Mikrokrystalografia kryształów białek i dyfrakcji celulolo

Ogólnym celem niniejszego protokołu jest przedstawienie metodologii krystalografii rentgenowskiej stosowanej do mikrokryształów, a w szczególności do tych wytwarzanych w komórkach, które uznaje się za kryształy in vivo. Główną zaletą tego podejścia jest zapewnienie prostego i wydajnego procesu wytwarzania, wykrywania i analizy mikrokryształów. Metoda ta ma na celu ułatwienie wykorzystania mikrokryształów poprzez zastosowanie kryształów hodowanych wewnątrz żywych komórek, co eliminuje konieczność przeprowadzania złożonych procesów oczyszczania oraz prób sedacji Aprocox.

W tym filmie skupimy się na prostym przygotowaniu i manipulacji próbek do eksperymentów z dyfrakcją promieni rentgenowskich na linii wiązki synchrotronu. Przedstawiamy kroki, które najbardziej różnią się od klasycznej krystalografii. W tej demonstracji wykorzystamy kryształy białka poliedru życiowego, wyhodowane z sukcesem, jednak metoda ta może być również zastosowana do białek tworzących kryształy w dowolnych komórkach bakteryjnych, owadzie, ssaczych lub drożdżowych.

W pierwszej kolejności inkubować 30 mililitrów komórek Sf9 wykazujących nadekspresję białka polihedralnego cypowirusa przez trzy dni w temperaturze 27 stopni Celsjusza na platformie rotacyjnej. Przenieść 500 mikrolitrów hodowli komórek Sf9 do probówki do mikrocentryfugi za pomocą sterylnej pipety serologicznej, dbając o zachowanie sterylności hodowli głównej poprzez pracę w komorze bezpieczeństwa biologicznego klasy II i stosowanie standardowych technik aseptycznych. Nanieść pipetą pięć mikrolitrów komórek z probówki do mikrocentryfugi na szkiełko przedmiotowe.

Następnie należy delikatnie nachylić szkiełko nakrywcze nad próbką tak, aby jeden jego brzeg stykał się z kroplą, a następnie ostrożnie opuścić je na ciecz, unikając powstawania pęcherzyków powietrza. Następnie należy wykonać obraz preparatu za pomocą mikroskopu odwróconego. Należy dokładnie zbadać komórki, zaczynając od powiększenia 200x i przechodząc do maksymalnego powiększenia po wykryciu potencjalnego kryształu.

Należy szukać ostrych krawędzi oraz zmian w refrakcyjności. W przypadku zidentyfikowania kryształów, należy codziennie badać kulturę, aby monitorować wzrost kryształów, powtarzając poprzednie kroki. W przypadku komórek Sf9, zebrać je poprzez przeniesienie kultury do probówki do wirówki.

Umieścić probówkę na lodzie i jak najszybciej przejść do następnego kroku. W celu izolacji komórek zawierających kryształy, pipetować 4 mL zainfekowanych komórek Sf9 do probówki przystosowanej do analizy cytometrycznej. Przygotować drugą probówkę z równą liczbą komórek Sf9 z kultury pozornie zainfekowanej w celu zastosowania jako kontrola.

Następnie, tuż przed oceną metodą cytometrii przepływowej, dodać jodek propidyny do obu próbek do stężenia końcowego 1 µg/mL. Teraz nałożyć komórki z próbki kontrolnej na standardowy cytometr przepływowy umożliwiający sortowanie komórek na podstawie FSC i SSC. Przeanalizować co najmniej 20 000 zdarzeń.

Po odrzuceniu z analizy martwych komórek, agregatów komórkowych i zanieczyszczeń, wygeneruj wykres FSC względem SSC. Następnie przeanalizuj co najmniej 20 000 zdarzeń z próbki zawierającej kryształy. Porównaj wykres FSC względem SSC z próbką kontrolną i sprawdź, czy pojawiła się odrębna populacja odpowiadająca komórkom zawierającym kryształy.

Zdefiniuj bramki wokół populacji komórek zawierających kryształy, które zazwyczaj pojawiają się przy wyższym SSC lub FSC. Wykorzystując tę bramkę, posortuj od około 150 000 do 200 000 komórek zawierających kryształy do probówki do mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml, uprzednio wypełnionej 50 µl buforu PBS. Próbki po sortowaniu obrazuj za pomocą mikroskopii świetlnej zgodnie z wcześniejszym opisem, aby potwierdzić, która populacja jest powiązana z komórkami zawierającymi kryształy.

Na tym etapie komórki mogą być inkubowane z roztworami ciężkich atomów, jeśli wymagane jest fazowanie eksperymentalne. Podejście to opiera się na przesiewaniu różnych związków i czasach inkubacji, zgodnie z opisem w tekście oraz w innych przeglądach literatury. Przygotuj narzędzia do montażu próbki, przypinając najpierw mikro-siatkę zamocowaną na pinie do końca magnetycznego pręta.

