Name: Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów (Wideo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 43 s
Description: Poznaj metodę tworzenia wolnych od surowicy ciał embrionalnych z hiPSC do badania rozwoju kory mózgowej i odkrywania leków. Ten model 3-D umożliwia analizę tworzenia się sieci neuronowych w tkance ludzkiej.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Dziękujemy Elizabeth Benevides za korektę artykułu. Dziękujemy doktorom Johnowi Hussmanowi i Gene'owi Blattowi za ich pomocne dyskusje i komentarze.

1. Generacja neuronalnych komórek progenitorowych
<ol>
	<li>Utrzymuj hiPSC pochodzące z fibroblastów i PBMC w 6-dołkowych płytkach na napromieniowanej γ warstwie komórek embrionalnych myszy (MEF) w ludzkiej pożywce iPSC uzupełnionej małymi cząsteczkami (patrz tabela materiałów). 
	UWAGA: Codzienna konserwacja jest zmodyfikowaną wersją wcześniej zgłaszanych procedur1,16.
	<ol>
		<li>Płytkę 6 x 105 MEF na każdym dołku 6-dołkowej płytki do hodowli tkankowej w zalecanej pożywce 300 μl/basenik (zgodnie z protokołem producenta).</li>
		<li>Po 48 godzinach zastąp pożywkę MEF pożywką o pojemności 300 μl/studzienkę hiPSC na 1 godzinę przed dodaniem hiPSC.</li>
		<li>Szybko rozmrozić hiPSC w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C i powoli dodawać kroplami 1 ml pożywki hiPSC. Przenieść hiPSC i pożywkę do stożkowej probówki o pojemności 15 ml. Dodaj pożywkę, aby zwiększyć całkowitą objętość do 5 ml. Wirować przez 4 minuty przy 129 x g, odessać supernatant, delikatnie zawiesić osad w 1 ml pożywki hiPSC z inhibitorem ROCK w stężeniu 1:1,000.</li>
		<li>Zawiesinę komórkową (zwykle wysianą w 300 000 komórek/dołk) należy umieścić na warstwie komórek MEF i inkubować w temperaturze 37 °C, 5% CO2, wilgotności 95%.</li>
		<li>Uważnie monitoruj hodowlę iPSC za pomocą mikroskopu świetlnego. Po 48 godzinach usuń kultury, które mają nierówne krawędzie, stały się torbielowate lub wydają się żółtawo-brązowe pod mikroskopem świetlnym, aby zminimalizować spontaniczne różnicowanie. 
		UWAGA: Po 7 - 10 dniach powinny utworzyć się kolonie hiPSC. Kolonie powinny być okrągłe, z wyraźnie zaznaczonymi granicami i jednolitą gęstością komórek oraz pozbawione luźno upakowanych niejednorodnych komórek.</li>
		<li>Ręcznie wybierz okrągłe kolonie hiPSC, aby oczyścić kulturę spontanicznie różnicujących się komórek. Rozszerz kolonie, umieszczając je na świeżych warstwach MEF. Rozwijaj 1:3 co 7 dni, gdy kultury zbliżają się do konfluencji i zamrażają1,16.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po ekspansji i zamrożeniu komórek (w celu kopii zapasowej) hoduj kolonie hiPSC na płytkach, aż osiągną 50 - 75% konfluencji.</li>
	<li>Siedem dni po posiewie należy zastosować łagodną obróbkę enzymatyczną (5-10 minut z 300 μl roztworu enzymatycznego) i delikatne rozcieranie (2-4 razy pipetą o pojemności 1 000 μl) w celu zebrania i przygotowania hiPSC do różnicowania neuronalnych komórek prekursorowych.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o sile 129 x g przez 4 minuty, odessać supernatant i ponownie zawiesić osad w 5 ml ludzkiej pożywki iPSC. Przenieść zawiesinę komórkową do pokrytego 0,1% żelatyną naczynia do hodowli komórkowej o średnicy 5 cm na 1 godzinę w temperaturze 37 °C w celu wyeliminowania MEF i maksymalizacji wydajności hiPSC. Przenieś podłoże (z nieprzylegającymi komórkami) do innego naczynia pokrytego żelatyną o średnicy 5 cm.</li>
	<li>Przenieść nieprzylegające komórki do probówki wirówkowej o pojemności 15 ml za pomocą pipety transferowej. Delikatnie opłucz płytki 3 ml pożywki i dodaj je do probówki o pojemności 15 ml.</li>
	<li>Odwirować zawiesinę komórkową o stężeniu 129 x g przez 4 minuty, odessać supernatant i delikatnie zawiesić osad w pożywce. Określ liczbę komórek za pomocą automatycznego licznika komórek. Płytka 9,000 komórek / studzienka w 96-dołkowej płytce dolnej w kształcie litery V o niskiej przyczepności.</li>
	<li>Odwirować płytkę przy sile 163 x g przez 3 minuty. Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5%CO2. Za pomocą pipety zmieniaj 50% pożywki co drugi dzień, usuwając połowę pożywki i zastępując ją świeżą, chemicznie zdefiniowaną pożywką różnicującą 1 (DM1; <silna klasa="xfig">Rysunek 1; Tabela materiałów) przez 14 dni.</li>
</ol>
2. Indukcja ciała zarodkowego bez surowicy (SFEB) (<silna klasa="xfig">Rysunek 2)
<ol>
	<li>Umieścić 40 μm wkładek do hodowli komórkowych na płytkach 6-dołkowych i dodać 1 ml pożywki DM1 co najmniej 1 godzinę przed dodaniem kruszyw.</li>
	<li>W dniu 14 przenieś agregaty z pożywką o pojemności 20 μl za pomocą końcówki o szerokości 200 μl na wkładki do hodowli komórkowych 40 μm i zmień pożywkę na DM2. 
	UWAGA: Wkładki do hodowli komórkowych to specjalistyczne wkładki, które są nieco odstawione od dna studzienki i składają się z membrany politetrafluoroetylenowej zawieszonej na plastikowej ramie. Membrana ta jest biokompatybilna i może skutecznie podtrzymywać transport składników odżywczych i tlenu do SFEB, które są umieszczone na górze. Są one powszechnie używane z organotypowymi kulturami plastrów hipokampa pobranymi od myszy lub szczura7,17,18.
	<ol>
		<li>Przenieść 4-6 agregatów do jednej wkładki do hodowli komórkowej i pozostawić odpowiednią przestrzeń między agregatami. Usunąć jak najwięcej nadmiaru roztworu za pomocą cienkiej końcówki pipety (np. końcówki 200 μl). 
		UWAGA: Dopuszczalne jest krótkotrwałe zakłócenie SFEB, ponieważ będą się one przemieszczać po wkładce do hodowli komórkowej, gdy roztwór zostanie usunięty z okolic SFEB.</li>
		<li>Utrzymuj kultury w 1 ml DM2 w temperaturze 37 °C, 95% wilgotności i 5% CO2 . Za pomocą pipety zmieniaj 75% pożywki co drugi dzień, usuwając trzy czwarte pożywki i zastępując ją trzema czwartymi świeżej pożywki. Na przykład usuń 750 μl pożywki i dodaj 750 μl świeżej pożywki.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Po 14 dniach hodowli należy zmienić pożywkę na DM3 z 75% wymianą pożywki co drugi dzień i przez kolejne 16 dni.</li>
