Name: Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 38 s
Description: Poznaj metody znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku Danio rerio. Technika ta umożliwia badanie dynamiki mikrotubul in situ w neurobiologii rozwojowej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Mikroskop konfokalny został zakupiony dzięki funduszom z U.S. National Science Foundation (NSF), grant #DBI-0722569. Badania były wspierane przez U.S. National Institutes of Health/National Institute of General Medical Sciences (NIH/NIGMS) grant #GM085290 oraz grant Departamentu Obrony USA (DOD) #W81XWH-16-1-0466 przyznany R.M. Brewsterowi. E. Vital otrzymał grant dla UMBC z Instytutu Medycznego Howarda Hughesa w ramach programu edukacji przedszkolnej i licencjackiej w zakresie nauk ścisłych, grant #52008090. S.P. Brown był wspierany przez stypendium GAANN Departamentu Edukacji Stanów Zjednoczonych, stypendium Meyerhoff Graduate Fellowship ufundowane przez #GM055036 grantu NIH/NIGMS oraz asystenturę badawczą ufundowaną przez grant Departamentu Edukacji Stanów Zjednoczonych #W81XWH-16-1-0466.

<ol><li>Akhmanova, A., Steinmetz, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tracking+the+ends%3A+a+dynamic+protein+network+controls+the+fate+of+microtubule+tips%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Tracking the ends: a dynamic protein network controls the fate of microtubule tips.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (4), 309-322 (2008).</li>
<li>Conde, C., Cáceres, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+assembly%2C+organization+and+dynamics+in+axons+and+dendrites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microtubule assembly, organization and dynamics in axons and dendrites.</a> Nat Rev Neurosci. 10 (5), 319-332 (2009).</li>
<li>Kaverina, I., Straube, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+cell+migration+by+dynamic+microtubules%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of cell migration by dynamic microtubules.</a> Semin Cell Dev Biol. 22 (9), 968-974 (2011).</li>
<li>Kollman, J. M., Merdes, A., Mourey, L., Agard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+nucleation+by+%CE%B3-tubulin+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule nucleation by γ-tubulin complexes.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 12 (11), 709-721 (2011).</li>
<li>Howard, J., Hyman, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth%2C+fluctuation+and+switching+at+microtubule+plus+ends%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Growth, fluctuation and switching at microtubule plus ends.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 10 (8), 569-574 (2009).</li>
<li>Schulze, E., Kirschner, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+and+stable+populations+of+microtubules+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Dynamic and stable populations of microtubules in cells.</a> J Cell Biol. 104 (2), 277-288 (1987).</li>
<li>Gundersen, G. G., Kalnoski, M. H., Bulinski, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+populations+of+microtubules%3A+Tyrosinated+and+nontyrosinated+alpha+tubulin+are+distributed+differently+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Distinct populations of microtubules: Tyrosinated and nontyrosinated alpha tubulin are distributed differently in vivo.</a> Cell. 38 (3), 779-789 (1984).</li>
<li>Li, R., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+polymer+polarity%3A+how+the+cytoskeleton+builds+a+polarized+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Beyond polymer polarity: how the cytoskeleton builds a polarized cell.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (11), 860-873 (2008).</li>
<li>Asakawa, K., Kawakami, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+transgenic+zebrafish+for+monitoring+in+vivo+microtubule+structures%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn+Off+Publ+Am+Assoc+Anat%22%5BJournal%5D)">A transgenic zebrafish for monitoring in vivo microtubule structures.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 239 (10), 2695-2699 (2010).</li>
<li>Wühr, M., Tan, E. S., Parker, S. K., Detrich, H. W., Mitchison, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+cleavage+plane+determination+in+early+amphibian+and+fish+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol+CB%22%5BJournal%5D)">A model for cleavage plane determination in early amphibian and fish embryos.</a> Curr Biol CB. 20 (22), 2040-2045 (2010).</li>
<li>Tran, L. D., Hino, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+microtubules+at+the+vegetal+cortex+predict+the+embryonic+axis+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Dynamic microtubules at the vegetal cortex predict the embryonic axis in zebrafish.</a> Development. 139 (19), 3644-3652 (2012).</li>
<li>Butler, R., Wood, J. D., Landers, J. A., Cunliffe, V. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+and+chemical+modulation+of+spastin-dependent+axon+outgrowth+in+zebrafish+embryos+indicates+a+role+for+impaired+microtubule+dynamics+in+hereditary+spastic+paraplegia%5BTitle%5D)+AND+%22Dis+Model+Mech%22%5BJournal%5D)">Genetic and chemical modulation of spastin-dependent axon outgrowth in zebrafish embryos indicates a role for impaired microtubule dynamics in hereditary spastic paraplegia.</a> Dis Model Mech. 3 (11-12), 743-751 (2010).</li>
<li>Yoo, S. K., Lam, P. -Y., Eichelberg, M. R., Zasadil, L., Bement, W. M., Huttenlocher, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+microtubules+in+neutrophil+polarity+and+migration+in+live+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of microtubules in neutrophil polarity and migration in live zebrafish.</a> J Cell Sci. 125 (23), 5702-5710 (2012).</li>