Umieść pręcik bokiem w szczelinie pływaka do dializy. Następnie za pomocą pęsety chwyć knot papierowy i zablokuj go. Przed przejściem do kolejnego kroku upewnij się, że konfiguracja jest kompletna.

Następnie zmieszaj komórki z równą objętością 0,4% roztworu trypanu błękitnego do końcowego stężenia 0,2%. Po resuspensji komórek nanieś pipetą 0,5 µl posortowanych komórek na mikrositko. Po osadzeniu się komórek na powierzchni mikrositka usuń większość nadmiaru cieczy, odciskając ją za pomocą papierowego knotka. Jeśli mikrositko nie zostanie odpowiednio osuszone, komórki znajdą się na różnych głębokościach w nadmiarze cieczy, co utrudni ich wyrównanie względem wiązki promieni rentgenowskich w synchrotronie.

Ponadto nadmiar cieczy zwiększy tło rozpraszania promieni rentgenowskich. Jeśli mikrosiatka zostanie zbyt mocno odsączona, ciecz zostanie całkowicie usunięta, a próbka nie utrzyma się w otworach siatki. Przy optymalnym odsączaniu na mikrosiatce pozostaje jedynie cienka warstwa cieczy, która chroni próbkę i wymusza jej wprowadzenie do otworów siatki.

Niektóre kryształy wymagają zastosowania krioprotektanta. W naszym przypadku nie jest to konieczne, jednak procedura byłaby taka sama jak w przypadku nakładania próbki, a następnie osuszania. Należy upewnić się, że pozostała jedynie cienka warstwa cieczy.

Natychmiast schłodź mikro-siatkę w ciekłym azocie i przenieś ją do uchwytu robota w celu transportu do linii wiązki mikroogniskowej synchrotronu. Ze względu na niewielki rozmiar kryształów in vivo, zbierz dane dyfrakcyjne na linii krystalografii mikroogniskowej. W pierwszej kolejności zamocuj mikro-siatkę na goniometrze.

Następnie należy wycentrować mikrositko względem drogi wiązki, korzystając z orientacji przodem i z boku. Przy ustawieniu mikrositka przodem, precyzyjnie dostroić wyrównanie, dopasowując środek jednego z poziomych pasów mikrositka. Zbierać dane wzdłuż tego poziznego pasa, wprowadzając jedynie niewielkie korekty wyrównania.

Po przetestowaniu wszystkich kryształów w danej ścieżce, przejdź do następnej ścieżki i powtórz procedurę dopasowania. Upewnij się, że przetworzone ścieżki są wyraźnie oznaczone, aby uniknąć pominięcia kryształów lub ich dwukrotnego naświetlenia, wykorzystując zmianę barwy na trypan blue jako wskaźnik. Przedstawiono przegląd dwóch metod wyznaczania struktury z wykorzystaniem mikrokryształów in vivo.

Górny rząd opisuje klasyczne podejście obejmujące oczyszczanie kryształów z komórek, natomiast dolny rząd przedstawia podejście krystalografii in cellulo, w którym kryształy pozostają w komórkach gospodarza w celu zebrania danych. W przypadku podejścia in cellulo profil cytometrii przepływowej komórek niezainfekowanych jest porównywany z profilem komórek zawierających kryształy i służy do określenia, która populacja komórek powinna zostać wybrana, aby oddzielić komórki zawierające kryształy od pozostałych komórek. W tym przykładzie komórki zawierające poliedry wykazują wyższe rozproszenie boczne niż komórki niezainfekowane.

Komórki barwione błęknitem trypanowym można łatwo zwizualizować przy użyciu kamer dostępnych w większości linii promieniowania synchrotronowego. Podczas gdy oczyszczone kryształy są trudne do zidentyfikowania i ustawienia w wiązce promieni X ze względu na ich niewielki rozmiar, podczas zbierania danych najlepiej postępować zgodnie z wzorem siatki, aby zminimalizować procedury centrowania i uniknąć dwukrotnego naświetlania tej samej komórki lub kryształu bądź pominięcia komórek i kryształów. Po opanowaniu tej metody, cały proces — od zbioru komórek zawierających kryształy do gromadzenia danych — zajmuje około pół dnia.

Niniejsza procedura jest zgodna z metodą namaczania w ciężkich atomach w celu eksperymentalnego wyznaczenia faz. W przypadku wielościanu normalna struktura została uzyskana w ciągu ośmiu dni od rozpoczęcia ekspresji białka. Należy pamiętać, że praca z ciekłym azotem może być niezwykle niebezpieczna i konieczne jest zachowanie środków ostrożności w celu uniknięcia uduszenia oraz oparzeń.