Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Ogólnym celem tych procedur znakowania jest obrazowanie i ilościowe określanie stabilnych, dynamicznych i nowo powstających mikrotubul w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, takie jak wpływ mikrotubul na ustanawianie polaryzacji komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest optymalizacja detekcji i kwantyfikacji poszczególnych populacji mikrotubul in situ.

Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące tę metodę napotykają trudności ze względu na problemy z zachowaniem integralności mikrotubul. Po odchlorowaniu zarodków danio przebrania (zebrafish) na odpowiednim etapie rozwoju zgodnie z opisanym protokołem, przenieś je do probówek dośrodkowych o pojemności 1,5 ml, usuwając jak najwięcej medium. Dodaj 1 ml 4% PFA w buforze do montażu mikrotubul (MAB), aby utrwalić zarodki w temperaturze 28,5 °C przez pięć minut.

Następnie za pomocą pipety odessać utrwalacz i zastąpić go jednym mililitrem świeżego utrwalacza. Próbki inkubować na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Odessać utrwalacz i dodać jeden mililitr buforu TBS NP-40.

Delikatnie mieszaj embriony na wytrząsacie przez pięć minut. Powtórz proces płukania jeszcze dwa razy. Następnie, po zastąpieniu buforu jednym mililitrem świeżego TBS NP-40, przechowuj embriony w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez siedem dni.

Po usunięciu żółtka i zatopieniu embrionów w agarozie zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować naczynie do sekcjonowania wypełnione buforem TBS NP-40 i użyć wibrotomu do wykonania przekrojów o grubości 40 µm wzdłuż najdłuższej osi embrionów zatopionych w agarozie. Za pomocą precyzyjnej pęsety przenieść wybrane przekroje do 500 µL buforu TBS NP-40 w płytce 24-dołkowej. Usunąć bufor i dodać 500 µL roztworu blokującego.

Następnie delikatnie kołysze się preparatami w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Roztwór blokujący zastępuje się 300 µL przeciwciał pierwotnych rozcieńczonych w buforze blokującym, a następnie inkubuje próbki na kołysarce w temperaturze 4 °C przez 36 do 72 godzin. Próbki płucze się dwukrotnie, używając 600 µL TBS NP-40.

Umieść je na kołysarce w temperaturze pokojowej na 30 minut każdą partię. Do przekrojów dodaj 300 µL przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluorochromem, rozcieńczonych w buforze blokującym, a następnie inkubuj je w ciemności na kołysarce w temperaturze 4 °C przez 16 do 24 godzin. Następnie przemyj próbki dwukrotnie, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.

Następnie do embrionów należy dodać 500 µL roztworu DAPI i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie próbki należy przemyć trzy razy buforem TBS NP-40 w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po przemyciu na środku czystego od kurzu szkiełka przedmiotowego należy nanieść kroplę medium montażowego z dodatkiem środka zapobiegającego blaknięciu.

Używając precyzyjnej pęsety, przenieś przekroje do kropli medium montażowego. Następnie na próbkę nałóż czyste, wolne od kurzu szkiełko nakrywkę. Przechowuj preparaty zawinięte w folię, w suchym, ciemnym i chłodnym miejscu do momentu wykonania obrazowania.

Kierując się szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, należy wykonać obrazy konfokalne w stosie z (z-stack) z ustawieniami kanałów dla wybranych fluoroforów przeciwciał wtórnych, a następnie zapisać pliki obrazów. Za pomocą oprogramowania do analizy 3D, takiego jak Image J, należy otworzyć kopię pliku z danymi. Utwórz obraz scalony poprzez nałożenie na siebie wybranych kanałów, wybierając opcję image, color, merge channels.

Wybierz kanały 594 nanometr, 488 nanometr oraz DAPI, aby przypisać im odpowiednio kolory czerwony, zielony i niebieski. Zaznacz opcję, utwórz obraz złożony i zatwierdź przyciskiem OK. Zwizualizuj połączony stos z jako pojedynczy obraz 2D, wykonując projekcję maksymalnej intensywności stosu z za pomocą menu images, stack, z project.

