Name: Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-14T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 16 s
Description: Poznaj metodę wstępnego kondycjonowania hipoksyjnego komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Ta technika wspiera regenerację nerwów po urazach.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Autorzy chcieliby podziękować dr Nai-Sum Wong za dostarczenie aparatu do komory hipoksyjnej oraz Pani Alice Lui za wsparcie techniczne.

Wszystkie procedury z udziałem zwierząt zostały przeprowadzone zgodnie z Przewodnikiem NIH dotyczącym opieki i użytkowania zwierząt laboratoryjnych oraz zatwierdzone przez Komitet ds. Wykorzystania Żywych Zwierząt do Nauczania i Badań, Wydział Medycyny Li Ka Shing, Uniwersytet w Hongkongu. Próbki ludzkiego szpiku kostnego pobrano z grzebienia biodrowego zdrowych dawców po uzyskaniu świadomej zgody. Protokoły zostały zatwierdzone przez Instytucjonalną Komisję Rewizyjną Uniwersytetu w Hongkongu.
1. Przygotowanie kultur MSC szczurów
<ol>
	<li>Pobieranie MSCs z kości udowej
	<ol>
		<li>Wszystkie narzędzia do preparowania (tj. cienkie nożyczki do preparowania, nożyczki tnące z końcówkami i kleszcze zębate) należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 180 °C przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.</li>
		<li>Przygotować pożywkę MSC składającą się z minimalnej ilości niezbędnej pożywki - modyfikacji alfa (αMEM) uzupełnionej 15% płodową surowicą bydlęcą (FBS) i penicyliną/streptomycyną (P/S, 1% v/v).</li>
		<li>Ofiarować młode samce szczurów Sprague Dawley (200-250 g masy ciała) przez przedawkowanie pentobarbitonu (240 mg/kg masy ciała, dootrzewnowo). 
		UWAGA: Próbki szpiku od różnych szczurów powinny być przetwarzane oddzielnie.</li>
		<li>Ułóż ofiarowane zwierzęta w pozycji leżącej. Dokładnie oczyść ich brzuch i kończyny dolne 70% etanolem.</li>
		<li>Usuń skórę i tkankę podskórną nad przyśrodkowymi udami za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Usuń mięśnie ud obwodowo, aż kość udowa zostanie odsłonięta. Kontynuuj to proksymalnie i dystalnie, aż zobaczysz stawy kolanowe i biodrowe. Odłącz kość udową przez staw biodrowy i kolanowy za pomocą nożyczek tnących z końcówką. 
		UWAGA: Na tym etapie nie należy przekraczać kości udowej w celu odsłonięcia jamy szpiku. Przenieś nienaruszone kości udowe do okapu do hodowli tkankowej z przepływem laminarnym w celu dalszego przetwarzania.</li>
		<li>Użyj nożyczek tnących z końcówką, aby przeciąć dystalne i proksymalne końce kości udowej przez przynasadę.</li>
		<li>Umieść sitko o pojemności 70 μm na stożkowej probówce o pojemności 50 ml. Włożyć strzykawkę o pojemności 21 g i pojemności 10 ml zawierającą sól fizjologiczną buforowaną fosforanami (PBS, 10 mM Na2HPO4, pH 7,4) do odsłoniętego kanału udowego i przepłukać zawartość szpiku do stożkowej rurki przez wielokrotne płukanie. 
		UWAGA: Około 20 ml PBS służy do przepłukania każdej kości udowej. Jeśli kolor zaczerwienionej zawartości pozostaje zabarwiony krwią i mętny, można użyć większej objętości.</li>
		<li>Zebrać komórki przez odwirowanie w stężeniu 480 x g przez 5 minut. Odrzucić supernatant. Zawiesić osad komórkowy w 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Umieść komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Umieścić szalki z kultur tkankowych w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ). Zapisz początkowy dzień posiewu jako dzień 0, 
		UWAGA: Na wszystkich etapach związanych z wirowaniem należy ustawić hamulec na maksymalne opóźnienie.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Zakładanie i rozbudowa kolonii MSC 
	UWAGA: Protokół ten opiera się na przestrzeganiu zaleceń dotyczących tworzyw sztucznych w hodowlach tkankowych jako sposobie selekcji MSCs z jamy szpiku kostnego11. Zawartość szpiku kostnego może przylegać do plastiku hodowli tkankowej przez 2 dni.
	<ol>
		<li>W drugim dniu przepłucz płytki hodowlane trzy razy 10 ml PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki. Po spłukaniu zastąp PBS 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Umyj komórki PBS i uzupełniaj pożywką MSC co 3 dni. 
		UWAGA: Kolonie MSC powinny być widoczne w 6-7 dniu (<silna klasa="xfig">Rysunek 2A).</li>
		<li>Przejdź komórki do 10 dnia, usuwając pożywkę wzrostową i przepłukując komórki PBS. Dodać 1,5 ml rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych i inkubować w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Dodać 3 ml pożywki wzrostowej MSC, aby zneutralizować reakcję. Zebrać oderwane komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 min.</li>
		<li>Określić ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS.</li>
		<li>Wysiewaj pasażowane komórki o gęstości 40 000 komórek/cm2 na 10-centymetrową płytkę hodowlaną w pożywce wzrostowej MSC. 
		UWAGA: MSC szczurów powinny osiągnąć 80-90% zbieżności w ciągu 2 dni od przejścia (<silna klasa="xfig">Rysunek 2B). Komórki mogą być pasażowane zgodnie z opisem w kroku 1.2.2 dla maksymalnie 8 przejść. MSCs można scharakteryzować za pomocą immunocytochemii i ich zdolności do różnicowania trójliniowego (<silna klasa="xfig">Ryc. 3)12. Tylko posiewy MSC między pasażami 3 i 8 są poddawane późniejszemu kondycjonowaniu wstępnemu hipoksyjnemu i wzbogacaniu neuronalnych progenitorów. MSC o większej liczbie pasaży przyjmują spłaszczoną morfologię (<silna klasa="xfig">Rysunek 2C) i nie wytwarzają wystarczającej liczby neuronalnych komórek progenitorowych. Te kultury należy wyrzucić.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Przygotowanie ludzkich kultur BMSC
