Nieinwazyjne pobieranie próbek płynu wyściełającego błonę śluzową w celu ilościowego określenia in vivo poziomów mediatorów immunologicznych w górnych drogach oddechowych
August 7th, 2017
Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek nienaruszonego płynu z błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Może być stosowany do ilościowego oznaczania in vivo poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.
Ogólnym celem tej metody pobierania płynu z błony śluzowej jest zbadanie lokalnej sygnatury immunologicznej dróg oddechowych bez konieczności stosowania procedur stymulacji. Metoda ta pozwala na zbadanie kluczowych pytań z zakresu chorób układu oddechowego u dzieci, takich jak infekcje, astma i alergie. Zaletą tej metody jest to, że można zmierzyć bardzo niski poziom mediatorów immunologicznych w niestymulowanej błonie śluzowej dróg oddechowych in vivo.
Demonstrację procedury wykona dr Wolsk. W celu pobrania próbki noworodków należy najpierw wyciąć co najmniej dwa paski o wymiarach trzy na 15 milimetrów z włóknistych hydrooksylowanych poliestrowych arkuszy filtracyjnych. Następnie połóż noworodka na łóżku i zwróć uwagę na wszelkie objawy infekcji dróg oddechowych.
Następnie za pomocą kleszczy włóż jeden kawałek bibuły filtracyjnej na około jeden centymetr do przedniej części dolnej małżowiny usznej każdego nozdrza niemowlęcia i w razie potrzeby podaj noworodkowi wodę z cukrem, aby uzyskać komfort. Zwróć uwagę na kichanie, uporczywy płacz lub krwawienie z nosa, które występują w okresie pobierania próbek. Po dwóch minutach wchłaniania przenieś bibuły filtracyjne do oznakowanej probówki w celu natychmiastowego przechowywania w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza.
Eksperymentalną procedurę zademonstruje Lisbeth Rosholm, technik w moim laboratorium. W celu ilościowego określenia mediatora immunologicznego dróg oddechowych należy umieścić na lodzie do 10 próbek z ujemnego poziomu 80 stopni Celsjusza i zapisać ich numery identyfikacyjne. Po rozmrożeniu próbek zanurzyć obie bibuły filtracyjne na osobę badaną w 150 mikrolitrach świeżo przygotowanego buforu na bibułę filtracyjną, uzupełnionego jedną kompletną tabletką inhibitora proteazy na 25 mililitrów podstawowego roztworu buforowego.
Przenieść próbki do wytrząsarki płytkowej z prędkością 400 obr./min na pięć minut. Przenieść bufor i bibułę filtracyjną do kubków poszczególnych filtrów z rurki z octanu celulozy. Odwirować próbki, aby zebrać przefiltrowany ekstrakt z nosa na dnie probówek do mikrowirówek.
Następnie wyjmij kubki i umieść probówki na lodzie. Następnie przenieś 150 mikrolitrów podwielokrotności ekstraktu z nosa do indywidualnych studzienek płytek magazynujących o niskim poziomie wiązania białek i przechowuj płytki w temperaturze minus 80 stopni Celsjusza do czasu analizy. Następnie zmierz stężenie interesujących nas mediatorów immunologicznych nosa za pomocą multipleksowanej matrycy opartej na elektrochemiluminescencji o wysokiej czułości zgodnie ze standardowymi protokołami testów.
W tej reprezentatywnej analizie 620 noworodków większość mierzonych mediatorów immunologicznych wykazała niski poziom wykrywalności. Poziomy gamma IFN były poniżej dolnej granicy wykrywalności w prawie połowie próbek, podczas gdy poziomy TNF alfa, CCL4 i TGF beta były poniżej dolnej granicy wykrywalności w mniej niż 1% próbek. Silna wieloliniowość była widoczna dla 20 wykrytych poziomów mediatorów, co ilustruje mapa cieplna.
U bezobjawowych noworodków zakażonych pikornawirusem zaobserwowano podwyższony profil upośledzony głównie przez mediatory immunologiczne typu 1, co sugeruje immunologiczną rolę kolonizacji bakterii i wirusów we wczesnej fazie życia. Ustalono również związek między obecnością rodzeństwa w gospodarstwie domowym w momencie urodzenia a specyficzną odpowiedzią immunologiczną błony śluzowej typu 1 typu 17 na podstawie dowodów na korelację tego zjawiska z efektem pobudzania immunologicznego in utero, który jest odwrotnie skorelowany z czasem od ostatniego porodu. Ponadto dzieci urodzone przez matki otrzymujące suplementy o wysokim poziomie w porównaniu z placebo charakteryzowały się zwiększeniem specyficznych mediatorów immunologicznych, co sugeruje, że witamina D promuje przeciwbakteryjną odpowiedź immunologiczną niezależną od tej indukowanej przez wirusa, bakterie, rodzeństwo lub atopię matki.
Ta metoda mikropobierania próbek może być również stosowana za pomocą bronchoskopu, co pozwala na badanie mediatorów immunologicznych w dolnych drogach oddechowych. Po obejrzeniu tego filmu powinieneś dobrze zrozumieć, jak mierzyć mediatory w niestymulowanej błonie śluzowej dróg oddechowych in vivo u noworodków i starszych dzieci.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Przegląd
Ten protokół opisuje nieinwazyjną technikę pobierania próbek niezakłóconego płynu śluzowego błony śluzowej z górnych dróg oddechowych. Umożliwia ona ilościową ocenę poziomów mediatorów białkowych, takich jak cytokiny i chemokiny, u osób w każdym wieku.
