Przewidywanie wyciszania genów poprzez czasoprzestrzenną kontrolę uwalniania siRNA z reagujących na światło nanonośników polimerowych

Ogólnym celem tych metod jest uniemożliwienie przewidywania skuteczności wyciszania genów za pośrednictwem małych interferujących genów za pośrednictwem RNA i ułatwienie kontroli nad wynikającymi poziomami ekspresji białek w sposób przestrzenny i czasowy. Ta metoda może wyjaśnić strukturę, funkcje, relacje i nośniki reagujące na bodźce. Uzyskanie lepszej kontroli nad wiązaniem i uwalnianiem może odblokować translacyjne platformy i odkrywanie leków, a także technologie medycyny regeneracyjnej.

Głównymi zaletami tej techniki jest to, że zmiany w ekspresji genów mogą być kontrolowane i przewidywane na podstawie jako proste, testy uwalniania siRNA i modelowanie kinetyczne. Chociaż metody te wykorzystują nowatorskie polimery reagujące na światło, ten zestaw testów można łatwo dostosować do testowania szerokiej gamy innych systemów reagujących na bodźce. Na początek przygotuj 32 mikrogramy na mililitr roztworu siRNA, dodając siRNA do 20-mikromolowego roztworu HEPES o pH sześć.

Następnie przygotuj roztwór polimeru, dodając rozpuszczone polimery blokowe mPEG polyAPN BMA do 20-milimolowego roztworu HEPES o pH sześć. Aby osiągnąć stężenie 220 mikrogramów na mililitr, stężenie to spowoduje stosunek N do P wynoszący cztery, co oznacza, że na polimerze będzie cztery razy więcej grup aminowych niż grup fosforanowych na siRNA. Następnie dodaj roztwór polimeru kroplami do równej objętości roztworu siRNA, delikatnie mieszając na maszynie wirowej.

Kontynuuj wirowanie przez 30 sekund po dodaniu polimeru. Następnie inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodaj roztwór STS do każdego roztworu nanonośnika kroplami, delikatnie mieszając na maszynie wirowej.

Kontynuuj wirowanie przez 30 sekund po wydaniu SDS. Odwirować próbki w temperaturze 3 000 G przez pięć sekund, a następnie inkubować próbki w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Skalibruj i ustaw laser UV z filtrem 365 nanometrów na intensywność 200 watów na metr kwadratowy.

Następnie wytnij otwór w gumowej uszczelce, umieść gumową uszczelkę na umytym i wysuszonym szkiełku szkiełkowym. Odpipetować roztwór SDS nanonośnika na szklane szkiełko wewnątrz otworu gumowej uszczelki. Załaduj nadmiar roztworu na szkiełko podstawowe, unikając kontaktu z gumową uszczelką.

Umieść drugi szkiełko na uszczelce prowadnicy. Aby uniknąć powstawania pęcherzyków powietrza, najpierw umieść jeden koniec zjeżdżalni w dół, a następnie powoli opuść drugi koniec. Przymocuj klipsy do segregatora z każdej strony szklanej komory, aby trzymać ją blisko.

Naświetlaj próbki przez żądany czas za pomocą lasera UV z filtrem 365 nanometrów o intensywności 200 watów na metr kwadratowy. Wyjmij spinki do segregatora i otwórz komorę. Następnie pipetować 25 mikrolitrów napromieniowanych próbek nanonośnika SDS na probówki do mikrowirówek.

Roztwory inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 30 minut. Dodać pięć mikrolitrów roztworu buforu ładującego do 25 mikrolitrów każdej próbki SDS nanonośnika. Próbki należy inkubować w ciemności w temperaturze pokojowej przez 10 minut.

Następnie załaduj 30 mikrolitrów każdej próbki SDS nanonośnika do 2% żelu agarozowego, wstępnie wybarwionego bromkiem etydyny. Uruchom żel w ciemności przy napięciu 100 woltów przez 30 minut. Zobrazuj żel za pomocą systemu obrazowania żelu z filtrami bromku etydyny.

Zapisz pliki obrazów żelu i przystąp do kwantyfikacji intensywności zgięcia zgodnie z opisem w protokole tekstowym. Usuń kawałki papieru z dwustronnej przekładki samoprzylepnej, aby odsłonić powierzchnię klejącą. Przymocuj przekładkę do szklanego szkiełka nakrywkowego.

Odpipetować roztwór SDS nanonośnika na szkiełko nakrywkowe. Następnie umieść wstępnie umyte szkiełko podstawowe na szkiełku nakrywkowym z otworem w przekładce kleju, wyśrodkowanym wokół próbki. Dociśnij szkiełko szklane, aby upewnić się, że szkiełko szkiełkowe i szkiełko nakrywkowe są dobrze zamocowane i tworzą uszczelnienie.

Do pomiarów FCS należy użyć mikroskopu konfokalnego z 40-krotnie zanurzonym w wodzie, aperchromalnym obiektywem o aperturze numerycznej 1,2. Użyj odpowiedniego kanału lasera wzbudzającego, aby zebrać co najmniej 30 pomiarów po 10 sekund każdy na próbkę. Następnie wprowadź dane o uwalnianiu siRNA z FCS do modelu kinetycznego, aby przewidzieć reakcje wyciszania genów, zgodnie z opisem w protokole tekstowym.