<ol>
	<li>Rozcieńczyć 1 ml ludzkiego szpiku kostnego w 9 ml pożywki wzrostowej MSC i umieścić komórki na 10-centymetrowym naczyniu do hodowli tkankowej. Utrzymywać kultury w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ).</li>
	<li>Usuń pożywkę po 2 dniach i delikatnie spłucz kultury trzy razy 10 ml PBS, aby usunąć nieprzylegające komórki. Po ostatnim płukaniu usuń PBS i zastąp go 10 ml pożywki wzrostowej MSC. Uzupełniaj pożywkę po każdych 3 dniach hodowli po płukaniu PBS. 
	UWAGA: Kolonie MSC powinny być widoczne w 6-7 dniu. Liczba kolonii może się różnić w zależności od obiektu.</li>
	<li>Przejść przez komórki w 10 dniu, jak opisano w kroku 1.2.2. Określić ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS. Wysiewaj pasażowane komórki o gęstości 40 000 komórek/cm2 na 10 cm płytce hodowlanej w pożywce MSC. 
	UWAGA: Ludzkie MSC (<silna klasa="xfig">Rysunek 2D) wykazują podobną morfologię do MSC szczurów i podobnie powinny osiągnąć 80-90% zbieżności w ciągu 2 dni od przejścia. Powinny być scharakteryzowane za pomocą immunocytochemii i ich zdolności do różnicowania trójliniowego12. Podobnie jak w przypadku MSC szczurów, ludzkie MSC, które znajdują się między pasażem 3 a 8, są poddawane późniejszemu kondycjonowaniu wstępnemu hipoksyjnemu i wzbogacaniu neuronalnych komórek progenitorowych.</li>
</ol>
3. Kondycjonowanie wstępne hipoksyjne
<ol>
	<li>Zdemontuj elementy komory hipoksji (tj. podstawę, pokrywę, tace) po zwolnieniu zacisku pierścieniowego i wytrzyj poszczególne części do czysta 70% etanolem. Umieść elementy komory w okapie do hodowli tkanek z przepływem laminarnym w celu sterylizacji w świetle UV przez 15 minut.</li>
	<li>Przed wstępnym kondycjonowaniem hipoksyjnym należy usunąć pożywkę i przepłukać hodowle MSC szczurów i ludzi (sekcje 1 i 2) 10 ml PBS. Zastąp PBS 10 ml pożywki wzrostowej MSC uzupełnionej 25 mM HEPES. 
	UWAGA: MSCs hodowane na 10-centymetrowych szalkach powinny osiągnąć 80-90% konfluencji, zanim zostaną poddane wstępnemu kondycjonowaniu hipoksyjnemu.</li>
	<li>Umieść szalki hodowlane w komorze hipoksji. Ponownie zmontuj elementy komory i dokręć pierścień clamp. Mieszaninę gazów o stężeniu 99% N2/1% O2 należy przepłukać do komory o natężeniu przepływu 10 l/min przez 5 minut.</li>
	<li>Uszczelnij końce łączące komorę hipoksji, aby upewnić się, że nie ma wycieku gazu. Umieścić komorę w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ) na 16 godzin.</li>
	<li>Po zakończeniu kondycjonowania wstępnego hipoksyjnego należy usunąć kultury z komory, przygotowując się do późniejszej hodowli wzbogacającej neuronalne pregenitory.</li>
</ol>
4. Kultura wzbogacania neuronalnych przodków
<ol>
	<li>Przygotuj neuronalną pożywkę progenitorową składającą się ze zmodyfikowanej pożywki orła firmy Dulbecco/mieszanki składników odżywczych szynki F12 (DMEM/F12) uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), podstawowym czynnikiem wzrostu fibroblastów (bFGF, 20 ng/ml), naskórkowym czynnikiem wzrostu (EGF, 20 ng/mL) i P/S (1% v/v).</li>
	<li>Odłączyć wstępnie kondycjonowane do hipoksyjności MSCs szczura/człowieka, jak opisano w kroku 1.2.2. Zebrać oderwane komórki przez odwirowanie przy 250 x g przez 5 min. Oznaczyć ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu w PBS.</li>
	<li>Ponownie zawiesić komórki w pożywce progenitorowej neuronu i wysiać nasiona na 6-dołkowych płytkach o niskim przyleganiu o gęstości 6,000 komórek/cm2. Umieścić kulturę w inkubatorze komórkowym (37 °C, 5% CO2 ) na 12 dni. Uzupełniaj 75% pożywki progenitorowej układu nerwowego co 3 dni. 
	UWAGA: Duże skupiska nieprzylegających komórek należy obserwować do 6-7 dnia. W dniach 10-12 można zaobserwować neurosfery o średnicy ≥ 100 μm (<silna klasa="xfig">Rysunek 4). Wstępnie kondycjonowane MSCs powinny dawać więcej neurosfer w porównaniu z MSCs hodowanymi w warunkach normoksyjnych9.</li>
	<li>Zbierz neurosfery w 12 dniu, odsysając je do pipety o pojemności 10 ml i przenosząc do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Odwirować neurosfery przy 250 x g przez 5 min. 
	UWAGA: Neurosfery można scharakteryzować w dniu 12 dla markerów progenitorowych neuronów, takich jak nestin i GFAP7.</li>
</ol>
5. Generowanie komórek Schwanna zaangażowanych przez los poprzez kokulturę z neuronami DRG
<ol>
	<li>Przygotowanie oczyszczonych neuronów DRG szczura
	<ol>
		<li>Wszystkie narzędzia do preparowania (tj. nożyczki do preparowania, kleszcze, dwa kleszcze do mikrodysekcji i nożyczki do mikropreparacji) należy sterylizować w autoklawie w temperaturze 180 °C przez co najmniej 2 godziny przed użyciem.</li>
		<li>Pokryć 6-dołkowe płytki do hodowli tkankowych poli-D-lizyną (PDL, 10 μg/ml w PBS) w temperaturze 4 °C przez noc. Usuń PDL i spłucz 1,5 ml PBS na studzienkę.</li>
		<li>Kontynuować powlekanie płytek lamininą (10 μg/ml w PBS) w temperaturze 37 °C przez 2 godziny. Przepłukać płytki 1,5 ml PBS na studzienkę.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę podtrzymującą neurony DRG, składającą się z pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), L-glutaminą (1% v/v), czynnikiem wzrostu nerwów (NGF, 20 ng/mL) i P/S (1% v/v).</li>
		<li>Przygotuj pożywkę do oczyszczania neuronów DRG, składającą się z pożywki neuropodstawowej uzupełnionej witaminą B27 (2% v/v), L-glutaminą (1%), NGF (20 ng/mL), P/S (1%), fluorodeoksyurydyną (FDU, 10 μg/ml) i urydyną (10 μg/ml).</li>
		<li>Uśmiercać ciężarne szczury w 14-15 dniu ciąży przez przedawkowanie pentobarbitalu (240 mg/kg masy ciała, dootrzewnowe).</li>