Wprowadź pozycje początkową i końcową wewnętrznych najlepszych płaszczyzn z jako odpowiednio slajd początkowy i wycinek końcowy. Wybierz maksymalną intensywność jako typ projekcji i kliknij OK. W oprogramowaniu do analizy 3D wybierz opcję tworzenia biblioteki i podaj opisową nazwę dla biblioteki obrazów.

Kliknij, utwórz i przeciągnij surowe pliki obrazów do biblioteki. Następnie wybierz plik do analizy. Następnie z menu widoku wybierz opcję rozszerzonego ostrzenia, aby wyświetlić obraz z nałożonymi kanałami w głównym oknie.

Wybierz narzędzie ROI do ręcznego zaznaczania obszarów i obrysuj obszar zainteresowania do analizy. Wybierz kartę działań, a następnie opcję przytnij do zaznaczenia, aby wyciąć obraz. Następnie zapisz przycięty plik obrazu pod nową nazwą.

Następnie kliknij kartę pomiarów (measurements), aby stworzyć protokół filtrowania konkretnych obiektów istotnych dla analizy 3D. Następnie przeciągnij funkcję znajdź obiekty (find objects) do okna protokołu i zmień nazwę pierwszego protokołu na DAPI. Wybierz kanał beta tubuliny z menu rozwijanego.

Następnie przeciągnij poniższe ustawienia do protokołu dla β-tubuliny i umieść je pod funkcją find objects w następującej kolejności: Fill holes and objects, separate touching objects, exclude objects by size oraz exclude not touching ROIs. Teraz wybierz opcję measure na dole każdego protokołu.

Następnie dla wszystkich kanałów z wyjątkiem DAPI wybierz pomiar intensywności i objętości oraz długość szkieletową dla wszystkich znakowań tubuliny. Obrysuj ROI wokół obszaru do pomiaru. W zakładce podsumowania (summary) przejrzyj pomiary po przetworzeniu regionu przez oprogramowanie.

Następnie skopiuj dane i zapisz je w arkuszu kalkulacyjnym, jak pokazano tutaj. Aby skonstruować aparat do przepływu z wieloma studzienkami, należy za pomocą uchwytu lub piły pasmowej przeciąć wzdłuż probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na pół. Z nylonowej siatki o oczkach 70 µm wytnij siedem półkoli o promieniu 3 cm i przytnij je tak, aby ściśle pasowały do jednej z połowy rozciętej probówki wirówkowej.

Używając akwariowego silikonu uszczelniającego, przyklej półkola do probówki wirówkowej równolegle do oznaczeń graduacyjnych 10 ml. Po pozostawieniu urządzenia do wyschnięcia przez dwa dni, wypłucz je, namaczając w zlewce z wodą przez dwie do trzech godzin. Wyłóż górny gwintowany koniec przeciętej probówki wirówkowej plasteliną w taki sposób, aby wysokość cieczy zatrzymanej w urządzeniu przepływowym wynosiła 1/4 cala.

Przygotuj aparat do wypłukiwania, wyjmując tłok z strzykawki o pojemności 50 mililitrów i wkładając 12 cali cienkiej rurki do końcówki. Wsuń rurkę tak głęboko, jak to możliwe, a następnie użyj plasteliny, aby uszczelnić miejsce połączenia. Namocz siatkę w medium dla embrionów, aby ciecz przepłynęła przez całe urządzenie przepływowe.

Ustaw urządzenie na lodzie pod kątem tak, aby ciecz wypełniła wszystkie komory, ale jednocześnie wypłynęła z przedniej części, w której znajduje się gliniany rant. Zawieś aparat do wypłukiwania na statywie z pierścieniem nad urządzeniem przepływowym umieszczonym na lodzie. Schłodź 200 milliliters medium dla embrionów na lodzie i wlej do aparatu do wypłukiwania ilość wystarczającą do usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza i zapewnienia prędkości przepływu wynoszącej około seven milliliters per minute.

