Name: Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 35 s
Description: Poznaj metody mikrokrystalografii rentgenowskiej dla mikrokryształów białkowych wytwarzanych w żywych komórkach. Protokół upraszcza produkcję i analizę krystalograficzną bez złożonej puryfikacji.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować Chan-Sien Lay za dostarczenie zdjęć oczyszczonych mikrokryształów, Danielowi Erikssonowi i Tomowi Caradoc-Daviesowi za wsparcie na linii badawczej MX2 australijskiego synchrotronu, oraz Kathryn Flanagan i Andrew Fryga z ośrodka FlowCore na Uniwersytecie Monash za ich nieocenioną pomoc.

<ol><li>Tari, L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+utility+of+structural+biology+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Bio+%28Clifton%2C+N.J%29%22%5BJournal%5D)">The utility of structural biology in drug discovery.</a> Methods Mol Bio (Clifton, N.J). 841, 1-27 (2012).</li>
<li>Gati, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+crystallography+on+in+vivo+grown+microcrystals+using+synchrotron+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22IUCrJ%22%5BJournal%5D)">Serial crystallography on in vivo grown microcrystals using synchrotron radiation.</a> IUCrJ. 1 (2), 0(2014).</li>
<li>Redecke, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Natively+inhibited+Trypanosoma+brucei+cathepsin+B+structure+determined+by+using+an+X-ray+laser%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Natively inhibited Trypanosoma brucei cathepsin B structure determined by using an X-ray laser.</a> Science. 339 (2013), 227-230 (2013).</li>
<li>Shi, D., Nannenga, B. L., Iadanza, M. G., Gonen, T. <a target="_blank" href="https://elifesciences.org/articles/01345">Three-dimensional electron crystallography of protein microcrystals.</a> eLife. 2 (0), e01345(2013).</li>
<li>Evans, G., Axford, D., Waterman, D., Owen, R. L. <a target="_blank" href="http://www.tandfonline.com/doi/abs/10.1080/0889311X.2010.527964">Macromolecular microcrystallography.</a> Crystallog. Rev. 17 (2), 105-142 (2011).</li>
<li>Smith, J. L., Fischetti, R. F., Yamamoto, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-crystallography+comes+of+age%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Micro-crystallography comes of age.</a> Curr Opin Struct Biol. 22 (5), 602-612 (2012).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.publish.csiro.au/CH/CH14455">Reflections on the Many Facets of Protein Microcrystallography.</a> Aust J Chem. 67 (12), 1793-1806 (2014).</li>
<li>Nelson, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+cross-beta+spine+of+amyloid-like+fibrils%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the cross-beta spine of amyloid-like fibrils.</a> Nature. 435 (7043), 773-778 (2005).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+molecular+organization+of+cypovirus+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The molecular organization of cypovirus polyhedra.</a> Nature. 446 (7131), 97-101 (2007).</li>
<li>Coulibaly, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+atomic+structure+of+baculovirus+polyhedra+reveals+the+independent+emergence+of+infectious+crystals+in+DNA+and+RNA+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The atomic structure of baculovirus polyhedra reveals the independent emergence of infectious crystals in DNA and RNA viruses.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22205-22210 (2009).</li>
<li>Johansson, L. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+photosynthetic+reaction+centre+determined+by+serial+femtosecond+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Structure of a photosynthetic reaction centre determined by serial femtosecond crystallography.</a> Nat Comm. 4, (2013).</li>
<li>Li, D., Boland, C., Aragao, D., Walsh, K., Caffrey, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harvesting+and+Cryo-cooling+Crystals+of+Membrane+Proteins+Grown+in+Lipidic+Mesophases+for+Structure+Determination+by+Macromolecular+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Harvesting and Cryo-cooling Crystals of Membrane Proteins Grown in Lipidic Mesophases for Structure Determination by Macromolecular Crystallography.</a> J Vis Exp. (67), (2012).</li>
<li>Roedig, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+micro-patterned+silicon+chip+as+sample+holder+for+macromolecular+crystallography+experiments+with+minimal+background+scattering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A micro-patterned silicon chip as sample holder for macromolecular crystallography experiments with minimal background scattering.</a> Sci Rep. 5, 10451(2015).</li>
<li>Koopmann, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+opens+new+routes+in+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization opens new routes in structural biology.</a> Nature Methods. 9 (3), 259-262 (2012).</li>