		<li>Ułóż ofiarowane zwierzęta w pozycji leżącej. Dokładnie oczyść ich brzuch 70% etanolem.</li>
		<li>Przetnij dolną ścianę brzucha zwierzęcia wzdłużnie za pomocą cienkich nożyczek preparacyjnych i kleszczy. Zidentyfikuj i usuń macicę za pomocą nożyczek do preparowania. Przetnij ścianę macicy, aby odsłonić i usunąć zarodki. Przenieś zarodki do sterylnego, 10 cm naczynia hodowlanego wypełnionego PBS. Umieść naczynie hodowlane na lodzie.</li>
		<li>Przenieść zarodek przeznaczony do sekcji do sterylnego, 10 cm naczynia hodowlanego wypełnionego PBS (temperatura pokojowa) i umieścić go pod mikroskopem preparacyjnym. Ułóż zarodek w pozycji leżącej. 
		UWAGA: Białawy rdzeń kręgowy i dołączone DRG można zobaczyć nad grzbietową częścią zarodka, przez jego półprzezroczystą skórę.</li>
		<li>Włóż kleszcze do mikropreparowania po obu stronach rdzenia kręgowego i użyj sekcji, aby rozpocząć oddzielanie rdzenia kręgowego od otaczającej tkanki miękkiej. Odetnij rdzeń kręgowy od zwierzęcia za pomocą kleszczy do mikropreparowania wzdłuż otworu szyi i kikuta ogona. Wykonaj dalszą sekcję nad brzuszną częścią rdzenia, aby uwolnić ją od otaczających tkanek miękkich.</li>
		<li>Użyj kleszczy do mikropreparacji, aby usunąć resztki tkanek miękkich nad grzbietową częścią uwolnionego rdzenia kręgowego. 
		UWAGA: Na tym etapie powinien pozostać tylko rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe i przyczepiony DRG.</li>
		<li>Odłącz poszczególne DRG od łączących je korzeni nerwowych za pomocą kleszczy do mikropreparacji. Użyj pisaka do pipet dołączonego do końcówki o pojemności 1 ml, aby przenieść DRG do sterylnej probówki wirówkowej o pojemności 1,5 ml zawierającej PBS. 
		UWAGA: Na każdą probówkę o pojemności 1,5 ml można umieścić maksymalnie 100 DRG.</li>
		<li>Odwirować DRG przy 250 x g przez 5 minut i ponownie zawiesić je w rekombinowanym odczynniku do dysocjacji komórek enzymatycznych (200 μl na probówkę). Inkubować (37 °C, 5% CO2 ) przez 10 min. Odwirować DRG przy 250 x g przez 5 minut, usunąć supernatant i ponownie zawiesić w pożywce podtrzymującej neurony DRG. Oddzielić osad przez delikatne rozcieranie za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 μl. Oznaczyć ilościowo komórki w osadzie za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.</li>
		<li>Zasiać komórki o gęstości 5,000 komórek/cm2 do 6-dołkowych płytek pokrytych PDL/lamininą w 1,5 ml pożywki podtrzymującej neurony DRG na dołek. Po dwóch dniach hodowli usuń pożywkę podtrzymującą neurony DRG, spłucz PBS i zastąp pożywką do oczyszczania neuronów DRG. 
		UWAGA: Dla każdego cyklu oczyszczania należy traktować kultury DRG pożywką oczyszczającą przez 2 dni, a następnie 1 dzień inkubacji w pożywce konserwującej. Po 3-4 cyklach oczyszczania oczekuje się usunięcia wszystkich endogennych komórek glejowych7. Powinno to zająć około 14 dni. Oczyszczone kultury dają wynik dodatni dla markera neuronalnego TUJ1 i nie występują w przypadku ekspresji S100β (<silna klasa = "xfig">Figura 5).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Wytwarzanie komórek podobnych do komórek Schwanna
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę do indukcji glejowej składającą się z αMEM uzupełnionego β-hereguliną (100 ng/ml), bFGF (10 ng/ml), płytkowym czynnikiem wzrostu (PDGF-AA, 5 ng/ml), FBS (10%) i P/S (1% v/v).</li>
		<li>Umieść neurosfery przygotowane w sekcji 4 na 6-dołkowych płytkach pokrytych PDL / lamininą o gęstości 5-10 kulek nacm2 w 1,5 ml pożywki do indukcji glejowej na dołek. Pożywkę do indukcji glejowej należy wymieniać co 2 dni po przepłukaniu komórek PBS. 
		UWAGA: Obserwuje się, że komórki z zasianych neurosfer migrują na zewnątrz do 2 dnia. Do 7 dnia komórki migrujące mają zwężający się wygląd i powinny wykazywać immunopozytywność dla markerów komórek Schwanna receptora neurotrofiny p75 (p75) i S100β7. Komórki te są określane jako SCLC.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Kokultura SCLC z neuronami DRG
	<ol>
		<li>Przygotować pożywkę do kokultury składającą się z pożywki podtrzymującej neurony DRG (krok 5.1.4) i pożywki do indukcji glejowej (krok 5.2.1) w stosunku objętościowym 1:1.</li>
		<li>Przygotuj pożywkę do konserwacji komórek Schwanna składającą się z DMEM/F12 uzupełnionego FBS (5%), β-hereguliny (10 ng / ml) i P/S (1% v/v).</li>
		<li>Usunąć pożywkę hodowlaną z SCLC dnia 7, przepłukać je PBS i inkubować z 0,5 ml/studzienkę rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych w temperaturze 37 °C przez 5 minut. Ponownie zawiesić SCLC w pożywce do kokultury.</li>
		<li>Określić ilościowo komórki za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.</li>
		<li>Zasiaj SCLC na oczyszczonych kulturach neuronów DRG o gęstości 1,000 komórek/cm2. Utrzymuj kokultury przez 14 dni, z wymianą pożywki co 2 dni. 
		UWAGA: Podczas kohodowli SCLC uzyskały wrzecionowatą morfologię, która jest typowa dla dojrzałych komórek Schwanna (<silna klasa="xfig">Ryc. 6). Komórki te utrzymują się w swoim fenotypie po wycofaniu czynników wzrostu i są zdolne do mielinizacji aksonów in vitro i in vivo7,10. Dodatniość markerów komórek Schwanna (tj. p75 i S100β) powinna być monitorowana za pomocą immunofluorescencji.</li>
		<li>Po zakończeniu kohodowli pasują komórki Schwanna zaangażowane w los, jak opisano w kroku 1.2.2. Użyj 0,5 ml odczynnika dysocjacyjnego na studzienkę. Określić ilościowo komórki za pomocą hemocytometru po odpowiednim rozcieńczeniu.</li>
		<li>Ponownie zawiesić komórki Schwanna zaangażowane w los w pożywce podtrzymującej komórki Schwanna o gęstości 10 000 komórek/cm2. Komórki nasienne na 6-dołkowe płytki pokryte PDL/lamininą w celu immunofluorescencji. 