	<li>Aby utrzymać SFEB na wkładkach do hodowli komórkowych dłużej niż 30 dni, należy zmieniać pożywkę co drugi dzień przez 60, 90 i 120 dni. 
	UWAGA: SFEB osiągną średnicę około 1 000 μm i zazwyczaj mają grubość 100-150 μm1.</li>
</ol>
3. Określanie składu SFEB
<ol>
	<li>Odłącz SFEB od wkładu, delikatnie pipetując medium za pomocą końcówki do pipety o szerokiej średnicy 200 μl. Aby przenieść SFEBs, użyj końcówki pipety z szeroką końcówką, aby delikatnie zassać korpusy do końcówki pipety. Po załadowaniu SFEB do końcówki pipety, delikatnie przenieść do płytek 12-dołkowych i przemyć 300 μl soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) na dołek. 
	UWAGA: SFEB zostaną zawieszone w roztworze na płytkach 12-dołkowych. Jest to ważne, aby umożliwić pełną penetrację utrwalacza, roztworu blokującego i przeciwciał. W przypadku używania wielu SFEB do barwienia, można dodać do 10 SFEB na dołek 12-dołkowej płytki. Pozwoli to zachować roztwory i przeciwciała.</li>
	<li>Utrwalić SFEB za pomocą 300 μl na studzienkę 4% paraformaldehydu w temperaturze pokojowej przez 30-45 min. Przemyć utrwalone SFEB dwukrotnie 300 μl PBS, 3-5 minut każde płukanie. 
	Uwaga: Podczas pracy z paraformaldehydem należy nosić odpowiednie środki ochrony osobistej. 
	UWAGA: Sonda immunoreaktywności na markery w celu określenia dojrzałości, typu komórki itp. Do oznaczania neuronów w tym badaniu użyto chicken-Tuj1 w skali 1:500, dodatkowe markery znajdują się w Tabeli 2 i odniesieniach1,16.</li>
	<li>Przepuszczalność i blokowanie 0,1% Triton-X100 w PBS i 10% normalnej surowicy osła (roztwór blokujący; 300 μl na studzienkę) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.</li>
	<li>Usunąć roztwór blokujący i potraktować SFEB 300 μl przeciwciał pierwszorzędowych w roztworze blokującym. Inkubować w temperaturze 4 °C przez noc. Umyj SFEB trzykrotnie (3-5 minut na pranie) w 300 μl PBS zawierającym 0,1% Triton-X.</li>
	<li>Przygotować przeciwciała drugorzędowe w stosunku 1:1000 w roztworze blokującym. Inkubować SFEB przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej z przeciwciałami drugorzędowymi. Umyj SFEB 300 μl PBS, 3 razy po 3-5 minut. 
	UWAGA: Na tym etapie SFEB mogą być przygotowane do obrazowania.</li>
	<li>Aby uzyskać obraz, pipetuj SFEB na szklanym szkiełku za pomocą pipety o szerokim otworze. Usunąć nadmiar roztworu wokół SFEB za pomocą delikatnego odsysania. 
	UWAGA: W przypadku podobnych warunków barwienia na tym samym szkiełku można umieścić wiele SFEB.</li>
	<li>Dodaj kroplę podłoża montażowego na SFEBs, umieść szklane szkiełko nakrywkowe i delikatnie dociśnij, aby upewnić się, że nie ma pęcherzyków powietrza. Poczekaj, aż podłoże mocujące stwardnieje i przystąp do obrazowania i oznaczania ilościowego (krok 3.8). 
	UWAGA: Po stwardnieniu podłoża montażowego SFEB są gotowe do obrazowania.</li>
	<li>Przeprowadź kwantyfikację komórek, biorąc pod uwagę wiele obszarów zainteresowania (ROI) w SFEB i używając stosu z połączonym z maksymalnym obrazem projekcyjnym przez każdy zwrot z inwestycji na standardowym mikroskopie konfokalnym, zgodnie z opisem w references1,16. 
	UWAGA: Całe SFEB można określić ilościowo za pomocą kafelków opartych na obrazach (szczegóły w references1,16). Ponieważ SFEB rozrzedzają się do około 100 μm, rozpraszanie światła w tkance jest minimalne, a zatem nie ma potrzeby stosowania mikroskopii 2-fotonowej. Wcześniejsze zastosowania tego protokołu z iPSC pochodzącymi z fibroblastów stworzyły mapę losu SFEB, która ujawniła złożoną i zróżnicowaną strukturę z subpopulacjami interneuronów o tożsamościach transkrypcyjnych, które przypominały CGE i losy przedniego przodomózgowia1,16.</li>
</ol>
4. Rejestrowanie aktywności neuronalnej w SFEB za pomocą MEA
<ol>
	<li>Przygotować 12-dołkowe płytki MEA zgodnie z instrukcjami producenta.</li>
	<li>Umyć płytki MEA 3 razy przez 5 minut sterylnymH2Ow aseptycznych warunkach w celu wyczyszczenia. Myć przez 5 minut 75% etanolem, a następnie 100% etanolem, aby wysterylizować płytkę.</li>
	<li>Piecz talerz odwrócony w piekarniku przez 4-5 godzin w temperaturze 50 °C, aby zakończyć proces sterylizacji.</li>
	<li>Dodać 500 μl 0,2% roztworu polietylenoiminy (PEI) do każdej studzienki i inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej. Odessać PEI i umyć studzienki 4x sterylnym destylowanymH2O. Suszyć na powietrzu w kapturze przez noc.</li>
	<li>Przygotuj 20 μl/ml roztworu lamininy w pożywce L15 i dodaj 10 μl lamininy do środka każdej studzienki. 
	UWAGA: Nie powlekaj otaczających elektrod odniesienia i uziemiających.</li>
	<li>Dodać sterylne dH2O do otaczających zbiorników, aby zapobiec parowaniu pożywki lub lamininy. Inkubować płytkę przez 1 godzinę w temperaturze 37 °C.</li>
	<li>Dodać SFEB (patrz punkty 1 i 2) do płytek MEA pokrytych lamininą, delikatnie odsysając je do końcówki pipety z szerokim otworem i przenieść. Dodać 200 μl pożywki DM2 do każdej studzienki i inkubować przez noc w temperaturze 37 °C, wilgotności 95% i 5% CO2 .</li>
	<li>Po 24 godzinach dodać dodatkowe 200 μl pożywki i pozostawić na 30 minut w temperaturze 37 °C, wilgotności 95%, 5% CO2 przed odczytaniem płytki.</li>
	<li>Umieścić płytkę MEA w czytniku płytek (podgrzanym do temperatury 37 °C) w celu zarejestrowania aktywności neuronalnej. Rejestruj aktywność przez 10 minut za pomocą odpowiedniego oprogramowania do nagrywania MEA. Zobacz reference19, aby uzyskać szczegółowe informacje.</li>
	<li>Generuj surowe strumienie danych i wykresy rastrowe aktywności neuronalnej za pomocą oprogramowania do analizy statystycznej19. 
	UWAGA: Nagrania MEA są wykonywane 7 dni po poszyciu SFEB. Na potrzeby tego badania prowadzono nagrania przez 10 minut w celu wykrycia aktywności impulsów sieciowych, ciągłego śledzenia i wykresów rastrowych. SFEB mogą być utrzymywane długoterminowo na płytkach MEA i mogą być rejestrowane przez dłuższy czas w kontrolowanych warunkach środowiskowych (<silna klasa="xfig">Rysunek 6).</li>
</ol>

