Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Ogólnym celem tego protokołu dla 3D ludzkich ciał zarodkowych wolnych od surowicy iPSC jest zapewnienie systemu in vitro, który przybliża wczesny rozwój kory mózgowej człowieka, który może być wykorzystany do odkrywania leków. Metoda ta może pomóc odpowiedzieć na kluczowe pytania w dziedzinie komórek macierzystych, takie jak, w jaki sposób neurony pochodzą z iPSC, tworzą funkcjonalne sieci w tkance 3D. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala nam modelować aspekty rozwoju kory mózgowej w naczyniu, z tkanki ludzkiej zawierającej genetykę osób chorych, dzięki czemu system służy jako platforma komórkowa do badań przesiewowych leków, która jest skalowalna i może być wykorzystywana do badania wielu różnych zaburzeń neurobiologicznych.

Chociaż metoda ta może zapewnić wgląd w zaburzenia neurobiologiczne lub zaburzenia rozwoju neurologicznego, może być również stosowana do innych systemów, takich jak te, które koncentrują się na modelach funkcji neuroimmunologicznych lub informacji neuronalnej. W przypadku tego protokołu zacznij od ustalenia komórek płodowych. Aby ustalić tę kulturę, umieść 600 000 komórek płodowych w każdym dołku sześciodołkowej płytki, z 300 mililitrami pożywki na studzienkę.

Po hodowli komórek płodu przez 48 godzin wymień pożywkę. Inkubuj płytki przez godzinę, przygotowując komórki macierzyste. Rozmrozić komórki macierzyste w kąpieli wodnej o temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Po rozmrożeniu przenieś komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 mililitrów i napełnij probówkę do pięciu mililitrów pożywką hodowlaną, dodawaną kroplami. Następnie delikatnie odwiruj komórki przez cztery minuty, odessaj supernatant i delikatnie ponownie zawiesij osad w jednym mililitrze pożywki z komórkami macierzystymi z inhibitorem ROCK. Po ilościowym określeniu gęstości komórek, umieść 300 000 komórek macierzystych na komórkach zasilających.

Następnie hoduj i rozszerzaj kultury, okresowo selekcjonując zdrowe komórki, po ekspansji i zamrożeniu komórek do kopii zapasowej. Hoduj kolonie komórek macierzystych na standardowych płytkach, aż osiągną 50% do 70% konfluencji. Następnie zastosuj łagodną obróbkę enzymatyczną i delikatne rozcieranie za pomocą jednomililitrowej końcówki pipety, aby zebrać hiPSC w celu różnicowania komórek neuroprekursorowych.

Delikatnie odwirować zawiesinę, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w pięciomililitrowym ludzkim podłożu iPSC. Następnie przenieś zawiesinę komórkową do 5-centymetrowego naczynia do hodowli komórek pokrytego 0,1% żelatyną i inkubuj płytkę przez godzinę. Po godzinie przenieś nieprzylegające komórki do 15-mililitrowej probówki wirówkowej.

Następnie delikatnie spłucz płytkę trzema mililitrami pożywki i przenieś ją do tej samej probówki. Następnie powtórz etap ponownego zawieszania z delikatnym odwirowaniem, a następnie określ gęstość komórek i umieść komórki na 96-dołkowej dolnej płytce V o niskiej przyczepności przy 9 000 komórek na studzienkę. Teraz obracaj płytką przez trzy minuty i rozpocznij hodowlę komórek.

Przez następne 14 dni co drugi dzień wymieniaj pół pożywki na świeżą, różnicującą pożywkę. Po dwóch tygodniach hodowli komórek przygotuj sześć dołków z 40-mikronowymi wkładkami do hodowli komórkowych i jednym mililitrem pożywki DM1. Inkubować te płytki przez co najmniej cztery godziny przed dodaniem hodowanych komórek.

Następnie, za pomocą końcówki do pipety o szerokości 200 mikrolitrów, zbierz dwutygodniowe agregaty komórek o wartości około 20 mikrolitrów pożywki. Przenieś od czterech do sześciu agregatów na każdą wkładkę z minimalnym roztworem, usuń nadmiar. Na tym etapie ważne jest, aby pracować szybko i pewną ręką, podczas usuwania medium z okolic SFEB, możesz zobaczyć, jak SFEB przesuwają się po roztworze z powodu napięcia powierzchniowego.

Można je ponownie ustawić po usunięciu nośnika. Gdy wszystkie agregaty zostaną załadowane na wkładki, zmień pożywkę na jeden mililitr DM2 i kontynuuj hodowlę komórek co drugi dzień. Zastąp trzy czwarte podłoża świeżym podłożem.