<li>Andersen, E. F., Halloran, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrosome+movements+in+vivo+correlate+with+specific+neurite+formation+downstream+of+LIM+homeodomain+transcription+factor+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Centrosome movements in vivo correlate with specific neurite formation downstream of LIM homeodomain transcription factor activity.</a> Development. 139 (19), 3590-3599 (2012).</li>
<li>Lee, S. -J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+regulation+of+the+microtubule+and+actin+cytoskeleton+in+zebrafish+epiboly%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Dynamic regulation of the microtubule and actin cytoskeleton in zebrafish epiboly.</a> Biochem Biophys Res Commun. 452 (1), 1-7 (2014).</li>
<li>Bulinski, J. C., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stabilization+and+post-translational+modification+of+microtubules+during+cellular+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Stabilization and post-translational modification of microtubules during cellular morphogenesis.</a> BioEssays. 13 (6), 285-293 (1991).</li>
<li>Magiera, M. M., Janke, C. Chapter 16 - Investigating Tubulin Posttranslational Modifications with Specific Antibodies. Methods Cell Biol. 115, 247-267 (2013).</li>
<li>Hong, E., Jayachandran, P., Brewster, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+polarity+protein+Pard3+is+required+for+centrosome+positioning+during+neurulation%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The polarity protein Pard3 is required for centrosome positioning during neurulation.</a> Dev Biol. 341 (2), 335-345 (2010).</li>
<li>Westermann, S., Weber, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+regulate+microtubule+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications regulate microtubule function.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (12), 938-948 (2003).</li>
<li>Jayachandran, P., Olmo, V. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule-associated+protein+1b+is+required+for+shaping+the+neural+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Neural+Develop%22%5BJournal%5D)">Microtubule-associated protein 1b is required for shaping the neural tube.</a> Neural Develop. 11, 1(2016).</li>
<li>Nam, S. -C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+Tau%2C+a+microtubule+associated+protein%2C+in+Drosophila+photoreceptor+morphogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+N+Y+N+2000%22%5BJournal%5D)">Role of Tau, a microtubule associated protein, in Drosophila photoreceptor morphogenesis.</a> Genes N Y N 2000. 54 (11), 553-561 (2016).</li>
<li>Abal, M., Piel, M., Bouckson-Castaing, V., Mogensen, M., Sibarita, J. -B., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+release+from+the+centrosome+in+migrating+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Microtubule release from the centrosome in migrating cells.</a> J Cell Biol. 159 (5), 731-737 (2002).</li>
<li>Delgehyr, N., Sillibourne, J., Bornens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microtubule+nucleation+and+anchoring+at+the+centrosome+are+independent+processes+linked+by+ninein+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Microtubule nucleation and anchoring at the centrosome are independent processes linked by ninein function.</a> J Cell Sci. 118 (8), 1565-1575 (2005).</li>
<li>Manning, J. A., Lewis, M., Koblar, S. A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+essential+function+for+the+centrosomal+protein+NEDD1+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">An essential function for the centrosomal protein NEDD1 in zebrafish development.</a> Cell Death Differ. 17 (8), 1302-1314 (2010).</li>
<li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn+Off+Publ+Am+Assoc+Anat%22%5BJournal%5D)">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn Off Publ Am Assoc Anat. 203 (3), 253-310 (1995).</li>
<li>Beck, A. P., Watt, R. M., Bonner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+and+Lateral+Mounting+of+Zebrafish+Embryos%3A+Analysis+of+Spinal+Cord+Development%5BTitle%5D)+AND+%22JoVE+J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Dissection and Lateral Mounting of Zebrafish Embryos: Analysis of Spinal Cord Development.</a> JoVE J Vis Exp. (84), e50703(2014).</li>
<li>FÖldes-Papp, Z., Demel, U., Tilz, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+scanning+confocal+fluorescence+microscopy%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Laser scanning confocal fluorescence microscopy: an overview.</a> Int Immunopharmacol. 3 (13-14), 1715-1729 (2003).</li>
<li>Ferreira, T., Rasband, W. S. ImageJ User Guide - IJ 1.46. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/">https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/</a> (2010).</li>
<li>Z-functions - ImageJ. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://imagej.net/Z-functions">https://imagej.net/Z-functions</a> (2017).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Obecnie istnieje wiele metod obrazowania dynamiki MT we wczesnym rozwoju danio pręgowanego, począwszy od obrazowania na żywo oznakowanych cząsteczek, a skończywszy na znakowaniu immunologicznym utrwalonej tkanki 11,12,13,14. Chociaż MT w pojedynczej komórce mogą istnieć w stanie dynamicznym lub stabilnym, epitelializacja jest procesem, w którym MT są stopniowo stabilizowane w czasie. Użycie mar...