<ol><li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+serum-free+embryoid+bodies+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+into+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Differentiation of serum-free embryoid bodies from human induced pluripotent stem cells into networks.</a> Stem Cell Res. 10 (3), 454-463 (2013).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organized+formation+of+polarized+cortical+tissues+from+ESCs+and+its+active+manipulation+by+extrinsic+signals%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-organized formation of polarized cortical tissues from ESCs and its active manipulation by extrinsic signals.</a> Cell Stem Cell. 3 (5), 519-532 (2008).</li>
<li>Sasai, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+regenerative+medicine%3A+organogenesis+from+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Next-generation regenerative medicine: organogenesis from stem cells in 3D culture.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 520-530 (2013).</li>
<li>Song, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cortical+development+and+remapping+through+spike+timing-dependent+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Cortical development and remapping through spike timing-dependent plasticity.</a> Neuron. 3 (2), 339-350 (2001).</li>
<li>Pre, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+time+course+analysis+of+the+electrophysiological+properties+of+neurons+differentiated+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+%28iPSCs%29%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A time course analysis of the electrophysiological properties of neurons differentiated from human induced pluripotent stem cells (iPSCs).</a> PLoS One. 9 (7), e103418(2014).</li>
<li>Sproul, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+molecular+profiling+of+PSEN1+familial+Alzheimer%27s+disease+iPSC-derived+neural+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Characterization and molecular profiling of PSEN1 familial Alzheimer's disease iPSC-derived neural progenitors.</a> PLoS One. 9 (1), e84547(2014).</li>
<li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).</li>
<li>Nicholas, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+maturation+of+hPSC-derived+forebrain+interneurons+requires+an+extended+timeline+and+mimics+human+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Functional maturation of hPSC-derived forebrain interneurons requires an extended timeline and mimics human neural development.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 573-586 (2013).</li>
<li>Cukier, H. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exome+sequencing+of+extended+families+with+autism+reveals+genes+shared+across+neurodevelopmental+and+neuropsychiatric+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Autism%22%5BJournal%5D)">Exome sequencing of extended families with autism reveals genes shared across neurodevelopmental and neuropsychiatric disorders.</a> Mol Autism. 5 (1), (2014).</li>
<li>Marchetto, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+for+neural+development+and+treatment+of+Rett+syndrome+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model for neural development and treatment of Rett syndrome using human induced pluripotent stem cells.</a> Cell. 143 (4), 527-539 (2010).</li>
<li>Choi, S. H., Tanzi, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSCs+to+the+rescue+in+Alzheimer%27s+research%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">iPSCs to the rescue in Alzheimer's research.</a> Cell Stem Cell. 10 (3), 235-236 (2012).</li>
<li>Yagi, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+familial+Alzheimer%27s+disease+with+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Modeling familial Alzheimer's disease with induced pluripotent stem cells.</a> Hum Mol Genet. 20 (23), 4530-4539 (2011).</li>
<li>Mariani, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+human+cortical+development+in+vitro+using+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Modeling human cortical development in vitro using induced pluripotent stem cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (31), 12770-12775 (2012).</li>
<li>Quadrato, G., Brown, J., Arlotta, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promises+and+challenges+of+human+brain+organoids+as+models+of+neuropsychiatric+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The promises and challenges of human brain organoids as models of neuropsychiatric disease.</a> Nat Med. 22 (11), 1220-1228 (2016).</li>
<li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+Inducible+Pluripotent+Stem+Cells+and+Autism+Spectrum+Disorder%3A+Emerging+Technologies%5BTitle%5D)+AND+%22Autism+Res%22%5BJournal%5D)">Human Inducible Pluripotent Stem Cells and Autism Spectrum Disorder: Emerging Technologies.</a> Autism Res. 9 (5), 513-535 (2016).</li>
<li>Nestor, M. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+a+subpopulation+of+developing+cortical+interneurons+from+human+iPSCs+within+serum-free+embryoid+bodies%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Characterization of a subpopulation of developing cortical interneurons from human iPSCs within serum-free embryoid bodies.</a> Am J Physiol Cell Physiol. 308 (3), C209-C219 (2015).</li>
<li>Nestor, M. W., Hoffman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+cycling+rates+of+Kv4.2+channels+in+proximal+and+distal+dendrites+of+hippocampal+CA1+pyramidal+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Differential cycling rates of Kv4.2 channels in proximal and distal dendrites of hippocampal CA1 pyramidal neurons.</a> Hippocampus. 22 (5), 969-980 (2012).</li>
<li>Nestor, M. W., Mok, L. P., Tulapurkar, M. E., Thompson, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+of+neuron-glial+interactions+mediated+by+astrocytic+EphARs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Plasticity of neuron-glial interactions mediated by astrocytic EphARs.</a> J Neurosci. 27 (47), 12817-12828 (2007).</li>
<li>Woodard, C. M., Campos, B. A., Kuo, S. H., Nirenberg, M. J., Nestor, M. W., Zimmer, M., Mosharov, E. V., Sulzer, D., Zhou, H., Paull, D., Clark, L., Schadt, E. E., Sardi, S. P., Rubin, L., Eggan, K., Brock, M., Lipnick, S., Rao, M., Chang, S., Li, A., Noggle, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPSC-Derived+Dopamine+Neurons+Reveal+Differences+Between+Monozygotic+Twins+Discordant+for+Parkinson%27s+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">iPSC-Derived Dopamine Neurons Reveal Differences Between Monozygotic Twins Discordant for Parkinson's Disease.</a> Cell Rep. 9 (4), 1173-1182 (2014).</li>
<li>Huang, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tankyrase+inhibition+stabilizes+axin+and+antagonizes+Wnt+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Tankyrase inhibition stabilizes axin and antagonizes Wnt signalling.</a> Nature. 461 (7264), 614-620 (2009).</li>
<li>Chambers, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+efficient+neural+conversion+of+human+ES+and+iPS+cells+by+dual+inhibition+of+SMAD+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling.</a> Nat Biotechnol. 27 (3), 275-280 (2009).</li>
<li>Kriks, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dopamine+neurons+derived+from+human+ES+cells+efficiently+engraft+in+animal+models+of+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dopamine neurons derived from human ES cells efficiently engraft in animal models of Parkinson's disease.</a> Nature. 480 (7378), 547-551 (2011).</li>
<li>Maroof, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+and+functional+maturation+of+cortical+interneurons+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation and functional maturation of cortical interneurons from human embryonic stem cells.</a> Cell Stem Cell. 12 (5), 559-572 (2013).</li>
<li>Pasca, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+cortical+neurons+and+astrocytes+from+human+pluripotent+stem+cells+in+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Functional cortical neurons and astrocytes from human pluripotent stem cells in 3D culture.</a> Nat Methods. 12 (7), 671-678 (2015).</li>
<li>Yan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((iPS+cells+reprogrammed+from+human+mesenchymal-like+stem%2Fprogenitor+cells+of+dental+tissue+origin%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Dev%22%5BJournal%5D)">iPS cells reprogrammed from human mesenchymal-like stem/progenitor cells of dental tissue origin.</a> Stem Cells Dev. 19 (4), 469-480 (2010).</li>
<li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+clinical-grade+human+induced+pluripotent+stem+cells+in+Xeno-free+conditions%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+Ther%22%5BJournal%5D)">Generation of clinical-grade human induced pluripotent stem cells in Xeno-free conditions.</a> Stem Cell Res Ther. 6, 223(2015).</li>
<li>Kwon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+Differentiation+of+a+Human+Induced+Pluripotent+Stem+Cell+Line+%28FS-1%29+Derived+from+Newborn+Foreskin+Fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Neuronal Differentiation of a Human Induced Pluripotent Stem Cell Line (FS-1) Derived from Newborn Foreskin Fibroblasts.</a> Int J Stem Cells. 5 (2), 140-145 (2012).</li>
<li>Li, X. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coordination+of+sonic+hedgehog+and+Wnt+signaling+determines+ventral+and+dorsal+telencephalic+neuron+types+from+human+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Coordination of sonic hedgehog and Wnt signaling determines ventral and dorsal telencephalic neuron types from human embryonic stem cells.</a> Development. 136 (23), 4055-4063 (2009).</li>
<li>Sheridan, S. D., Surampudi, V., Rao, R. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+embryoid+bodies+derived+from+human+induced+pluripotent+stem+cells+as+a+means+to+assess+pluripotency%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells+Int%22%5BJournal%5D)">Analysis of embryoid bodies derived from human induced pluripotent stem cells as a means to assess pluripotency.</a> Stem Cells Int. , 738910(2012).</li>
<li>Smith, Q., Stukalin, E., Kusuma, S., Gerecht, S., Sun, S. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stochasticity+and+Spatial+Interaction+Govern+Stem+Cell+Differentiation+Dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Stochasticity and Spatial Interaction Govern Stem Cell Differentiation Dynamics.</a> Sci Rep. 5, 12617(2015).</li>
</ol>