Po 14 dniach hodowli zacznij dodawać pożywkę DM3 do kultur. Kontynuuj hodowlę przez kolejne 16 dni, aby wyhodować SFEB. Teraz delikatnie odłącz SFEB od wkładu, używając końcówki do pipety o szerokości 200 mikrolitrów.

Przenieś SFEB na płytki 12-dołkowe, ładując od czterech do ośmiu na studzienkę. Następnie zabarwić je jako kontur w protokole tekstowym. Aby przygotować 12 dołków i osiem płytek, najpierw umyj je trzy razy sterylną wodą.

Następnie umyj je raz przy użyciu 75% etanolu i ponownie 100% etanolu. Następnie piecz talerze w temperaturze 50 stopni Celsjusza przez cztery do pięciu godzin do góry nogami, aby zakończyć proces sterylizacji. Po upieczeniu dodaj 500 mikrolitrów 0,2% roztworu PEI do każdej studzienki i pozostaw talerz w temperaturze pokojowej na godzinę.

Następnie odessać PEI i umyć studzienki cztery razy sterylną wodą destylowaną i wysuszyć je na powietrzu przez noc. Następnego dnia przygotuj świeży laminant w podłożu L15 i dodaj 10 mikrolitrów do środka każdej studzienki. Następnie dodaj wodę destylowaną do otaczających zbiorników, aby zapobiec parowaniu i inkubuj płytkę przez godzinę w temperaturze 37 stopni Celsjusza.

Pamiętaj, aby skierować laminant w środek elektrod, uważając, aby nie przekroczyć przestrzeni elektrod uziemiających, jeśli ta przestrzeń zostanie przekroczona, neurony będą rosły nad elektrodami uziemiającymi, powodując artefakty szumu i wpływając na wierność nagrania. Teraz dodaj jeden przygotowany SFEB do każdej studzienki, delikatnie odsysając pipetą o szerokim otworze. Następnie dodaj 200 mikrolitrów DM2 do każdej studzienki i hoduj płytkę przez noc.

Później, aby zarejestrować aktywność neuronalną, włóż płytkę do czytnika płytek. Rozgrzej do 37 stopni Celsjusza. Następnie użyj oprogramowania, aby zarejestrować 10 minut aktywności z każdej studni.

SFEB jest hodowany przy użyciu opisanej metody, dając tkankę o cechach morfologicznych przypominających wcześnie rozwijającą się korową strefę podkomorową wypełnioną rozległymi neuronami Tuj1 dodatnimi, a także neuro progenitorami. Liczne rozwijające się rozety korowe zaobserwowano w warstwach zewnętrznych i wewnętrznych warstwach ciał. Zewnętrzna krawędź ciał przypomina rozwijającą się płytkę korową zawierającą neurony postmitotyczne, co jest wspierane przez ekspresję Brn2, markera dla neuro progenitorów i najbardziej brzusznie zbalansowanych zewnętrznych warstw korowych.

Zewnętrzne warstwy zawierają również komórki Reelin-dodatnie, które mogą być przypadkowymi komórkami gratzela lub ich przodkami. W ciałach stwierdzono również ekspresję markerów zgodnych z mieszanym pochodzeniem immenantów kodalnych i przyśrodkowych zwojów. Na podstawie ekspresji ugotowanych markerów TF2 i Nkx2.1.

Hodowane SFEB dają zarówno w CalR, jak i CalB dodatnich neuronach pośrednich. A także neurony pobudzające VGLUT dodatnie i glutaminergiczne progenitory nerwowe Tbr1-dodatnie. Zgodnie z innymi doniesieniami, 61% komórek z ciał było VGLUT dodatnich, a 43% było Tbr1-dodatnich.

Nagrania MEM wykonane z ciał mogą być wykonywane przez długi okres czasu, a nagrania wykazały rozwój pękania na poziomie sieci korowej. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak hodować SFEB z ludzkich iPSC, scharakteryzować zawartość neuruli w karnie rozwijających się rozetach korowych za pomocą NSFEB. i wykonywać testy neurofizjologiczne na dojrzewających SFEB.

Ogólnie rzecz biorąc, osoby, które są nowe w tej metodzie, mogą mieć trudności, ponieważ potrzeba czasu i praktyki, aby rozwinąć niezbędną dziedzinę naukową, aby zachowanie iPSC i iPSC dotarło do neuronów w hodowli. Hodowane komórki powinny być monitorowane codziennie. Po tej procedurze można wykonać inne metody, takie jak obrazowanie wapnia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, takie jak, jak leczenie farmakologiczne może wpłynąć na oscylacje sieci korowych.