Wstępne kondycjonowanie hipoksyjne komórek progenitorowych pochodzących ze szpiku jako źródło do wytwarzania dojrzałych komórek Schwanna

Ogólnym celem tej techniki hodowli komórkowej jest wzbogacenie populacji progenitorów neuronalnych szpiku kostnego, aby ułatwić ich różnicowanie w funkcjonalne komórki Schwanna. Metoda ta rozwiązuje kluczowy problem w medycynie regeneracyjnej i badaniach nad komórkami macierzystymi: jak wykorzystać ograniczone źródło neuroprogenitorów do generowania gleju, który wspomaga powysiłkowy odrost aksonalny i remielinizację. Zaletą tej techniki jest zastosowanie wydajnego kondycjonowania hodowli w celu ułatwienia ekspansji komórek neuronalnych z komórek zrębowych szpiku kostnego na potrzeby autologicznej terapii komórkowej.

Po dwóch dniach hodowli usunąć 75% zużytego medium wraz z nieprzylegającymi komórkami, a następnie przepłukać komórki przylegające trzykrotnie, używając po 10 ml PBS. Po trzecim płukaniu zastąpić PBS 10 ml medium wzrostowego dla komórek macierzystych szpiku kostnego (MSC) i umieścić hodowlę z powrotem w inkubatorze. Widoczne kolonie powinny pojawić się między szóstym a siódmym dniem.

W 10. dniu wypłucz kulturę świeżym PBS i odseparuj komórki za pomocą 1,5 ml rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek. Po pięciu minutach w temperaturze 37 °C dodaj 3 ml pożywki wzrostowej MSC, aby zneutralizować reakcję, a następnie zbierz odseparowane komórki poprzez wirowanie. Resuspenduj osad w 5 ml świeżej pożywki wzrostowej MSC i wysiej komórki z gęstością 4×10⁴ komórek na cm² do nowej 10-centymetrowej płytki do hodowli tkanek.

Komórki powinny osiągnąć 80 do 90% konfluencji w ciągu dwóch dni od pasażowania. W celu przeprowadzenia prekondycjonowania hipoksyjnego należy najpierw poluzować zacisk pierścieniowy i oczyścić odsłonięte elementy 70% etanolem. Następnie należy rozebrać komorę hipoksyczną na poszczególne części i umieścić je w komorze z laminarnym przepływem powietrza w celu sterylizacji promieniami UV przez 15 minut.

Następnie przemyj kulturę MSC o konfluencji od 80 do 90% za pomocą 10 ml PBS, tak jak właśnie zademonstrowano, i potraktuj kultury świeżą pożywką wzrostową MSC uzupełnioną o 25 mM hepes. Umieść potraktowaną kulturę w ponownie zmontowanej komorze hipoksji i dokręć zacisk pierścieniowy. Uszczelnij końce przyłączne komory, aby upewnić się, że nie ma wycieku gazu, i przepuść do komory mieszaninę gazów składającą się z 99% azotu i 1% tlenu z przepływem 10 l/min.

Po pięciu minutach umieść komorę w inkubatorze do hodowli komórkowych na 16 godzin. Następnego ranka odseparuj komórki w sposób zaprezentowany przed chwilą i zbierz je poprzez wirowanie. Resuspenduj osad w pożywce dla progenitorów neuronalnych i zasiać 6 × 10³ komórek na cm² na niskoprzylegających płytkach 6-dołkowych w celu ich hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2 przez 12 dni.

Do szóstego lub siódmego dnia powinny być widoczne znaczne, nieprzylegające sfery komórek. Między 10. a 12. dniem w kulturach kondycjonowanych hipoksją powinno być zauważalnie więcej neurosfer niż w tych poddanych normoksji. W 12. dniu za pomocą pipety 10 ml przenieść neurosfery do stożkowej probówki 15 ml i zebrać je poprzez wirowanie.

Resuspenduj sfery w DMEM/F12 i wysiej od pięciu do 10 neurosfer na centymetr kwadratowy na 6-dołkowe płytki pokryte polilizyną i lamininą w 1,5 mililitrów medium do indukcji gleju na dołek. Hoduj kulturę komórek sferycznych przez co najmniej siedem dni, wymieniając medium co trzy dni. Aby zebrać zwoje korzeni grzbietowych, przenieś pierwszy embrion w pozycji brzusznej pod mikroskopem stereoskopowym do 10-centymetrowej szalki hodowlanej zawierającej PBS w temperaturze pokojowej i wprowadź mikropincety wzdłuż obu stron rdzenia kręgowego.