Dostosuj szybkość przepływu, zmieniając wysokość strzykawki. Po odchlorowaniu embrionów i przygotowaniu nocodazolu zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 10 mililitrów zimnego roztworu roboczego nocodazolu, aby wymienić medium embrionów w grupie traktowanej nocodazolem. Umieść szalki Petriego na lodzie na czas odpowiedni dla danego etapu rozwoju.

Następnie, używając wypalanej szklanej pipety o poj. 1 ml, przenieś embriony do aparatu przepływowego, wykorzystując oddzielne komory dla każdej grupy eksperymentalnej. Rozpocznij wypłukiwanie nocodazolu, wlewając lodowate podłoże dla embrionów do górnej części strzykawki o poj. 50 ml. Po 20 minutach wypłukiwania w temperaturze pokojowej umożliw regenerację mikrotubul, przenosząc embriony wypalaną szklaną pipetą o poj. 1 ml do szklanych naczyń Petri zawierających ciepłe podłoże dla embrionów.

Niezwłocznie po przeniesieniu embrionów uruchom stoper. Na koniec utrwal embriony kontrolne oraz poddane wypłukiwaniu w czasie jednej, pięciu i 10 minut, przenosząc pipetą około 10 embrionów do probówki do wirowania o pojemności 1,5 mililitra wypełnionej jednym mililitrem utrwalacza 4%PFA MAB i utrwalając próbki zgodnie z wcześniejszą instrukcją w tym filmie. Jako markery stabilnych i dynamicznych mikrotubul należy zastosować glu-tubulinę oraz tyr-tubulinę.

Wykazano, że dynamiczne mikrotubule przeważają w tylnym mózgu na etapie neural kill. W miarę rozwoju kill w pręt neuronowy (neural rod), który jest etapem nasilonej epitelizacji, jakościowo mniej mikrotubul wykazuje immunoreaktywność z przeciwciałem przeciwko tyr-tubulinie, szczególnie w brzusznej części pręta. Z kolei glu-tubulina jest rozproszona i punktowa w całym neural kill, ale występuje w zwiększonym stężeniu w brzusznej części pręta neuronowego wzdłuż traktu mikrotubul.

Głowice strzałek wskazują na konkretne pęczki lub struktury mikrotubularne, w których intensywność znakowania jest zwiększona. Obróbka nocodazolem powoduje depolimeryzację mikrotubul, co prowadzi do rozproszenia znakowania. W miarę odrastania mikrotubule wydłużają się z centrosomu.

Może to być jednak nieoczywiste w pojedynczej płaszczyźnie ze względu na ich niepłaskie trajektorie. Niemniej jednak niektóre oprogramowanie do analizy obrazu pozwala na pomiar długości w 3D, co umożliwia ocenę wzrostu mikrotubul po wypłukaniu nocodazolu. Średnia długość mikrotubul wydaje się zwiększać w czasie po wypłukaniu nocodazolu we wszystkich analizowanych obszarach cewy neuronalnej.

Po zakończeniu analizy danych za pomocą oprogramowania do analizy obrazów 3D oraz przeprowadzeniu kontroli jakości, z surowych danych można uzyskać przydatne informacje, takie jak średnia długość wszystkich mikrotubul oraz mikrotubul stabilnych, a także stosunek mikrotubul stabilnych do wszystkich mikrotubul. Po opanowaniu tej techniki cały proces, od początku do końca, nie zajmuje więcej niż tydzień. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pobierać i przetwarzać próbki bezzwłocznie, ponieważ mikrotubule łatwo ulegają depolimeryzacji.

Niniejszą procedurę można zastosować również do analizy mutantów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wyizolować poszczególne populacje mikrotubul w nienaruszonym embrionie.