Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

Ogólnym celem tej techniki hodowli komórkowej jest wzbogacenie progenitorów nerwowych szpiku kostnego, aby ułatwić ich różnicowanie w funkcjonalne komórki Schwanna. Metoda ta rozwiązuje kluczowy problem w medycynie komórek macierzystych i medycyny regeneracyjnej: jak wykorzystać ograniczone źródło neuroprogenitorów do generowania gleju, aby pomóc w pourazowym odrastaniu aksonów i remielinizacji. Zaletą tej techniki jest zastosowanie wydajnego kondycjonowania hodowli w celu ułatwienia ekspansji komórek nerwowych z komórek zrębu szpiku kostnego w celu ich wykorzystania w autologicznej terapii komórkowej.

Po dwóch dniach w hodowli usuń 75% zużytej pożywki i nieprzylegających komórek, a następnie przepłucz przylegające komórki trzema 10-milimetrowymi płukankami PBS. Po trzecim płukaniu zastąp PBS 10 mililitrami komórek stomii szpiku kostnego lub MSC, pożywką wzrostową i włóż hodowlę z powrotem do inkubatora. Widoczne kolonie powinny pojawić się od szóstego do siódmego dnia.

W dniu 10 umyj kulturę w świeżym PBS i odłącz komórki 1,5 mililitra rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych. Po pięciu minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza dodaj trzy mililitry pożywki wzrostowej MSC, aby zneutralizować reakcję i zebrać oderwane komórki przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w pięciu mililitrach świeżej pożywki wzrostowej MSC i zasiać komórki w gęstości od czterech razy 10 do czwartej komórek na centymetr kwadratowy na nowej 10-centymetrowej płytce do hodowli tkankowej.

Komórki powinny osiągnąć zbieżność od 80 do 90% w ciągu dwóch dni od pasażu. W celu wstępnego kondycjonowania hipoksyjnego najpierw zwolnij zacisk pierścieniowy i wyczyść odsłonięte części 70% etanolem. Następnie zdemontuj komorę hipoksji na części i umieść je w okapie z przepływem laminarnym w celu sterylizacji w świetle UV przez 15 minut.

Następnie umyj 80 do 90% zlewającą się kulturę MSC 10 mililitrami PBS, jak właśnie pokazano, i potraktuj kultury świeżą pożywką wzrostową MSC uzupełnioną 25 milimolowymi hepes. Umieść potraktowaną kulturę w ponownie zmontowanej komorze hipoksji i dokręć zacisk pierścieniowy. Uszczelnij końce łączące komorę, aby upewnić się, że nie ma wycieku gazu i wypłukać mieszaninę gazów 99% azotu i 1% tlenu do komory z natężeniem przepływu 10 litrów na minutę.

Po pięciu minutach umieść komorę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 16 godzin. Następnego ranka odłącz komórki, jak właśnie pokazano, i zbierz je przez odwirowanie. Ponownie zawiesić osad w pożywce progenitorowej neuronu i wysiewać sześć razy 10 do trzecich komórek na centymetr kwadratowy na 6-dołkowych płytkach o niskim przyczepieniu do ich hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 przez 12 dni.

Spore, nieprzylegające kule komórek należy obserwować od szóstego do siódmego dnia. Z większą liczbą neurosfer widocznych w kulturach uwarunkowanych hipoksją niż w kulturach w normoksji do 10 do 12 dni. W dniu 12 użyj pipety o pojemności 10 mililitrów, aby przenieść neurosfery do stożkowej rurki o pojemności 15 mililitrów i zebrać neurosfery przez odwirowanie.

Ponownie zawiesić kulki w DMEM / F12 i umieścić od pięciu do 10 neurosfer na centymetr kwadratowy na 6-dołkowych płytkach pokrytych poli-D-lizyną lamininą w 1,5 mililitra pożywki do indukcji glejowej na studzienkę. Utrzymuj hodowlę komórek sferycznych przez co najmniej siedem dni, odświeżając pożywkę co trzy dni. Aby pobrać zwoje korzenia grzbietowego, przenieś pierwszy zarodek do 10-centymetrowego naczynia hodowlanego zawierającego PBS o temperaturze pokojowej pod mikroskopem preparacyjnym w pozycji leżącej i włóż mikrokleszcze preparacyjne po obu stronach rdzenia kręgowego.