Za pomocą rozcinania tępego oddziel rdzeń kręgowy od otaczających go tkanek miękkich, używając pęsety do wycięcia rdzenia kręgowego wzdłuż otworu szyjnego i kikuta ogona. Usuwaj pozostałe tkanki miękkie z uwolnionego rdzenia kręgowego, aż pozostaną jedynie rdzeń kręgowy, korzenie nerwowe i przymocowane zwoje korzeni grzbietowych. Oddziel poszczególne zwoje korzeni grzbietowych od łączących je korzeni nerwowych.

Następnie, używając pipety z końcówką o pojemności 1 ml, przenieś do probówki mikrocentryfugi o pojemności 1,5 ml z PBS do 100 zwojów korzeni grzbietowych. Zbierz zwoje poprzez wirowanie i resuspenduj osady w 200 µL rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek na probówkę. Po 10 minutach w temperaturze 37 °C ponownie odwiruj zwoje korzeni grzbietowych, a następnie użyj końcówki do pipety 200 µL, aby delikatnie utrzeć osady w pożywce do utrzymania neuronów zwojów korzeni grzbietowych.

Wysiej komórki zwojów korzeni grzbietowych w zagęszczeniu 5 × 10³ komórek na cm² na płytki 6-dołkowe pokryte poli-D-lizyną i lamininą, dodając 1,5 ml pożywki do utrzymania neuronów zwojów korzeni grzbietowych na dołek. Po dwóch dniach hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2, wypłucz komórki i przenieś hodowle neuronów z powrotem do inkubatora w świeżej pożywce do oczyszczania neuronów zwojów korzeni grzbietowych na kolejne dwa dni. Po trzech do czterech cyklach utrzymania i oczyszczania, hodowle komórek zwojów korzeni grzbietowych powinny wykazywać pozytywny wynik w kierunku markera neuronalnego Tuj-1 oraz negatywny w kierunku markera komórek glejowych S100 beta.

Siódmego dnia hodowli komórek przypominających komórki Schwanna, wypłukać komórki w PBS, a następnie przeprowadzić dysocjację, stosując 0,5 ml rekombinowanego enzymatycznego odczynnika do dysocjacji komórek na dołek w temperaturze 37 °C przez pięć minut. Osad komórkowy zawiesić ponownie w medium do ko-hodowli i zasiać komórki przypominające komórki Schwanna na oczyszczoną hodowlę neuronów z zwojów korzeni grzbietowych w zagęszczeniu 1×10³ komórek/cm² na 14 dni ko-hodowli w temperaturze 37 °C i 5% CO2. Zdrowe MSC wykazują wydłużoną morfologię, w przeciwieństwie do czworobocznego wyglądu MSC, które były utrzymywane przez dużą liczbę pasaży i utraciły swoją wielopotencjalność.

Rozszerzone kolonie MSC powinny wykazywać ekspresję markerów MSC, brak markerów hematopoetycznych komórek macierzystych oraz zdolność do różnicowania się w linie adipogenne, osteogenne i chondrogenne. Zdrowe hodowle MSC poddane prekondycjonowaniu hipoksycznemu wykazują obecność neurosfer o większej liczbie i rozmiarze. Czystość sieci neuronowej zwoju korzenia grzbietowego można potwierdzić poprzez ekspresję markera neuronalnego Tuj-1 oraz jednoczesny brak markera komórek Schwanna S100.

Po 14 dniach kokultury z neuronami zwojów korzeni grzbietowych, komórki podobne do komórek Schwanna nabywają cech i właściwości funkcjonalnych dojrzałych, zdeterminowanych komórek Schwanna. Po opanowaniu tej metody, subpopulacja progenitorów neuronalnych może zostać powiększona w ludzkich lub szczurzych BMSC w ciągu 10 dni, pod warunkiem prawidłowego przeprowadzenia techniki ekspansji komórek. Podczas wykonywania tej procedury ważne jest upewnienie się, że próbka BMSC zawiera nestynowo-dodatnie neuroprogenitory i że wszystkie CD45-dodatnie progenitorzy hematopoetyczne zostały usunięte.

Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat pozyskiwania BMSCs, wzbogacania subpopulacji progenitorów neuronalnych oraz kierowania różnicowaniem progenitorów neuronalnych w komórki Schwanna o określonym przeznaczeniu, w celu zwiększenia pozurazowego odrastania aksonów i remielinizacji. Zgodnie z tą procedurą można uzyskać glię mielinizującą, taką jak dojrzałe komórki Schwanna, do wykorzystania w opracowywaniu terapii urazów demielinizacyjnych oraz chorób zarówno obwodowego, jak i ośrodkowego układu nerwowego.