Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych

Ogólnym celem tej metody pobierania płynu z błony śluzowej jest zbadanie lokalnej sygnatury immunologicznej dróg oddechowych bez konieczności stosowania procedur stymulacji. Metoda ta pozwala na zbadanie kluczowych pytań z zakresu chorób układu oddechowego u dzieci, takich jak infekcje, astma i alergie. Zaletą tej metody jest to, że można zmierzyć bardzo niski poziom mediatorów immunologicznych w niestymulowanej błonie śluzowej dróg oddechowych in vivo.

Demonstrację procedury wykona dr Wolsk. W celu pobrania próbki noworodków należy najpierw wyciąć co najmniej dwa paski o wymiarach trzy na 15 milimetrów z włóknistych hydrooksylowanych poliestrowych arkuszy filtracyjnych. Następnie połóż noworodka na łóżku i zwróć uwagę na wszelkie objawy infekcji dróg oddechowych.

Następnie za pomocą kleszczy włóż jeden kawałek bibuły filtracyjnej na około jeden centymetr do przedniej części dolnej małżowiny usznej każdego nozdrza niemowlęcia i w razie potrzeby podaj noworodkowi wodę z cukrem, aby uzyskać komfort. Zwróć uwagę na kichanie, uporczywy płacz lub krwawienie z nosa, które występują w okresie pobierania próbek. Po dwóch minutach wchłaniania przenieś bibuły filtracyjne do oznakowanej probówki w celu natychmiastowego przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.

Eksperymentalną procedurę zademonstruje Lisbeth Rosholm, technik w moim laboratorium. W celu ilościowego określenia mediatora immunologicznego dróg oddechowych należy umieścić na lodzie do 10 próbek z ujemnego poziomu 80 stopni Celsjusza i zapisać ich numery identyfikacyjne. Po rozmrożeniu próbek zanurzyć obie bibuły filtracyjne na osobę badaną w 150 mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu na bibułę filtracyjną, uzupełnionego jedną kompletną tabletką inhibitora proteazy na 25 mililitrów podstawowego roztworu buforowego.

Przenieść próbki do wytrząsarki płytkowej z prędkością 400 obr./min na pięć minut. Przenieść bufor i bibułę filtracyjną do kubków poszczególnych filtrów z rurki z octanu celulozy. Odwirować próbki, aby zebrać przefiltrowany ekstrakt z nosa na dnie probówek do mikrowirówek.

Następnie wyjmij kubki i umieść probówki na lodzie. Następnie przenieś 150 mikrolitrów podwielokrotności ekstraktu z nosa do indywidualnych studzienek płytek magazynujących o niskim poziomie wiązania białek i przechowuj płytki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Następnie zmierz stężenie interesujących nas mediatorów immunologicznych nosa za pomocą multipleksowanej matrycy opartej na elektrochemiluminescencji o wysokiej czułości zgodnie ze standardowymi protokołami testów.

W tej reprezentatywnej analizie 620 noworodków większość mierzonych mediatorów immunologicznych wykazała niski poziom wykrywalności. Poziomy gamma IFN były poniżej dolnej granicy wykrywalności w prawie połowie próbek, podczas gdy poziomy TNF alfa, CCL4 i TGF beta były poniżej dolnej granicy wykrywalności w mniej niż 1% próbek. Silna wieloliniowość była widoczna dla 20 wykrytych poziomów mediatorów, co ilustruje mapa cieplna.

U bezobjawowych noworodków zakażonych pikornawirusem zaobserwowano podwyższony profil upośledzony głównie przez mediatory immunologiczne typu 1, co sugeruje immunologiczną rolę kolonizacji bakterii i wirusów we wczesnej fazie życia. Ustalono również związek między obecnością rodzeństwa w gospodarstwie domowym w momencie urodzenia a specyficzną odpowiedzią immunologiczną błony śluzowej typu 1 typu 17 na podstawie dowodów na korelację tego zjawiska z efektem pobudzania immunologicznego in utero, który jest odwrotnie skorelowany z czasem od ostatniego porodu. Ponadto dzieci urodzone przez matki otrzymujące suplementy o wysokim poziomie w porównaniu z placebo charakteryzowały się zwiększeniem specyficznych mediatorów immunologicznych, co sugeruje, że witamina D promuje przeciwbakteryjną odpowiedź immunologiczną niezależną od tej indukowanej przez wirusa, bakterie, rodzeństwo lub atopię matki.

Ta metoda mikropobierania próbek może być również stosowana za pomocą bronchoskopu, co pozwala na badanie mediatorów immunologicznych w dolnych drogach oddechowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć mediatory w niestymulowanej błonie śluzowej dróg oddechowych in vivo u noworodków i starszych dzieci.