<li>Gallat, F. -X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallography+at+X-ray+free-electron+lasers%3A+the+next+generation+of+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Phil+Trans+R+Soc+B%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallography at X-ray free-electron lasers: the next generation of structural biology.</a> Phil Trans R Soc B. 369 (1647), 20130497(2014).</li>
<li>Duszenko, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+protein+crystallization+in+combination+with+highly+brilliant+radiation+sources+offers+novel+opportunities+for+the+structural+analysis+of+post-translationally+modified+eukaryotic+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+F%22%5BJournal%5D)">In vivo protein crystallization in combination with highly brilliant radiation sources offers novel opportunities for the structural analysis of post-translationally modified eukaryotic proteins.</a> Acta Cryst. F. 71 (8), 929-937 (2015).</li>
<li>Axford, D., Ji, X., Stuart, D. I., Sutton, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+cellulo+structure+determination+of+a+novel+cypovirus+polyhedrin%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">In cellulo structure determination of a novel cypovirus polyhedrin.</a> Acta Cryst D. 70 (5), 1435-1441 (2014).</li>
<li>Sawaya, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+crystal+structure+obtained+at+2.9+%C3%85+resolution+from+injecting+bacterial+cells+into+an+X-ray+free-electron+laser+beam%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Protein crystal structure obtained at 2.9 Å resolution from injecting bacterial cells into an X-ray free-electron laser beam.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (35), 12769-12774 (2014).</li>
<li>Tsutsui, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Diffraction-Quality+Protein+Crystal+Processed+as+an+Autophagic+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">A Diffraction-Quality Protein Crystal Processed as an Autophagic Cargo.</a> Mol Cell. 58 (1), 186-193 (2015).</li>
<li>Boudes, M., Garriga, D., Fryga, A., Caradoc-Davies, T., Coulibaly, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+pipeline+for+structure+determination+of+in+vivo-grown+crystals+using+in+cellulo+diffraction%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">A pipeline for structure determination of in vivo-grown crystals using in cellulo diffraction.</a> Acta Cryst D. 72, 576-585 (2016).</li>
<li>Doye, J. P. K., Poon, W. C. K. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S1359029405000956">Protein crystallization in vivo.</a> Curr Opin Colloid Interface Sci. 11 (1), 40-46 (2006).</li>
<li>Mori, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Bombyx+mori+cytoplasmic+polyhedrosis+virus+polyhedrin+in+insect+cells+by+using+a+baculovirus+expression+vector%2C+and+its+assembly+into+polyhedra%5BTitle%5D)+AND+%22J+Gen+Virol%22%5BJournal%5D)">Expression of Bombyx mori cytoplasmic polyhedrosis virus polyhedrin in insect cells by using a baculovirus expression vector, and its assembly into polyhedra.</a> J Gen Virol. 74, Pt 1 99-102 (1993).</li>
<li>Arevalo, M. T., Wong, T. M., Ross, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+and+Purification+of+Virus-like+Particles+for+Vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression and Purification of Virus-like Particles for Vaccination.</a> J Vis Exp. (112), (2016).</li>
<li>Yates, L. A., Gilbert, R. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+Production+and+Purification+of+Recombinant+Murine+Kindlin-3+from+Insect+Cells+for+Biophysical+Studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Efficient Production and Purification of Recombinant Murine Kindlin-3 from Insect Cells for Biophysical Studies.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Berger, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+MultiBac+Protein+Complex+Production+Platform+at+the+EMBL%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The MultiBac Protein Complex Production Platform at the EMBL.</a> J Vis Exp. (77), (2013).</li>
<li>Margine, I., Palese, P., Krammer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Functional+Recombinant+Hemagglutinin+and+Neuraminidase+Proteins+from+the+Novel+H7N9+Influenza+Virus+Using+the+Baculovirus+Expression+System%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Expression of Functional Recombinant Hemagglutinin and Neuraminidase Proteins from the Novel H7N9 Influenza Virus Using the Baculovirus Expression System.</a> J Vis Exp. (81), (2013).</li>
<li>Khurana, A., Kronenberg, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Method+For+Production+of+Recombinant+mCD1d+Protein+in+Insect+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Method For Production of Recombinant mCD1d Protein in Insect Cells.</a> J Vis Exp. (10), (2007).</li>