		UWAGA: Kokultury nieuchronnie zawierają MSC, które przyjęły los komórek fibroblastów7. Komórki te są pasażowane razem z komórkami Schwanna zaangażowanymi w los po zakończeniu kokultury. Komórki Schwanna leżące na tym podłożu fibroblastów mogą być łatwo odłączone i dalej namnażane po przepłukaniu "zimnymi strumieniami" PBS (4 °C), jak opisano w innym miejscu13. Komórki Schwanna zaangażowane w los można namnażać w pożywce podtrzymującej przez 1 miesiąc.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Wiliams, R. R., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation%3A+a+repair+strategy+for+spinal+cord+injury%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation: a repair strategy for spinal cord injury?</a> Prog Brain Res. 201, 295-312 (2012).</li>
<li>Kanno, H., Pearse, D. D., Ozawa, H., Itoi, E., Bunge, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Schwann+cell+transplantation+for+spinal+cord+injury+repair%3A+its+significant+therapeutic+potential+and+prospectus%5BTitle%5D)+AND+%22Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Schwann cell transplantation for spinal cord injury repair: its significant therapeutic potential and prospectus.</a> Rev Neurosci. 26 (2), 121-128 (2015).</li>
<li>Lindvall, O., Kokaia, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+cells+in+human+neurodegenerative+disorders--time+for+clinical+translation%3F%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem cells in human neurodegenerative disorders--time for clinical translation?</a> J Clin Invest. 120 (1), 29-40 (2010).</li>
<li>Terzic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+Differentiation+of+Oligodendrocyte+Progenitor+Cells+From+Mouse+Induced+Pluripotent+Stem+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplant%22%5BJournal%5D)">Directed Differentiation of Oligodendrocyte Progenitor Cells From Mouse Induced Pluripotent Stem Cells.</a> Cell Transplant. 25 (2), 411-424 (2016).</li>
<li>Takashima, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroepithelial+cells+supply+an+initial+transient+wave+of+MSC+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neuroepithelial cells supply an initial transient wave of MSC differentiation.</a> Cell. 129 (7), 1377-1388 (2007).</li>
<li>Felling, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem%2Fprogenitor+cells+participate+in+the+regenerative+response+to+perinatal+hypoxia%2Fischemia%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Neural stem/progenitor cells participate in the regenerative response to perinatal hypoxia/ischemia.</a> J Neurosci. 26 (16), 4359-4369 (2006).</li>
<li>Shea, G. K., Tsui, A. Y., Chan, Y. S., Shum, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bone+marrow-derived+Schwann+cells+achieve+fate+commitment--a+prerequisite+for+remyelination+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Bone marrow-derived Schwann cells achieve fate commitment--a prerequisite for remyelination therapy.</a> Exp Neurol. 224 (2), 448-458 (2010).</li>
<li>Jessen, K. R., Mirsky, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+origin+and+development+of+glial+cells+in+peripheral+nerves%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The origin and development of glial cells in peripheral nerves.</a> Nat Rev Neurosci. 6 (9), 671-682 (2005).</li>
<li>Mung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+efficient+generation+of+neural+progenitors+from+adult+bone+marrow+stromal+cells+by+hypoxic+preconditioning%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Rapid and efficient generation of neural progenitors from adult bone marrow stromal cells by hypoxic preconditioning.</a> Stem Cell Res Ther. 7 (1), 146(2016).</li>
<li>Ao, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+regeneration+of+transected+sciatic+nerves+of+adult+rats+using+chitosan+nerve+conduits+seeded+with+bone+marrow+stromal+cell-derived+Schwann+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The regeneration of transected sciatic nerves of adult rats using chitosan nerve conduits seeded with bone marrow stromal cell-derived Schwann cells.</a> Biomaterials. 32 (3), 787-796 (2011).</li>
<li>Tondreau, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+BM+mesenchymal+stem+cells+by+plastic+adhesion+or+negative+selection%3A+phenotype%2C+proliferation+kinetics+and+differentiation+potential%5BTitle%5D)+AND+%22Cytotherapy%22%5BJournal%5D)">Isolation of BM mesenchymal stem cells by plastic adhesion or negative selection: phenotype, proliferation kinetics and differentiation potential.</a> Cytotherapy. 6 (4), 372-379 (2004).</li>
<li>Baksh, D., Song, L., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adult+mesenchymal+stem+cells%3A+characterization%2C+differentiation%2C+and+application+in+cell+and+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Adult mesenchymal stem cells: characterization, differentiation, and application in cell and gene therapy.</a> J Cell Mol Med. 8 (3), 301-316 (2004).</li>
<li>Jirsova, K., Sodaar, P., Mandys, V., Bar, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cold+jet%3A+a+method+to+obtain+pure+Schwann+cell+cultures+without+the+need+for+cytotoxic%2C+apoptosis-inducing+drug+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurosci.+Methods%22%5BJournal%5D)">Cold jet: a method to obtain pure Schwann cell cultures without the need for cytotoxic, apoptosis-inducing drug treatment.</a> J. Neurosci. Methods. 78 (1-2), 133-137 (1997).</li>
</ol>

