiem adaptera do przesuwania płytek. Następnie zamknij przedni panel. W interfejsie zarządzania metodami robota do obsługi cieczy wybierz Setup Plates.Monitoruj inicjalizację obu systemów i uzupełnij parametry uruchomienia, w tym typ płytki oraz liczbę kropel dla każdego warunku, rozmiar kropli, pozycję pierwszej przetwarzanej płytki oraz liczbę płytek. Kliknij No w odpowiedzi na pytanie, czy chcesz otrzymać pomoc przy ładowaniu pokładu. Po upewnieniu się, że nie ma pustych kaset z końcówkami, kliknij OK.Po upewnieniu się, że liczba końcówek jest wystarczająca do przeprowadzenia procesu, kliknij OK.W razie potrzeby zaktualizuj system zarządzania końcówkami i kliknij OK.Upewnij się, że pokład dozownika nanolitrowego jest wolny od bloku uchwytu pasków, a nośnik znajduje się z tyłu stosów końcówek 50 µL, które są wolne od aluminiowych pokryw SBS.Upewnij się, że wszystkie pozostałe wymagane komponenty są przygotowane, a następnie uruchom proces. Monitoruj system podczas dozowania nanolitrowych kropel do pierwszej płytki przez dyspenser oraz późniejszego zamykania płytki przez zgrzewarkę. Nie pozostawiaj systemu bez nadzoru do czasu zakończenia przygotowania pierwszej płytki.Po przygotowaniu wszystkich 20 płytek z kroplami krystalizacyjnymi i ich automatycznym powrocie do wysuwanych nośników, otwórz przedni panel i ostrożnie wyjmij płytki. Przed odstawieniem ich do krystalizacji sprawdź, czy płytki są prawidłowo uszczelnione. Przed ułożeniem pokrywek SBS w stosie po lewej stronie robota do obsługi cieczy w celu ich przechowywania, oczyść je roztworem 20% etanolu.Wyrzuć płytkę PCR oraz mikroprowetkę. Wyłącz chłodzak do mikroprowetek i wytrzyj kondensację. Pozostaw ręcznik papierowy na powierzchni chłodnika, aby pochłaniał dalszą kondensację.Następnie załóż pokrywę kasety i zamknij przedni panel. Białka OmpF i MreB zostały wstępnie przebadane z wykorzystaniem tych w pełni zautomatyzowanych protokołów. Kryształy OmpF o jakości wystarczającej do dyfrakcji rentgenowskiej znaleziono w studzience A4 płytki LMB 7.Kryształy MreB o jakości dyfrakcyjnej znaleziono w studzience D12 płytki LMB 20. Przechowywanie płytek przed inkubacją w temperaturze 10 stopni Celsius jest kompromisem pozwalającym uniknąć zamrażania oraz przechowywania w temperaturze 4 stopni, co może prowadzić do pogorszenia warunków krystalizacji i problemów związanych z kondensacją. Przechowywane w ten sposób płytki mogą być używane w ciągu czterech do pięciu miesięcy.Za pomocą Systemu 1 rocznie produkuje się od 4 000 do 8 000 płytek LMB, które są następnie wykorzystywane do wstępnego przesiewu. Protokoły powinny zostać zoptymalizowane w inny sposób w przypadku znacznie niższej oczekiwanej przepustowości. Nasz cały zestaw płytek wstępnych jest zazwyczaj wykorzystywany jako obszerny wstępny przesiew dla nowej próbki.Jednakże, w zależności od specyficznych wymagań dotyczących próbek, można wybrać mniejszą liczbę płytek. Po przygotowaniu kropel płytki są przechowywane na półkach o niskich wibracjach, przy ściśle kontrolowanej temperaturze 4 lub 18 °C. Eksperymenty są oceniane za pomocą mikroskopów ze źródłem światła typu scroll.Po dokładnym zbadaniu natury kryształów, cechy i podobieństwa między różnymi warunkami można analizować za pomocą narzędzi internetowych, takich jak bazy danych LMB lub C6 Screen. Dalsza optymalizacja warunków krystalizacji może być nadal konieczna. Dodatkowe protokoły zautomatyzowane, obejmujące metody 4-narożne oraz przesiewanie dodatków, opisano w naszym manuskrypcie.

automated-protocols-for-macromolecular-crystallization-at-mrc

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Struktura trójwymiarowa cząsteczki pozwala na unikalne zrozumienie sposobu jej funkcjonowania. Główną metodą wyznaczania struktury w rozdzielczości bliskiej atomowej jest krystalografia rentgenowska. W niniejszym materiale prezentujemy aktualne metody otrzymywania kryształów trójwymiarowych dowolnej makrocząsteczki, które nadają się do wyznaczenia struktury za pomocą krystalografii rentgenowskiej.

Krystalizacja białek do krystalografii rentgenowskiej

W niniejszym opracowaniu opisano zrobotyzowane podejście do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych, przeznaczone do wyznaczania struktur za pomocą makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej. Przedstawiono trzy roboty zdolne do pracy z lepką i kleistą mezofazą zawierającą białka, która jest nieodzownym elementem tej metody.