<li>Ricardo, R., Phelan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+and+Determining+the+Viability+of+Cultured+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Counting and Determining the Viability of Cultured Cells.</a> J Vis Exp. (16), (2008).</li>
<li>Baskaran, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+cellulo-derived+structure+of+PAK4+in+complex+with+its+inhibitor+Inka1%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">An in cellulo-derived structure of PAK4 in complex with its inhibitor Inka1.</a> Nat Comm. 6, 1-11 (2015).</li>
<li>Armour, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-target+Parallel+Processing+Approach+for+Gene-to-structure+Determination+of+the+Influenza+Polymerase+PB2+Subunit%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit.</a> J Vis Exp. (76), (2013).</li>
<li>Otwinowski, Z., Minor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+X-ray+diffraction+data+collected+in+oscillation+mode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Processing of X-ray diffraction data collected in oscillation mode.</a> Methods Enzymol. 276, 307-326 (1997).</li>
<li>Battye, T. G. G., Kontogiannis, L., Johnson, O., Powell, H. R., Leslie, A. G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iMOSFLM%3A+a+new+graphical+interface+for+diffraction-image+processing+with+MOSFLM%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">iMOSFLM: a new graphical interface for diffraction-image processing with MOSFLM.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 271-281 (2011).</li>
<li>Kabsch, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((XDS%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">XDS.</a> Acta Cryst D. 66, Pt 2 125-132 (2010).</li>
<li>French, S., Wilson, K. <a target="_blank" href="http://scripts.iucr.org/cgi-bin/paper?a15572">On the treatment of negative intensity observations.</a> Acta Cryst.A. 34, 517-525 (1978).</li>
<li>Winn, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+the+CCP4+suite+and+current+developments%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Overview of the CCP4 suite and current developments.</a> Acta Cryst D. 67, Pt 4 235-242 (2011).</li>
<li>Foadi, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clustering+procedures+for+the+optimal+selection+of+data+sets+from+multiple+crystals+in+macromolecular+crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst+D%22%5BJournal%5D)">Clustering procedures for the optimal selection of data sets from multiple crystals in macromolecular crystallography.</a> Acta Cryst D. 69 (8), 1617-1632 (2013).</li>
<li>Rey, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virology%3A+holed+up+in+a+natural+crystal%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Virology: holed up in a natural crystal.</a> Nature. 446 (7131), 35-37 (2007).</li>
<li>Schönherr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+investigation+of+dynamic+protein+crystallization+in+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Struct+Dyn%22%5BJournal%5D)">Real-time investigation of dynamic protein crystallization in living cells.</a> Struct Dyn. 2 (4), 041712(2015).</li>
<li>Hasegawa, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+crystallization+of+human+IgG+in+the+endoplasmic+reticulum+of+engineered+Chinese+hamster+ovary+%28CHO%29+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo crystallization of human IgG in the endoplasmic reticulum of engineered Chinese hamster ovary (CHO) cells.</a> J Biol Chem. 286 (22), 19917-19931 (2011).</li>
<li>Ishchenko, A., Cherezov, V., Liu, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+and+Delivery+of+Protein+Microcrystals+in+Lipidic+Cubic+Phase+for+Serial+Femtosecond+Crystallography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation and Delivery of Protein Microcrystals in Lipidic Cubic Phase for Serial Femtosecond Crystallography.</a> J Vis Exp. (115), e54463(2016).</li>
<li>Zander, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MeshAndCollect%3A+an+automated+multi-crystal+data-collection+workflow+for+synchrotron+macromolecular+crystallography+beamlines%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Cryst.+D%22%5BJournal%5D)">MeshAndCollect: an automated multi-crystal data-collection workflow for synchrotron macromolecular crystallography beamlines.</a> Acta Cryst. D. 71, 2328-2343 (2015).</li>
<li>Fan, G. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+calcineurin+crystals+formed+using+the+baculovirus+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Micros+Res+Tech%22%5BJournal%5D)">In vivo calcineurin crystals formed using the baculovirus expression system.</a> Micros Res Tech. 34 (1), 77-86 (1996).</li>
<li>Nass, K. <a target="_blank" href="NULL">Investigation of protein structure determination using X-ray free-electron lasers</a>. , Hamburg University. PhD dissertation (2013).</li>
</ol>