Autorzy nie mają konkurencyjnych interesów finansowych.

Opisany tutaj protokół zapewnia warunki do różnicowania źródła hiPSC w strukturę 3D, która podsumowuje wczesny etap rozwoju kory czołowej. Procedura ta pozwala uzyskać struktury, które można badać pod kątem elektrofizjologii, a jednocześnie można je uzyskać pod mikroskopem. Ostateczna morfologia SFEB przypomina organotypową morfologię kultur wycinków mózgu i umożliwia wysokiej jakości szczegółowe obrazowanie konfokalne. Protokół ten może z powodzeniem generować SFEB zarówno z fibroblastów, jak i hiPSC pochodzących z komó...

Wcześniej opisaliśmy system modeli 3-D, wygenerowany z ludzkich indukowanych przez pacjentów pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC), który podsumowuje niektóre aspekty wczesnego rozwoju sieci korowej1. Ten model 3D, ciało zarodkowe bez surowicy (SFEB), jest lepszy od poprzednich prostych modeli agregacji hiPSC2,3. Coraz więcej prac pokazuje, że struktury 3D, takie jak nasze SFEB, przybliżają aspekty rozwoju neuronalnego powszechnie obserwowane in vivo i we wcześniejszym punkcie czasowym niż obserwowane w dwuwymiarowych (2-D)/jednowarstwowych modelach hiPSC4,5. Początkowe badania koncentrowały się na samoorganizującej się złożoności ciał 3D, nie wykazując ich złożoności fizjologicznej2.
Opisany tutaj protokół został zastosowany na niezróżnicowanych hiPSC pochodzących z fibroblastów i komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC). Komórki te są utrzymywane w napromieniowanych γ embrionalnych karmnikach myszy (MEF). Te kolonie hiPSC są ręcznie oczyszczane ze spontanicznie różnicujących się komórek, zbierane enzymatycznie i ponownie zawieszane w pożywce zawierającej inhibitor kinazy Rho Y-27632 (ROCKi). Niezróżnicowane hiPSC są poddawane dysocjacji i wirowaniu przed przeniesieniem do 96-dołkowych płytek o niskiej przyczepności V-bottom. Po posianiu inicjowana jest indukcja neuronalna za pomocą podwójnego hamowania SMAD (SB431542 i LDN193189 wraz z dickkopf 1 (DKK-1)) w celu wysterowania linii neuronalno-losowej przedniego przodomózgowia w przodomózgowiu6. Po 14 dniach SFEB przenosi się do wkładek do hodowli komórkowych na płytce 6-dołkowej. Po przeniesieniu okrągłe SFEB zaczynają się rozprzestrzeniać i rozrzedzać, utrzymując jednocześnie lokalne połączenia sieciowe, co często obserwuje się w preparatach do organotypowych kultur warstwowych hipokampa przy użyciu podobnych wkładek do hodowli komórkowych1,7.
Użycie platformy 3-D opartej na SFEB w tym formacie umożliwia efektywne wytwarzanie sieci korowych, które mogą być badane za pomocą testów fizjologicznych opartych na komórkach, takich jak obrazowanie wapnia lub testy elektrofizjologiczne, takie jak zapisy pojedynczej komórki lub matryca wieloelektrodowa (MEA)1. Chociaż systemy 3D noszą markery wczesnego rozwoju kory mózgowej, inne badania wykazały, że te ciała 3D mogą wymagać dłuższego czasu inkubacji, aby umożliwić z natury wolniejsze tempo rozwoju tkanek ludzkich8. Ten protokół SFEB z powodzeniem generuje 3-D SFEB z niezróżnicowanych hiPSC, które ujmują aspekty wczesnego rozwoju kory mózgowej.
Potencjał SFEB do modelowania aberracji sieciowych w zaburzeniach neurologicznych jest mocną stroną tego systemu. Wirusy hiPS pochodzące z tkanek pacjenta mogą być hodowane w komórkach układu nerwowego, które są poddawane testom związanym z biologią komórki, a także jednoczesną ekspresją genów. Ludzkie iPSC są wykorzystywane do ustalania profilu genetycznego dużych grup osób z różnymi zaburzeniami neurologicznymi o złożonej etiologii, takimi jak zaburzenia ze spektrum autyzmu (ASD), schizofrenia9, Rett Syndrome10 i choroba Alzheimera11,12. Do niedawna modele iPSC były zazwyczaj preparatami jednowarstwowymi, które, choć były biegłe w ocenie interakcji molekularnych, nie były wystarczające w rozszyfrowywaniu złożonych interakcji komórkowych obserwowanych in vivo. Modele zwierzęce były domyślnym substytutem odtwarzania platformy całego narządu. Te modele zwierzęce są nękane przez słabe tłumaczenie wyników i mają ograniczoną zdolność do replikacji ludzkich profili genetycznych zidentyfikowanych w dużych genetycznych badaniach przesiewowych. W związku z tym rozwój systemów 3D z iPSC dodaje potrzebną warstwę złożoności w modelowaniu chorób ludzkich13,14. Kolejnym krokiem dla platform 3D hiPSC jest dostosowanie się do wymagań dużej skali dotyczących wysokoprzepustowych badań przesiewowych przy użyciu testów opartych na komórkach15.