Aby przygotować dostarczenie siRNA in vitro, najpierw dodaj dwa mililitry zawiesiny komórkowej do każdego dołka z sześciodołkowej płytki. Pozwól komórkom przylegać i regenerować się przez 24 godziny w inkubatorze. Po umyciu komórek solą fizjologiczną buforowaną fosforanami, przygotuj je do transwekcji, dodając 1,5 mililitra surowicy i pożywki transwekcyjnej bez antybiotyków.

Następnie dodaj 25 mikrolitrów roztworu nanonośnika, zawierającego 30 pikomoli siRNA tp w każdym dołku. Delikatnie odpipetować pożywkę w górę i w dół, aby wymieszać. Umieść komórki w inkubatorze na trzy godziny.

Usunąć pożywkę transwekcyjną i umyć każdą studzienkę PBS. Następnie dodaj jeden mililitr uzupełnionej pożywki wzrostowej i umieść komórki w inkubatorze, aby doszły do siebie przez 30 minut. Aby przygotować komórki do leczenia bodźcem fotograficznym, usuń uzupełnioną pożywkę wzrostową.

Następnie dodaj jeden mililitr pożywki transwekcyjnej do każdej studzienki. Po skalibrowaniu lasera UV zgodnie z opisem w protokole tekstowym, umieść ogniwa na płycie grzejnej ustawionej na 37 stopni Celsjusza. Zdejmij pokrywę z płytki sześciodołkowej.

Naświetlaj komórki znad płytki przez żądany czas, używając lasera UV z filtrem 365 nanometrów o intensywności 200 watów na metr kwadratowy. Usuń pożywkę transwekcyjną i dodaj dwa mililitry uzupełnionej pożywki wzrostowej. Umieść komórki w inkubatorze do czasu dalszej analizy.

Aby przygotować maskę fotograficzną, która całkowicie blokuje światło 365 nanometrów i minimalizuje odbicia, najpierw wytnij, przebij i/lub obrób pożądany kształt w masce fotograficznej. Przyklej maskę fotograficzną do dolnej części płytki z sześcioma dołkami, tak aby wzór był wyśrodkowany na studzience zawierającej komórki i stroną antyrefleksyjną skierowaną w stronę płytki. Ustaw dwa stojaki pierścieniowe w odległości około 25 metrów od siebie i odłącz platformę do każdego stojaka pierścieniowego, tak aby platformy miały równą wysokość.

Zawieś płytkę ogniwa między dwoma stojakami, opierając płytkę na platformach. Naświetlać komórki od dołu próbki przez żądany czas, za pomocą lasera UV z filtrem 365 nanometrów, z intensywnością 200 watów na metr kwadratowy. Usuń pożywkę transwekcyjną i dodaj dwa mililitry uzupełnionej pożywki wzrostowej.

Następnie umieść komórki w inkubatorze, aby odzyskały siły przez co najmniej 24 godziny. Zobrazuj komórki za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej, jak opisano wcześniej. Pokazany tutaj jest przykład prostego modelowania kinetycznego dynamiki wyciszania genów.

Model został uruchomiony w celu przewidywania stężeń mRNA, białka i siRNA w funkcji czasu następującego po uwolnieniu siRNA wywołanego światłem. Względne ilości siRNA uwalniane po różnych dawkach światła zostały wprowadzone jako początkowe stężenie siRNA w modelu kinetycznym. Uzyskane w ten sposób modelowe przewidywania dotyczące poziomów ekspresji białek były zgodne z eksperymentalnie wyznaczonymi poziomami ekspresji uzyskanymi za pomocą western blot.

W celu wizualizacji komórki wykazujące ekspresję GFP potraktowano GFP ukierunkowanym na siRNA, a przed napromieniowaniem na płytce umieszczono pierścieniową maskę fotograficzną w celu wygenerowania okrągłego wzoru. Komórki, które były chronione przed światłem, wykazywały intensywność fluorescencji, która była nie do odróżnienia od próbek kontrolnych, które nie były traktowane siRNA i światłem. Jednak prawie wszystkie komórki w obrębie kolistego wzoru nie wykazywały ekspresji GFP, co wskazuje na efektywne uwalnianie siRNA i knockdown genu.

Co więcej, użycie światła jest czynnikiem aktywującym ekspresję genów, który można kontrolować na skalach długości komórek. Podsumowując, metoda ta umożliwia szybkie określenie warunków napromieniowania w celu czasoprzestrzennej kontroli uwalniania siRNA i przewidywania wyciszenia genów a priori. Zastosowanie tego protokołu pomoże wyjaśnić zależności między strukturą, funkcją rządzącą stabilnością i skutecznością nanonośników.

Technika ta może umożliwić zastosowania w medycynie regeneracyjnej, która wymaga czasoprzestrzennej kontroli ekspresji genów. Preparaty te doskonale nadają się również do leczenia miejscowych zaburzeń, takich jak rak skóry, a także zaburzeń dermatologicznych.