Autorzy nie mają nic do ujawnienia.

Protokół ten zapewnia dwa podejścia do analizy mikrokryształów w celu ułatwienia analizy bardzo małych kryształów, które w przeszłości zostałyby przeoczone.
Kluczowe etapy oczyszczania mikrokryształów Prezentowany protokół został zoptymalizowany przy użyciu wielościanu Bombyx mori CPV1 ulegającego ekspresji w komórkach Sf9 jako układu modelowego. Jednak mikrokryształy in vivo wykazują dużą zmienność odporności mechanicznej. Na przykład kryształy przypomi...

Wykorzystanie krystalografii rentgenowskiej do określania struktur makrocząsteczek biologicznych o wysokiej rozdzielczości przez ostatnie dwie dekady stale się rozwijało. Rosnące zainteresowanie krystalografią rentgenowską przez badaczy niebędących ekspertami jest przykładem demokratyzacji tego podejścia w wielu dziedzinach nauk przyrodniczych1.
Historycznie rzecz biorąc, kryształy o wymiarach poniżej ~10 μm były uważane za trudne, jeśli nie bezużyteczne, do określenia struktury. Rosnąca na całym świecie dostępność dedykowanych linii mikrofokusowych do źródeł promieniowania synchrotronowego oraz postęp technologiczny, taki jak rozwój narzędzi do manipulowania mikrokryształami, usunęły wiele z tych barier, które utrudniały szerokie zastosowanie mikrokrystalografii rentgenowskiej. Postępy w seryjnej mikrokrystalografii rentgenowskiej2,3 i mikro dyfrakcja elektronów4 pokazały, że wykorzystanie mikro- i nanokryształów do określania struktury jest nie tylko wykonalne, ale czasami nawet lepsze niż użycie dużych kryształów5,6,7.
Te postępy zostały po raz pierwszy zastosowane do badania peptydów8 i naturalnych kryształów wytwarzanych przez wirusy owadów9,10. Są one obecnie używane w różnych makrocząsteczkach biologicznych, w tym w najtrudniejszych systemach, takich jak białka błonowe i duże kompleksy11. Aby ułatwić analizę tych mikrokryształów, zostały one przeanalizowane w mezo, w szczególności w białkach błonowych12 oraz w mikrofluidyce chips13.
Dostępność tych nowatorskich metodologii mikrokrystalografii zwiększyła możliwość wykorzystania krystalizacji in vivo jako nowej drogi dla biologii strukturalnej14,15,16 oferując alternatywę dla klasycznej krystalogenezy in vitro. Niestety, nawet jeśli kryształy in vivo mogą być wyprodukowane, pozostaje kilka przeszkód, takich jak degradacja lub utrata ligandów podczas oczyszczania z komórek, trudności w manipulacji i wizualizacji kryształów na linii synchrotronowej oraz żmudne eksperymenty dyfrakcji rentgenowskiej. Alternatywnie, kryształy zostały również przeanalizowane bezpośrednio w komórce, bez żadnego etapu oczyszczania17,18,19. Analiza porównawcza sugeruje, że takie podejścia w celulo mogą być bardziej efektywne niż analiza oczyszczonych kryształów i dawać dane o wyższej rozdzielczości20.
Ten protokół ma na celu pomóc badaczom nowym w mikrokrystalografii białek. Dostarcza metodologii koncentrujących się na przygotowaniu próbek i manipulacji nimi do eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej na linii synchrotronowej. Zaproponowano dwie opcje z wykorzystaniem izolowanych kryształów do klasycznej mikrokrystalografii lub komórek zawierających kryształy posortowanych za pomocą cytometrii przepływowej do analizy w celulo (<silna klasa = "xfig">Rysunek 1).