Za pomocą sekcji oddziel rdzeń kręgowy od otaczającej tkanki miękkiej za pomocą kleszczy, aby wyciąć rdzeń kręgowy wzdłuż otworu szyi i kikuta ogona. Usuń resztki tkanki miękkiej z uwolnionego rdzenia kręgowego, aż pozostanie tylko rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe i przyczepiony ganglion korzenia grzbietowego. Odłącz poszczególne zwoje korzenia grzbietowego od łączących je korzeni nerwowych.

Następnie użyj pisaka wyposażonego w końcówkę o pojemności jednego mililitra, aby przenieść do 100 zwojów korzenia grzbietowego do 1,5-mililitrowej probówki mikrowirówkowej PBS. Zebrać zwoje przez odwirowanie i ponownie zawiesić granulki w 200 mikrolitrach rekombinowanego odczynnika do dysocjacji komórek enzymatycznych na probówkę. Po 10 minutach w temperaturze 37 stopni Celsjusza ponownie odwiruj zwoje korzenia grzbietowego za pomocą końcówki pipety o pojemności 200 mikrolitrów, aby delikatnie rozprowadzić granulki w pożywce podtrzymującej neuron zwoju korzenia grzbietowego.

Wysiej komórki zwojowe korzenia grzbietowego pięć razy 10 do trzecich komórek na centymetr kwadratowy na 6-dołkowych płytkach pokrytych lamininą poli-D-lizyny w 1,5 mililitra pożywki podtrzymującej neuron zwoju korzenia grzbietowego na studzienkę. Po dwóch dniach w hodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2 umyj komórki i zwróć kultury komórek neuronalnych do inkubatora w świeżej pożywce do oczyszczania neuronów zwoju korzenia grzbietowego przez kolejne dwa dni. Po trzech do czterech cyklach konserwacji i oczyszczania, hodowle komórek zwojowych korzenia grzbietowego powinny dać wynik dodatni dla markera neuronalnego Tuj-1 i ujemny dla markera komórek glejowych S100 beta.

W siódmym dniu hodowli komórek podobnych do komórek Schwanna przepłucz komórki w PBS, a następnie dokonaj dysocjacji 0,5 mililitra rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek na studzienkę w temperaturze 37 stopni Celsjusza przez pięć minut. Zawiesić osad komórkowy w pożywce do kohodowli i zasiać komórki podobne do komórek Schwanna na oczyszczonej hodowli neuronów zwojowych korzenia grzbietowego w ilości od 10 do 3 komórek na centymetr kwadratowy przez 14 dni kohodowli w temperaturze 37 stopni Celsjusza i 5% CO2. Zdrowe MSCs wykazują zwężającą się morfologię w przeciwieństwie do czworokątnego wyglądu MSC, które były utrzymywane przez dużą liczbę pasaży i utraciły swoją multipotencję.

Rozszerzone kolonie MSC powinny wykazywać ekspresję markerów MSC, brak markerów hematopoetycznych komórek macierzystych oraz zdolność do różnicowania się w linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne. Zdrowe posiewy MSC, które zostały poddane wstępnemu kondycjonowaniu hipoksyjnemu, wykazują neurosfery, które są większe zarówno pod względem liczby, jak i wielkości. Czystość sieci neuronów zwoju korzenia grzbietowego można potwierdzić przez ekspresję markera neuronalnego Tuj-1 i jednoczesny brak markera komórek Schwanna S100.

Po 14 dniach w kohodowli z neuronami zwoju grzbietowego korzenia, komórki podobne do komórek Schwanna nabywają cechy i właściwości funkcjonalne dojrzałych komórek Schwanna, które popełniły los. Po opanowaniu, subpopulacja neuronalnych progenitorów może zostać rozszerzona w BMSC ludzi lub szczurów w ciągu 10 dni, jeśli technika ekspansji komórek zostanie wykonana prawidłowo. Próbując wykonać tę procedurę, należy pamiętać o potwierdzeniu, że próbka BMSC jest wyposażona w neuroprogenitory gniazdowo-dodatnie, a wszystkie komórki progenitorowe hematopoetyczne CD45 zostały usunięte.

Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, w jaki sposób pozyskiwać BMSC, wzbogacać subpopulację neuronalnych progenitorów i kierować różnicowanie neuronalnych progenitorów do zaangażowanych w los komórek Schwanna w celu wykorzystania we wzmacnianiu pourazowego odrastania aksonów i remielinizacji. Po tej procedurze można uzyskać mielinizujące się komórki glejowe, takie jak dojrzałe komórki Schwanna, w celu ich wykorzystania w opracowywaniu terapii urazów demielinizacyjnych i chorób zarówno obwodowego, jak i ośrodkowego układu nerwowego.