Mikrotubule (MTs) to polimery α- i β-tubuliny, które łączą się w liniowe protofilamenty, z których kilka łączy się w pustą rurkę1,2. MT są spolaryzowanymi strukturami, z szybko rosnącymi końcami dodatnimi i wolno rosnącymi końcami ujemnymi, które są zakotwiczone w centrosomie lub innym centrum organizującym mikrotubule (MTOC)3. De novo Tworzenie MT jest inicjowane przez zarodkowanie w kompleksie pierścieniowym γ-tubulina (γ-TURC), który stanowi szablon dla MT assembly4. W każdej komórce można wyróżnić dwie populacje MT, które obracają się w różnym tempie. Dynamiczne MT badają swoje środowisko komórkowe, przełączając się między fazami wzrostu i kurczenia się w procesie znanym jako dynamiczna niestabilność5. W przeciwieństwie do dynamicznych MT, stabilne MT nie rosną i mają dłuższy okres półtrwania niż dynamiczne MTs6.

Dziesięciolecia badań nad biologią komórki dostarczyły wyrafinowanego zestawu narzędzi do badania struktury i funkcji MT i zaowocowały dużą ilością wiedzy na temat tych elementów cytoszkieletu. Na przykład MT odgrywają kluczową rolę w ustalaniu i utrzymywaniu polaryzacji komórek, co można przypisać nie tylko ich wewnętrznej polaryzacji, ale także zróżnicowanemu subkomórkowemu rozkładowi stabilnych i dynamicznych MTs7,8. W przeciwieństwie do tego, znacznie mniej wiadomo o architekturze i funkcji MT w bardziej złożonych środowiskach trójwymiarowych (3D), takich jak zarodek kręgowców, częściowo ze względu na wyzwanie związane z obrazowaniem cytoszkieletu MT w wysokiej rozdzielczości. Pomimo tego ograniczenia, najnowsza generacja linii transgenicznych wykazujących ekspresję GFP, które znakują MT lub przejściową ekspresję markerów MT znakowanych fluorescencyjnie, zwiększyła naszą wiedzę na temat dynamicznych zmian, jakie przechodzą MT oraz ich roli komórkowej i rozwojowej w zarodku danio pręgowanego. Cała sieć MT może być zobrazowana w liniach transgenicznych, w których tubulina jest albo bezpośrednio znakowana9, albo polimery tubuliny są pośrednio znakowane za pomocą białek związanych z MT Kinaza podobna do Doublecortin-like (Dclk) lub Ensconsin (EMTB)10,11. Wygenerowano inne linie (i konstrukcje), które umożliwiają ocenę wewnętrznej polaryzacji MT poprzez specyficzne oznaczanie końców MT plus lub końców ujemnych zakotwiczonych w centrosomach11,12,13,14. Siła tych narzędzi polega na możliwości badania dynamiki MT w żywych, rozwijających się organizmach. Badania te ujawniły na przykład przestrzenne i dynamiczne rozmieszczenie MT w określonych populacjach komórek, orientację wrzecion mitotycznych w tkankach ulegających morfogenezie (wskaźnik płaszczyzny podziału komórki), polarność polimeru MT w odniesieniu do procesów takich jak wydłużanie i migracja komórek oraz tempo wzrostu MT określone przez prędkość komety9, 13,15. Ograniczeniem tych narzędzi jest to, że nie pozwalają one łatwo na rozróżnienie między stabilnymi i dynamicznymi populacjami MT.

Czerpiąc z bogatej literatury z zakresu biologii komórki, opisano tutaj metody immunoznakowania do obrazowania stabilnych i dynamicznych MT w zarodku danio pręgowanego, które są komplementarne do stosowania linii transgenicznych. Powszechne stosowanie takich metod znakowania immunologicznego u danio pręgowanego było nieco utrudnione ze względu na trudności w zachowaniu integralności MT podczas procedury utrwalania. Protokół 1 przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego całkowitych, dynamicznych i stabilnych MT w przekrojach poprzecznych rozwijającego się tyłomózgowia danio pręgowanego. Ponadto opisano prostą metodę wykorzystującą komercyjnie dostępne oprogramowanie do ilościowego określania tych populacji MT. Stabilne MT różnią się od dynamicznych MT opartych na kilku potranslacyjnych modyfikacjach α-tubuliny, takich jak acetylacja i detyrozynacja, które gromadzą się na stabilnych MT w czasie16,17. W zarodku danio pręgowanego acetylacja zachodzi na rzęskach i aksonach MT, ale nie na stabilnych MT interfazowych18, co ogranicza przydatność tego markera do podzbioru ustabilizowanych MT. W przeciwieństwie do tego, detyrozynacja wydaje się zachodzić na wszystkich stabilnych MT w danio pręgowanym embryo18. Ta potranslacyjna modyfikacja odsłania karboksylowo-końcowy kwas glutaminowy α-tubuliny (tubulina zdetyrozynowana)18 i może być wykryty za pomocą anty-Glu-tubuliny19. Chociaż detyrozynacja zachodzi preferencyjnie na stabilnych MT, dowody eksperymentalne wskazują, że ta modyfikacja potranslacyjna jest raczej wynikiem, niż przyczyną stabilności MT16. Wzajemna populacja MT, składająca się z dynamicznych MT, jest rozróżniana za pomocą przeciwciała, anty-tubuliny, które specyficznie rozpoznaje tyrozynową formę α-tubuliny19. Po znakowaniu immunologicznym za pomocą tych markerów i obrazowaniu konfokalnym, można przeprowadzić analizę ilościową MT (długość, liczba i względna obfitość) w określonych obszarach rozwijającej się cewy nerwowej. W tym miejscu przedstawiono uproszczoną metodę przeprowadzania tej analizy przy użyciu oprogramowania do przetwarzania obrazów 3D. Metoda ta może być stosowana w celu odpowiedzi na pytania dotyczące morfogenezy oraz ustalania lub dojrzewania polarności komórek20. Rzeczywiście, opracowanie spolaryzowanych układów stabilnych MT towarzyszy wielu zdarzeniom rozwojowym, w tym morfogenezie fotoreceptorów21, epitelializacji komórek w rozwijającej się cewce nerwowej18 i tworzeniu aksonów8.