<table><tbody><tr><td>Komórki Sf9</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SF900-SFM pożywka dla owadów</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 L kolba do hodowli komórkowych</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inkubator wstrząsowy do hodowli komórek owadów</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 ml probówki stożkowe</td><td>Falcon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>z uchylnymi wiadrami do 50 ml Rurki</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sonicator wyposażone w sondę 19 mm</td><td>MSE Soniprep 150&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Szkiełka</td><td>szklane Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Jodek Propidium</td><td>Thermofisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BD Sorter komórek napływowych&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hampton Sita atomowe Heavy</td><td>Hampton Research</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microwirifuge</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromesh</td><td>Siatki Mitigen</td><td></td><td>700/25 oferują większą powierzchnię. Siatki indeksowane można zakupić do systematycznych badań.</td></tr><tr><td>papierowy</td><td>Mitigen</td><td></td><td>Rozmiar papierowego można zmieniać w celu uzyskania optymalnego przepływu. Będzie to w dużej mierze zależało od charakteru zastosowanych kryształów i krioprotektantu.</td></tr><tr><td>Glikol etylenowy</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Life Technologies</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MX2 linia mikrofokusowa</td><td>Australijski synchrotron</td><td></td><td>Listę dostępnych linii mikrofokusowych można znaleźć w Boudes et al. (2014) Reflections on the Many Aspects of Protein Microcrystallography. Australian Journal of Chemistry 67 (12), 1793&ndash; 1806, doi:10.1071/CH14455.</td></tr></tbody></table>

mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Microcrystallography of Protein Crystals and In Cellulo Diffraction

Pojawienie się wysokiej jakości linii mikrofokusowych w wielu obiektach synchrotronowych umożliwiło rutynową analizę kryształów mniejszych niż 10 μm w ich największym wymiarze, co kiedyś stanowiło wyzwanie. Przedstawiamy dwa alternatywne procesy oznaczania struktury mikrokryształów białek za pomocą krystalografii rentgenowskiej, ze szczególnym uwzględnieniem kryształów hodowanych in vivo. Mikrokryształy są ekstrahowane z komórek za pomocą sonikacji i oczyszczane przez wirowanie różnicowe lub analizowane w celulo po sortowaniu komórek za pomocą cytometrii przepływowej komórek zawierających kryształy. Opcjonalnie oczyszczone kryształy lub komórki zawierające kryształy są moczone w roztworach ciężkich atomów w celu fazowania eksperymentalnego. Próbki te są następnie przygotowywane do eksperymentów dyfrakcyjnych w podobny sposób poprzez nałożenie na podłoże z mikrosiatki i błyskawiczne chłodzenie w ciekłym azocie. Pokrótce opisujemy i porównujemy seryjne eksperymenty dyfrakcyjne izolowanych mikrokryształów i komórek zawierających kryształy przy użyciu synchrotronowej linii badawczej z mikroogniskowaniem w celu uzyskania zestawów danych odpowiednich do fazowania, budowania modelu i udoskonalania.
Te przepływy pracy są zilustrowane kryształami polihedryny Bombyx mori cypovirus 1 (BmCPV1) powstałymi w wyniku zakażenia komórek owadów rekombinowanym bakulowirusem. W tym studium przypadku analiza w celulo jest bardziej wydajna niż analiza oczyszczonych kryształów i daje strukturę w ciągu ~8 dni od ekspresji do uszlachetnienia.