Wykorzystanie robota do wysokoprzepustowej krystalizacji białek błonowych w mezofazach lipidowych

Tutaj opisujemy ogólną metodę losowego przesiewania matryc mikronasion. Wykazano, że technika ta znacznie zwiększa wskaźnik sukcesu eksperymentów przesiewowych krystalizacji białek, zmniejsza potrzebę optymalizacji i zapewnia niezawodne dostarczanie kryształów do zbierania danych i eksperymentów z moczeniem ligandów.

Poprawa wskaźnika sukcesu krystalizacji białek poprzez losowe badania przesiewowe matrycy mikronasion

Tutaj opisujemy, jak korzystać z opcji automatycznego badania przesiewowego i zbierania danych dostępnych na niektórych liniach synchrotronowych. Naukowcy wysyłają próbki chłodzone kriogenicznie do synchrotronu, gdzie badane są właściwości dyfrakcyjne, zestawy danych są zbierane i przetwarzane, a tam, gdzie to możliwe, przeprowadzane jest rozwiązanie strukturalne – a wszystko to bez interwencji człowieka.

W pełni autonomiczna charakterystyka i zbieranie danych z kryształów makrocząsteczek biologicznych

Przedstawiono nowatorski uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej wraz z odpowiednim protokołem postępowania. System umożliwia wzrost kryształów, wygrzewanie kryształów i gromadzenie danych dyfrakcyjnych in situ zarówno w temperaturze otoczenia, jak i kriogenicznej, bez konieczności jakiejkolwiek manipulacji kryształami lub montażu.

Uniwersalny uchwyt na próbki do makromolekularnej krystalografii rentgenowskiej z minimalnym rozpraszaniem tła

Badania strukturalne biomakromolekuł za pomocą krystalografii wymagają kryształów wysokiej jakości. W tym miejscu demonstrujemy protokół, który może być używany przez OptiCrys (w pełni zautomatyzowane urządzenie opracowane w naszym laboratorium) i/lub przyciski do mikrodializy do hodowli dużych, wysokiej jakości kryształów w oparciu o znajomość schematu faz krystalizacji.

Optymalizacja wzrostu kryształów w ultramolekularnej krystalografii neutronów

Stosunek sygnału do szumu danych jest jednym z najważniejszych czynników przy wykonywaniu pomiarów dyfrakcji rentgenowskiej z mikrokryształów. Linia badawcza VMXm zapewnia środowisko o niskim poziomie hałasu i mikrowiązkę do takich eksperymentów. W tym miejscu opisano metody przygotowania próbek do montażu i chłodzenia mikrokryształów dla VMXm i innych linii badawczych do krystalografii makromolekularnej mikrofokusowej.

Rurociąg przygotowania próbek mikrokryształów na linii badawczej VMXm

Tutaj opisujemy, jak korzystać z automatycznych procesów krystalografii makromolekularnej do analizy białko-struktura, szybkiej analizy kompleksu ligand-białko i badań przesiewowych fragmentów na dużą skalę w oparciu o technologię CrystalDirect w laboratorium HTX w EMBL Grenoble.

Zautomatyzowane rurociągi krystalograficzne w zakładzie EMBL HTX w Grenoble

Ten protokół szczegółowo opisuje wysokoprzepustowe badanie przesiewowe krystalizacji, począwszy od przygotowania 1 536 mikropróbek do końca 6-tygodniowego okna eksperymentalnego. Znajdują się tam szczegółowe informacje na temat konfiguracji próbki, uzyskanego obrazowania oraz sposobu, w jaki użytkownicy mogą wykonywać analizy za pomocą graficznego interfejsu użytkownika opartego na sztucznej inteligencji, aby szybko i skutecznie zidentyfikować warunki krystalizacji makromolekularnej.

Wysokoprzepustowe badania przesiewowe w celu uzyskania trafień kryształów do krystalografii białek

Prezentujemy protokół krystalizacji białek za pomocą urządzenia do krystalizacji w Kompleksie Badawczym w Harwell i późniejsze zbieranie danych krystalograficznych in situ w promieniowaniu rentgenowskim in situ z kryształów wewnątrz płytek na linii badawczej Diamond's Versatile Macromolecular Crystallography in situ (VMXi). Opisujemy wymagania dotyczące próbek, protokoły krystalizacji i wytyczne dotyczące zbierania danych.

Gromadzenie danych o krystalizacji i temperaturze pokojowej in situ przy użyciu urządzenia do krystalizacji w Harwell i linii badawczej VMXi, diamentowego źródła światła

Poznaj zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC. Metoda umożliwia przygotowanie do 1920 eksperymentów dyfuzji parowej w nanolitrowych kroplach dla badań strukturalnych białek, DNA i RNA.

Zautomatyzowane protokoły krystalizacji makromolekularnej w Laboratorium Biologii Molekularnej MRC

Przeglądaj więcej filmów