Protokół 2 opisuje adaptację in vivo testu biologii komórki do analizy MT podczas ich fazy składania (zarodkowanie/zakotwiczenie i wzrost)22,23. Powstające MT są zarodkowane w centrosomie, a następnie zakotwiczone w subdystalnych przydatkach macierzystego centriole23. Opisano metodę analizy powstającego odrostu MT po depolimeryzacji. Protokół ten zawiera szczegółowe informacje na temat leczenia nokodazolem w celu depolimeryzacji MT, procedury wymywania leku i okresu rekonwalescencji po leczeniu. Ponowny wzrost MT jest monitorowany w regularnych odstępach czasu po wypłukaniu przez znakowanie immunologiczne za pomocą markerów całkowitej liczby MT (anty β-tubuliny) wraz z markerami dla centrosomu (anty γ-tubulina) i jądra (4',6-diamidino-2-fenyloindol (DAPI)), zgodnie z ogólnymi procedurami opisanymi w Protokole 1. Etap depolimeryzacji MT w tym protokole jest niezbędny, ponieważ umożliwia ocenę wzrostu MT de novo, a nie rozszerzenie wcześniej istniejących MT. Technika ta różni się zatem od innych opublikowanych procedur pomiaru szybkości wzrostu MT (przy braku depolimeryzacji) przy użyciu markera końcówki dodatniej, takiego jak białko wiążące koniec 3 połączone z białkiem zielonej fluorescencji (EB3-GFP), jak pokazano w Tran i wsp., 201211. Co więcej, test ten jest szczególnie przydatny do analizy zarodków wadliwych w składaniu de novo MT, takich jak wcześniej opisane mutanty NEDD1, w których rekrutacja γ-tubuliny do centrosomu jest upośledzona, co skutkuje niepełnym tworzeniem cewy nerwowej i wadami neuronów24.

<table><tbody><tr><td>Agaroza</td><td></td><td></td><td>Stosowana w leczeniu pestek. &nbsp; Przygotować 1% agarozy przez podgrzanie roztworu&nbsp; 1 gram agarozy na 100 ml 1X pożywka dla zarodków w kuchence mikrofalowej aż do polimeryzacji.&nbsp;</td></tr><tr><td>Kpipes</td><td>Sigma</td><td>P7643</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl</td><td>Sigma</td><td>T3253-500G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&middot; 2H2O</td><td>Sigma</td><td>C5080</td><td></td></tr><tr><td>NP-40</td><td>Amerykańskie bioanalityczne</td><td>AB01424</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma</td><td>E3889-25G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma</td><td>M2670-500G</td><td></td></tr><tr><td>Albumina surowicy bydlęcej (BSA)</td><td>Fisher</td><td>BP1605</td><td></td></tr><tr><td>Triton-x</td><td>American Bioanalyticals</td><td>AB02025</td><td></td></tr><tr><td>Montaż Anti-Fade medium</td><td>Invitrogen</td><td>P10144</td><td></td></tr><tr><td>Mysia anty-&beta;-tubulina</td><td>Badania rozwojowe Hybridoma Bank</td><td>E7</td><td>1/200</td></tr><tr><td>Królicza anty-&gamma;-tubulina</td><td>Genetex</td><td>GTX113286</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Królicza anty-&alfa;-tubulina</td><td>Genetex</td><td>GTX108784</td><td>1/1000*</td></tr><tr><td>Królicza tubulina anty-detyrozynowana</td><td>Millipore</td><td>AB3201</td><td>1/200-1/1000*&nbsp; Miareczkować przeciwciała przy pierwszym użyciu nowej partii.</td></tr><tr><td>Królik anty-tyrozynowana-tubulina</td><td>Millipore</td><td>ABT171</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Mysz anty-centrin</td><td>Millipore</td><td>04-1624</td><td>1/1000</td></tr><tr><td>Koza 488 anty-królik</td><td>Thermofisher</td><td>A11008</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Koza 594 anty-królik</td><td>Thermofisher</td><td>A11012</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Koza 594 anty-mysz</td><td>Thermofisher</td><td>A11005</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Koza 488 przeciw myszom</td><td>Thermofisher</td><td>A11001</td><td>1/500</td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>Vibratome</td><td>1500</td><td></td></tr><tr><td>Kleszcze</td><td>World Precision Instruments</td><td>555227F</td><td></td></tr><tr><td>Szalka Petriego 100 mm</td><td>Cell treat</td><td>229693</td><td></td></tr><tr><td>szalka Petriego 35 mm</td><td>Cell treat</td><td>229638</td><td></td></tr><tr><td>50 ml rurka sokoła</td><td>Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Siatka nylonowa tkana 70 um</td><td>Amazon.com</td><td>B0043D1SZG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Mikropipeta</td><td>Gilson</td><td>F123602</td><td></td></tr><tr><td>Szklana pipeta</td><td>Fisher</td><td>NC-999363-9</td><td></td></tr><tr><td>Uszczelniacz akwariowy</td><td>Amazon.com, firmy MarineLand</td><td>Silicone Sealer 1 uncja (tuba)&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Stojak na pierścionki</td><td>Fisher</td><td>14-675BO</td><td></td></tr><tr><td>Microbore PTFE Rurka, 0,022"ID</td><td>Cole-Parmer</td><td>WU-06417-21</td><td></td></tr><tr><td>Modelina</td><td>Amazon.com</td><td>Sargent Art 22-4000</td><td>Wystarczy dowolna nietoksyczna modelina na bazie wosku lub oleju</td></tr><tr><td>Clamp</td><td>Fisher</td><td>02-215-466</td><td></td></tr><tr><td>Strzykawka 60ml</td><td>Fisher</td><td>14-820-11</td><td></td></tr><tr><td>Pożywka dla zarodków (E3)</td><td></td><td></td><td>34,8 g NaCl 1,6 g KCl 5,8 g CaCl2&middot; 2H2O 9,78 g MgCl2&middot; 6H2O Aby przygotować 60-krotny bulion, rozpuść składniki w H2O do końcowej objętości 2 l. Dostosuj pH do 7,2 za pomocą NaOH. Autoklaw. Aby przygotować pożywkę 1X, rozcieńczyć 16,5 ml bulionu 60X do 1 l.&nbsp;</td></tr><tr><td>Roztwór</td><td></td><td></td><td>blokujący 50 ml TBS-NP-40 2,5 ml normalna surowica kozia 1 g BSA 625 &mikro; l Triton-X</td></tr><tr><td>TBS-NP-40 (pH 7,6)</td><td></td><td></td><td>155 mM NaCl 10 mM Tris HCl 0,1% NP-40</td></tr><tr><td>2x MAB (pH6,4)</td><td></td><td></td><td>160 mM KPIPES 10 mM EGTA 2 mM MgCl2</td></tr><tr><td>Komercyjne oprogramowanie do przetwarzania obrazów 3D</td><td>PerkinElmer</td><td>Volocity (V 6.2)</td><td></td></tr><tr><td>Suchy grzejnik blokowy&nbsp;</td><td>VWR</td><td>12621-108</td><td>Używany jako płyta grzejna do topienia agarozy w Protokole 1.</td></tr><tr><td>Mikroskop preparacyjny</td> Mikroskop konfokalny <td>Leica</td><td>MZ12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Leica</td><td>SP5</td><td></td></tr><tr><td>Płaska forma do zatapiania</td><td>emsdiasum.com</td><td>BEEM 70904-01</td><td></td></tr><tr><td>Oprogramowanie do przetwarzania obrazów w domenie publicznej</td><td>NIH</td><td>ImageJ (V 1.5)</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">* Sukces różni się w zależności od numeru partii</td></tr></tbody></table>

zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Use of Immunolabeling to Analyze Stable, Dynamic, and Nascent Microtubules in the Zebrafish Embryo

Mikrotubule (MT) to dynamiczne i delikatne struktury, które są trudne do zobrazowania in vivo, szczególnie w zarodkach kręgowców. Opisano tutaj metody znakowania immunologicznego w celu analizy odrębnych populacji MT w rozwijającej się cewie nerwowej zarodka danio pręgowanego. Chociaż nacisk kładziony jest na tkankę nerwową, metodologia ta ma szerokie zastosowanie do innych tkanek. Procedury są zoptymalizowane dla zarodków we wczesnym i średnim stadium somitogenezy (od 1 somitu do 12 somitów), jednak można je dostosować do szeregu innych stadiów przy stosunkowo niewielkich korektach. Pierwszy protokół zawiera metodę oceny przestrzennego rozmieszczenia stabilnych i dynamicznych MT oraz przeprowadzenia analizy ilościowej tych populacji za pomocą oprogramowania do przetwarzania obrazów. Podejście to uzupełnia istniejące narzędzia do obrazowania dynamiki i dystrybucji mikrotubul w czasie rzeczywistym, przy użyciu linii transgenicznych lub przejściowej ekspresji oznakowanych konstruktów. Rzeczywiście, takie narzędzia są bardzo przydatne, jednak nie rozróżniają łatwo między dynamicznymi i stabilnymi MT. Możliwość obrazowania i analizowania tych odrębnych populacji mikrotubul ma ważne implikacje dla zrozumienia mechanizmów leżących u podstaw polaryzacji i morfogenezy komórek. Drugi protokół przedstawia technikę analizy powstających MT. Osiąga się to poprzez uchwycenie właściwości wzrostu de novo MT w czasie, po depolimeryzacji mikrotubul z lekiem nocodazolem i okresie rekonwalescencji po wypłukaniu leku. Technika ta nie została jeszcze zastosowana do badania MT w zarodkach danio pręgowanego, ale jest cennym testem do badania funkcji in vivo białek zaangażowanych w tworzenie mikrotubul.

Analiza stabilnych i dynamicznych MT za pomocą immunoznakowania 
W Protokole 1, wykorzystując Glu-tubulinę i Tyr-tubulinę jako markery odpowiednio stabilnych i dynamicznych MT, wykazano rozkład subpopulacji MT podczas wczesnych (stadium grzebienia neuronalnego) i późnych (stadium pręta neuronalnego) etapów rozwoju rurki neuralnej. Dynamiczne MT przeważają w rombencephalonie w stadium grzebienia neuronalnego (4-5 somity) (Rycina 2...

Metody immunoznakowania do analizy różnych populacji mikrotubul w rozwijającym się mózgu danio pręgowanego są tutaj opisane, które mają szerokie zastosowanie do innych tkanek. Pierwszy protokół przedstawia zoptymalizowaną metodę znakowania immunologicznego stabilnych i dynamicznych mikrotubul. Drugi protokół zapewnia metodę obrazowania i ilościowego oznaczania powstających mikrotubul.

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Microtubules (MTs) are dynamic and fragile structures that are challenging to image in vivo, particularly in vertebrate embryos. Immunolabeling methods ...