Przedstawiono przegląd obu alternatywnych metod wyznaczania struktury z wykorzystaniem mikrokryształów in vivo (Rysunek 1). Poliedry można łatwo oczyścić poprzez sonikację i wirowanie. Ze względu na swoją gęstość tworzą one warstwę na dnie probówki, pod warstwą zanieczyszczeń, którą można usunąć za pomocą pipety (Rysunek 3a i 3b). Następnie próbkę poddaje się kilku cyklom sonikacji i przemywania, aż do o...

Przedstawiono protokół krystalografii rentgenowskiej z wykorzystaniem mikrokryształów białkowych. Porównano dwa przykłady analizujące mikrokryształy hodowane in vivo po oczyszczeniu lub w celulo.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

The advent of high-quality microfocus beamlines at many synchrotron facilities has permitted the routine analysis of crystals smaller than 10 &#181;m in ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie metodologii krystalografii rentgenowskiej stosowanej do mikrokryształów, a w szczególności do tych wytwarzanych w komórkach, które uznaje się za kryształy in vivo. Główną zaletą tego podejścia jest zapewnienie prostego i wydajnego procesu wytwarzania, wykrywania i analizy mikrokryształów. Metoda ta ma na celu ułatwienie wykorzystania mikrokryształów poprzez zastosowanie kryształów hodowanych wewnątrz żywych komórek, co eliminuje konieczność przeprowadzania złożonych procesów oczyszczania oraz prób sedacji Aprocox.W tym filmie skupimy się na prostym przygotowaniu i manipulacji próbek do eksperymentów z dyfrakcją promieni rentgenowskich na linii wiązki synchrotronu. Przedstawiamy kroki, które najbardziej różnią się od klasycznej krystalografii. W tej demonstracji wykorzystamy kryształy białka poliedru życiowego, wyhodowane z sukcesem, jednak metoda ta może być również zastosowana do białek tworzących kryształy w dowolnych komórkach bakteryjnych, owadzie, ssaczych lub drożdżowych.W pierwszej kolejności inkubować 30 mililitrów komórek Sf9 wykazujących nadekspresję białka polihedralnego cypowirusa przez trzy dni w temperaturze 27 s

microcrystallography-of-protein-crystals-and-in-cellulo-diffraction

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Biochemia

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej (2D) w celu utworzenia uporządkowanych macierzy białek błonowych jest niezwykle istotnym i trudnym zadaniem w krystalografii elektronowej. Opisujemy tutaj nasze podejście do przesiewania i identyfikacji kryształów 2D, głównie małych białek błonowych o masie w zakresie 15 – 90kDa.

Ocena prób krystalizacji dwuwymiarowej małych białek błonowych do badań biologii strukturalnej metodą krystalografii elektronowej

Ten artykuł opisuje metodologię mikroskopii krioelektronowej, która jest używana do uzyskiwania wysokiej jakości mikroskopowych obrazów makrocząsteczek w ich stanie zbliżonym do natywnego. Metoda ta pozwala uzyskać obrazy nadające się do dalszego przetwarzania komputerowego przy użyciu podejścia pojedynczej cząstki, opracowanego w celu wygenerowania rekonstrukcji 3D makrocząsteczki.

Co robić, a czego nie robić w mikroskopii krioelektronowej: podstawa przygotowania próbek i gromadzenia wysokiej jakości danych do makromolekularnej rekonstrukcji 3D

Ten protokół opisuje szczegółowo, jak wytwarzać i obsługiwać urządzenia mikroprzepływowe do zbierania danych dyfrakcji rentgenowskiej w temperaturze pokojowej. Dodatkowo opisano, w jaki sposób monitorować krystalizację białek poprzez dynamiczne rozpraszanie światła oraz jak przetwarzać i analizować uzyskane dane dyfrakcyjne.