Kluczowe komponenty badania
Dziedzina nauki
- Choroby układu oddechowego
- Immunologia
- Pediatria
Tło
- Ta metoda bada lokalny podpis immunologiczny dróg oddechowych bez procedur stymulacji.
- Jest stosowana w pediatrycznych chorobach układu oddechowego, takich jak infekcje, astma i alergia.
- Technika umożliwia pomiar niskich poziomów mediatorów immunologicznych w niestymulowanej błonie śluzowej dróg oddechowych in vivo.
- Demonstrację procedury przeprowadza dr Wolsk.
Cel badania
- Zbadanie odpowiedzi immunologicznej w błonie śluzowej dróg oddechowych.
- Zdobycie wglądu w pediatryczne choroby układu oddechowego.
- Ułatwienie niesamowitych technik pobierania próbek dla badań.
Zastosowane metody
- Pobieranie płynu śluzowego błony śluzowej z górnych dróg oddechowych.
- Użycie włóknistych, hydroksylowanych poliestrowych arkuszy filtratorów do pobierania próbek.
- Obserwacja objawów infekcji dróg oddechowych u noworodków.
- Ilościowa ocena cytokin i chemokin w pobranej próbce.
Główne wyniki
- Skuteczne pobranie płynu śluzowego błony śluzowej bez inwazyjnych procedur.
- Możliwość pomiaru mediatorów immunologicznych in vivo.
- Wgląd w profil immunologiczny pacjentów pediatrycznych.
- Potencjalne zastosowania w rozumieniu chorób układu oddechowego.
Wnioski
- Nieinawazywna metoda pobierania próbek jest skuteczna w badaniu odporności dróg oddechowych.
- Ta technika może ulepszyć badania w dziedzinie zdrowia oddechowego u dzieci.
- Przyszłe badania mogą rozwijać wyniki związane z mediatorami immunologicznymi.
Często zadawane pytania
Executive Industry Relevance
This noninvasive mucosal lining fluid sampling method enables direct quantification of in vivo immune mediators in the upper airway mucosa without stimulation, providing a physiologically relevant readout of airway immune activity. The technique supports early-life immune profiling and longitudinal monitoring, facilitating mechanistic de-risking in respiratory therapeutic development by linking genetic and environmental exposures to immune phenotypes. Its application in neonatal and pediatric cohorts offers predictive value for endotyping and monitoring disease progression, particularly in asthma, allergy, and infectious disease contexts.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring baseline and induced levels of immune mediators in unstimulated mucosal tissue.
- Operational Value: Provides a reproducible, minimally invasive matrix for functional target validation in pediatric populations.
- Predictive Value: Supports biological de-risking through correlation of mediator profiles with clinical phenotypes such as asymptomatic viral infection and sibling exposure effects.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates eluted protein samples compatible with high-sensitivity electrochemiluminescence multiplex arrays for quantitative immune profiling.
- Standardization: Uses consistent filter paper absorption and elution protocols to ensure reproducible recovery of analytes across subjects and timepoints.
- Scalability: Demonstrated feasibility in large neonatal cohorts (n=620), supporting high-throughput screening applications in epidemiologic and interventional studies.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Enables longitudinal sampling from birth through childhood, linking early-life immune signatures to later respiratory disease outcomes.
- Biomarker Alignment: Detects upregulation of type 1 and type 17 immune mediators in asymptomatic picornavirus-infected neonates, suggesting utility in identifying immune endotypes.
- Mechanistic De-risking: Reveals associations between maternal vitamin D supplementation and antibacterial immune responses, supporting target prioritization for immunomodulatory interventions.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery biology phase by enabling direct measurement of immune mediators in vivo, informing target selection and pathway elucidation prior to lead identification.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of immune pathway activation in mucosal tissue without ex vivo manipulation or stimulation artifacts.
- Screening: Produces standardized eluates suitable for multiplex immunoassay readouts, facilitating comparative analysis across treatment or exposure groups.
- Analytics: Generates quantitative mediator levels that allow statistical assessment of collinearity, immune network activity, and phenotype associations.
- Translational Research: Connects neonatal immune profiles to childhood respiratory symptoms and environmental exposures, supporting risk-stratified advancement decisions.
- Enterprise Reuse: Represents a platform-compatible sampling technique applicable across respiratory disease models and therapeutic modalities.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Provides predictive confidence in target validation by capturing endogenous immune activity in the native mucosal microenvironment.
- Operational Value: Ensures reproducibility through standardized collection, elution, and storage procedures, minimizing pre-analytical variability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by linking immunomodulatory mechanisms to early-life immune signatures, reducing late-stage biological risk in respiratory programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of candidates based on demonstrated effects on mucosal immune pathways in relevant, longitudinal human models.
Implementation Considerations
- Requires training in neonatal airway anatomy and gentle sampling technique to ensure subject comfort and sample integrity.
- Dependent on access to ultrafilter tubes, plate shakers, and electrochemiluminescence immunoassay infrastructure for analyte detection.
- Necessitates standardized buffer preparation with protease inhibitors to prevent mediator degradation during extraction.
- Requires adaptation of sampling duration or filter size when applied to older children or alternative mucosal sites.
- Limited by analyte abundance, with some mediators frequently below detection limit, necessitating assay sensitivity optimization for low-expression targets.