Ogólnym celem tych procedur znakowania jest obrazowanie i ilościowe określanie stabilnych, dynamicznych i nowo powstających mikrotubul w rozwijającym się zarodku danio pręgowanego. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z zakresu neurobiologii rozwojowej, takie jak wpływ mikrotubul na ustanawianie polaryzacji komórkowej. Główną zaletą tej techniki jest optymalizacja detekcji i kwantyfikacji poszczególnych populacji mikrotubul in situ.Zazwyczaj osoby po raz pierwszy stosujące tę metodę napotykają trudności ze względu na problemy z zachowaniem integralności mikrotubul. Po odchlorowaniu zarodków danio przebrania (zebrafish) na odpowiednim etapie rozwoju zgodnie z opisanym protokołem, przenieś je do probówek dośrodkowych o pojemności 1,5 ml, usuwając jak najwięcej medium. Dodaj 1 ml 4% PFA w buforze do montażu mikrotubul (MAB), aby utrwalić zarodki w temperaturze 28,5 °C przez pięć minut.Następnie za pomocą pipety odessać utrwalacz i zastąpić go jednym mililitrem świeżego utrwalacza. Próbki inkubować na wytrząsarce w temperaturze pokojowej przez trzy godziny. Odessać utrwalacz i dodać jeden mililitr buforu TBS NP-40.Delikatnie mieszaj embriony na wytrząsacie przez pięć minut. Powtórz proces płukania jeszcze dwa razy. Następnie, po zastąpieniu buforu jednym mililitrem świeżego TBS NP-40, przechowuj embriony w temperaturze 4 °C nie dłużej niż przez siedem dni.Po usunięciu żółtka i zatopieniu embrionów w agarozie zgodnie z protokołem tekstowym, należy przygotować naczynie do sekcjonowania wypełnione buforem TBS NP-40 i użyć wibrotomu do wykonania przekrojów o grubości 40 µm wzdłuż najdłuższej osi embrionów zatopionych w agarozie. Za pomocą precyzyjnej pęsety przenieść wybrane przekroje do 500 µL buforu TBS NP-40 w płytce 24-dołkowej. Usunąć bufor i dodać 500 µL roztworu blokującego.Następnie delikatnie kołysze się preparatami w temperaturze pokojowej przez co najmniej jedną godzinę. Roztwór blokujący zastępuje się 300 µL przeciwciał pierwotnych rozcieńczonych w buforze blokującym, a następnie inkubuje próbki na kołysarce w temperaturze 4 °C przez 36 do 72 godzin. Próbki płucze się dwukrotnie, używając 600 µL TBS NP-40.Umieść je na kołysarce w temperaturze pokojowej na 30 minut każdą partię. Do przekrojów dodaj 300 µL przeciwciał wtórnych sprzężonych z fluorochromem, rozcieńczonych w buforze blokującym, a następnie inkubuj je w ciemności na kołysarce w temperaturze 4 °C przez 16 do 24 godzin. Następnie przemyj próbki dwukrotnie, zgodnie z wcześniejszą demonstracją.Następnie do embrionów należy dodać 500 µL roztworu DAPI i inkubować je w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Następnie próbki należy przemyć trzy razy buforem TBS NP-40 w temperaturze pokojowej przez pięć minut. Po przemyciu na środku czystego od kurzu szkiełka przedmiotowego należy nanieść kroplę medium montażowego z dodatkiem środka zapobiegającego blaknięciu.Używając precyzyjnej pęsety, przenieś przekroje do kropli medium montażowego. Następnie na próbkę nałóż czyste, wolne od kurzu szkiełko nakrywkę. Przechowuj preparaty zawinięte w folię, w suchym, ciemnym i chłodnym miejscu do momentu wykonania obrazowania.Kierując się szczegółami opisanymi w protokole tekstowym, należy wykonać obrazy konfokalne w stosie z (z-stack) z ustawieniami kanałów dla wybranych fluoroforów przeciwciał wtórnych, a następnie zapisać pliki obrazów. Za pomocą oprogramowania do analizy 3D, takiego jak Image J, należy otworzyć kopię pliku z danymi. Utwórz obraz scalony poprzez nałożenie na siebie wybranych kanałów, wybierając opcję image, color, merge channels.Wybierz kanały 594 nanometr, 488 nanometr oraz DAPI, aby przypisać im odpowiednio kolory czerwony, zielony i niebieski. Zaznacz opcję, utwórz obraz złożony i zatwierdź przyciskiem OK. Zwizualizuj połączony stos z jako pojedynczy obraz 2D, wykonując projekcję maksymalnej intensywności stosu z za pomocą menu images, stack, z project.Wprowadź pozycje początkową i końcową wewnętrznych najlepszych płaszczyzn z jako odpowiednio slajd początkowy i wycinek końcowy. Wybierz maksymalną intensywność jako typ projekcji i kliknij OK. W oprogramowaniu do analizy 3D wybierz opcję tworzenia biblioteki i podaj opisową nazwę dla biblioteki obrazów.Kliknij, utwórz i przeciągnij surowe pliki obrazów do biblioteki. Następnie wybierz plik do analizy. Następnie z menu widoku wybierz opcję rozszerzonego ostrzenia, aby wyświetlić obraz z nałożonymi kanałami w głównym oknie.Wybierz narzędzie ROI do ręcznego zaznaczania obszarów i obrysuj obszar zainteresowania do analizy. Wybierz kartę działań, a następnie opcję przytnij do zaznaczenia, aby wyciąć obraz. Następnie zapisz przycięty plik obrazu pod nową nazwą.Następnie kliknij kartę pomiarów (measurements), aby stworzyć protokół filtrowania konkretnych obiektów istotnych dla analizy 3D. Następnie przeciągnij funkcję znajdź obiekty (find objects) do okna protokołu i zmień nazwę pierwszego protokołu na DAPI. Wybierz kanał beta tubuliny z menu rozwijanego.Następnie przeciągnij poniższe ustawienia do protokołu dla β-tubuliny i umieść je pod funkcją find objects w następującej kolejności: Fill holes and objects, separate touching objects, exclude objects by size oraz exclude not touching ROIs. Teraz wybierz opcję