<table><tbody><tr><td>SFEB Pożywka do hodowli komórkowych do różnicowania neuronów. Odczynniki. Komponenty&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>STEMdiff Pożywka do indukcji neuronalnej (hiPSC Media)</td><td>STEMCELL Technologies</td><td>0-5835</td><td>250 mL</td></tr><tr><td>PluriQ ES-DMEM Medium (MEF Media)</td><td>GlobalStem</td><td>GSM-2001</td><td></td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company&nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>DM1 Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>385 mL</td></tr><tr><td>Knockout Serum Replacement</td><td>Invitrogen</td><td>10828028</td><td>20% 100 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Glutamax 200</td><td>mM Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>MEM Roztwór aminokwasów endogennych 10 mM (100x), płynny</td><td>Invitrogen</td><td>11140050</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>2-merkaptoetanolu (1 000x), płynny</td><td>Invitrogen</td><td>21985023</td><td>900 &mu; L</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Company&nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>DM2 Media Components</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-MEM/F-12 (1x), Glutamax liquid, 1:1</td><td>Invitrogen</td><td>10565018</td><td>500</td></tr><tr><td>mL Glutamax 200</td><td>mM Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 mL</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>suplementu N-2 (100x), płyn</td><td>Invitrogen</td><td>17502048</td><td>10 ml</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Firma&nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>DM3 Składniki mediów</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEUROBASAL Medium (1x), płyn</td><td>Invitrogen</td><td>21103049</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>B-27 Suplement Minus Witamina A (50x), płyn</td><td>Invitrogen</td><td>12587010</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>Invitrogen</td><td>35050061</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>wstrzykiwacz/paciorkowiec</td><td>Invitrogen</td><td>15140122</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company&nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Małe cząsteczki</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thiazovivin</td><td>Stemgent</td><td>04-0017</td><td>2 &mu; M</td></tr><tr><td>SB431542</td><td>Stemgent</td><td>04-0010-10</td><td>1:1,000 (10 &mu; M)</td></tr><tr><td>Dorsomorphin</td><td>Stemgent</td><td>04-0024</td><td>1 &mu; M</td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Stemgent</td><td>04-0074-10</td><td>250 nM</td></tr><tr><td>Y27632 (ROCKi)</td><td>Stemgent</td><td>04-0012-10</td><td>10 &mu; M</td></tr><tr><td>Nazwa<</td><td>strong>Company&nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</strong</td></tr><tr><td>>Rekombinowane Protiens</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DKK-1</td><td>Peprotech</td><td>120-30</td><td>200 ng/mL</td></tr><tr><td>Nazwa</td><td>Company&nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Uwagi</td></tr><tr><td>Komponenty/Materiały</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Culture inserts 0,4 &mu; M, 30mm średnicy Millicell</td><td></td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>Mysze fibroblasty embrionalne</td><td>GlobalStem</td><td>GSC-6301G</td><td></td></tr><tr><td>96 dołków V z pokrywkami</td><td>Evergreen</td><td>222-8031-01V</td><td></td></tr><tr><td>StemPro Accutase Odczynnik do dysocjacji komórek</td><td>ThermoFisher</td><td>A1110501</td><td></td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>ThermoFisher</td><td>85111</td><td></td></tr><tr><td>Sól fizjologiczna buforowana fosforanami (PBS)</td><td>ThermoFisher</td><td>10010023</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>Normalna surowica osła</td><td>Jackson Labs</td><td>017-000-121</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz's L-15 Medium</td><td>ThermoFisher</td><td>11415114</td><td>500 ml</td></tr><tr><td>DRAQ5 (marker jądrowy)</td><td>ThermoFisher</td><td>65-0880-96</td><td></td></tr><tr><td>Płytki MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-GL1-30Pt200</td><td></td></tr><tr><td>6-dołkowy płaski</td><td>dno Falcon</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td><silny>Nazwa</td><td>Company&nbsp; </td><td>Numer katalogowy</td><td>Komentarze</td></tr><tr><td>Przeciwciało</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB5326</td><td></td></tr><tr><td>Brn-2</td><td>Protein tech</td><td>14596-1-AP</td><td></td></tr><tr><td>VGLUT1</td><td>Systemy synaptyczne</td><td>135 303</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>abcam</td><td>ab5790</td><td></td></tr><tr><td>Calretinin</td><td>abcam</td><td>ab702</td><td></td></tr><tr><td>Calbindin</td><td>abcam</td><td>ab11426</td><td></td></tr><tr><td>CoupTFII</td><td>R& D Systems</td><td>PPH714700</td><td></td></tr><tr><td>Nkx 2.1</td><td>abcam</td><td>ab12650</td><td></td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>abcam</td><td>ab41489</td><td></td></tr><tr><td>Reelin</td><td>Millipore</td><td>MAB5364</td><td></td></tr><tr><td>Tbr1</td><td>Millipore</td><td>MAB2261</td><td></td></tr><tr><td>NFH</td><td>Dako</td><td>M0762</td><td></td></tr></tbody></table>

opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z hipsc do badania kultur 3-d komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Developing HiPSC Derived Serum Free Embryoid Bodies for the Interrogation of 3-D Stem Cell Cultures Using Physiologically Relevant Assays

Chociaż wiele modeli chorób in vitro zostało opracowanych przy użyciu hiPSC, jednym z ograniczeń jest to, że te dwuwymiarowe (2-D) systemy mogą nie reprezentować podstawowej cytoarchitektonicznej i funkcjonalnej złożoności osób dotkniętych chorobą, które mają podejrzane warianty choroby. Konwencjonalne modele 2D pozostają niekompletnymi reprezentacjami struktur podobnych do in vivo i nie oddają odpowiednio złożoności mózgu. W związku z tym pojawia się zapotrzebowanie na więcej modeli 3D opartych na hiPSC, które mogą lepiej podsumować interakcje i funkcje komórkowe obserwowane w systemie in vivo.
Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju systemu 3-D z niezróżnicowanych hiPSC na podstawie surowicy wolnego od embrionów ciała (SFEB). Ten model 3D odzwierciedla aspekty rozwijającej się brzusznej kory nowej i pozwala na badania funkcji integralnych z żywymi komórkami nerwowymi i nienaruszonymi tkankami, takich jak migracja, łączność, komunikacja i dojrzewanie. W szczególności wykazaliśmy, że SFEB za pomocą naszego protokołu mogą być badane za pomocą fizjologicznie istotnych i opartych na komórkach testów o wysokiej zawartości, takich jak obrazowanie wapnia i zapisy z matrycą wieloelektrodową (MEA) bez kriosekcji. W przypadku nagrań MEA wykazaliśmy, że SFEB zwiększają zarówno aktywność skoków, jak i aktywność pękania na poziomie sieci podczas długotrwałej hodowli. Ten protokół SFEB zapewnia solidny i skalowalny system do badania rozwoju tworzenia sieci w modelu 3D, który ujmuje aspekty wczesnego rozwoju kory mózgowej.

SFEB wyhodowane przy użyciu naszej techniki dały tkankę o charakterystyce morfologicznej przypominającej wczesną strefę podkomorową kory, obfitującą w liczne neurony Tuj1-dodatnie, a także w progenitory neuronalne (Rysunek 3A). W warstwach zewnętrznych i wewnętrznych SFEB zaobserwowano liczne rozwijające się rozety korowe (Rysunek 3B). Zewnętrzna krawędź SFEB przypomina rozwijającą się płytkę korową zawierającą neurony postmitoty...

Tutaj przedstawiamy protokół rozwoju trójwymiarowego (3-D) systemu z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hiPSC) o nazwie surowica wolnego od embrionów (SFEB). Ten model 3D może być używany jak organotypowa kultura plasterków do modelowania rozwoju ludzkiej kory mózgowej i do fizjologicznego badania rozwijających się obwodów neuronalnych.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Although a number of in vitro disease models have been developed using hiPSCs, one limitation is that these two-dimensional (2-D) systems may not ...