Wszyscy autorzy tego manuskryptu nie mają żadnych oświadczeń do oświadczeń.

Niezbędne jest zachowanie "macierzystości" MSC przed wzbogaceniem neuronalnych komórek progenitorowych poprzez hipoksyjne warunkowanie wstępne i hodowlę neurosfery. Z naszego doświadczenia wynika, że multipotencjalne MSCs można wiarygodnie zidentyfikować na podstawie ich wydłużonej morfologii podobnej do fibroblastów. W przeciwieństwie do tego, MSC, które przyjęły bardziej spłaszczoną, czworokątną morfologię, z wyraźnymi włóknami stresu cytoszkieletu, nie przyjmują łatwo losów komórek nerwowych i powinny zostać odrzucone...

Przeszczepienie progenitorów nerwowych i ich pochodnych okazuje się obiecującą strategią leczenia po urazowym uszkodzeniu nerwów1,2 i neurodegeneracja3,4. Przed zastosowaniem klinicznym konieczne jest upewnienie się: i) metody dostępu i ekspansji autologicznego źródła komórek macierzystych/progenitorowych oraz ii) sposobu kierowania ich do odpowiednich, dojrzałych typów komórek3. Nasze zainteresowanie terapią komórkową w przypadku uszkodzenia rdzenia kręgowego skłoniło nas do poszukiwania solidnego, autologicznego źródła komórek progenitorowych nerwowych z dorosłych tkanek.
Subpopulacja MSCs wywodzi się z grzebienia nerwowego i jest łatwo dostępna z jamy szpiku. Komórki te są neuronalnymi przodkami, które mogą generować neurony i glej5. Zwierzęce modele niedokrwienia mózgu pokazują, że niedotlenienie sprzyja proliferacji i multipotencji neuronalnych komórek progenitorowych w mózgu6. Było to podstawą do wykorzystania wstępnego kondycjonowania hipoksyjnego jako sposobu na ekspansję progenitorów nerwowych pochodzących ze szpiku.
Przeszczepienie komórek Schwanna do uszkodzonego rdzenia kręgowego sprzyja regeneracji2. SCLC mogą być generowane z MSC poprzez suplementację czynnikami glejowymi (tj. β-hereguliną, bFGF i PDGF-AA), ale wykazują niestabilność fenotypową. Po wycofaniu czynników wzrostu powracają do fenotypu podobnego do fibroblastów7. Niestabilność fenotypowa jest niepożądana w transplantacji komórek ze względu na ryzyko nieprawidłowego różnicowania i kancerogenezy. Ponieważ prekursory komórek Schwanna są związane z wiązkami aksonów w obrębie embrionalnego nerwu obwodowego8, zostaliśmy doprowadzeni do kokultury SCLC z oczyszczonymi embrionalnymi neuronami DRG7,9. Powstałe w ten sposób dojrzałe komórki Schwanna są zaangażowane w los i wykazują funkcję in vitro7,9 oraz in vivo10.
Nasz protokół wzbogacania neuronalnych komórek progenitorowych z MSC jest prosty i skuteczny i powoduje wzrost liczby komórek do kolejnych testów. Wyprowadzenie komórek Schwanna zaangażowanych w los za pomocą platformy kokultury pozwala na badanie różnicowania glejowego oraz generowanie stabilnych i funkcjonalnych komórek Schwanna do potencjalnego zastosowania klinicznego.

<table><tbody><tr><td>&alfa; MEM</td><td>Sigmaaldrich</td><td>M4526</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Thermofisher scientific</td><td>12400-024</td><td></td></tr><tr><td>Podłoże neuropodstawowe</td><td>Thermofisher scientific</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biosurà</td><td>FB-1280/500</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>Thermofisher scientific</td><td>17504-001</td><td></td></tr><tr><td>Naskórkowy czynnik wzrostu (EGF)</td><td>Thermofisher scientific</td><td></td><td></td>PHG0313</tr><tr><td>Podstawowy czynnik wzrostu fibroblastów (bFGF)&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>100-18B/100UG</td><td></td></tr><tr><td>Czynnik wzrostu nerwów (NGF)&nbsp;</td><td>Millipore</td><td>NC011</td><td></td></tr><tr><td>Płytkopochodny czynnik wzrostu-AA (PDGF-AA)</td><td>Peprotech</td><td>100-13A</td><td></td></tr><tr><td>Heregulina beta-3, domena EGF (&beta;-Her)</td><td>Milipore</td><td>01-201</td><td></td></tr><tr><td>Urydyna</td><td>Sigmaaldrich</td><td>U3003</td><td></td></tr><tr><td>5-Fluro-2' - deoksyurydyna (FDU)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>F0503</td><td></td></tr><tr><td>Poli-D-lizyna (PDL)</td><td>Sigmaaldrich</td><td>P7886-1G</td><td></td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Thermofisher 23017015</td><td></td><td></td></tr><tr><td>naukowy GlutaMAX</td><td>Thermofisher</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>naukowy Penicylina / streptomycyna (P/S)</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>12604-013</td><td></td></tr><tr><td>10 cm talerz do hodowli</td> <td>adherentówTPP</td><td>93100</td><td>Używany do selekcji MSCs według adherencji kultur tkankowych</td></tr><tr><td>6-dołkowa płytka do hodowli adherentnej</td><td>TPP</td><td>92006</td><td>Używana do namnażania MSCs po pasażowaniu</td></tr><tr><td>UltraLow 6-dołkowa płytka do hodowli nieprzylegającej</td><td>Corning</td><td>3471</td><td>Używana do wzbogacania neuronalnych progenitorów</td></tr><tr><td>anty-ludzka CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>555593</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzka CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>550256</td><td></td></tr><tr><td>anty-człowiek/szczur STRO-1</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1038</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkie gniazdo w</td><td>R& D Systems</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>anty-ludzkim CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>555480</td><td></td></tr><tr><td>anty-szczurzy CD90(Thy-1)</td><td>BD Biosciences</td><td>554895</td><td></td></tr><tr><td>antyszczurzy CD73</td><td>BD Biosciences</td><td>551123</td><td></td></tr><tr><td>antyszczurzy nestin</td><td>BD Biosciences</td><td>MAB1259</td><td></td></tr><tr><td>antyszczurzy CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>554875</td><td></td></tr><tr><td>Anty-S100 i wersja beta;</td><td>Dako</td><td>Z031101</td><td></td></tr><tr><td>Anty-p75</td><td>Millipore</td><td>MAB5386</td><td></td></tr><tr><td>Anty-GFAP</td><td>Sigmaaldrich</td><td>G3893</td><td></td></tr><tr><td>Anty-klasa III-beta tubulina (Tuj-1)</td><td>Covance</td><td>MMS-435P</td><td></td></tr><tr><td>Anty-ludzkie jądra</td><td>Milipory</td><td>MAB1281</td><td></td></tr><tr><td>Komora hipoksji</td><td>Billups-Rothenberg</td><td>MIC-101</td><td></td></tr><tr><td>HEPES bufor</td><td>Sigmaaldrich</td><td>H4034-100G</td><td></td></tr></tbody></table>

wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek schwanna

Hypoxic Preconditioning of Marrow-derived Progenitor Cells As a Source for the Generation of Mature Schwann Cells

Ten manuskrypt opisuje sposób wzbogacania progenitorów nerwowych z populacji komórek zrębu szpiku (MSC), a następnie kierowania ich do losu dojrzałych komórek Schwanna. Poddaliśmy MSC szczurów i ludzi przejściowym warunkom niedotlenienia (1% tlenu przez 16 godzin), a następnie ekspansji jako neurosfery na podłożu o niskim przyczepie z suplementacją naskórkowego czynnika wzrostu (EGF) / podstawowego czynnika wzrostu fibroblastów (bFGF). Neurosfery wysiewano na plastikowej kulturze tkankowej pokrytej poli-D-lizyną/lamininą i hodowano w koktajlu glejowym zawierającym β-heregulinę, bFGF i płytkowy czynnik wzrostu (PDGF) w celu wytworzenia komórek podobnych do komórek Schwanna (SCLC). SCLC skierowano do zobowiązania losu poprzez kokulturę przez 2 tygodnie z oczyszczonymi neuronami zwojów korzenia grzbietowego (DRG) uzyskanymi od ciężarnych szczurów Sprague Dawley E14-15. Dojrzałe komórki Schwanna wykazują trwałość w ekspresji S100β/p75 i mogą tworzyć segmenty mieliny. Wygenerowane w ten sposób komórki mają potencjalne zastosowanie w autologicznym przeszczepie komórek po urazie rdzenia kręgowego, a także w modelowaniu chorób.

Przegląd kluczowych etapów naszego protokołu przedstawiono na Rysunku 1. Podsumowując, MSC szczura i człowieka są selekcjonowane poprzez adhezję do tworzywa sztucznego używanego w hodowlach tkankowych. Namnożone MSC są poddawane prekondycjonowaniu w warunkach hipoksji, a następnie przenoszone do warunków sprzyjających tworzeniu neurosfer. Neurosfery są wysiewane i poddawane różnicowaniu w SCLC. SCLC są hodowane współdzielnie z oczyszczonymi neuronami DRG w ce...

Komórki zrębu szpiku (MSC) o potencjale neuronalnym istnieją w szpiku kostnym. Nasz protokół wzbogaca tę populację komórek poprzez wstępne kondycjonowanie hipoksyjne, a następnie kieruje je do dojrzałych komórek Schwanna.

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

This manuscript describes a means to enrich for neural progenitors from the marrow stromal cell (MSC) population and thereafter to direct them to the ...