measure na dole każdego protokołu.Następnie dla wszystkich kanałów z wyjątkiem DAPI wybierz pomiar intensywności i objętości oraz długość szkieletową dla wszystkich znakowań tubuliny. Obrysuj ROI wokół obszaru do pomiaru. W zakładce podsumowania (summary) przejrzyj pomiary po przetworzeniu regionu przez oprogramowanie.Następnie skopiuj dane i zapisz je w arkuszu kalkulacyjnym, jak pokazano tutaj. Aby skonstruować aparat do przepływu z wieloma studzienkami, należy za pomocą uchwytu lub piły pasmowej przeciąć wzdłuż probówkę wirówkową o pojemności 50 ml na pół. Z nylonowej siatki o oczkach 70 µm wytnij siedem półkoli o promieniu 3 cm i przytnij je tak, aby ściśle pasowały do jednej z połowy rozciętej probówki wirówkowej.Używając akwariowego silikonu uszczelniającego, przyklej półkola do probówki wirówkowej równolegle do oznaczeń graduacyjnych 10 ml. Po pozostawieniu urządzenia do wyschnięcia przez dwa dni, wypłucz je, namaczając w zlewce z wodą przez dwie do trzech godzin. Wyłóż górny gwintowany koniec przeciętej probówki wirówkowej plasteliną w taki sposób, aby wysokość cieczy zatrzymanej w urządzeniu przepływowym wynosiła 1/4 cala.Przygotuj aparat do wypłukiwania, wyjmując tłok z strzykawki o pojemności 50 mililitrów i wkładając 12 cali cienkiej rurki do końcówki. Wsuń rurkę tak głęboko, jak to możliwe, a następnie użyj plasteliny, aby uszczelnić miejsce połączenia. Namocz siatkę w medium dla embrionów, aby ciecz przepłynęła przez całe urządzenie przepływowe.Ustaw urządzenie na lodzie pod kątem tak, aby ciecz wypełniła wszystkie komory, ale jednocześnie wypłynęła z przedniej części, w której znajduje się gliniany rant. Zawieś aparat do wypłukiwania na statywie z pierścieniem nad urządzeniem przepływowym umieszczonym na lodzie. Schłodź 200 milliliters medium dla embrionów na lodzie i wlej do aparatu do wypłukiwania ilość wystarczającą do usunięcia wszystkich pęcherzyków powietrza i zapewnienia prędkości przepływu wynoszącej około seven milliliters per minute.Dostosuj szybkość przepływu, zmieniając wysokość strzykawki. Po odchlorowaniu embrionów i przygotowaniu nocodazolu zgodnie z protokołem tekstowym, użyj 10 mililitrów zimnego roztworu roboczego nocodazolu, aby wymienić medium embrionów w grupie traktowanej nocodazolem. Umieść szalki Petriego na lodzie na czas odpowiedni dla danego etapu rozwoju.Następnie, używając wypalanej szklanej pipety o poj. 1 ml, przenieś embriony do aparatu przepływowego, wykorzystując oddzielne komory dla każdej grupy eksperymentalnej. Rozpocznij wypłukiwanie nocodazolu, wlewając lodowate podłoże dla embrionów do górnej części strzykawki o poj. 50 ml. Po 20 minutach wypłukiwania w temperaturze pokojowej umożliw regenerację mikrotubul, przenosząc embriony wypalaną szklaną pipetą o poj. 1 ml do szklanych naczyń Petri zawierających ciepłe podłoże dla embrionów.Niezwłocznie po przeniesieniu embrionów uruchom stoper. Na koniec utrwal embriony kontrolne oraz poddane wypłukiwaniu w czasie jednej, pięciu i 10 minut, przenosząc pipetą około 10 embrionów do probówki do wirowania o pojemności 1,5 mililitra wypełnionej jednym mililitrem utrwalacza 4%PFA MAB i utrwalając próbki zgodnie z wcześniejszą instrukcją w tym filmie. Jako markery stabilnych i dynamicznych mikrotubul należy zastosować glu-tubulinę oraz tyr-tubulinę.Wykazano, że dynamiczne mikrotubule przeważają w tylnym mózgu na etapie neural kill. W miarę rozwoju kill w pręt neuronowy (neural rod), który jest etapem nasilonej epitelizacji, jakościowo mniej mikrotubul wykazuje immunoreaktywność z przeciwciałem przeciwko tyr-tubulinie, szczególnie w brzusznej części pręta. Z kolei glu-tubulina jest rozproszona i punktowa w całym neural kill, ale występuje w zwiększonym stężeniu w brzusznej części pręta neuronowego wzdłuż traktu mikrotubul.Głowice strzałek wskazują na konkretne pęczki lub struktury mikrotubularne, w których intensywność znakowania jest zwiększona. Obróbka nocodazolem powoduje depolimeryzację mikrotubul, co prowadzi do rozproszenia znakowania. W miarę odrastania mikrotubule wydłużają się z centrosomu.Może to być jednak nieoczywiste w pojedynczej płaszczyźnie ze względu na ich niepłaskie trajektorie. Niemniej jednak niektóre oprogramowanie do analizy obrazu pozwala na pomiar długości w 3D, co umożliwia ocenę wzrostu mikrotubul po wypłukaniu nocodazolu. Średnia długość mikrotubul wydaje się zwiększać w czasie po wypłukaniu nocodazolu we wszystkich analizowanych obszarach cewy neuronalnej.Po zakończeniu analizy danych za pomocą oprogramowania do analizy obrazów 3D oraz przeprowadzeniu kontroli jakości, z surowych danych można uzyskać przydatne informacje, takie jak średnia długość wszystkich mikrotubul oraz mikrotubul stabilnych, a także stosunek mikrotubul stabilnych do wszystkich mikrotubul. Po opanowaniu tej techniki cały proces, od początku do końca, nie zajmuje więcej niż tydzień. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest, aby pobierać i przetwarzać próbki bezzwłocznie, ponieważ mikrotubule łatwo ulegają depolimeryzacji.Niniejszą procedurę można zastosować również do analizy mutantów. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać dobrą wiedzę na temat tego, jak wyizolować poszczególne populacje mikrotubul w nienaruszonym embrionie.