Ogólnym celem niniejszego protokołu dotyczącego 3D ludzkich ciałek zarodkowych (embryoid bodies) z iPSC w warunkach bezsurowiczych jest zapewnienie systemu in vitro, który przybliża wczesny rozwój kory mózgu człowieka i może być wykorzystany w procesie odkrywania leków. Metoda ta może pomóc w odpowiedzi na kluczowe pytania z dziedziny komórek macierzystych, takie jak sposób, w jaki neurony powstają z iPSC i tworzą funkcjonalne sieci w tkance 3D. Główną zaletą tej techniki jest to, że pozwala ona modelować aspekty rozwoju kory w warunkach laboratoryjnych, wykorzystując ludzką tkankę zawierającą genotyp osób chorych; tym samym system ten służy jako skalowalna platforma oparta na komórkach do przesiewania leków, która może być wykorzystana do badania wielu różnych zaburzeń neurobiologicznych.Chociaż metoda ta może dostarczyć wiedzy na temat zaburzeń neurobiologicznych lub rozwoju neurologicznego, można ją również zastosować do innych układów, na przykład tych skupiających się na modelach funkcji neuroimmunologicznych lub informacji neuronalnej. W ramach niniejszego protokołu należy rozpocząć od namnożenia komórek płodowych. Aby utworzyć tę hodowlę, wysiej 600 000 komórek płodowych do każdego dołka płytki sześciodołkowej, stosując 300 milliliters pożywki na dołek.Po 48-godzinnej hodowli komórek płodowych należy wymienić pożywkę. Inkubować płytki przez godzinę, przygotowując w tym czasie komórki macierzyste. Rozmrozić komórki macierzyste w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.Po rozmrożeniu przenieść komórki do stożkowej probówki o pojemności 15 ml i dopełnić ją do poziomu 5 ml pożywką hodowlaną, dodawaną kroplami. Następnie delikatnie odwirować komórki przez cztery minuty, odessać nadsącz i delikatnie resuspender osad w 1 ml pożywki dla komórek macierzystych z inhibitorem ROCK. Po oznaczeniu gęstości komórek, wysiać 300 000 komórek macierzystych na komórki karmione.Następnie hoduj i namnażaj kultury, okresowo selekcjonując zdrowe komórki, a po namnożeniu zamrażaj komórki w celu stworzenia kopii zapasowej. Hoduj kolonie komórek macierzystych na standardowych płytkach, aż osiągną 50% do 70% konfluencji. Następnie zastosuj łagodną obróbkę enzymatyczną i delikatną tryturację za pomocą końcówki do pipety o objętości 1 ml, aby zebrać hiPSC do różnicowania w kierunku prekursorowych komórek neuronalnych.Zawiesinę należy delikatnie odwirować, odessać nadsącz i ponownie zawiesić osad w 5 mL pożywki do ludzkich iPSC. Następnie zawiesinę komórkową przenosi się do naczynia hodowlanych o średnicy 5 cm pokrytego 0,1% żelatyną i inkubować płytkę przez jedną godzinę. Po godzinie komórki nieprzywierające przenosi się do probówki wirówkowej o pojemności 15 mL.Następnie delikatnie wypłucz płytkę trzema mililitrami pożywki i przenieś ją do tej samej probówki. Następnie powtórz etap resuspensji wraz z delikatnym wirowaniem, po czym określ gęstość komórek i wysiej je na płytkę 96-dołkową z niską adhezją i dnem w kształcie litery V w zagęszczeniu 9 000 komórek na dołek. Teraz wiruj płytkę przez trzy minuty i rozpocznij hodowlę komórek.Przez kolejne 14 dni, co drugi dzień, wymieniaj połowę pożywki na świeżą pożywkę różnicującą nr 1. Po dwóch tygodniach hodowli komórek przygotuj płytki sześciodołkowe z wkładkami do hodowli komórkowych o wielkości porów 40 µm i jednym mililitrem pożywki DM1. Inkubuj te płytki przez co najmniej cztery godziny przed dodaniem wyhodowanych komórek.Następnie, używając końcówki do pipety o szerokim wylocie o pojemności 200 µL, należy zebrać dwutygodniowe agregaty komórkowe w około 20 µL medium. Przenieś od czterech do sześciu agregatów na każdy wkład z minimalną ilością roztworu, usuwając wszelkie nadmiary. Na tym etapie ważne jest, aby pracować szybko i pewną ręką; podczas usuwania medium z otoczenia SFEB można zauważyć, że SFEB przemieszczają się w roztworze pod wpływem napięcia powierzchniowego.Dopuszczalne jest ich ponowne rozmieszczenie po usunięciu pożywki. Po załadowaniu wszystkich agregatów na wkłady, należy wymienić pożywkę na 1 mL DM2 i kontynuować hodowlę komórek co drugi dzień. Trzy czwarte pożywki należy zastąpić świeżą pożywką.Po 14 dniach hodowli należy rozpocząć dodawanie pożywki DM3 do kultur. Kontynuuj hodowlę przez kolejne 16 dni, aby doprowadzić do wzrostu SFEB. Następnie delikatnie oddziel SFEB od wkładki, używając końcówki do pipety o szerokim wylocie o pojemności 200 µL.Przenieś SFEBs do płytek 12-dołkowych, umieszczając od czterech do ośmiu w każdym dołku. Następnie zabarw je zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Aby przygotować płytki 12-dołkowe i ośmiodołkowe, najpierw przemyj je trzykrotnie sterylną wodą.Następnie wypłucz je raz za pomocą 75% etanolu i jeszcze raz za pomocą 100% etanolu. Potem wygrzej płytki w temperaturze 50 °C przez cztery do pięciu godzin w pozycji odwróconej, aby zakończyć proces sterylizacji. Po wygrzaniu dodaj 500 µL 0,2% roztworu PEI do każdego dołka i pozostaw płytkę w temperaturze pokojowej na godzinę.Następnie odessać PEI i przemyć studnie czterokrotnie sterylną wodą destylowaną, a potem pozostawić do wyschnięcia na powietrzu przez noc. Następnego dnia przygotować świeży laminant w pożywce L15 i dodać 10 µL do centrum każdej studni. Następnie do otaczających zbiorników dodać wodę destylowaną, aby zapobiec parowaniu, i inkubować płytkę przez jedną godzinę w temperaturze 37 °C.Należy upewnić się, że laminat znajduje się w centrum elektrod, uważając, aby nie przekroczyć obszaru elektrod uziemiających; w przypadku przekroczenia tego obszaru neurony wyrosną na elektrodach uziemiających, co spowoduje artefakty szumowe i wpłynie na wierność rejestracji. Następnie do każdego dołka należy dodać jeden przygotowany SFEB, używając delikatnego zasysania za pomocą pipety o szerokim wlocie. Potem należy dodać 200 µL DM2 do każdego dołka i inkubować płytkę przez noc.Następnie, aby zarejestrować aktywność neuronalną, umieść płytkę w czytniku płytek. Podgrzej go wstępnie do 37 °C. Następnie, za pomocą oprogramowania, zarejestruj 10 minut aktywności z każdej studni.SFEB hodowane za pomocą opisanego метода uzyskiwały tkankę o charakterystyce morfologicznej przypominającej wczesną strefę podkomorową kory, obfitującą w liczne neurony Tuj1-dodatnie, a także w progenitorów neuronalnych. W warstwach zewnętrznych i wewnętrznych ciałek zaobserwowano liczne rozwijające się rozetki korowe. Zewnętrzna krawędź ciałek przypomina rozwijającą się blaszkę korową zawierającą neurony pomitotyczne, co potwierdzono ekspresją Brn2, markera dla progenitorów neuronalnych oraz najbardziej brzusznych zewnętrznych warstw kory.Warstwy zewnętrzne zawierają również komórki Reelin-dodatnie, które mogą być komórkami gratzela lub ich progenitorami. Ciała te wykazywały również ekspresję markerów zgodną z mieszanym pochodzeniem z kodalnej i medialnej eminencji zwojowej, na podstawie ekspresji markerów TF2 i Nkx2.1.Kulturowe SFEB dają zarówno interneurony wykazujące pozytywną reakcję na CalR i CalB, jak i pobudzające neurony pozytywne dla VGLUT oraz glutaminergiczne progenitory neuronalne pozytywne dla Tbr1. Zgodnie z innymi doniesieniami, 61% komórek z ciałek było pozytywnych dla VGLUT, a 43% dla Tbr1.Rejestracje MEM wykonane z ciał komórek można prowadzić przez długie okresy czasu; zapisy te wykazały rozwój wyładowań seryjnych (bursting) na poziomie sieci korowej. Po obejrzeniu tego filmu powinni Państwo posiadać gruntowną wiedzę na temat tego, jak hodować SFEB z ludzkich iPSC, charakteryzować zawartość neuronalną rozwijających się rozet korowych z wykorzystaniem NSFEB oraz przeprowadzać badania neurofizjologiczne na dojrzewających SFEB.Zazwyczaj osoby rozpoczynające pracę z tą metodą mogą napotkać trudności, ponieważ wypracowanie niezbędnego doświadczenia w zakresie zachowania iPSC oraz ich różnicowania w neurony w hodowli wymaga czasu i praktyki. Hodowane komórki należy monitorować codziennie. Po przeprowadzeniu tej procedury można zastosować inne metody, takie jak obrazowanie wapnia, aby odpowiedzieć na dodatkowe pytania, na przykład dotyczące wpływu konkretnych leków na oscylacje sieci korowej.