Chipy mikroprzepływowe do dyfrakcji rentgenowskiej kryształów in situ i dynamicznego rozpraszania światła in situ do krystalografii szeregowej

Ten artykuł szczegółowo opisuje protokół wytwarzania mikroprzepływowych chipów opracowanych do krystalizacji białek na chipie metodą dializy i eksperymentów dyfrakcji rentgenowskiej in situ. Proces mikroprodukcji umożliwia zintegrowanie półprzepuszczalnej membrany do dializy z regenerowanej celulozy z dowolnym odcięciem masy cząsteczkowej między dwiema warstwami chipa.

Krystalizacja białek na chipie za pomocą mikrodializy do badań dyfrakcji rentgenowskiej in situ

Tutaj opisujemy procedury opracowane w naszym laboratorium do przygotowywania proszków z małych kryształów molekularnych do eksperymentów z dyfrakcją elektronów mikrokrystalicznych (MicroED).

Mikrokrystaliczna dyfrakcja elektronów małych cząsteczek

Określanie struktury kompleksów makromolekularnych za pomocą cryoEM stało się rutyną dla niektórych klas białek i kompleksów. W tym miejscu podsumowano ten proces (przygotowanie próbki, badanie przesiewowe, pozyskiwanie i przetwarzanie danych), a czytelnicy są kierowani do dalszych szczegółowych zasobów i zmiennych, które mogą ulec zmianie w przypadku trudniejszych próbek.

Mikroskopia krioelektronowa pojedynczych cząstek: od próbki do struktury

Monowarstwy lipidowe były używane jako podstawa do tworzenia dwuwymiarowych (2D) kryształów białkowych do badań strukturalnych przez dziesięciolecia. Są stabilne na granicy faz powietrze-woda i mogą służyć jako cienki materiał nośny do obrazowania elektronów. Poniżej przedstawiamy sprawdzone etapy przygotowania monowarstw lipidowych do badań biologicznych.

Przygotowanie próbki metodą monowarstwową lipidów do badań krystalografii elektronowej

Ten wkład opisuje, jak skonfigurować krystalizację białek na urządzeniach typu kryształ na krysztale oraz jak przeprowadzić automatyczne szeregowe zbieranie danych w temperaturze pokojowej za pomocą platformy krystalizacji na chipie.

Krystalizacja na chipie i dyfrakcja szeregowa na dużą skalę w temperaturze pokojowej

Mapy krio-EM makromolekuł o wysokiej rozdzielczości można również uzyskać za pomocą mikroskopów TEM 200 kV. Protokół ten przedstawia najlepsze praktyki w zakresie ustawiania dokładnych wyrównań optyki, schematów akwizycji danych i wyboru obszarów obrazowania, które są niezbędne do pomyślnego zbierania zestawów danych o wysokiej rozdzielczości przy użyciu TEM 200 kV.

Rutynowe zbieranie zestawów danych krio-EM o wysokiej rozdzielczości przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego 200 KV

Prezentowany protokół opisuje proste podejście do badania przesiewowego warunków krystalizacji białek i wzrostu kryształów przy użyciu 96-dołkowej płytki do dializy o wysokiej przepustowości. Zastosowanie probówek dializatorów do hodowli mikrokryształów na dużą skalę wykazano również w krystalografii seryjnej i zastosowaniach MicroED.

Wysokoprzepustowa krystalizacja białek za pomocą mikrodializy

Poznaj metody mikrokrystalografii rentgenowskiej dla mikrokryształów białkowych wytwarzanych w żywych komórkach. Protokół upraszcza produkcję i analizę krystalograficzną bez złożonej puryfikacji.

Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Przeglądaj więcej filmów