use-immunolabeling-to-analyze-stable-dynamic-nascent-microtubules

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Niniejszy protokół opisuje obrazowanie poszczególnych neuronów lub komórek grzebienia neuronalnego w żywych embrionach danio pruzebrzuchego. Metoda ta jest wykorzystywana do badania zachowań komórkowych oraz lokalizacji aktyny przy użyciu konfokalnej mikroskopii fluorescencyjnej w trybie time-lapse.

Obrazowanie na żywo ruchliwości komórek oraz cytoszkieletu aktynowego pojedynczych neuronów i komórek grzebienia nerwowego w embrionach danio pręgowanego

Kluczem do zrozumienia procesów morfogenetycznych kształtujących wczesny embrion jest możliwość obrazowania komórek w wysokiej rozdzielczości. Opisujemy tutaj technikę znakowania pojedynczych komórek lub małych skupisk komórek w całych embrionach ryby danio pręgowanej za pomocą białka GFP skierowanego do błony komórkowej.

Znakowanie i obrazowanie komórek w rdzeniu przedłużonym rybki danio

Obrazowanie dynamicznego zachowania organelli i innych struktur subkomórkowych in vivo może rzucić światło na ich funkcję w warunkach fizjologicznych i chorobowych. W tym artykule przedstawiono metody genetycznego znakowania dwóch organelli, centrosomów i mitochondriów oraz obrazowania ich dynamiki w żywych zarodkach danio pręgowanego za pomocą mikroskopii szerokokątnej i konfokalnej.

Obrazowanie struktur subkomórkowych w żywym zarodku danio pręgowanego

Opisano techniki immunobarwienia fosfo-epitopów w całych zarodkach danio pręgowanego, a następnie przeprowadzania dwukolorowej fluorescencyjnej lokalizacji konfokalnej w strukturach komórkowych tak małych jak pierwotne rzęski. Techniki utrwalania i obrazowania mogą określać lokalizację i kinetykę pojawiania się lub aktywacji określonych białek.

Immunobarwiące fosfo-epitopy w narządach rzęskowych całych zarodków danio pręgowanego

Łącząc transplantację komórek, znakowanie cytoszkieletu i podejście do utraty/wzmocnienia funkcji, ten protokół opisuje, w jaki sposób migrująca prospektywna płytka przedstrunowa danio pręgowanego może być wykorzystana do analizy funkcji genu kandydującego w migracji komórek in vivo.

Analiza migracji komórek in vivo przy użyciu przeszczepów komórek i obrazowania poklatkowego w zarodkach danio pręgowanego

Mitoza jest niezbędna dla każdego żywego organizmu, a defekty często prowadzą do raka i zaburzeń rozwojowych. Korzystając z tego protokołu obrazowania i danio pręgowanego jako systemu modelowego, naukowcy mogą wizualizować mitozę w żywym organizmie kręgowców i mnogość defektów, które powstają, gdy procesy mitotyczne są wadliwe.

Obserwacja podziału i dynamiki mitotycznej w żywym zarodku danio pręgowanego

Rozwój rzęsek jest niezbędny do prawidłowego organogenezy. Protokół ten opisuje zoptymalizowaną metodę oznaczania i wizualizacji komórek rzęskowych danio pręgowanego.

Wizualizacja wielorzęskowych komórek u danio pręgowanego za pomocą połączonego protokołu fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ i immunofluorescencji całej góry

Ten protokół demonstruje sekwencyjną immunofluorescencję i immunohistochemię na kriosekcjach z wczesnych stadiów zarodków danio pręgowanego, umożliwiając precyzyjne analizy kolokalizacji w określonych populacjach komórek.

Sekwencyjna immunofluorescencja i immunohistochemia na kriowyciętych zarodkach danio pręgowanego

Tutaj prezentujemy protokół wykrywania białek za pośrednictwem przeciwciał fluorescencyjnych w całych preparatach zarodków i larw danio pręgowanego.

Immunohistochemia całego wierzchowca w zarodkach i larwach danio pręgowanego

Pokazujemy metodę, która wykorzystuje szybką skaningową mikroskopię konfokalną do wykonywania na żywo obrazowania komórek mikrogleju w rozwijającym się tektum wzrokowym danio pręgowanego, umożliwiając analizę dynamiki tych komórek in vivo.

Obrazowanie na żywo i charakterystyka dynamiki mikrogleju w zarodku danio pręgowanego

Opisano strategię przygotowania próbki do obrazowania wczesnych zarodków danio pręgowanego w nienaruszonym kosmówce za pomocą mikroskopu z arkuszami świetlnymi. Analizuje różne orientacje, jakie zarodki nabywają w kosmówce na 70% etapie epibolii i pąków, a także szczegółowo opisuje strategie obrazowania w celu uzyskania rozdzielczości w skali komórkowej w całym zarodku przy użyciu systemu arkuszy świetlnych.

Obrazowanie w mikroskopii świetlnej i strategie montażu wczesnych zarodków danio pręgowanego

Poznaj metody znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku Danio rerio. Technika ta umożliwia badanie dynamiki mikrotubul in situ w neurobiologii rozwojowej.

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego (Wideo) | JoVE Journal

Zastosowanie znakowania immunologicznego do analizy stabilnych, dynamicznych i powstających mikrotubul w zarodku danio pręgowanego

Przeglądaj więcej filmów