Ogólnym celem tej techniki hodowli komórkowej jest wzbogacenie populacji progenitorów neuronalnych szpiku kostnego, aby ułatwić ich różnicowanie w funkcjonalne komórki Schwanna. Metoda ta rozwiązuje kluczowy problem w medycynie regeneracyjnej i badaniach nad komórkami macierzystymi: jak wykorzystać ograniczone źródło neuroprogenitorów do generowania gleju, który wspomaga powysiłkowy odrost aksonalny i remielinizację. Zaletą tej techniki jest zastosowanie wydajnego kondycjonowania hodowli w celu ułatwienia ekspansji komórek neuronalnych z komórek zrębowych szpiku kostnego na potrzeby autologicznej terapii komórkowej.Po dwóch dniach hodowli usunąć 75% zużytego medium wraz z nieprzylegającymi komórkami, a następnie przepłukać komórki przylegające trzykrotnie, używając po 10 ml PBS. Po trzecim płukaniu zastąpić PBS 10 ml medium wzrostowego dla komórek macierzystych szpiku kostnego (MSC) i umieścić hodowlę z powrotem w inkubatorze. Widoczne kolonie powinny pojawić się między szóstym a siódmym dniem.W 10. dniu wypłucz kulturę świeżym PBS i odseparuj komórki za pomocą 1,5 ml rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek. Po pięciu minutach w temperaturze 37 °C dodaj 3 ml pożywki wzrostowej MSC, aby zneutralizować reakcję, a następnie zbierz odseparowane komórki poprzez wirowanie. Resuspenduj osad w 5 ml świeżej pożywki wzrostowej MSC i wysiej komórki z gęstością 4×10⁴ komórek na cm² do nowej 10-centymetrowej płytki do hodowli tkanek.Komórki powinny osiągnąć 80 do 90% konfluencji w ciągu dwóch dni od pasażowania. W celu przeprowadzenia prekondycjonowania hipoksyjnego należy najpierw poluzować zacisk pierścieniowy i oczyścić odsłonięte elementy 70% etanolem. Następnie należy rozebrać komorę hipoksyczną na poszczególne części i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu sterylizacji promieniami UV przez 15 minut.Następnie przemyj kulturę MSC o konfluencji od 80 do 90% za pomocą 10 ml PBS, tak jak właśnie zademonstrowano, i potraktuj kultury świeżą pożywką wzrostową MSC uzupełnioną o 25 mM hepes. Umieść potraktowaną kulturę w ponownie zmontowanej komorze hipoksji i dokręć zacisk pierścieniowy. Uszczelnij końce przyłączne komory, aby upewnić się, że nie ma wycieku gazu, i przepuść do komory mieszaninę gazów składającą się z 99% azotu i 1% tlenu z przepływem 10 l/min.Po pięciu minutach umieść komorę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 16 godzin. Następnego ranka odseparuj komórki w sposób zaprezentowany przed chwilą i zbierz je poprzez wirowanie. Resuspenduj osad w pożywce dla progenitorów neuronalnych i zasiać 6 × 10³ komórek na cm² na niskoprzylegających płytkach 6-dołkowych w celu ich hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 12 dni.Do szóstego lub siódmego dnia powinny być widoczne znaczne, nieprzylegające sfery komórek. Między 10. a 12. dniem w kulturach kondycjonowanych hipoksją powinno być zauważalnie więcej neurosfer niż w tych poddanych normoksji. W 12. dniu za pomocą pipety 10 ml przenieść neurosfery do stożkowej probówki 15 ml i zebrać je poprzez wirowanie.Resuspenduj sfery w DMEM/F12 i wysiej od pięciu do 10 neurosfer na centymetr kwadratowy na 6-dołkowe płytki pokryte polilizyną i lamininą w 1,5 mililitrów medium do indukcji gleju na dołek. Hoduj kulturę komórek sferycznych przez co najmniej siedem dni, wymieniając medium co trzy dni. Aby zebrać zwoje korzeni grzbietowych, przenieś pierwszy embrion w pozycji brzusznej pod mikroskopem stereoskopowym do 10-centymetrowej szalki hodowlanej zawierającej PBS w temperaturze pokojowej i wprowadź mikropincety wzdłuż obu stron rdzenia kręgowego.Za pomocą rozcinania tępego oddziel rdzeń kręgowy od otaczających go tkanek miękkich, używając pęsety do wycięcia rdzenia kręgowego wzdłuż otworu szyjnego i kikuta ogona. Usuwaj pozostałe tkanki miękkie z uwolnionego rdzenia kręgowego, aż pozostaną jedynie rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe i przymocowane zwoje korzeni grzbietowych. Oddziel poszczególne zwoje korzeni grzbietowych od łączących je korzeni nerwowych.Następnie, używając pipety z końcówką o pojemności 1 ml, przenieś do probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z PBS do 100 zwojów korzeni grzbietowych. Zbierz zwoje poprzez wirowanie i resuspenduj osady w 200 µL rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek na probówkę. Po 10 minutach w temperaturze 37 °C ponownie odwiruj zwoje korzeni grzbietowych, a następnie użyj końcówki do pipety 200 µL, aby delikatnie utrzeć osady w pożywce do utrzymania neuronów zwojów korzeni grzbietowych.Wysiej komórki zwojów korzeni grzbietowych w zagęszczeniu 5 × 10³ komórek na cm² na płytki 6-dołkowe pokryte poli-D-lizyną i lamininą, dodając 1,5 ml pożywki do utrzymania neuronów zwojów korzeni grzbietowych na dołek. Po dwóch dniach hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2, wypłucz komórki i przenieś hodowle neuronów z powrotem do inkubatora w świeżej pożywce do oczyszczania neuronów zwojów korzeni grzbietowych na kolejne dwa dni. Po trzech do czterech cyklach utrzymania i oczyszczania, hodowle komórek zwojów korzeni grzbietowych powinny wykazywać pozytywny wynik w kierunku markera neuronalnego Tuj-1 oraz negatywny w kierunku markera komórek glejowych S100 beta.Siódmego dnia hodowli komórek przypominających komórki Schwanna, wypłukać komórki w PBS, a następnie przeprowadzić dysocjację, stosując 0,5 ml rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek na dołek w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Osad komórkowy zawiesić ponownie w medium do ko-hodowli i zasiać komórki przypominające komórki Schwanna na oczyszczoną hodowlę neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w zagęszczeniu 1×10³ komórek/cm² na 14 dni ko-hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Zdrowe MSC wykazują wydłużoną morfologię, w przeciwieństwie do czworobocznego wyglądu MSC, które były utrzymywane przez dużą liczbę pasaży i utraciły swoją wielopotencjalność.Rozszerzone kolonie MSC powinny wykazywać ekspresję markerów MSC, brak markerów hematopoetycznych komórek macierzystych oraz zdolność do różnicowania się w linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne. Zdrowe hodowle MSC poddane prekondycjonowaniu hipoksycznemu wykazują obecność neurosfer o większej liczbie i rozmiarze. Czystość sieci neuronowej zwoju korzenia grzbietowego można potwierdzić poprzez ekspresję markera neuronalnego Tuj-1 oraz jednoczesny brak markera komórek Schwanna S100.Po 14 dniach kokultury z neuronami zwojów korzeni grzbietowych, komórki podobne do komórek Schwanna nabywają cech i właściwości funkcjonalnych dojrzałych, zdeterminowanych komórek Schwanna. Po opanowaniu tej metody, subpopulacja progenitorów neuronalnych może zostać powiększona w ludzkich lub szczurzych BMSC w ciągu 10 dni, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia techniki ekspansji komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że próbka BMSC zawiera nestynowo-dodatnie neuroprogenitory i że wszystkie CD45-dodatnie progenitorzy hematopoetyczne zostały usunięte.Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pozyskiwania BMSCs, wzbogacania subpopulacji progenitorów neuronalnych oraz kierowania różnicowaniem progenitorów neuronalnych w komórki Schwanna o określonym przeznaczeniu, w celu zwiększenia pozurazowego odrastania aksonów i remielinizacji. Zgodnie z tą procedurą można uzyskać glię mielinizującą, taką jak dojrzałe komórki Schwanna, do wykorzystania w opracowywaniu terapii urazów demielinizacyjnych oraz chorób zarówno obwodowego, jak i ośrodkowego układu nerwowego.