developing-hipsc-derived-serum-free-embryoid-bodies-for-interrogation

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Neuronauka

Bioinformatyka wideo to zautomatyzowane przetwarzanie, analiza, interpretacja i eksploracja danych biologicznych czasowo-przestrzennych wyekstrahowanych z filmów mikroskopowych. Celem niniejszego artykułu jest zaprezentowanie metody pomiaru wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych z wykorzystaniem metody bioinformatyki wideo.

Bioinformatyczna analiza wideo wzrostu kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych

Niniejsza praca szczegółowo opisuje przygotowanie trójwymiarowych (3D) rusztowań fibrynowych do hodowli i różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych. Takie rusztowania mogą być wykorzystywane do badania wpływu różnych związków biologicznych na zachowanie komórek macierzystych, a także modyfikowane w celu włączenia systemów dostarczania leków.

Przygotowanie trójwymiarowych rusztowań fibrynowych do zastosowań w hodowli komórek macierzystych

Film opisuje procedurę tworzenia ciał embrionalnych wolnych od surowicy (SFEB) z komórek progenitorowych neuronów przy użyciu różnych pożywek różnicujących bez surowicy lub DM. DM-2 ułatwia dojrzewanie i układanie neuronów do tworzenia SFEB, podczas gdy DM-3 jest używany do dalszego utrzymania wzrostu.

Rozwój i utrzymanie ciał zarodkowych wolnych od surowicy

Ten protokół opisuje efektywną indukcję hemogennego śródbłonka i wielopotencjalnych hematopoetycznych komórek progenitorowych z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych poprzez wymuszoną ekspresję czynników transkrypcyjnych.

Bezpośrednia indukcja hemogennego śródbłonka i krwi przez nadekspresję czynników transkrypcyjnych w ludzkich pluripotencjalnych komórkach macierzystych

Przedstawiono protokół przygotowania hydrożeli z polialkoholu winylowego i kwasu ko-itakonowego o różnej sztywności, które zostały zaszczepione z oligopeptydami i bez nich, w celu zbadania wpływu sztywności biomateriałów na różnicowanie i proliferację komórek macierzystych. Sztywność hydrożeli była kontrolowana przez czas sieciowania.

Ludzka pluripotencjalna hodowla komórek macierzystych na hydrożelach z polialkoholem winylowym i kwasem ko-itakonowym o różnej sztywności w warunkach wolnych od ksenotypów

Ten protokół opisuje podejście do produkcji hepatosfer z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych przy użyciu zdefiniowanego systemu hodowli i samoorganizacji komórek. Protokół ten jest powtarzalny w wielu liniach komórkowych, jest opłacalny i pozwala na produkcję stabilnych ludzkich hepatosfer do zastosowań biomedycznych.

Produkcja trójwymiarowych ludzkich hepatosfer bez surowicy z pluripotencjalnych komórek macierzystych

Ligandy macierzy zewnątrzkomórkowej mogą być wzorowane na hydrożelach poliakrylamidowych, aby umożliwić hodowlę ludzkich embrionalnych komórek macierzystych w zamkniętych koloniach na podatnych podłożach. Metodę tę można połączyć z mikroskopią sił trakcyjnych i testami biochemicznymi w celu zbadania wzajemnych zależności między geometrią tkanki, siłami generowanymi przez komórkę i specyfikacją losu.

Modelowanie geometrii kolonii ludzkich embrionalnych komórek macierzystych na podatnych podłożach w celu kontrolowania mechaniki na poziomie tkankowym

Prezentujemy szczegółowe protokoły generowania i charakterystyki modeli rozwoju 2D i 3D ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (hIPSC) opartych na korze nowej, a także uzupełniające metodologie umożliwiające jakościową i ilościową analizę biogenezy i funkcji rzęsek pierwotnych (PC).

Modele 2D i 3D oparte na pluripotencjalnych komórkach macierzystych indukowanych przez człowieka do analizy pierwotnego zaangażowania rzęsek podczas rozwoju kory nowej

Organoidy stały się cennymi narzędziami do modelowania chorób. Macierz zewnątrzkomórkowa (ECM) kieruje losem komórki podczas generowania organoidów, a użycie systemu, który przypomina tkankę natywną, może poprawić dokładność modelu. W badaniu tym porównano wytwarzanie indukowanych organoidów jelitowych ludzkich komórek macierzystych pochodzących z pluripotencjalnych komórek macierzystych w hydrożelach ECM pochodzenia zwierzęcego i bezksenowęglowych.

Badanie porównawcze matryc podstawno-błonowych do utrzymania ludzkich komórek macierzystych i generowania organoidów jelitowych

Ten protokół przedstawia różnicowanie ludzkich osteoklastów od indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (iPSC) i opisuje metody charakterystyki osteoklastów i prekursorów osteoklastów.

Różnicowanie i charakterystyka osteoklastów z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych

Poznaj metodę tworzenia wolnych od surowicy ciał embrionalnych z hiPSC do badania rozwoju kory mózgowej i odkrywania leków. Ten model 3-D umożliwia analizę tworzenia się sieci neuronowych w tkance ludzkiej.

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów (Wideo) | JoVE Journal

Opracowanie wolnych od surowicy ciał embrionalnych pochodzących z HiPSC do badania kultur 3-D komórek macierzystych przy użyciu fizjologicznie odpowiednich testów

Przeglądaj więcej filmów