hypoxic-preconditioning-marrow-derived-progenitor-cells-as-source-for

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia rozwojowa

Opisano metodę analizy rozkładu progenitorów krwiotwórczych szpiku kostnego w cytometrii przepływowej, a także efektywnej izolacji wysoko oczyszczonych komórek macierzystych krwiotwórczych (HSCs). Procedura izolacji opiera się przede wszystkim na magnetycznym wzbogaceniu komórek c-Kit+ oraz sortowaniu komórek w celu oczyszczenia HSCs do badań komórkowych i molekularnych.

Analiza fenotypowa i izolacja mysich hematopoetycznych komórek macierzystych oraz progenitorów zadeklarowanych do określonej linii

Ten film demonstruje metodę uzyskiwania komórek podobnych do komórek Schwanna z multipotencjalnych komórek zrębu szpiku kostnego (BMSC). Początkowo BMSC poddawane są leczeniu hipoksji, a następnie ukierunkowanemu różnicowaniu do neuronalnych komórek progenitorowych. Następnie stosuje się określone pożywki i warunki hodowli, aby indukować transformację tych komórek progenitorowych w komórki podobne do komórek Schwanna.

Generowanie komórek podobnych do komórek Schwanna z komórek zrębu szpiku kostnego

Ten film demonstruje procedurę izolowania neuronów zwoju korzenia grzbietowego (DRG) od zarodków szczurów i współhodowli ich z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Wyizolowane DRG są przetwarzane w celu wyizolowania neuronów i komórek glejowych. Wyizolowane komórki są hodowane w celu oczyszczenia neuronów, które są następnie hodowane wspólnie z komórkami podobnymi do komórek Schwanna (SCLC) w pożywce do wspólnej hodowli. Interakcja z neuronami DRG...

Izolacja neuronów DRG i kokultura z prekursorami komórek Schwanna w celu wytworzenia komórek Schwanna

Generowanie indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych dostarcza fascynujących perspektyw dla pochodnych autologicznych przeszczepów. Jednak progresja przez stan pluripotencjalny i pracochłonne różnicowanie nadal utrudnia translację kliniczną. Tutaj opisujemy pochodzenie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednią konwersję do indukowanych nerwowych komórek progenitorowych, a następnie różnicowanie w linie nerwowe.

Wyprowadzanie fibroblastów dorosłego człowieka i ich bezpośrednia konwersja do ekspandowalnych nerwowych komórek progenitorowych

Pokazujemy, jak zidentyfikować i wyizolować 6 podzbiorów komórek progenitorowych szpiku myszy za pomocą kombinacji sortowania magnetycznego i fluorescencyjnego (MACS i FACS). Protokół ten może być stosowany do testów hodowli in vitro (hodowle metylocelulozy lub płynów), eksperymentów z transferem adoptywnym in vivo oraz analiz RNA/białka.

Identyfikacja i izolacja oligopotencjalnych i zaangażowanych w linię przodków szpiku szpiku

Interakcje neuron-glej w neurodegeneracji nie są dobrze poznane z powodu nieodpowiednich narzędzi i metod. W tym miejscu opisujemy zoptymalizowane protokoły uzyskiwania indukowanych neuronów, komórek prekursorowych oligodendrocytów i oligodendrocytów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych oraz podajemy przykłady wartości tych metod w zrozumieniu wkładu specyficznego typu komórki w chorobie Alzheimera.

Generowanie ludzkich neuronów i oligodendrocytów z pluripotencjalnych komórek macierzystych do modelowania interakcji neuron-oligodendrocyty

Opisujemy trzy metody przeszczepu szpiku kostnego (BMT): BMT z napromienianiem całego ciała, BMT z napromienianiem ekranowanym oraz metoda BMT bez wstępnego kondycjonowania (adoptywna BMT) do badania hematopoezy klonalnej w modelach mysich.

Procedury przeszczepu szpiku kostnego u myszy w celu zbadania hematopoezy klonalnej

Ten protokół opisuje doudowe wstrzyknięcie kilku krwiotwórczych lub białaczkowych komórek macierzystych, w tym komórek z edytowanymi genami, w mysich modelach ksenoprzeszczepów, co nie tylko umożliwi szybki i bezpieczny przeszczep komórek, ale także seryjne analizy szpiku kostnego.

Uproszczone iniekcje doudowe przy użyciu żywych myszy pozwalają na ciągłą analizę szpiku kostnego

Tutaj ustanowiliśmy in vivo osteo-organoidy uruchamiane przez morfogenetyczne rusztowania żelatynowe z białkiem 2 w celu pobrania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych w celu odbudowy uszkodzonego układu krwiotwórczego i odpornościowego. Ogólnie rzecz biorąc, takie podejście może stanowić obiecujące źródło komórek w terapiach komórkowych.

Podejście osteoorganoidowe in vivo do pozyskiwania terapeutycznych hematopoetycznych komórek macierzystych/progenitorowych

W tym protokole zostanie zilustrowane pochodzenie komórek progenitorowych serca zarówno z mysich, jak i ludzkich embrionalnych komórek macierzystych. Główną strategią w tym protokole jest wzbogacenie komórek progenitorowych serca za pomocą cytometrii przepływowej przy użyciu fluorescencyjnych reporterów zmodyfikowanych w embrionalnych liniach komórek macierzystych.

Wyprowadzenie komórek progenitorowych serca z embrionalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę wstępnego kondycjonowania hipoksyjnego komórek progenitorowych szpiku kostnego w celu wytworzenia dojrzałych komórek Schwanna. Ta technika wspiera regenerację nerwów po urazach.

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna (Wideo) | JoVE Journal

Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

Przeglądaj więcej filmów